CN102228685A - 中国大鲵虹彩病毒细胞灭活疫苗的制备及其使用方法 - Google Patents

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董武子
杨长明
张驰
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Abstract

本发明公开了一种中国大鲵虹彩病毒细胞灭活疫苗的制备及其使用方法，所述疫苗是按下述方法制得，1.无菌获取濒死的含有蛙虹彩病毒的大鲵肝脏，制成组织匀浆；2.在冰面上将组织匀浆20kHz超声快速裂解，过滤；3.对滤液离心分离，得纯粹的病毒沉淀，然后调整病毒滴度达到105TCID50；4.病毒细胞培养，收获细胞培养液；5.用终浓度为0.4％的甲醛，将细胞培养液在37℃灭活5-10小时，即成为中国大鲵虹彩病毒细胞灭活疫苗。该疫苗4℃保存，一年内有效。幼鲵及0.25kg以下的成鲵免疫采用疫苗稀释液浸浴方式；0.25kg以上的成鲵免疫采取肌肉注射。该疫苗的免疫特异性很强，免疫率可达80-93％。

Description

中国大鲵虹彩病毒细胞灭活疫苗的制备及其使用方法
技术领域
本发明涉及一种病毒细胞灭活疫苗的制备方法及其使用方法，特别是一种预防中国大鲵虹彩病毒细胞灭活疫苗的制备方法及其使用方法。
背景技术
大鲵，俗名娃娃鱼，两栖类动物，具有极高的科研、营养、药用、人文及观赏价值。近年来，养殖大鲵已形成一个新兴的朝阳产业，给广大养殖户带来了十分显著的经济效益，也带动了整个产业链的发展。然而，随着大鲵集约化养殖的发展和养殖规模的不断扩大，大鲵病害也不断发生，而且症状越来越复杂，发病率逐年上升，尤其是以四肢肿大、头肿大、体表溃烂为主要临床病状特征的大鲵“大脚病”在全国各主产地相继爆发，许多繁殖场的种鲵及养殖场的成鲵和幼鲵发病死亡，损失惨重，直接经济损失累计数亿元人民币，间接损失更是高达数十上百亿人民币。
“大脚病”是大鲵感染蛙虹彩病毒后继发感染嗜水气单孢菌等细菌所致，死亡率高达90-100％，传染性极强，是当前大鲵养殖危害最大的疫病和制约我国大鲵产业发展的最大瓶颈。目前国内外尚无治疗该病的有效药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中国大鲵虹彩病毒细胞灭活疫苗的制备、保存及其使用方法，该疫苗能有效预防大鲵“大脚病”的发生，确保大鲵产业稳定发展。
实现上述目的的技术方案是：
1.中国大鲵虹彩病毒细胞灭活疫苗的制备方法
1.1病鲵组织获取
无菌获取濒死的并确诊其肝脏中含有蛙虹彩病毒的大鲵肝脏，将肝脏制成组织匀浆；
1.2组织裂解病毒原液获取
将组织匀浆在冰面上20kHz超声快速裂解，经过5000rpm离心30min，获取清液，然后用0.4um无菌过滤器过滤，得到滤液；
1.3病毒的纯化
将上述滤液经过20000rpm离心60min，去掉上清液，沉淀物用适量的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，再经20000rpm离心60min，获取的沉淀即为纯粹的病毒沉淀，然后调整病毒滴度达到105TCID50；
1.4病毒细胞培养
在无菌超净台上接种草鱼性腺细胞，或鲤鱼表皮瘤细胞，或293-T细胞，在25℃、5％CO2培养箱中，用含有10％小牛血清的M199培养基，pH为7.0-7.4，培养48-72h，收获细胞培养液；
1.5回归感染试验
取少量上述细胞培养液，加入10倍量0.7％的生理盐水，制成病毒液，按大鲵体重0.1ml/kg的剂量给健康大鲵腹腔注射该病毒液，待被注射的大鲵发病后，即表现出“大脚病”的症状后，再次诊断检测，当确定为中国大鲵虹彩病毒感染后，再将此病毒液按上述1.4步骤扩大生产细胞培养液；
1.6灭活、分装
用终浓度为0.4％的甲醛，将细胞培养液在37℃灭活5-10小时，即成为中国大鲵虹彩病毒细胞灭活疫苗。
2.本发明病毒细胞灭活疫苗的保存方法是：4℃保存，一年内有效。
3.本发明病毒细胞灭活疫苗使用方法
3.1幼鲵及0.25kg以下的成鲵免疫：把疫苗用50倍无菌水稀释，将开口60天以上、消化道充分发育的幼鲵或0.25kg以下的成鲵浸浴其中60分钟。
3.2重量在0.25kg以上的成鲵免疫：按大鲵体重0.1ml/kg剂量肌注疫苗。
本发明病毒细胞灭活疫苗能确保中国大鲵虹彩病毒的标准性和特异性。实验证明，该疫苗的免疫特异性很强，免疫效果稳定，对能感染大鲵致大鲵患“大脚病”的中国大鲵虹彩病毒株型有很好的免疫保护效果，对其它蛙虹彩病毒株型也有一定的免疫保护效果，免疫率可达80-93％。疫苗的生产中，病毒量易于计量和控制，疫苗的质量稳定。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)将濒死并确诊其肝脏中含有蛙虹彩病毒的大鲵肝脏取出，制成组织匀浆；
(2)将组织匀浆在冰面上用20kHz超声波快速裂解，经过5000rpm离心30min，获取清液，然后用0.4um无菌过滤器过滤，收集滤液；
(3)将滤液经过20000rpm离心60min，去掉上清液，沉淀物用适量的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，再经20000rpm离心60min，然后调整沉淀的病毒滴度达到105TCID50；
(4)在无菌间超净台内接种草鱼性腺细胞，在25℃、5％CO2培养箱中，用含有10％小牛血清的M199培养基，pH为7.0-7.4，培养48-72h，收获细胞培养液。在该过程中，除了草鱼性腺细胞，也可使用鲤鱼表皮瘤细胞或293-T细胞作为替代细胞；
(5)取少量上述细胞培养液，加入10倍量0.7％的生理盐水，制成病毒液，然后按大鲵体重0.1ml/kg的剂量给健康大鲵腹腔注射该病毒液，待被注射的大鲵发病后，即表现出“大脚病”的症状后，再次诊断检测，当确定为中国大鲵虹彩病毒感染后，再将此病毒液按上述步骤(4)扩大生产细胞培养液；
(6)用终浓度为0.4％的甲醛，将细胞培养液在37℃灭活5-10小时，即成为中国大鲵虹彩病毒细胞灭活疫苗。
(7)分装于2ml的疫苗专用无菌瓶中，4℃保存，有效期可达一年。
实施例2
幼鲵的疫苗免疫：
取实施例1所得到的疫苗100ml于水盆中，用无病毒无菌养殖用水5L稀释，将100尾开口60天以上、消化道充分发育的幼鲵或0.25kg以下的成鲵放入其中进行浸浴，浸浴时间为60min，在浸浴过程中每10min摇动水盆一次予以增氧，然后将它们放入消毒处理过的养殖池中。根据它们的生长情况，1个月以后再按上述浸浴方法进行一次加强免疫。
实施例3
成鲵的疫苗免疫：
对于0.25kg以下的成鲵，按照实施例2所述方法完成疫苗免疫即可。
对于0.25kg以上的成鲵，均采用肌注疫苗的方法进行免疫，注射剂量按0.1ml/kg体重，具体步骤如下：
(1)将养殖池水放干，称量大鲵的体重；
(2)用70％酒精棉球轻轻擦拭大鲵尾侧肌注射区；
(3)用实施例1所得疫苗，根据大鲵体重按计量进行肌肉注射。
(4)将注射疫苗后的大鲵放入养殖池中，重新加入养殖用水，按常规管理。一个月后，在大鲵尾侧肌另一侧按本实施例(2)至(3)所述的方法再注射一次疫苗。

