CN108409857A - 虹鳟抗传染性造血器官坏死病卵黄抗体的制备及其应用 - Google Patents

虹鳟抗传染性造血器官坏死病卵黄抗体的制备及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种虹鳟抗传染性造血器官坏死病卵黄抗体的制备及其应用，制备方法包括以下步骤：S1.IHNV灭活抗原制备；S2.蛋鸡免疫；S3.免疫鸡蛋卵黄收集；S4.卵黄抗体的去脂提纯，三次添加饱和硫酸铵溶液提纯IHNV卵黄抗体；本方法制备得到的传染性造血器官坏死病毒（IHNV）卵黄抗体性质稳定，效价高，可用于工业大规模制备IHNV卵黄抗体。本发明的制备方法所制得的卵黄抗体可用于治疗传染性造血器官坏死病，具有广阔的应用前景。

Description

虹鳟抗传染性造血器官坏死病卵黄抗体的制备及其应用
技术领域
本发明涉及一种虹鳟抗传染性造血器官坏死病卵黄抗体的制备及其应用。
背景技术
传染性造血器官坏死病（InfectiouA Hematopoietic NecroAiA, IHN）是由传染性造血器官坏死病毒（InfectiouA Hematopoietic NecroAiA ViruA, IHNV）所引起的一种鲑科鱼类急性死亡的病毒性传染病，呈现快速传播与广泛发生的特征。该病被OIE列为必须申报的动物疫病，是鱼类进出口岸第1类检疫对象。2014年我国农业部将其列为《2014年国家水生动物疫情监测计划》的重点专项监测疫病之一。自1985年IHN疫情首次在中国出现以来，IHN已经先后在黑龙江、辽宁、青海、北京、甘肃、吉林、山东以及四川等地暴发，死亡率可高达100%，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。
IHNV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae），诺拉弹状病毒属（NovirhabdoviruA）。其外形为子弹状，含二十面立体对称型核衣壳，长150 nm-190 nm，直径65 nm-75nm，为单股负链RNA病毒。IHNV含有脂蛋白包膜，表面有纤细的刺突，与狂犬病毒的蛋白结构类似，能在多种细胞系上生长，包括大鳞大马哈鱼胚细胞系(Chinook Aalmon embryo，CHAE-14)、鲤鱼上皮瘤细胞系(Epithelioma papuloAAum of carp，EPC)、肥头鲦鱼细胞(Fathead minnow,FHM)、虹鳟性腺细胞系(Rainbow trout gonad，RTG-2)、蓝鳃太阳鱼成纤维细胞系(Bluegill fry，BF-2)等。该病毒的增殖温度范围为4℃-20℃，其最适增殖温度为15℃，细胞病变主要表现为细胞变圆，细胞脱落，出现空斑且空斑边缘细胞牵拉，成葡萄状。
IHNV的易感对象主要为鲑科鱼类的鱼苗或者幼鱼，成鱼感染通常不会出现死亡，而是成为病毒的传染宿主。当幼鱼和鱼苗感染后，其临床症状表现为眼球突出，鳃丝苍白，鳍条基部充血，体色发黑，腹部膨大，肛门处常拖着一条黄色的粘液粪便，解剖可见肝苍白，肾脏常呈现花斑状，胃、肠内有大量微黄、浑浊的粘液。幼鱼也常常变现出一些神经症状，包括打转，痉挛，时在剧烈抽搐后死亡。
卵黄抗体(Immunoglobulin of egg Yolk，IgY) 是一种多克隆抗体，由禽类经特异性抗原刺激后通过 B 淋巴细胞产生并运行至卵黄中所形成。IgY是一种7A免疫球蛋白，等电点接近5.2，分子量180kDa，有2条重链（67-70kDa）和2条轻链（22-30kDa）通过二硫键相连组成，轻链有1个恒定区和1个可变区，重链有1个可变区和4个恒定区。2007至今，IgY技术在国内研究的大体情况是在兽医学和功能食品开发上比较受重视，在实际生产中，水产养殖最理想、最便捷的给药方式便是拌料口服投喂，有大量文献报道了鱼类口服疫苗、药物的相关研究内容；结合IgY生产上的便捷性、高产性以及其耐酸不耐碱等特殊的理化性质，IgY可作为口服的免疫增强剂或高效性渔药。此外，卵黄抗体在多种环境中有较好的稳定性。在低于75℃条件下，卵黄抗体具有良好的热稳定性，90℃处理15min后，大部分卵黄抗体丧失结合活性，在PH12时，卵黄抗体迅速失去结合活性。实验表明，卵黄抗体具有耐受反复冻融的特性，即使经过5次冻融，其抗原结合活性几乎不受影响。在室温下可保存6个月，4℃保存可达5年以上，活性仅下降5％左 右。
现今主要使用IHNV灭活疫苗预防传染性造血器官坏死病，但是一方面IHNV灭活疫苗稳定性差，多次冻融后其与抗体结合性下降，同时，在实际使用过程中IHNV灭活疫苗给药方式受到限制。结合到卵黄抗体的优良的理化性质和稳定性，但是现今未将卵黄抗体应用到传染性造血器官坏死病的防治上。
发明内容
本发明的目的在于提供一种虹鳟抗传染性造血器官坏死病卵黄抗体的制备，用于制备高效价的IHNV卵黄抗体，并将该方法制得的IHNV卵黄抗体用于治疗传染性造血器官坏死病。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
虹鳟抗传染性造血器官坏死病卵黄抗体的制备，包括如下步骤：
S1. IHNV灭活抗原制备：将IHNV毒液加入到FHM细胞中培养得到IHNV病毒液，并以β-丙内酯为灭活剂制得IHNV灭活抗原；
S2.蛋鸡免疫：用S1制得的IHNV灭活抗原免疫蛋鸡；
S3.高免蛋卵黄收集：采集免疫后蛋鸡的鸡蛋得到高免蛋，高免蛋消毒晾干后采集卵黄，并剪破卵黄膜得到卵黄液；
