CN109438575B - 一种大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体，包括通过以下方法制备而得：(1)从感染大口黑鲈弹状病毒的大口黑鲈中分离培养获得大口黑鲈弹状病毒；(2)对大口黑鲈弹状病毒进行灭活；(3)以灭活的大口黑鲈弹状病毒为抗原对180‑190日龄的产蛋鸡进行免疫，收集免疫后产蛋鸡的鸡蛋，从鸡蛋的卵黄中提取纯化卵黄抗体。本发明有效中和大口黑鲈弹状病毒，从而终止病毒感染，为后续用于该病毒的防控提供了一种有效的被动免疫制剂，对于降低亲本的带毒率和提高苗种的存活率具有重要的意义。

Description

一种大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体
技术领域
本发明涉及鱼用生物制品生产技术领域，特别涉及一种大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体。
背景技术
大口黑鲈Micropterussalmoides俗称加州鲈，原产于美国加利福尼亚州密西西比河水系，肉质鲜美、在市场上很受欢迎，加之具有生长迅速、易起捕，适温范围广，耐低氧能力强等特点，一直深受养殖户的欢迎。我国年产量可达30多万吨，是全球产量最高的国家。2016年浙江省大口黒鲈养殖面积近5万亩。近年来加州鲈已成为跑道式循环水养殖的主要养殖品种。但无论是传统的高密度养殖还是跑道式集中圈养模式，都存在着疫病快速传播的潜在危险。其中病毒性病害，目前尚无有效的治疗药物，一旦爆发，会造成严重的经济损失。采用免疫预防措施是病毒性病害防治的重要手段。
大口黑鲈弹状病毒(Micropterussalmoidesrhabdovirus，MSRV)属于水泡性病毒属，为线性负链单链RNA病毒，大小为53nm×140nm，形态似棒状或子弹状。大口黑鲈鱼苗弹状病毒病常有爆发。其发病时间主要在4～5月、10～11月，水温在25℃～28℃最容易发病，通常发生在水温突然升高或突然降低时，危害的主要对象是苗种。感染途径主要既有以水体为媒介的水平传播，亦可由亲鱼通过垂直传播给苗种。该病传播快、潜伏期短、死亡率高。近年来，此病在加州鲈鱼苗种培育及养殖早期流行，严重时80％池塘发病，死亡率高，短时间内可高达90％，经济损失巨大。免疫预防是防治病毒性病害的主要手段。免疫预防措施有特异性和非特异性两大类，其中特异性预防包括主动免疫和被动免疫。由于弹状病毒主要危害5cm以下的鲈鱼苗种，而这一阶段的鱼苗免疫系统发育不完善，主动免疫预防难以实现。以抗体作为被动免疫的预防措施具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体，可有效中和大口黑鲈弹状病毒，从而终止病毒感染，为后续用于该病毒的防控提供了一种有效的被动免疫制剂，对于降低亲本的带毒率和提高苗种的存活率具有重要的意义。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体，通过以下方法制备而得：
(1)从感染大口黑鲈弹状病毒的大口黑鲈鱼苗(体长2-5cm)中分离培养获得大口黑鲈弹状病毒；
(2)对大口黑鲈弹状病毒进行灭活；
(3)以灭活的大口黑鲈弹状病毒为抗原对180-190日龄的产蛋鸡进行免疫，收集免疫后产蛋鸡的鸡蛋，从鸡蛋的卵黄中提取纯化卵黄抗体。
卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，是存在于卵黄中的唯一的免疫球蛋白，获取方便，免疫蛋鸡所产的鸡蛋卵黄中即含有高水平的特异性抗体，具有化学性质稳定、产量高、成本低、特异性强且无任何毒副作用的优势；由于与大口黑鲈种系发生距离远，不会发生交叉血清学反应。因此选用卵黄抗体。本发明制备的卵黄抗体可有效中和病毒的感染，可应用于大口黑鲈弹状病毒病的防治与诊断试剂的开发。本发明制备的卵黄抗体是一种专门针对大口黑鲈鱼苗使用的免疫制剂。
