CN106749647A - 鲑鳟鱼ihnv单克隆抗体及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种单克隆抗体，其是由鲑鳟鱼IHNV免疫动物制得，并对IHNV N蛋白具有特异性。本发明还提供了鲑鳟鱼IHNV检测试剂盒及方法，以及所述单克隆抗体在制备诊断鲑鳟鱼IHNV的产品中的应用。本发明获得的IHNV单克隆抗体，该单克隆抗体特异性强，可以检测除了U型之外的国内J型鲑鳟鱼IHNV的感染；并且能够避免与其它弹状病毒发生交叉反应。克服了目前分子生物学对IHNV感染幼鱼的错检、漏检现象。本发明可直接通过荧光显微镜观察结果，操作简便、快速，成本费用低，普通实验室即可完成本操作，在鲑鳟鱼IHNV检测上具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于动物传染病病原微生物检测领域，涉及鲑鳟鱼IHNV单克隆抗体及检测试剂盒，用于快速、准确检测虹鳟鱼传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)感染。
技术背景
传染性造血器官坏死病是一种能够引起鲑鱼、鳟鱼等鲑科鱼类急性传染病。是由传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)引起的，属于弹状病毒科成员。本病发病特征主要以肾脏和脾脏等造血器官坏死为主，主要传播途径是患病鱼类或者是感染病毒鱼卵的进出口。该病最早流行于美国西北太平洋地区，随后传遍整个北美、亚洲和欧洲。1985年，IHNV病毒进入我国东北境内，并在辽宁本溪市大规模爆发流行。近几年，在河北、甘肃、深圳和北京等养殖场也检测到了IHNV，并给当地的冷水养殖业造成严重的经济损失。IHNV主要危害刚孵育的鱼苗到四周龄的鲑科幼鱼，感染后死亡率可达到70％-90％，目前已成为制约虹鳟鱼养殖业发展的重要威胁并被世界动物卫生组织(OIE)列为必报动物疫病，为鱼类进出口第一类检疫对象，我国列为第二类动物疫病。由于病毒病尚无有效的治疗方法，因此，病毒性疾病的早期快速检测对控制该病的爆发流行至关重要。目前，对虹鳟鱼感染IHNV检测的方法主要有细胞培养技术、RT-PCR技术、ELISA检测技术、斑点杂交技术和原位杂交技术等，这些检测技术中有些技术的应用明显缩短了检测时间，有些提高了检测结果的准确性。但他们本身也存在着不可逾越的缺陷。例如，细胞培养和RT-PCR技术耗时耗力、表达的N蛋白和G蛋白荧光抗体技术由于表达蛋白的免疫原性不稳定、易与弹状病毒中其他病毒发生交叉反应、养殖场实验设备满足不了检测需求等因素造成错检、漏检、延检、检出率低等现象。目前，尚无对虹鳟鱼IHNV免疫荧光检测方法的报道，应用鲑鳟鱼IHNV的特异性单克隆抗体的免疫荧光检测方法也未见报道。而针对虹鳟鱼IHNV制备高质量的抗体、制备高质量的抗体、提高检测的特异性、提高检出率、缩短繁琐的检测步骤是本研究的研发关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鲑鳟鱼IHNV单克隆抗体，可用于检测鲑鳟鱼IHNV。
本发明的另一目的在于提供用该抗体制备的检测试剂或试剂盒，以及检测鲑鳟鱼IHNV的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
在本发明的第一方面，本发明首先提供一种单克隆抗体，其是由鲑鳟鱼IHNV免疫动物制得，并对IHNV N蛋白具有特异性反应。其次，本发明提供分泌所述单克隆抗体的单克隆细胞株。所述单克隆细胞株为抗传染性造血器官坏死病毒N蛋白杂交瘤细胞株5D5，保藏号为：CGMCC No.13595(保藏日期为2017年2月6日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)。
本发明的第二方面，提供一种鲑鳟鱼IHNV检测试剂及检测试剂盒，其包含上述所述的单克隆抗体。
优选地，所述的检测试剂盒还包括细胞培养板、FITC二抗、稀释液和阴性对照中的一种或多种。
优选地，所述阴性对照为未接种病毒的EPC细胞培养物。
优选地，所述FITC二抗为FITC标记兔抗鼠IgG。