S4. 卵黄抗体去脂提纯，包括如下步骤：
S4.1. 卵黄抗体液提取：取S3步骤中得到的卵黄液，在卵黄液中缓慢加入生理盐水并搅拌，其中卵黄液和生理盐水的体积比为1：（0.8-1.2），将混合液室温静置后于3℃-6℃离心，收集上清液；
S4.2.去脂：取S4.1中得到的上清液，在上清液中缓慢加入氯仿并搅拌，其中上清液和氯仿的体积比为1：（0.9-1.1），将混合液于-30℃~-10℃静置，之后于3℃-6℃离心，收集上清液得到IgY提取液；利用氯仿分子质量大且不溶于水而溶于脂的性质，与卵黄液充分混合静置，可使其中的脂蛋白因结合氯仿而沉淀，从而达到IHNV卵黄抗体去脂的目的，同时除去了加入的氯仿。
S4.3.初次沉淀提纯：取S4.2中得到的IgY提取液，在IgY提取液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液并搅拌，其中IgY提取液和饱和硫酸铵溶液的体积比为（1.8~2.3）:1，将混合液于3℃-6℃静置，之后于3℃-6℃离心，分别收集上清液和沉淀；
S4.4.二次沉淀提纯：取S4.3中得到的上清液，在上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液并搅拌，其中上清液和饱和硫酸铵溶液的体积比为（0.95~1.05）:1，将混合液将混合液于3℃-6℃静置，之后于3℃-6℃离心，弃上清，收集沉淀；加大混合液中硫酸铵的饱和度，提取S4.3中所得上清液中剩余的有效卵黄抗体。
S4.5.重悬提纯：取S4.3和S4.4中得到的沉淀，加入PBS溶液重悬沉淀得到上清液，在所得上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液并搅拌，其中上清液和饱和硫酸铵溶液的体积比为（1.8~2.3）：1，将混合液将于3℃-6℃静置，之后于3℃-6℃离心收集沉淀；重悬溶解沉淀提纯，提高沉淀中IHNV卵黄抗体的纯度。
S4.6. 透析浓缩：用PBS溶液洗涤S4.5中得到的沉淀，之后加入PBS溶液重悬沉淀得到沉淀悬浊液，然后沉淀悬浊液经透析和浓缩后得到IHNV卵黄抗体。
优选的，所述S1中IHNV灭活疫苗的制备具体过程为：
A1. FHM细胞复苏：将冻存的FHM细胞置于35℃-38℃下恒温水浴1-3min，然后再800-1000 r/min 离心4-6 min，去掉上清液，得到复苏的FHM细胞；
A2. FHM细胞基础培养：往A1步骤所得的FHM细胞中加入培养基，然后转移至培养瓶I中培养； 所述培养基中含有体积分数为8%-10%的FBS；
A3. FHM细胞扩大培养：待A2步骤中细胞长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗2-3次，然后取浓度为0.20%-0.30%的胰蛋白酶消化贴壁细胞，待1-2分钟后去掉胰蛋白酶；然后在细胞液中加入培养基，混匀之后将细胞液转入培养瓶II中，将培养瓶II置于25℃下培养；所述培养瓶II的生长面积是培养瓶I的3-4倍；所述培养基中含有体积分数为8%-10%的FBS；
A4. IHNV病毒培养：待A3步骤中FHM细胞在培养瓶II中长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗2-3次，然后加入IHNV毒液，13℃-17℃孵育1 h -2h；之后加入培养基维持液，13℃-17℃培养3-4天，收获IHNV病毒；所述培养基中含有体积分数为2%-5%的FBS；
A5. IHNV病毒提纯：将A4步骤得到的IHNV病毒液置于-80℃~-20℃下冻融，然后将病毒液4000~8000r/min离心10~15min，收集上清液得到IHNV活病毒液；
A6. IHNV病毒灭活：往A5步骤中得到的IHNV活病毒液中加入β-丙内酯，直至混合液中β-丙内酯的浓度为0.08-0.1%，3℃-5℃静置灭活，然后将灭活后的混合液置于36℃-37.5℃恒温水浴2h-2.5h水解β-丙内酯，最后将水解后的混合液经配制得到IHNV病毒灭活疫苗；其中，所述A1步骤取用的冻存FHM细胞、A2步骤加入的培养基、A3步骤加入的胰蛋白酶、A3步骤加入的培养基、A4步骤加入的培养基维持液的体积比为（1-1.5）：（4-6）：（0.2-1）：（4-6）：（11-13）。该IHNV灭活疫苗未对IHNV病毒的基因作任何改变，可以避免因基因改变对接种生物体产生副作用，疫苗安全性高，同时以β-丙内酯作为灭活剂灭活，灭活效果好。
优选的，所述S2中蛋鸡免疫的具体过程为：用S1制得的IHNV灭活抗原免疫SPF级蛋鸡，共免疫四次，每相邻两次免疫的时间间隔为5-10天；进一步优选的，第一次免疫所用的疫苗为：将弗氏完全佐剂和S1制得的IHNV灭活抗原按体积比1:1混合制成的疫苗；第二次和第三次免疫蛋鸡所用的疫苗为：将弗氏不完全佐剂和S2制得的IHNV灭活抗原按体积比1:1混合制成的疫苗；第四次直接用S1制得的IHNV灭活抗原免疫蛋鸡；其中四次免疫疫苗的注射量为1mL/鸡。
优选的，所述的S3步骤中，鸡蛋消毒晾干的过程具体为：将鸡蛋置于新洁尔灭溶液中浸泡消毒，之后用酒精棉球擦拭鸡蛋表面，并将鸡蛋置于无菌环境中晾干。
优选的，所述的S4.2中所加入的氯仿的纯度大于等于95%。
优选的，所述的S6中沉淀悬浊液透析和浓缩的具体过程为：将悬浊液加入到透析袋内，并将透析袋放置在PBS液中透析，透析后用PEG20000对透析产物进行浓缩，得到IHNV卵黄抗体。