步骤(1)从感染大口黑鲈弹状病毒的大口黑鲈中分离培养获得大口黑鲈弹状病毒具体操作如下：
①取感染MSRV的大口黑鲈鱼苗，匀浆后冻融2次，离心，取上清，经0.25μm的细菌过滤器过滤，滤液即为病毒粗提液；
②采用草鱼卵巢细胞株CO细胞作为大口黑鲈弹状病毒的敏感细胞，CO细胞培养基为M199完全培养基；待CO细胞在细胞汇合度达60-80％时，吸出培养基，加入M199基础培养基和病毒粗提液的混合液，覆盖至单层细胞表面，吸附1.5-2小时后，吸出未吸附病毒粗提液，添加M199维持液继续培养48-72小时，出现细胞病变50％以上，收获病毒液，并置于-80℃保存备用。
M199完全培养基为M199基础培养基中添加10％胎牛血清，100μg/mL青霉素，100μg/mL链霉素。M199维持液为M199基础培养基中添加3％胎牛血清，100μg/mL青霉素，100μg/mL链霉素。
步骤(2)对大口黑鲈弹状病毒进行灭活具体操作如下：病毒液经离心，上清分装至无菌离心管中，加入福尔马林使终浓度为0.5％，盖紧管口；置65℃水浴锅中，待离心管中温度达65℃时开始计时，灭活2小时，每30min摇匀一次；灭活后冷却至室温，加入青霉素和链霉素，封口，置4℃保存。
加入青霉素和链霉素的终浓度均为100μg/mL。
步骤(3)以灭活的大口黑鲈弹状病毒为抗原对产蛋鸡进行免疫具体操作为：将灭活的大口黑鲈弹状病毒与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂按1:1体积比混合，完全乳化后得弗氏完全佐剂乳化疫苗、弗氏不完全佐剂乳化疫苗；采用胸肌多点注射的方式，第一次以弗氏完全佐剂乳化疫苗免疫产蛋鸡，其它以弗氏不完全佐剂乳化疫苗免疫产蛋鸡，共免疫四次。
四次免疫的时间为1d、7d、14d和28d，每次免疫1mL/只。
从鸡蛋的卵黄中提取纯化卵黄抗体具体操作为：采用75％酒精对收集的鸡蛋进行表面消毒，在无菌条件下破壳，将蛋清倒出后，将蛋黄倒入无菌烧杯中，加入乙酸-乙酸钠缓冲液，搅拌10min，4℃沉淀过夜，吸取上清，离心，收集上清，加入饱和硫酸铵直至液体中出现沉淀，离心收集沉淀，沉淀超纯水重悬，透析除去硫酸铵，得卵黄抗体。
乙酸-乙酸钠缓冲液用量为每克蛋黄使用8mL，乙酸-乙酸钠缓冲液的pH为5.2，浓度0.12mol/L。
大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体在制备用于治疗和预防大口黑鲈弹状病毒引起疾病的制剂中的应用。
所述制剂为饲料添加剂、疫苗或药品。
本发明的有益效果是：可有效中和大口黑鲈弹状病毒，从而终止病毒感染，为后续用于该病毒的防控提供了一种有效的被动免疫制剂，对于降低亲本的带毒率和提高苗种的存活率具有重要的意义。
附图说明
图1是SDS-PAGE检测卵黄抗体的电泳图。
图2是卵黄抗体对弹状病毒复制的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例：
一种大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体，通过以下方法制备而得：
一、大口黑鲈弹状病毒的分离培养
取感染MSRV的大口黑鲈鱼苗(来自浙江省湖州市的养殖厂，体长2-5cm)，匀浆后冻融2次，于12000rpm离心30min，取上清经0.25μm的细菌过滤器过滤，滤液即为病毒粗提液，分装并于-80℃保存备用。
采用草鱼卵巢细胞株CO细胞作为大口黑鲈弹状病毒的敏感细胞。CO细胞培养基为M199完全培养基(M199基础培养基中添加10％胎牛血清，100μg/mL青霉素，100μg/mL链霉素)。在T25规格的细胞培养瓶中培养，M199完全培养基加入4-5毫升，待CO细胞在细胞汇合度60-80％时，吸出培养液，加入1毫升M199基础培养基(购买GBICO公司)和病毒粗提液的混合液，覆盖至单层细胞表面，吸附1.5-2小时后，吸出未吸附病毒粗提液，添加4-5毫升M199维持液(M199基础培养基中添加3％胎牛血清，100μg/mL青霉素，100μg/mL链霉素)继续培养48-72小时，出现细胞病变50％以上，收获细胞及培养液即为病毒液，采用荧光定量测定病毒拷贝数，并置于-80℃保存备用。
