CN101893631B

CN101893631B - 南芥菜花叶病毒的检测方法及专用试剂盒

Info

Publication number: CN101893631B
Application number: CN 201010220136
Authority: CN
Inventors: 李桂芬; 魏梅生; 马洁; 朱水芳
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2010-06-28
Filing date: 2010-06-28
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2030-06-28
Also published as: CN101893631A

Abstract

本发明公开了一种南芥菜花叶病毒的检测方法及专用试剂盒。该酶联免疫试剂盒包括用于包被的抗体A，用于检测的抗体B，作为阳性对照的抗体C和用于显色的酶标抗体；所述抗体A为动物Ⅰ来源的抗目标物质的抗体，所述抗体B为动物Ⅱ来源的抗目标物质的抗体，所述抗体C为抗所述抗体A的抗体且与酶标抗体相互作用。本发明的试剂盒中，山羊抗小鼠多克隆抗体能够起到很好的阳性对照作用，与感染南芥菜花叶病毒的昆藜10倍稀释病叶的读数相当，可监控整个酶联反应体系是否正常工作，替代具有侵染性的南芥菜花叶病毒作为阳性对照，避免检疫性病毒扩散到环境中去，无污染无危害。

Description

南芥菜花叶病毒的检测方法及专用试剂盒

技术领域

本发明涉及一种南芥菜花叶病毒的检测方法及专用试剂盒。

背景技术

目前植物病毒的检测方法主要包括生物学、血清学和分子生物学方法。其中血清学方法中的酶联方法由于其简单、重复性好、一次可处理多个样品而在植物病毒的检测中起到重要作用，在实际的植物病毒检测中应用广泛。酶联试剂盒中必须要提供阳性对照，而传统的阳性对照是采用某种植物病毒的感染叶片制成，如果不经过灭活处理，就有可能释放到环境中，对农作物造成影响，对于检疫性植物病毒如南芥菜花叶病毒等，具有侵染性的对照更是不允许释放到环境中的。而经过灭活处理后的对照一般不易获得。因此，需要发明一种安全的检测方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于检测样品中是否含有目标物质的酶联免疫试剂盒。

本发明所提供的用于检测样品中是否含有目标物质的酶联免疫试剂盒，包括用于包被的抗体A，用于检测的抗体B，作为阳性对照的抗体C和用于显色的酶标抗体；所述抗体A为动物Ⅰ来源的抗目标物质的抗体，所述抗体B为动物Ⅱ来源的抗目标物质的抗体，所述抗体C为抗所述抗体A的抗体；动物Ⅰ和动物Ⅱ为不同物种的动物。

上述任一所述酶联免疫试剂盒中，所述酶标抗体为酶标抗体D和酶标抗体E，所述抗体D为抗所述抗体B的抗体，所述抗体E为抗所述抗体D的抗体；所述抗体D为抗所述抗体C的抗体。

上述任一所述酶联免疫试剂盒中，所述酶标抗体为酶标抗体D和酶标抗体E，所述抗体D为抗所述抗体B的抗体，所述抗体E为抗所述抗体D的抗体，所述抗体D为抗所述抗体E的抗体；所述抗体E为抗所述抗体C的抗体。

上述任一所述酶联免疫试剂盒中，所述抗体A为小鼠来源的抗目标物质的抗体，所述抗体B为兔来源的抗目标物质的抗体，所述抗体C为山羊抗小鼠多克隆抗体，所述抗体D为山羊抗兔抗体，所述抗体E为兔抗山羊抗体。

上述任一所述酶联免疫试剂盒中，所述目标物质为植物病毒、植物细菌或植物真菌。

上述任一所述酶联免疫试剂盒中，所述植物病毒为南芥菜花叶病毒；所述抗体A为分泌抗南芥菜花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株4G10 CGMCC No.3672分泌的单克隆抗体，所述抗体B为兔来源的抗南芥菜花叶病毒的多克隆抗体。

所述杂交瘤细胞株4G10 CGMCC No.3672分泌的单克隆抗体是通过体外培养所述杂交瘤细胞株4G10 CGMCC No.3672得到的。

上述任一所述酶联免疫试剂盒中，所述试剂盒中包括包被缓冲液、样品抽提缓冲液、酶标抗体稀释缓冲液、洗涤缓冲液、底物溶液；

每1升所述包被缓冲液按照如下方法配制：将碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g和叠氮化钠0.20g溶于水，用水定容至1L；包被缓冲液的ρH值为9.6；

每1升所述洗涤缓冲液(PBST)按照如下方法配制：将氯化钠8.0g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠1.15g，氯化钾0.2g，吐温200.5mL，叠氮化钠0.2g溶于水中，用水定容至1L；所述洗涤缓冲液的ρH值为7.4；