优选的，所述S2中的蛋鸡为150-250日龄的罗曼粉鸡。
优选的，所述S4.5和S4.6中使用的PBS溶液的pH值为7.3-7.5，浓度为0.009-0.011mol/L。
根据以上所述制备方法得到的抗传染性造血器官坏死病卵黄抗体在预防和治疗传染性造血器官坏死病的应用。
本发明的有益效果是：采用本发明提供的制备方法得到的抗传染性造血器官坏死病卵黄抗体安全性高，本发明采用氯仿提取卵黄中的IgY，其后通过三次用不同浓度的饱和硫酸铵溶液分离提纯得到IHNV卵黄抗体沉淀，并经透析浓缩后得到IHNV卵黄抗体，制得的卵黄抗体纯度高，IgY效价可达1:960，性质稳定，同时适合IHNV卵黄抗体的大规模制备；该IHNV卵黄抗体在治疗传染性造血器官坏死病方面具有良好的应用前景，具有给药方便，可以采用口服给药方式，同时性质稳定保存方便。
附图说明
图1为IHNV灭活疫苗灭活效果检测图；
图2为不同收集日期免疫蛋所制得的抗IHNV卵黄抗体的滴度曲线图；
图3为虹鳟攻毒试验后发病死亡曲线图；
图4为死亡虹鳟RNS的PT-PCR检测结果图；
图5为各组虹鳟血液指标检测图。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、IHNV卵黄抗体制备
1.1、实验材料
胖头鳜肌肉细胞系（FSthesd minnow muScle cell line，FHM），购自ZetS life公司；胎牛血清（FBS），购自ZetS life公司；DMEM培养基，购自Hyclone公司；
胰蛋白酶，购自索莱宝公司；T25，T75康宁细胞培养瓶，购自康宁（Corning）公司；β-丙内酯，购自默克（Merk）公司；杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS），购自Hyclone公司；IHNV毒液，从患传染性造血器官坏死病的虹鳟鱼的肝脏、肾脏中分离；氯仿，购自西陇科学股份有限公司，其中CHCl3含量≥99.0%；
饱和硫酸铵溶液，浓度为0.9%的生理盐水，10%BSA，PBS溶液等由四川农业大学鱼病研究中心自备。
其中饱和硫酸铵溶液的制备如下：称取硫酸铵固体700g，置于2L烧杯中，加入1L去离子水，加温至80℃并搅拌，待固体完全溶解，烧杯静置降温，待溶液降至室温后，以0.22μm滤膜抽滤除菌、密封储存。
1.2、IHNV灭活疫苗制备
IHNV病毒灭活疫苗制备过程如下：
上述步骤中所用的DMEM培养基在使用过程中加入了青霉素和链霉素，青霉素的工作浓度为100U/mL，链霉素的浓度为0.1mg/ mL。
1.3、IHNV卵黄抗体制备
S2.蛋鸡免疫
实验试验共设置2个组，共20羽试验蛋鸡，随机分开单独饲养，具体分组表1所示。其中所选用的蛋鸡为SPF级蛋鸡，蛋鸡为罗曼粉蛋鸡，200日龄，日均产蛋1枚/羽，购于正大公司下属养殖场。
表1 免疫分组情况
分组 疫苗 蛋鸡数（羽）
试验组 （Sp-IgY） IHNV+佐剂 15
对照组（nSp-IgY） PBS+佐剂 5
以弗氏完全佐剂（FCA）按体积比1:1与1.2中制备好的IHNV灭活疫苗混合制成疫苗A，用于初免；以弗氏不完全佐剂（FIA）按体积比1:1与2中制备好的IHNV灭活疫苗混合制成疫苗B，用于第二、三次免疫；2中得到的IHNV灭活疫苗作为疫苗C用于第四次免疫。
其中以PBS溶液按体积比1:1与弗氏完全佐剂（FCA）混合成溶液A；以PBS溶液按体积比1:1与弗氏不完全佐剂 （FIA）混合成溶液B。其中PBS溶液的pH=7.4，浓度为0.01mol/L。
对蛋鸡免疫：
⑴ 初免：取制成的疫苗S对试验组蛋鸡进行皮下注射蛋鸡的翼内侧，1mL/鸡；对照组蛋鸡同部位注射同剂量的溶液A；
⑵ 二免：初免后7天，取制成的疫苗B进行肌肉注射蛋鸡的腿部，1mL/鸡；对照组蛋鸡同部位注射同剂量的溶液B；
⑶ 三免：二免后7天，取制成的疫苗B进行皮下注射蛋鸡的颈部，1mL/鸡；对照组蛋鸡同部位注射同剂量的溶液B；
⑷ 终免：三免后7天，取制成的疫苗C进行静脉注射蛋鸡的颈静脉，1mL/鸡；对照组蛋鸡同部位注射同剂量的PBS溶液；
四次免疫每次注射不同的部位，形成多点注射，使IHNV灭活疫苗能更好地发挥作用，提高免疫效果。
终免后第1天开始连续采集免疫鸡所产鸡蛋，做好时间、组别标记，于4℃储存备用，采集至终免后第82天。
S3. 免疫鸡蛋卵黄收集
采集好的鸡蛋于2%新洁尔灭溶液中浸泡消毒30min，75%酒精棉球擦拭表面，并置于超净工作台内晾干，用蛋清分离器采集每组卵黄，用灭菌眼科剪剪破卵黄膜，得到卵黄液；
S4. 卵黄抗体的去脂提纯
卵黄抗体去脂提纯实施例1
S4.1.卵黄抗体液提取：取S3步骤中得到的卵黄液，在卵黄液中缓慢加入生理盐水并不断搅拌10min，其中卵黄液和生理盐水的体积比为1：1，将混合液于室温静置15min后，以8000rpm、6℃离心15min，收集上清液；
S4.2.去脂：取S4.1中得到的上清液，在上清液中缓慢加入氯仿并搅拌，其中上清液和氯仿的体积比为1：1，将混合液于-20℃静置4h，之后以8000rpm、6℃离心15min，收集上清液得到IgY提取液；
S4.3.初次沉淀提纯：取S4.2中得到的IgY提取液，在IgY提取液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，其中IgY提取液和饱和硫酸铵溶液的体积比为2:1，磁力搅拌器室温搅拌混合液1h，6℃静置4h，之后以3500rpm、4℃离心20min，分别收集上清液和沉淀；