本发明的第三方面，提供一种检测鲑鳟鱼IHNV的方法，该方法用上述的试剂盒采用免疫荧光法检测样品中的IHNV抗原。具体地：
在96孔培养板上制备单层EPC细胞，按照病毒与细胞液接种的比例1:10—1:200接毒，其中以1:50—1：70接毒最优，设立不接毒的细胞为阴性对照。
以50％—80％丙酮和60％—100％乙醇作为固定液，以5—30min为固定时间，其中以70％丙酮固定10min效果最好。
用PBS将IHNV单克隆抗体按照1:100—1:10000进行稀释，FITC标记兔抗鼠IgG稀释度在1:100—1:10000，经验证，IHNV阳性血清稀释度在1:100—1:2000均可见明亮的特异性荧光，在1:5000稀释时可见较弱的特异性荧光，其中以1:1000倍稀释为最优。FITC标记兔抗鼠IgG稀释度在1:200—1:1000均可见特异性荧光，其中以1:500时最好。
本发明的第四方面，提供制备所述抗体的方法，该方法是以纯化的U型虹鳟鱼传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)免疫小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术获得杂交瘤细胞株，筛选分泌稳定，对IHNV N蛋白具有特异性的杂交瘤细胞株，培养筛选的杂交瘤细胞株，并分离获得抗体。
再一方面，本发明提供所述单克隆抗体在制备诊断鲑鳟鱼IHNV的产品中的应用。
本发明的单克隆抗体不限于用于免疫荧光检测法，还可用于诸如酶联免疫检测法、放射免疫分析法、免疫电泳、免疫印迹等等，以及相应的检测试剂或试剂盒。
本发明试剂盒还可以检测J型鲑鳟鱼IHNV感染的EPC细胞。
本发明用弹状病毒科的其它两种病毒性出血性败血症病毒(VHSV)和牙鲆弹状病毒(HRV)感染细胞，进行同IHNV免疫荧光检测相同的试验，经观察这两种病毒感染的细胞均无荧光，从而确定所建立的免疫荧光检测方法的特异性。
与现有技术相比，本发明有以下优点：
本发明获得的IHNV单克隆抗体，尤其是获得的单抗是针对IHNV N蛋白特异性单克隆抗体未见文献报道，经过多次试验，得到稳定性满足进一步检测IHNV病原的要求，经验证该单克隆抗体特异性强，可以检测除了U型之外的国内J型鲑鳟鱼IHNV的感染；并且能够避免与其它弹状病毒发生交叉反应。克服了目前分子生物学对IHNV感染幼鱼的错检、漏检现象。
本发明阴性对照明显，可直接通过荧光显微镜观察结果，操作简便，成本费用低，普通实验室即可完成本操作。
附图说明
图1是EPC细胞病变观察图(×100)，图A为正常EPC细胞，图B为感染IHNV后60小时的EPC细胞。
图2是4株杂交瘤细胞株上清与纯化IHNV的Western-Blotting检测结果。
图3是间接免疫荧光检测图(×200)，图A为接种U型IHNV的EPC细胞，图B未接种IHNV的EPC细胞。
图4是接种J型IHNV的间接免疫荧光检测图(×100)。
生物材料保藏信息：
1、抗传染性造血器官坏死病毒N蛋白杂交瘤细胞株5D5，保藏号为：CGMCCNo.13595，保藏日期为2017年2月6日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
2、传染性造血器官坏死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)IHNV-BJLL株，保藏号：CGMCC No.13594，保藏日期为2017年2月6日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。这些实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。
实施例1单克隆抗体的制备
1、病毒获得
本发明所用病毒为U型虹鳟鱼传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)，2012年于北京某渔场分离到该病毒株。该病毒株已于2017年2月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为传染性造血器官坏死病毒(Infectious haematopoieticnecrosis virus,IHNV)IHNV-BJLL株，保藏号：CGMCC No.13594(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。)。此基因型IHNV病毒在国内尚属首例，据报道国内IHNV分离株都为J型。