二、灭活病毒的准备
将上述病毒液冻融2次后，5000rpm离心30min，上清分装至50mL无菌离心管中，每管25ml。加入福尔马林使终浓度为0.5％，盖紧管口。置65℃水浴锅中，待管中温度达65℃时开始计时，灭活2小时，每30min摇匀一次。灭活后冷却至室温，加入青霉素和链霉素(终浓度均为100μg/mL)，封口，置4℃保存。
三、佐剂乳化疫苗的制备
将灭活的大口黑鲈弹状病毒与弗氏完全佐剂按1:1体积比混合，将灭活的大口黑鲈弹状病毒与弗氏不完全佐剂按1:1体积比混合，完全乳化后得弗氏完全佐剂乳化疫苗、弗氏不完全佐剂乳化疫苗，4℃保存备用。
四、产蛋鸡的免疫与免疫蛋的收集
用上述制备的佐剂乳化疫苗采用胸肌多点注射的方式，免疫180-190日龄的产蛋鸡。分别于1d、7d、14d和28d免疫，共免疫四次，每次免疫1mL/只。第1次采用弗氏完全佐剂乳化疫苗免疫，其它用弗氏不完全佐剂乳化疫苗免疫。免疫5周后，从第35天开始收集鸡蛋，每天收集免疫鸡所产的鸡蛋，总共收集20天。同时，以PBS注射作为对照组，免疫程序与实验组相同。
五、卵黄抗体制备
75％酒精对收集的鸡蛋进行表面消毒，在无菌条件下破壳，将蛋清倒出后，将蛋黄倒入无菌烧杯中，加入乙酸-乙酸钠缓冲液(每克蛋黄使用8mL，pH5.2，0.12mol/L)，搅拌10min，4℃沉淀过夜，吸取上清，10000rpm离心15min，收集上清，加入饱和硫酸铵直至液体中出现沉淀，12000rpm离心30min收集沉淀，沉淀用超纯水重悬，采用透析的方法除去卵黄抗体中残留的硫酸铵，分装后-80℃保存备用。同时用SDS-PAGE分析检测卵黄抗体。如图1所示，经SDS-PAGE电泳检测，可见大小分别为50-75KD之间和25-35KD之间有明显的条带，与卵黄抗体轻链和重链大小预期相符。
六、卵黄抗体的检测及抗病毒作用
1、ELISA检测卵黄抗体的效价
MSRV蛋白提取：在MSRV病毒液(步骤一制得)中加入RIPA(含1mM PMSF)，混匀后置于冰上30min，12000rpm离心10min，上清即为病毒蛋白。
包被：病毒蛋白用PBS二倍稀释后，每孔100μL，4℃过夜，PBST洗涤3次，每次5分钟；一抗：卵黄抗体倍比稀释后，每孔100μL，37℃作用1h，PBST洗涤3次，每次5分钟；二抗：兔抗鸡(购自索莱宝公司)1：20000倍稀释后，每孔100μL，37℃作用1h，PBST洗涤3次，每次5分钟；显色：加现配TMB底物溶液，100uL/孔，37℃孵育10～30min；终止：加入10％的硫酸溶液，50uL/孔，终止反应。
ELISA测得卵黄抗体的效价为1：256。
2、卵黄抗体对MSRV病毒中和作用率的测定
1)病毒半数细胞感染量(TCID50)的测定：将MSRV病毒原液进行梯度稀释，将稀释的病毒分别接种CO细胞，每个稀释度为1组，每组设8个重复。24℃培养96h，记录病变细胞数和未病变细胞数，按Reed-Muech法计算TCID50。
以每孔100倍的TCID50病毒量与倍比稀释的卵黄抗体混匀，24℃作用2h后接种细胞，同时设TCID50病毒量与对照鸡蛋卵黄抗体混合作为对照、正常细胞孔对照及100倍TCID50/孔、0.1倍TCID50/孔的病毒对照，当100倍TCID50/孔全部病变而0.1倍TCID50/孔无病变时，用MTT法检测细胞存活量，按公式：作用率(％)＝[(给药组平均值-病毒对照平均值)/(正常细胞对照组平均值-病毒对照平均值)]×100％，计算中和作用率。
2)卵黄抗体对弹状病毒复制的影响
病毒拷贝数标准曲线的建立