S4.4.二次沉淀提纯：取S4.3中得到的上清液，在上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，其中上清液和饱和硫酸铵溶液的体积比为1:1，磁力搅拌器室温下搅拌混合液1h，6℃静置4h，之后以3500rpm、6℃离心20min，直至混合液中没有沉淀析出，弃上清，收集沉淀；
S4.5.重悬提纯：取S4.3和S4.4中得到的沉淀，加入PBS溶液重悬沉淀得到上清液，在所得上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，其中上清液和饱和硫酸铵溶液的体积比为2:1，磁力搅拌器室温下搅拌混合液1h，6℃静置4h，之后以3500rpm、6℃离心20min，弃上清，收集沉淀；
S4.6.透析浓缩：用PBS溶液洗涤S4.5中得到的沉淀3次，按S4.5中原上清液体积等量加入PBS溶液重悬沉淀，将所得的沉淀悬浊液置入经EDTA处理过的透析袋内，于PBS中透析48h，每隔12h换PBS液一次，共4次，透析后用PEG20000对透析产物进行浓缩，得到IHNV卵黄抗体。取适量抗体于-20℃暂存，多余抗体冻干后于-80℃储存备用。其中S4.5和S4.6中所用PBS溶液的pH=7.4，浓度为0.01mol/L。
卵黄抗体去脂提纯实施例2
S4.1. 卵黄抗体液提取：取S3步骤中得到的卵黄液，在卵黄液中缓慢加入生理盐水并不断搅拌10min，其中卵黄液和生理盐水的体积比为1：0.8，将混合液于室温静置20min后，以8000rpm、5℃离心20min，收集上清液；
S4.2去脂：取S4.1中得到的上清液，在上清液中缓慢加入氯仿并搅拌，其中上清液和氯仿的体积比为1：1.1，将混合液于-30℃静置6h，之后以10000rpm、5℃离心15min，收集上清液得到IgY提取液；
S4.3.初次沉淀提纯：取S4.2中得到的IgY提取液，在IgY提取液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，其中IgY提取液和饱和硫酸铵溶液的体积比为1.8:1，磁力搅拌器室温搅拌混合液1.2h，5℃静置4h，之后以9000rpm、5℃离心18min，分别收集上清液和沉淀；
S4.4.二次沉淀提纯：取S4.3中得到的上清液，在上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，其中上清液和饱和硫酸铵溶液的体积比为0.95:1，磁力搅拌器室温下搅拌混合液1h，5℃静置4h，之后以9000rpm、5℃离心18min，直至混合液中没有沉淀析出，弃上清，收集沉淀；
S4.5.重悬提纯：取S4.3和S4.4中得到的沉淀，加入PBS溶液重悬沉淀得到上清液，在所得上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，其中上清液和饱和硫酸铵溶液的体积比为1.8:1，磁力搅拌器室温下搅拌混合液1h，5℃静置4h，之后以9000rpm、5℃离心18min，弃上清，收集沉淀；
S4.6.透析浓缩：用PBS溶液洗涤S4.5中得到的沉淀3次，按S4.5中原上清液体积等量加入PBS溶液重悬沉淀，将所得的沉淀悬浊液置入经EDTA处理过的透析袋内，于PBS中透析48h，每隔12h换PBS液一次，共4次，透析后用PEG20000对透析产物进行浓缩，得到IHNV卵黄抗体。取适量抗体于-20℃暂存，多余抗体冻干后于-80℃储存备用。其中S4.5和S4.6中所用PBS溶液的pH=7.5，浓度为0.011mol/L。
卵黄抗体去脂提纯实施例3
S4.1. 卵黄抗体液提取：取S3步骤中得到的卵黄液，在卵黄液中缓慢加入生理盐水并不断搅拌10min，其中卵黄液和生理盐水的体积比为1：1.2，将混合液于室温静置25min后，以9000rpm、4℃离心15min，收集上清液；
S4.2.去脂：取S4.1中得到的上清液，在上清液中缓慢加入氯仿并搅拌，其中上清液和氯仿的体积比为1：0.95，将混合液于-10℃静置4h，之后以9000rpm、3℃离心15min，收集上清液得到IgY提取液；
S4.3.初次沉淀提纯：取S4.2中得到的IgY提取液，在IgY提取液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，其中IgY提取液和饱和硫酸铵溶液的体积比为1.9:1，磁力搅拌器室温搅拌混合液1h，4℃静置4h，之后以5000rpm、4℃离心20min，分别收集上清液和沉淀；
S4.4.二次沉淀提纯：取S4.3中得到的上清液，在上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，其中上清液和饱和硫酸铵溶液的体积比为1.03:1，磁力搅拌器室温下搅拌混合液1h，4℃静置4h，之后以5000rpm、4℃离心20min，直至混合液中没有沉淀析出，弃上清，收集沉淀；
S4.5.重悬提纯：取S4.3和S4.4中得到的沉淀，加入PBS溶液重悬沉淀得到上清液，在所得上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，其中上清液和饱和硫酸铵溶液的体积比为2.3:1，磁力搅拌器室温下搅拌混合液1h，4℃静置4h，之后以5000rpm、4℃离心20min，弃上清，收集沉淀；