2、病毒制备
取鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)，加入含10％新生胎牛血清、1％青、链霉素的M199培养基，放在25℃生化培养箱培养，长成单层后备用。待细胞长成单层后，将IHNV种毒用199培养基按照1:50—1：70倍稀释接种细胞，于15℃生化培养箱中感作1h，然后补足培养基，此维持液中的血清终浓度为2％。置于15℃生化培养箱中继续培养，每日观察细胞病变的时间以及病变的程度，在80％细胞发生病变时将细胞瓶冻存于-20℃，共收获病毒液400mL。
2.2病毒纯化
通过常规的病毒浓缩和纯化方法将400mL病毒液进行浓缩和纯化。首先，经1000×g,2000×g,8000×g离心30min，取上清；接着沉淀用10mLPBS悬起，经超声裂解，8000×g离心30min取上清；最后将上清用90000×g超离20h取沉淀，即为纯化病毒。
3、单抗制备
用纯化病毒免疫小鼠，制备单抗。实验步骤表1：
表1免疫和制备单抗实验步骤
3.1 ELISA鉴定免疫小鼠产生抗体的情况
将收获病毒培养物，反复冻融三次，8000rpm，离心10min，取上清，每孔100μL，加于微量反应板，同时将未接种病毒的EPC细胞培养物，每孔100μL加于微量反应板作为阴性对照，4℃过夜包被，PBST洗涤后，以每孔200μL加入0.5％脱脂乳封闭液，37℃封闭2.5h，PBST洗涤，将鼠抗IHNV阳性血清与鼠阴性血清分别以1:1000,1:2000,1:4000,1:8000,1:16000,1:32000稀释作为一抗每孔100μL加于微量反应板，37℃作用60min PBST洗涤，加入酶标二抗，37℃作用60min，PBST洗涤，加入新配制的底物显色液每100μL，室温避光显色10-15min，2mo1/L H2SO4每孔50μL终止反应，酶标检测仪测定OD450nm值，以IHNV包被孔阳性血清孔值/阴性血清孔值大于2，同时IHNV包被孔OD450nm值/正常EPC细胞培养液阴性对照包被孔OD450nm值大于2，判定此次免疫的小鼠可用于细胞融合。用离心后的IHNV细胞培养液包被ELISA平板，根据阳性血清孔的OD450nm值接近1.0，阴性血清OD450nm＜0.2，P/N＞2，结果显示小鼠产生抗体的效价为1:8000，说明小鼠可用于细胞融合。
3.2骨髓瘤细胞的准备、饲养细胞的制备、脾淋巴细胞的准备、脾淋巴细胞的准备、细胞融合以及融合细胞的培养和筛选按照常规方法进行。
3.3杂交瘤细胞株建立和分泌抗体的稳定性
经过多次克隆和筛选获得了4株分泌单抗杂交瘤，分别为5D5、1F10、3C4、3C8，连续传代和冻存复苏后细胞上清原液测得的OD450nm值均明显高于SP2/0值。
结果表明，体外连续传代培养2个月及冻存后复苏均不影响抗体的分泌。说明这4株杂交瘤细胞都具有稳定分泌特异性单克隆抗体的能力。
3.4单克隆抗体的大量制备及效价测定
将筛选出的4株阳性杂交瘤细胞5D5、1F10、3C4、3C8于培养瓶中扩大培养，收集培养上清液，检测上清抗体效价，-80℃保存备用。腹水抗体的制备，将BALB/c小鼠预先用液体石蜡致敏，腹腔注射0.3mL液体石蜡，10d后注射约1×105个杂交瘤细胞，观察小鼠状态，待小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，500×g离心10min，取上清液，取少量腹水检测抗体效价，以SP2/0腹水以作为阴性对照。将腹水分别做1:101、1:102、1:103、1:104、1:105稀释，进行间接ELISA检测,每孔100μL，进行滴度的测定，酶标仪读取OD450nm。5D5、1F10、3C4、3C8分泌单抗的杂交瘤腹水抗体ELISA效价分别为1:105、1:104、1:104、1:104，进一步说明这4株杂交瘤细胞都具有稳定分泌特异性单克隆抗体的能力。