根据弹状病毒(GeneBank序列号为DQ399789.1)糖蛋白基因的保守序列，采用引物MSRV-G-F(5′-CTGCTGTGTTAATTTTGCTCTTGGTCCGATTTTCGGAGCCTTACCCGCTGTTTGTTCCG-3′，SEQ ID No.1)和
MSRV-G-R(5′-GATGGTGGTGGTGGTGGCTGCCGCTCACTCCAGTTCCCACC-3′，SEQ ID No.2)进行PCR扩增，获得1386bp大小的目的片段。将扩增的PCR产物连接至pGEM-T的质粒后，转化DH5α大肠杆菌。挑选阳性转化菌株，经PCR验证后提取其质粒作为后续MSRV荧光定量检测的标准质粒。
将上步的标准质粒10倍梯度稀释作为模板，采用
Figure BDA0001879318010000051
qPCR Mix(TOYOBO)在Mx3005p(Stratagene)上进行Real-time PCR，引物为MSRV-F和MSRV-R(见表1)。每个模板做3个重复样。20μL反应体系：
Figure BDA0001879318010000052
qPCR Mix(2×)10μL，cDNA模板1μL，上下游引物各1μL(10ng/μL)，ROX 0.04μL，dH2O 6.96μL。循环参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min19s，共40个循环。得到动力学曲线，并计算出相应的标准曲线。
卵黄抗体与病毒中和实验
倍比稀释的卵黄抗体与等体积的病毒液混合，24℃作用2h后感染细胞，同时设置病毒对照及正常细胞对照。于接种后第6、12、24、48及72h收集细胞培养物，TRIZOL提取总RNA，反转录参照TOYOBO公司的“ReverTra Ace qPCR RT Master Mix”试剂盒合成cDNA。分别应用引物MSRV-F/MSRV-R及β-actin-F/β-actin-R(表1)对样品cDNA进行Real-time PCR扩增，每个模板做3个重复样。样品由MSRV引物扩增得到的CT值经β-actin校正后，通过标准曲线换算得到样品中病毒基因组的拷贝数。
表1 Real time PCR中所用引物
Figure BDA0001879318010000061
卵黄抗体对病毒的中和作用及MTT法检测结果显示：1/64倍稀释的卵黄抗体对病毒的中和作用最为明显，中和作用率为38.29％以上。病毒拷贝数的检测结果显示：接种后第6、12、24、48及72h，这5个时间点的中和实验组病毒拷贝数均低于病毒对照组(图2、表2)。
表2卵黄抗体对弹状病毒复制的影响
Figure BDA0001879318010000062
上述结果表明，制备的大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体可有效中和病毒感染。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省淡水水产研究所
<120> 一种大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体
<130> 2018.11
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence)
<400> 1
ctgctgtgtt aattttgctc ttggtccgat tttcggagcc ttacccgctg tttgttccg 59
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence)
<400> 2
gatggtggtg gtggtggctg ccgctcactc cagttcccac c 41
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence)
<400> 3