S4.6. 透析浓缩：用PBS溶液洗涤S4.5中得到的沉淀3次，按S4.5中原上清液体积等量加入PBS溶液重悬沉淀，将所得的沉淀悬浊液置入经EDTA处理过的透析袋内，于PBS中透析48h，每隔12h换PBS液一次，共4次，透析后用PEG20000对透析产物进行浓缩，得到IHNV卵黄抗体。取适量抗体于-20℃暂存，多余抗体冻干后于-80℃储存备用。其中S4.5和S4.6中所用PBS溶液的pH=7.4，浓度为0.009mol/L。
卵黄抗体去脂提纯实施例4
S4.1. 卵黄抗体液提取：取S3步骤中得到的卵黄液，在卵黄液中缓慢加入生理盐水并不断搅拌10min，其中卵黄液和生理盐水的体积比为1：1.1，将混合液于室温静置15min后，以9000rpm、6℃离心15min，收集上清液；
S4.2.去脂：取S4.1中得到的上清液，在上清液中缓慢加入氯仿并搅拌，其中上清液和氯仿的体积比为1：1，将混合液于-25℃静置4h，之后以9000rpm、6℃离心15min，收集上清液得到IgY提取液；
S4.3.初次沉淀提纯：取S4.2中得到的IgY提取液，在IgY提取液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，其中IgY提取液和饱和硫酸铵溶液的体积比为2.1:1，磁力搅拌器室温搅拌混合液1h，6℃静置3h，之后以4000rpm、6℃离心20min，分别收集上清液和沉淀；
S4.4.二次沉淀提纯：取S4.3中得到的上清液，在上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，其中上清液和饱和硫酸铵溶液的体积比为0.98:1，磁力搅拌器室温下搅拌混合液1h，6℃静置3h，之后以4000rpm、6℃离心20min，直至混合液中没有沉淀析出，弃上清，收集沉淀；
S4.5.重悬提纯：取S4.3和S4.4中得到的沉淀，加入PBS溶液重悬沉淀得到上清液，在所得上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，其中上清液和饱和硫酸铵溶液的体积比为2.1:1，磁力搅拌器室温下搅拌混合液1h，6℃静置3h，之后以4000rpm、6℃离心20min，弃上清，收集沉淀；
S4.6. 透析浓缩：用PBS溶液洗涤S4.5中得到的沉淀3次，按S4.5中原上清液体积等量加入PBS溶液重悬沉淀，将所得的沉淀悬浊液置入经EDTA处理过的透析袋内，于PBS中透析48h，每隔12h换PBS液一次，共4次，透析后用PEG20000对透析产物进行浓缩，得到IHNV卵黄抗体。取适量抗体于-20℃暂存，多余抗体冻干后于-80℃储存备用。其中S4.5和S4.6中所用PBS溶液的pH=7.3，浓度为0.009mol/L。
卵黄抗体去脂提纯实施例5
S4.1. 卵黄抗体液提取：取S3步骤中得到的卵黄液，在卵黄液中缓慢加入生理盐水并不断搅拌10min，其中卵黄液和生理盐水的体积比为1：0.9，将混合液于室温静置15min后，以7000rpm、6℃离心15min，收集上清液；
S4.2.去脂：取S4.1中得到的上清液，在上清液中缓慢加入氯仿并搅拌，其中上清液和氯仿的体积比为1：1，将混合液于-25℃静置4h，之后以7000rpm、6℃离心15min，收集上清液得到IgY提取液；
S4.3.初次沉淀提纯：取S4.2中得到的IgY提取液，在IgY提取液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，其中IgY提取液和饱和硫酸铵溶液的体积比为2.3:1，磁力搅拌器室温搅拌混合液1h，6℃静置3h，之后以3000rpm、6℃离心25min，分别收集上清液和沉淀；
S4.4.二次沉淀提纯：取S4.3中得到的上清液，在上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，其中上清液和饱和硫酸铵溶液的体积比为1.05:1，磁力搅拌器室温下搅拌混合液1h，6℃静置3h，之后以3000rpm、6℃离心25min，直至混合液中没有沉淀析出，弃上清，收集沉淀；
S4.5.重悬提纯：取S4.3和S4.4中得到的沉淀，加入PBS溶液重悬沉淀得到上清液，在所得上清液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，其中上清液和饱和硫酸铵溶液的体积比为2.2:1，磁力搅拌器室温下搅拌混合液1h，6℃静置3h，之后以3000rpm、6℃离心25min，弃上清，收集沉淀；
S4.6. 透析浓缩：用PBS溶液洗涤S4.5中得到的沉淀3次，按S4.5中原上清液体积等量加入PBS溶液重悬沉淀，将所得的沉淀悬浊液置入经EDTA处理过的透析袋内，于PBS中透析48h，每隔12h换PBS液一次，共4次，透析后用PEG20000对透析产物进行浓缩，得到IHNV卵黄抗体。取适量抗体于-20℃暂存，多余抗体冻干后于-80℃储存备用。其中S4.5和S4.6中所用PBS溶液的pH=7.4，浓度为0.01mol/L。
二、效果检测
2.1、疫苗安全性检测
将1.2中制得的IHNV灭活疫苗接种实验组FHM细胞，对照组FHM细胞接种IHNV毒液，观察两组细胞，并盲传三代检测IHNV疫苗灭活效果（盲传三次均未出现细胞病变则表示该病毒灭活完全）。灭活效果见图1，图1中S表示实验组FHM细胞，B表示对照组FHM细胞。由图1可知，FHM细胞接种IHNV灭活苗，盲传三代无明显CPE出现，而对照组FHM细胞出现空斑，个别细胞呈现葡萄状；实验组FHM细胞无变化，如图1所示。说明IHNV灭活苗灭活成功。