Claims (3)

1.一种中国大鲵虹彩病毒细胞灭活疫苗的制备方法，其特征是按下述步骤完成：
(1)病鲵组织获取
无菌获取濒死的并确诊其肝脏中含有蛙虹彩病毒的大鲵肝脏，将肝脏制成组织匀浆；
(2)组织裂解病毒原液获取
将组织匀浆在冰面上20kHz超声快速裂解，经过5000rpm离心30min，获取清液，然后用0.4um无菌过滤器过滤，得到滤液；
(3)病毒的纯化
将上述滤液经过20000rpm离心60min，去掉上清液，沉淀物用适量的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，再经20000rpm离心60min，获取的沉淀即为纯粹的病毒沉淀，然后调整病毒滴度达到105TCID50；
(4)病毒细胞培养
在无菌超净台上接种草鱼性腺细胞，或鲤鱼表皮瘤细胞，或293-T细胞，在25℃、5％CO2培养箱中，用含有10％小牛血清的M199培养基，pH为7.0-7.4，培养48-72h，收获细胞培养液；
(5)回归感染试验
取少量上述细胞培养液，加入10倍量0.7％的生理盐水，制成病毒液，按大鲵体重0.1ml/kg的剂量给健康大鲵腹腔注射该病毒液，待被注射的大鲵发病后，即表现出“大脚病”的症状后，再次诊断检测，当确定为中国大鲵虹彩病毒感染后，再将此病毒液按上述步骤4扩大生产细胞培养液；
(6)灭活、分装
用终浓度为0.4％的甲醛，将细胞培养液在37℃灭活5-10小时，即成为中国大鲵虹彩病毒细胞灭活疫苗。
2.如权利要求1所述疫苗的保存方法，其特征在于：所述病毒细胞灭活疫苗4℃保存，一年内有效。
3.如权利要求1所述病毒细胞灭活疫苗的使用方法，其特征在于：
(1)幼鲵及0.25kg以下的成鲵免疫
把疫苗用50倍无菌水稀释，将开口60天以上、消化道充分发育的幼鲵或0.25kg以下的成鲵浸浴其中60分钟，一个月以后再按上述浸浴方法进行一次加强免疫；
(2)重量在0.25kg以上的成鲵免疫
按大鲵体重0.1ml/kg剂量肌注疫苗，一月后再按此方法做一次加强免疫。
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