3.5 Western blot分析
用杂交瘤细胞株细胞培养上清为一抗与纯化IHNV病毒进行Western blot检测，结果表明，4株单抗反应后均可在约43KD出现反应带，与IHNV病毒N蛋白大小相符，说明所制备的单抗是针对IHNV病毒N蛋白的特异性单抗。
3.6单克隆细胞株的保藏
选择综合性能显著优于其他单抗的单克隆细胞株5D5进行保藏，保藏号为：CGMCCNo.13595。以下实验如无特别说明均是采用该细胞株分泌的单抗。
实施例2免疫荧光检测的建立
1、检测样品的制备
1.1 IHNV接种EPC细胞
25℃培养EPC细胞，当细胞长成单层且长满90％时，按照IHNV病毒与细胞液接种的比例1:50—1：70倍稀释接毒最优，当细胞病变达到50％左右时即可固定细胞，用于下一步检测。同时设立阴性对照。1.2固定液和固定时间的确定
分别以50％，60％，70％，80％的丙酮和60％，70％，80％，90％，100％的乙醇作为固定液，分别采用5min，10min，15min，20min，25min，30min作为固定时间，观察细胞固定效果。以有无细胞脱落以及特异性荧光的强弱和清晰度确定最优的固定条件。结果表明80％的丙酮固定时间超过5min时就会腐蚀细胞版，70％丙酮固定10min和90％乙醇固定30min的效果很好，无显出差异。又由于丙酮固定病毒抗原的抗原性保持时间比乙醇长，因此，本发明选用70％丙酮固定10min作为最佳固定条件。
2、IHNV免疫荧光检测方法的建立
2.1 IHNV单抗和FITC兔抗鼠IgG工作浓度和工作时间的优化
采用上述确定的固定细胞的条件固定细胞培养板，将IHNV单抗分别以1:100,1:200,1:500，1:1000，1:2000，1：5000，1：10000进行稀释，将FITC兔抗鼠IgG以1:500作为工作浓度。每个稀释度又分别以37℃作用15min，30min，45min，60min作为作用时间，观察不同条件对实验结果的影响，选择最优的IHNV单抗工作浓度和工作时间。同样的方法将FITC兔抗鼠IgG以1:100,1:200,1:500,1:1000，1:2000,1:5000，1：10000进行稀释，IHNV单抗以1:1000作为工作浓度，对于每个稀释度又分别以37℃作用15min，30min，45min，60min作为作用时间。观察荧光二抗在不同浓度和不同作用时间下对实验结果的影响，从而选择最佳的稀释度和最佳的工作时间。镜检观察结果显示IHNV单抗稀释度在1:100—1:2000，工作时间在30mim时，可以获得较好的荧光信号和信号强度，当稀释度在1:5000时，携带荧光的细胞以及信号强度相对较弱。当延长作用时间时，非特异性荧光信号较强，容易出现假阳性。因此，本发明将IHNV单抗的稀释度定位在1:1000，工作条件为37℃作用30min。FITC兔抗鼠IgG的稀释度在1:200—1:1000，工作时间30min，45min，60min时均可以得到明亮的特异性荧光，二抗浓度过高会增加非特异性荧光信号强度，造成误判。其中以二抗稀释度1:500，工作条件为37℃作用30min所得效果最佳。
2.2国内其它基因型分离株的免疫荧光检测
用J型IHNV分离株接种EPC细胞，随后按照优化好的IHNV单抗和FITC兔抗鼠IgG浓度进行同IHNV免疫荧光检测相同的试验，观察与IHNV单抗和FITC兔抗鼠IgG的特异性免疫反应，从而确定该方法的广泛适用性。镜检结果表明，J型IHNV分离株也能够与IHNV单抗发生反应，有特异性荧光信号产生，从而证实了该检测方法在不同基因型IHNV之间具有很好的适应性。
2.3特异性检测
分别用VHSV和HRV病毒接种EPC细胞，随后按照优化好的IHNV单抗和FITC兔抗鼠IgG浓度进行同IHNV免疫荧光检测相同的试验，观察这两种病毒与IHNV单抗和FITC兔抗鼠IgG有无特异性免疫反应，即有无特异性荧光，从而确定该方法的特异性。镜检结果表明，这两种病毒并不与IHNV单抗发生交叉反应，也即无特异性荧光信号产生，从而证实了该检测方法具有很高的特异性。
2.4阴性对照
正常EPC细胞，一抗用IHNV单抗，二抗用FITC兔抗鼠IgG进行免疫荧光检测。镜检均无荧光信号，表明阴性对照成立。