2.2、 ELISA检测卵黄抗体活性
⑴ 用紫外灯将酶标板照射4小时，然后马上加入0.025%戊二醛，100μL/孔、37℃过夜，洗涤液洗三次后备用；
⑵ 用PBS稀释IHNV毒液，100μL/孔、4℃包被过夜
⑶ 用洗涤液洗涤酶标板里的包被物三次后加入10%BSA，300μL/孔，28℃封闭4h。洗涤液是试剂盒里面自带的20倍浓缩洗涤液，现用现配避免出现假阳性。
⑷ 用洗涤液洗涤酶标板里的包被物三次后加入实施例1中制得的IHNV卵黄抗体（调整每份IHNV卵黄抗体浓度至50μg/mL），100μL/孔，28℃孵育2h。
⑸ 用洗涤液洗涤酶标板里的包被物三次后加1:1000的酶标兔抗鸡IgY抗体，100μL/孔，37℃孵育2h。
⑹ 用洗涤液洗涤酶标板里的包被物三次后加入TMB，100μL/孔，置于37℃避光显色15min。
⑺ 显色反应结束后马上加入终止液，50μL/孔。
⑻ 终止显色后立即进行吸光值测定，用空白对照孔调零，然后测定其他孔的OD450值。
ELISA检测结果如图2所示，其中sp-IgY表示通过试验组蛋鸡的高免蛋制得的IHNV卵黄抗体，PBS表示通过对照组蛋鸡的高免蛋制得的卵黄抗体；ELISA测定结果表明，终免完后第46天收集所得的IgY效价（即滴度）达到峰值，峰值处抗体以500μg/mL为初始浓度，其效价可以达到1:960。
2.3、免疫保护效果检测
健康虹鳟（35g±5g）分为三组，即卵黄抗体组、PBS组和空白组， 15℃暂养7天后，卵黄抗体组和PBS组虹鳟注射攻毒，空白组正常饲养，三组虹鳟饲养1天后，卵黄抗体组虹鳟按剂量0.2 mL/尾灌胃抗IHNV卵黄抗体，PBS组注射同样剂量的无菌PBS溶液，空白组注射同剂量的无菌生理盐水；在灌胃后的第1天随机从空白组、对照组和灌胃组中各取三尾鱼采血，血液4℃静置过夜，4000r/min 离心10 min，取上清置于-20℃保存备用，用于对比各组虹鳟血液的各项指标。正常饲养各组虹鳟，统计每日死亡数，计算各组死亡率以及相对保护率。相对保护率＝[1-（灌胃组死亡率/对照组死亡率）]。同时，攻毒后分别取濒死虹鳟的肝、脾、肾组织进行RT-PCR检测。
2.3.1相对免疫保护率
攻毒感染试验后，各组虹鳟发病死亡状况如图3所示。攻毒后第3天，PBS组虹鳟率先开始出现患病死亡，卵黄抗体灌胃组鱼体也先后出现相同的发病症状并死亡。患病鱼发病症状，与自然感染 IHNV病毒的发病症状相似。攻毒后14天，经计算卵黄抗体灌胃组的相对免疫保护率（RPS）为58%。
2.3.2 RT-PCR检测
从攻毒后死亡虹鳟组织提取RNS，多重RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，如图4所示，死亡虹鳟组织脾脏和肾脏位于1500 bp处均可见特异性的单一条带，与IHNV预期大小一致（IHNV预期扩增条带大小为1500 bp），而阴性对照泳道无明显条带。将扩增条带测序结果与Genbank中已知核酸序列进行Blast比对，结果显示该序列与Genbank中IHNV基因99%的同源性，说明死亡虹鳟是由感染IHNV而导致的死亡。
2.3.3血液指标
血清中的白蛋白在血液中有重要的生理功能，和维持血液正常渗透压有关，是血液总渗透压的主要调节物质。血清球蛋白具有免疫作用，参与鱼体的特异性免疫反应；血清总蛋白在肝脏中合成，当肝脏发生病变时，肝细胞合成蛋白质的功能会减弱，血清中的蛋白质的种类和量就会发生改变。如图5所示，检测空白组、攻毒后卵黄抗体组和PBS组虹鳟的血液参数，发现三组的总蛋白、球蛋白、白蛋白三种参数变化差异显著，空白组＞卵黄抗体组＞PBS组，说明IHNV可以导致虹鳟肝脏损伤，导致蛋白质合成功能下降，同时也表明IHNV卵黄抗体可以显著降低IHNV病毒对肝脏的损害，起到保护作用。
血清中酶类的变化反应了机体组织状况的变化，一般来说，酶浓度的变化常常由细胞坏死或者细胞膜通透性的改变所引起。谷草转氨酶(AST)与谷丙转氨酶(ALT)都是代谢活动中不可缺少的酶类。正常情况下，谷草转氨酶存在于细胞中，其中心肌细胞中含量最高，其次为肝脏，血清中含量极少。在肝脏中，谷草转氨酶(AST)主要存在于肝细胞的线粒体内，当肝脏发生严重坏死或破坏时，能引起谷草转氨酶在血清中浓度会偏高。而谷丙转氨酶(ALT)主要存在肝细胞的胞浆内，细胞内浓度比血清高很多，因此，血清谷丙转氨酶是最能反映肝细胞是否损伤的指标。碱性磷酸酶(AKP)是一种磷酸单酯酶，可催化磷酸单酯的水解反应及磷酸基团的转移反应，广泛存在于动物血液和各种器官内，尤其以骨骼肌、肝脏、肠黏膜含量最高。它能加速物质的摄取和转运，为ADP磷酸化形成ATP提供更多所需的无机磷酸，它直接参与磷酸代谢，并与DNA、RNA、蛋白质、脂质等代谢有关，对钙质吸取、骨骼形成、磷酸钙沉积等都有重要作用，已成为动物生理活动和疾病诊断的一项重要指标。通过检测三组虹鳟血清中的谷丙转氨酶和谷草转氨酶以及碱性磷酸酶，可以发现三组均呈现空白组>卵黄抗体组>PBS组的趋势，再次说明了IHNV感染能够损伤虹鳟肝脏，而IHNV卵黄抗体可以显著减少肝脏的损害程度，起到保护作用。