每1升所述样品抽提缓冲液按照如下方法配制：将亚硫酸钠1.3g和聚乙烯基吡咯烷酮20g溶于PBST中，用PBST缓冲液定容至1L；

每1升所述酶标抗体稀释缓冲液按照如下方法配制：将聚乙烯基吡咯烷酮20g和牛血清白蛋白2g溶于洗涤缓冲液中，用洗涤缓冲液定容至1L；

每1升所述底物溶液按照如下方法配制：将二乙醇胺97mL和对硝基苯磷酸二钠(现配现用)1g溶于水中，调节ρH值至9.8，然后用水定容至1L；

所述酶标抗体中的酶是碱性磷酸酯酶。

本发明的最后一个目的是提供一种检测样品中是否含有目标植物病毒的方法。

本发明所提供的检测样品中是否含有目标植物病毒的方法，包括如下步骤：用上述任一所述酶联免疫试剂盒对待测样品进行检测。

上述方法中，在进行所述检测前，包括如下样品前处理的步骤：所述待测样品为植物组织，将所述植物组织与所述样品抽提缓冲液混合，得到混合物Ⅰ；将所述混合物磨碎，得到混合物Ⅱ，即为待检测液体。所述植物组织具体为植物叶片。

保藏编号为CGMCC No.3672的分泌抗南芥菜花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株4G10也属于本发明的保护范围。

由分泌抗南芥菜花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株4G10 CGMCC No.3672分泌得到的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。

本发明的试剂盒中，所用水均为蒸馏水。

本发明的试剂盒中，山羊抗鼠多克隆抗体能够起到很好的阳性对照作用，与感染南芥菜花叶病毒的昆藜10倍稀释病叶的读数相当，可监控整个酶联反应体系是否正常工作，替代具有侵染性的南芥菜花叶病毒作为阳性对照，避免南芥菜花病毒扩散到环境中去，无污染无危害。本发明的试剂盒中，2种互为抗原抗体的酶标抗体同时应用能够增强酶联反应的强度，在不增加本底反应的情况下，减少了假阴性反应的发生。本增强型三抗体夹心法可应用于以单克隆抗体为包被抗体、多克隆抗体为检测抗体的植物病毒、植物细菌、植物真菌等的检测。

附图说明

图1为本发明的原理示意图。

小鼠抗ArMV单克隆抗体：

兔抗山羊多克隆抗体：

山羊抗兔多克隆抗体：

兔抗ArMV多克隆抗体：

碱性磷酸酯酶：

ArMV病毒：

山羊抗小鼠多克隆抗体：

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、试剂盒的组成及制备

一、组成

1、由杂交瘤细胞株4G10 CGMCC No.3672分泌的单克隆抗体；

2、兔来源的抗南芥菜花叶病毒的多克隆抗体(即南芥菜花叶病毒兔多克隆抗体)购自美国ACD公司；

3、碱性磷酸酯酶标记的兔抗山羊抗体和碱性磷酸酯酶标记的山羊抗兔抗体均购自中山金桥公司。

4、山羊抗小鼠抗体(即山羊抗小鼠多克隆抗体)购自北京欣经科生物技术有限公司。

5、包被缓冲液：碳酸钠(Na₂CO₃)1.59g，碳酸氢钠(NaHCO₃)2.93g，叠氮化钠(NaN₃)0.20g，用蒸馏水定容至1L；ρH值为9.6、4℃储存。

6、洗涤缓冲液：氯化钠(NaCl)8.0g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1.15g，氯化钾(KCl)0.2g，吐温20(Tween-20)0.5mL，叠氮化钠(NaN₃)0.2g，用蒸馏水定容至1L；ρH值为7.4。

7、样品抽提缓冲液：亚硫酸钠(Na₂SO₃)1.3g，聚乙烯基吡咯烷酮(PVP，MV24000～40000)20g，用洗液(PBST)定容至1L。4℃储存。

8、酶标抗体稀释缓冲液：聚乙烯基吡咯烷酮(PVP，MV24000～40000)20g，牛血清白蛋白(BSA)2g，用洗涤缓冲液(PBST)定容至1L。4℃储存。

9、底物溶液：二乙醇胺(C₄H₁₁NO₂)97mL，硝基苯磷酸二钠1g，蒸馏水(H₂O)600mL，用盐酸(HCl)调ρH值至9.8，然后用蒸馏水定容至1L。4℃储存。