实施例3试剂盒的组成及使用
3.1 IHNV免疫荧光检测试剂盒包括的成分如下：
细胞培养板；
IHNV N蛋白特异性单克隆抗体；
酶标二抗：FITC标记的兔抗鼠IgG；
洗涤液：PBST
阳性标准品：接种了IHNV的鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma Papulosum Cyprini，EPC)(经70％丙酮固定)；
阴性标准品：未经接种IHNV的鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma PapulosumCyprini，EPC)(经70％丙酮固定)。
3.2 IHNV免疫荧光检测试剂盒的使用方法：
(1)取出细胞培养板，培养鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)；25℃培养EPC细胞，当细胞长成单层且长满90％时，按照1:50—1：70比例稀释无菌处理的待检物，当细胞病变达到50％左右(一般不超过72h)时即可固定细胞，用于下一步检测。
(3)用预冷的70％丙酮轻轻漂洗细胞3次。然后加入固定液，固定液的体积要以全部覆盖细胞为好，室温固定10min。
(4)缓慢弃固定液，室温自然干燥30min。如不立即使用可置于-20℃存放待用。
(5)取出试剂盒中的阴、阳性对照，以下步骤和检测样品同时进行。用PBST缓慢漂洗细胞4次。
(6)彻底弃除PBST，用PBST将IHNV单克隆抗体稀释1000倍，加至细胞上，单抗的体积要以全部覆盖细胞为好，37℃作用30min。
(7)用PBST缓慢漂洗细胞4次。
(8)彻底弃除PBST，加入500倍稀释的FITC标记的兔抗鼠IgG，置于湿盒内，37℃作用30min。
(9)用PBST缓慢漂洗4次。
(10)直接将细胞培养板置于荧光显微镜下观察结果。
3.3结果判定
阳性对照组可见清晰的绿色荧光。阴性对照组没有任何荧光或仅有微弱绿色背景荧光，则试验成立。若被检样品组可见清晰的绿色荧光，则判定为阳性；若被检样品组没有任何荧光或仅有微弱绿色背景荧光，则判定为阴性。
如果阳性对照组未见清晰的绿色荧光，或阴性对照组出现异常绿色荧光，则试验不成立。
Claims (10)
1.一种单克隆抗体，其是由鲑鳟鱼IHNV免疫动物制得，并对IHNV N蛋白具有特异性。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其是由抗传染性造血器官坏死病毒N蛋白杂交瘤细胞株5D5分泌获得，保藏号为：CGMCC No.13595。
3.产生权利要求1所述单克隆抗体的单克隆细胞株。
4.根据权利要求3所述的单克隆细胞株，其是抗传染性造血器官坏死病毒N蛋白杂交瘤细胞株5D5，保藏号为：CGMCC No.13595。
5.一种鲑鳟鱼IHNV检测试剂，其包含权利要求1或2所述的单克隆抗体。
6.一种鲑鳟鱼IHNV免疫荧光检测试剂盒，其包含权利要求1或2所述的单克隆抗体，优选其还包括细胞培养板、FITC二抗、稀释液和阴性对照中的一种或多种，优选，所述阴性对照为未接种病毒的EPC细胞。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述FITC二抗为FITC标记兔抗鼠IgG。
8.一种检测鲑鳟鱼IHNV的方法，该方法用权利要求6或7所述的试剂盒采用免疫荧光法检测样品中的IHNV抗原。
9.制备权利要求1所述抗体的方法，该方法是以纯化的U型虹鳟鱼传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)免疫小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术获得杂交瘤细胞株，筛选分泌稳定，对IHNV N蛋白具有特异性的杂交瘤细胞株，培养筛选的杂交瘤细胞株，并分离获得抗体。
10.权利要求1或2所述单克隆抗体在制备诊断鲑鳟鱼IHNV的产品中的应用。
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