血液中的胆红素在肝脏的作用下随着胆汁的排泄下而被及时清除，当红细胞受到破坏或肝细胞功能异常时，能够引起血液中总胆红素的含量的升高。总胆汁酸是肝脏内以胆固醇为原料合成的一种有机酸，它的生成和代谢与肝脏有密切关系；因此血清中的胆汁酸是肝脏清除胆固醇的主要形式。血清总胆汁酸是可以反映肝脏细胞分泌、合成、肝细胞损伤状态的指标，因此当肝细胞损伤时会导致血清总胆汁酸浓度升高。血清中的糖分称为血糖，其主要成分为葡萄糖，鱼体各个器官、组织及细胞活动所需要的能量大多来自葡萄糖的分解，血糖必须维持在一定的水平才能保证鱼体的正常生理代谢。实验发现三组均呈现空白组＜卵黄抗体组＜PBS组的趋势。与空白组相比，IHNV感染虹鳟后总胆红素、总胆汁酸和葡萄糖都升高，说明虹鳟肝脏损伤严重，且鱼体不能正常维持的血糖水平，IHNV卵黄抗体能减少IHNV病毒对肝脏的损害，但是对肝脏的保护作用有限。
肌酐和尿素这两个指标是评价动物肾功能的重要指标。当机体发生肾小球病变，肾损伤可引起血液中尿素含量的增高，而肌酐能反映肾脏损害、肾小球滤过率等肾功能指标。实验发现两组均呈现空白组＜卵黄抗体组＜PBS组的趋势，IHNV感染后，虹鳟血清中肌酐和尿素含量短时间内显著增高，说明虹鳟肾脏受到损伤，与IHNV能破坏虹鳟造血组织的研究一致，IHNV卵黄抗体能减少IHNV病毒对肾脏的损害，对肾脏起到保护作用。
血液中的电解质平衡对鱼体血液凝固、神经传导、肌肉伸缩等活动均产生重要影响，是维持鱼体各组织细胞渗透压平衡的基础。测定实验鱼血清中各种离子的含量变化，能够准确的反映IHNV对虹鳟血清电解质的影响规律。实验发现五组均呈现空白组＜卵黄抗体组＜PBS组的趋势，IHNV感染后，虹鳟的钙、钾、氯、钠和磷升高，表明虹鳟不能维持自身渗透压平衡，同时IHNV卵黄抗体能降低IHNV对血液中电解质平衡的破坏作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.虹鳟抗传染性造血器官坏死病卵黄抗体的制备，其特征在于，包括如下步骤：
S1. IHNV灭活抗原制备：将IHNV毒液加入到FHM细胞中培养得到IHNV病毒液，并以β-丙内酯为灭活剂制得IHNV灭活抗原；
S2. 蛋鸡免疫：用S1制得的IHNV灭活抗原免疫蛋鸡；
S3.高免蛋卵黄收集：采集免疫后蛋鸡的鸡蛋得到高免蛋，高免蛋消毒晾干后采集卵黄，并剪破卵黄膜得到卵黄液；
S4. 卵黄抗体去脂提纯，包括如下步骤：
S4.1.卵黄抗体液提取：取S3步骤中得到的卵黄液，在卵黄液中加入生理盐水并搅拌，其中卵黄液和生理盐水的体积比为1：（0.8-1.2），将混合液室温静置后于3℃-6℃离心，收集上清液；
S4.2.去脂：取S4.1中得到的上清液，在上清液中加入氯仿并搅拌，其中上清液和氯仿的体积比为1：（0.9-1.1），将混合液于-30℃~-10℃静置，之后于3℃-6℃离心，收集上清液得到IgY提取液；
S4.3.初次沉淀提纯：取S4.2中得到的IgY提取液，在IgY提取液中加入饱和硫酸铵溶液并搅拌，其中IgY提取液和饱和硫酸铵溶液的体积比为（1.8~2.3）：1，将混合液于3℃-6℃静置，之后于3℃-6℃离心，分别收集上清液和沉淀；
S4.4.二次沉淀提纯：取S4.3中得到的上清液，在上清液中加入饱和硫酸铵溶液并搅拌，其中上清液和饱和硫酸铵溶液的体积比为（0.95~1.05）：1，将混合液将混合液于3℃-6℃静置，之后于3℃-6℃离心，弃上清，收集沉淀；
S4.5.重悬提纯：取S4.3和S4.4中得到的沉淀，加入PBS溶液重悬沉淀得到上清液，在所得上清液中缓慢加入缓慢饱和硫酸铵溶液并搅拌，其中上清液和饱和硫酸铵溶液的体积比为（1.8~2.3）：1，将混合液将于3℃-6℃静置，之后于3℃-6℃离心收集沉淀；
S4.6. 透析浓缩：用PBS溶液洗涤S4.5中得到的沉淀，之后加入PBS溶液重悬沉淀得到沉淀悬浊液，然后沉淀悬浊液经透析和浓缩后得到IHNV卵黄抗体。
2.根据权利要求1所述的虹鳟抗传染性造血器官坏死病卵黄抗体的制备，其特征在于：所述S1中IHNV灭活疫苗的制备具体过程为：
A1. FHM细胞复苏：将冻存的FHM细胞置于35℃-38℃下恒温水浴1-3min，然后再800-1000 r/min 离心4-6 min，去掉上清液，得到复苏的FHM细胞；
A2. FHM细胞基础培养：往A1步骤所得的FHM细胞中加入培养基，然后转移至培养瓶I中培养； 所述培养基中含有体积分数为8%-10%的FBS；
A3. FHM细胞扩大培养：待A2步骤中细胞长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗2-3次，然后取浓度为0.20%-0.30%的胰蛋白酶消化贴壁细胞，待1-2分钟后去掉胰蛋白酶；然后在细胞液中加入培养基，混匀之后将细胞液转入培养瓶II中，将培养瓶II置于25℃下培养；所述培养瓶II的生长面积是培养瓶I的3-4倍；所述培养基中含有体积分数为8%-10%的FBS；
A4. IHNV病毒培养：待A3步骤中FHM细胞在培养瓶II中长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗2-3次，然后加入IHNV毒液，13℃-17℃孵育1 h -2h；之后加入培养基维持液，13℃-17℃培养3-4天，收获IHNV病毒；所述培养基中含有体积分数为2%-5%的FBS；
A5. IHNV病毒提纯：将A4步骤得到的IHNV病毒液置于-80℃~-20℃下冻融，然后将病毒液4000~8000r/min离心10~15min，收集上清液得到IHNV活病毒液；
A6. IHNV病毒灭活：往A5步骤中得到的IHNV活病毒液中加入β-丙内酯，直至混合液中β-丙内酯的浓度为0.08-0.1%，3℃-5℃静置灭活，然后将灭活后的混合液置于36℃-37.5℃恒温水浴2h-2.5h水解β-丙内酯，最后将水解后的混合液经配制得到IHNV病毒灭活疫苗；其中，所述A1步骤取用的冻存FHM细胞、A2步骤加入的培养基、A3步骤加入的胰蛋白酶、A3步骤加入的培养基、A4步骤加入的培养基维持液的体积比为（1-1.5）：（4-6）：（0.2-1）：（4-6）：（11-13）。