二、由杂交瘤细胞株4G10分泌的单克隆抗体的制备

1.毒源：南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus)：购自ATCC，编号为PV-192。

2.病毒繁殖与纯化：将南芥菜花叶病毒毒源接种在昆藜上，放于隔离温室中培养。接种后14天左右采收系统侵染的叶片进行纯化。100g叶片加200ml 0.05M的磷酸钠缓冲液(ρH8.0，含0.2％巯基乙醇)，匀浆，低速离心(8000rpm，10min)。上清加盐酸调ρH值到5.0，4℃过夜。低速离心(8000rpm，10min)。上清加NaCl至1％(W/V)，PEG6000至8％(W/V)，4℃搅拌4小时。离心(10000rpm，30min)。取沉淀用0.05M柠檬酸钠缓冲液(ρH7.0)悬浮，冰箱搅拌过夜。离心(8000rpm，10min)。上清离心(33000rpm，4h)，取沉淀悬浮在0.05M柠檬酸钠缓冲液中，离心(8000rpm，10min)，上清即为粗提纯的南芥菜花叶病毒制剂。

3.小鼠免疫

将纯化的南芥菜花叶病毒粒子在与其同体积的福氏完全佐剂中乳化，乳化后对8周龄的BALB/c小鼠做腹腔注射，每只小鼠60μg纯化病毒。2周后，将纯化的南芥菜花叶病毒粒子在与其同体积的福氏不完全佐剂中乳化作第二次腹腔注射，每只小鼠60μg纯化病毒。3周后第三次免疫小鼠(同第二次)。融合前3d加强免疫，加强免疫是采用100μg纯化病毒直接注射小鼠腹腔。

4.细胞融合

将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合，将融合后的细胞离心800rpm，8min，弃上清，用37℃水浴预热的含HAT培养液重新悬浮。加入有饲养细胞的培养板中，100μL/孔，置二氧化碳培养箱中培养(37℃，5％CO₂，饱和湿度)。

5.杂交瘤细胞的培养与筛选

5.1杂交瘤细胞的培养：每天观察细胞的生长情况，融合后4～5d，可见有杂交瘤细胞生长，注意其形态、活力及分布，待杂交瘤细胞生长至培养孔的1/3～1/2时，取其上清用间接ELISA方法进行检测，对检测出特异性抗体阳性孔的细胞，用有限稀释法克隆3次，使阳性率达100％，及时冻存细胞，然后扩大培养以制备腹水，观察其抗体分泌情况。

5.2杂交瘤细胞的筛选：采用间接ELISA方法测定。具体方法为：①用纯化病毒4μg/mL的浓度包被酶标板，37℃孵育2h，洗酶标板。②用含2％小牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液封板，37℃孵育30min，洗酶标板。③无菌操作下吸取被检测细胞孔中培养上清，加入到酶标板中，37℃孵育2h，洗酶标板。④加入1∶1000稀释的碱性磷酸酯酶标记的马抗小鼠抗体，37℃，孵育2h。洗酶标板。⑤加入底物溶液，37℃避光放置，待颜色合适时读数。

经间接ELISA法筛选，3次亚克隆化获得了能稳定分泌抗南芥菜花叶病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(4G10)。

该杂交瘤细胞株为4G10，该细胞株已于2010年3月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.3672，分类命名为分泌抗南芥菜花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

6.增量培养法制备单抗

将杂交瘤细胞株置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用G蛋白柱(GE公司)对培养液中抗体进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向DMEM培养基中添加胎牛血清和碳酸氢钠，使胎牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(v/v)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％；所述细胞培养基的ρH为7.4。

7.单克隆抗体生物学特性的鉴定

7.1抗体类型及亚类的鉴定：用4G10细胞株培养上清进行检测，按照单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(Sigma公司)说明书进行。结果由4G10细胞株分泌的单克隆抗体为IgG1亚类。

7.2抗体效价的测定：将按照增量培养法获得的细胞上清进行一定比例稀释，用间接ELISA方法测定(具体酶联方法见1.5.2杂交瘤细胞的筛选)。结果：4G10单抗的效价为1∶10⁵。

7.3抗体特异性测定：采用间接ELISA方法测定(具体操作步骤同5.2)。

烟草环斑病毒购自ATCC，产品目录号为PV-125；番茄环斑病毒购自ATCC，产品目录号为PV-239。

昆藜健康叶片在文献(李桂芬，马洁，魏梅生等，番茄环斑病毒单克隆抗体的制备及检测，植物检疫，2009年第6期，16-18页)中公开过，公众可从中国检验检疫科学研究院获得。

番杏健康叶片在文献(李桂芬，马洁，魏梅生等，番茄环斑病毒单克隆抗体的制备及检测，植物检疫，2009年第6期，16-18页)中公开过，公众可从中国检验检疫科学研究院获得。