catcctccgt ctggacttgg ct 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence)
<400> 4
cctctgggca cctgaacctc t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence)
<400> 5
agcagcatca ccagccacat c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence)
<400> 6
cgtccgtcgc ttgactcaat t 21

Claims (3)

1.一种大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：
（1）从感染大口黑鲈弹状病毒的大口黑鲈鱼苗中分离培养获得大口黑鲈弹状病毒；
（2）对大口黑鲈弹状病毒进行灭活；
（3）以灭活的大口黑鲈弹状病毒为抗原对180-190日龄的产蛋鸡进行免疫，收集免疫后产蛋鸡的鸡蛋，从鸡蛋的卵黄中提取纯化卵黄抗体；
步骤（1）从感染大口黑鲈弹状病毒的大口黑鲈中分离培养获得大口黑鲈弹状病毒具体操作如下：
①取感染MSRV的大口黑鲈鱼苗，匀浆后冻融2次，离心，取上清，经0.25μm的细菌过滤器过滤，滤液即为病毒粗提液；
②采用草鱼卵巢细胞株CO细胞作为大口黑鲈弹状病毒的敏感细胞，CO细胞培养基为M199完全培养基；待CO细胞在细胞汇合度达60-80%时，吸出培养基，加入M199基础培养基和病毒粗提液的混合液，覆盖至单层细胞表面，吸附1.5-2小时后，吸出未吸附病毒粗提液，添加M199维持液继续培养48-72小时，出现细胞病变50%以上，收获病毒液，并置于-80℃保存备用；M199完全培养基为M199基础培养基中添加10%胎牛血清，100μg/mL青霉素，100μg/mL链霉素； M199维持液为M199基础培养基中添加3%胎牛血清，100μg/mL青霉素，100μg/mL链霉素；
步骤（2）对大口黑鲈弹状病毒进行灭活具体操作如下：病毒液经离心，上清分装至无菌离心管中，加入福尔马林使终浓度为0.5%，盖紧管口；置65℃水浴锅中，待离心管中温度达65℃时开始计时，灭活2小时，每30min摇匀一次；灭活后冷却至室温，加入青霉素和链霉素，封口，置4℃保存；加入青霉素和链霉素的终浓度均为100ug/mL；
步骤（3）以灭活的大口黑鲈弹状病毒为抗原对产蛋鸡进行免疫具体操作为：将灭活的大口黑鲈弹状病毒与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂按1:1体积比混合，完全乳化后得弗氏完全佐剂乳化疫苗、弗氏不完全佐剂乳化疫苗；采用胸肌多点注射的方式，第一次以弗氏完全佐剂乳化疫苗免疫产蛋鸡，其它以弗氏不完全佐剂乳化疫苗免疫产蛋鸡，共免疫四次；四次免疫的时间为1d、7 d、14 d和28 d，每次免疫1mL/只。
2.根据权利要求1所述的一种大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于：从鸡蛋的卵黄中提取纯化卵黄抗体具体操作为：采用75%酒精对收集的鸡蛋进行表面消毒，在无菌条件下破壳，将蛋清倒出后，将蛋黄倒入无菌烧杯中，加入乙酸-乙酸钠缓冲液，搅拌10min，4℃沉淀过夜，吸取上清，离心，收集上清，加入饱和硫酸铵直至液体中出现沉淀，离心收集沉淀，沉淀超纯水重悬，透析除去硫酸铵，得卵黄抗体。
3.根据权利要求2所述的一种大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于：乙酸-乙酸钠缓冲液用量为每克蛋黄使用8mL，乙酸-乙酸钠缓冲液的pH为5.2，浓度0.12mol/L。
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