3.根据权利要求1所述的虹鳟抗传染性造血器官坏死病卵黄抗体的制备，其特征在于：所述A2中蛋鸡免疫的具体过程为：用A1制得的IHNV灭活抗原免疫SPF级蛋鸡，共免疫四次，每相邻两次免疫的时间间隔为5-10天。
4.根据权利要求1所述的虹鳟抗传染性造血器官坏死病卵黄抗体的制备，其特征在于：所述的A3步骤中，鸡蛋消毒晾干的过程具体为：将鸡蛋置于新洁尔灭溶液中浸泡消毒，之后用酒精棉球擦拭鸡蛋表面，并将鸡蛋置于无菌环境中晾干。
5.根据权利要求1所述的虹鳟抗传染性造血器官坏死病卵黄抗体的制备，其特征在于：所述的A4.2中所加入的氯仿的纯度大于等于95%。
6.根据权利要求1所述的虹鳟抗传染性造血器官坏死病卵黄抗体的制备，其特征在于：所述的A6中沉淀悬浊液透析和浓缩的具体过程为：将悬浊液加入到透析袋内，并将透析袋放置在PBS液中透析，透析后用PEG20000对透析产物进行浓缩，得到IHNV卵黄抗体。
7.根据权利要求1所述的虹鳟抗传染性造血器官坏死病卵黄抗体的制备，其特征在于：所述A2中的蛋鸡为150-250日龄的罗曼粉鸡。
8.根据权利要求1所述的虹鳟抗传染性造血器官坏死病卵黄抗体的制备，其特征在于：所述A4.5和A4.6中使用的PBS溶液的pH值为7.3-7.5，浓度为0.009-0.011mol/L。
9.根据权利要求1-8任一项所述制备方法得到的抗传染性造血器官坏死病卵黄抗体在预防和治疗传染性造血器官坏死病的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109438575A (zh) * 2019-01-14 2019-03-08 浙江省淡水水产研究所 一种大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体
CN113122510A (zh) * 2021-04-12 2021-07-16 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 一种传染性造血器官坏死病疫苗及其病毒在胖头鱥肌肉细胞上扩增的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0665101A (ja) * 1992-08-12 1994-03-08 Nippon Nousan Kogyo Kk 特異抗体含有鶏卵による鮭鱒類ウイルス病の防除方法
CN103525767A (zh) * 2013-09-22 2014-01-22 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 抗ihnv单克隆抗体6g7及其制备与应用
CN103739708A (zh) * 2013-12-18 2014-04-23 北京市水产技术推广站 抗传染性造血器官坏死病毒的单克隆抗体及其应用
CN106749647A (zh) * 2016-02-18 2017-05-31 北京市农林科学院 鲑鳟鱼ihnv单克隆抗体及检测试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0665101A (ja) * 1992-08-12 1994-03-08 Nippon Nousan Kogyo Kk 特異抗体含有鶏卵による鮭鱒類ウイルス病の防除方法
CN103525767A (zh) * 2013-09-22 2014-01-22 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 抗ihnv单克隆抗体6g7及其制备与应用
CN103739708A (zh) * 2013-12-18 2014-04-23 北京市水产技术推广站 抗传染性造血器官坏死病毒的单克隆抗体及其应用
CN106749647A (zh) * 2016-02-18 2017-05-31 北京市农林科学院 鲑鳟鱼ihnv单克隆抗体及检测试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
郭鑫 主编: "《动物免疫学实验教程（第2版）》", 28 February 2017 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109438575A (zh) * 2019-01-14 2019-03-08 浙江省淡水水产研究所 一种大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体
CN109438575B (zh) * 2019-01-14 2021-07-06 浙江省淡水水产研究所 一种大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体
CN113122510A (zh) * 2021-04-12 2021-07-16 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 一种传染性造血器官坏死病疫苗及其病毒在胖头鱥肌肉细胞上扩增的方法

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