白肋烟健康叶片在文献(李桂芬，朱水芳、周群等，侵染紫松果菊的黄瓜花叶病毒分离物的鉴定，植物保护，2007年第1期，54-56页)中公开过，公众可从中国检验检疫科学研究院获得。

将番茄环斑病毒毒源接种在番杏上，放于隔离温室中培养。接种后14天左右采收系统侵染的叶片进行纯化。100g病叶片加250ml 0.05M的磷酸钠缓冲液(ρH7.5，含0.2％巯基乙醇)，匀浆，低速离心(8000rpm，10min)，弃沉淀。上清加NaCl至3％(W/V)，PEG6000至8％(W/V)，TritonX-100至1％(V/V)，4℃冰箱搅拌4小时。离心(10000rpm，30min)，弃上清。取沉淀用0.01M磷酸钠缓冲液(ρH7.5)悬浮，4℃冰箱搅拌过夜。离心(7000rpm，10min)，弃沉淀。上清离心(30000rpm，4.5h)，弃上清，取沉淀悬浮在0.01M磷酸钠缓冲液中搅拌2h。离心(7000rpm，10min)，弃沉淀，上清即为粗提纯的番茄环斑病毒制剂。

烟草环斑病毒的纯化方法为：将烟草环斑病毒(PV-125)接种在白肋烟上，接种后约14天采收系统侵染的病叶进行纯化。100g病叶片加200ml0.5M硼酸钠缓冲液(ρH8.4，含0.2％巯基乙醇)，匀浆，低速离心(8000rpm，10min)，弃沉淀。上清加NaCl至3％(W/V)，PEG6000至8％(W/V)，TritonX-100至1％(V/V)，4℃冰箱搅拌4小时。离心(10000rpm，30min)，弃上清。取沉淀用0.01M硼酸钠缓冲液(ρH8.4)悬浮，4℃冰箱搅拌过夜。离心(8000rpm，10min)，弃沉淀。上清离心(30000rpm，4.5h)，弃上清，取沉淀悬浮在0.01M硼酸钠缓冲液中搅拌2h。离心(6000rpm，10min)，弃沉淀，上清即为粗提纯的烟草环斑病毒制剂。

特异性检测结果：实验设3次重复，结果取平均值。结果如表1所示。结果显示本发明试剂盒不与番茄环斑病毒、烟草环斑病毒反应。因此本发明试剂盒特异性好。

表1.单克隆抗体的特异性

处理	OD_405nm值
		纯化南芥菜花叶病毒(4ug/ml)	2.540
纯化番茄环斑病毒(4ug/ml)	0.077
		纯化烟草环斑病毒(4ug/ml)	0.081

昆藜健康叶片10倍稀释	0.082
		番杏健康叶片10倍稀释	0.083
白肋烟健康叶片10倍稀释	0.086

实施例2、检测南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus，ArMV)的方法

南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus，ArMV)购自ATCC，产品目录号为PV-192。

昆藜病叶的制备：将南芥菜花叶病毒摩擦接种在隔离温室中栽培的昆藜(Chenopodium quinoa)健康叶片上，接种后放隔离温室中培养，获得感病的昆藜叶片。

1、将单抗包被到酶标板上

用包被抗体缓冲液将实施例1中的杂交瘤细胞株4G10 CGMCC No.3672分泌的单克隆抗体稀释成浓度为2μg/ml的溶液，加入到酶标板孔中，100μl/孔。37℃孵育2h。洗板。

2、加入待检测样品

设如下各组：

实验组：向孔中分别加入样品，4℃冰箱过夜，洗酶标板。

阳性对照组：向孔中加入阳性对照。4℃冰箱过夜，洗酶标板。

阴性对照组：向孔中加入阴性对照。4℃冰箱过夜，洗酶标板。

样品按照如下方法制备得到：按照1g病叶：10ml样品抽提缓冲液的比例将昆藜病叶片与样品抽提缓冲液混合，在研钵中研磨，研磨后得到的液体为样品检测液；100μl/孔。

阳性对照：用样品抽提缓冲液将山羊抗小鼠抗体稀释成0.75μg/ml的溶液，100μl/孔。

阴性对照按照如下方法制备得到：按照1g叶片：10ml样品抽提缓冲液的比例将昆藜健康叶片与样品抽提缓冲液混合，在研钵中研磨，研磨后得到的液体为阴性对照检测液；100μl/孔。

3、加入酶标抗体

每组中均设对照孔和实验孔，阳性对照组的对照孔中同时加入南芥菜花叶病毒兔多克隆抗体和兔抗山羊酶标抗体(将上述2种抗体按照使用浓度同时稀释到所需体积的酶标抗体稀释缓冲液中，充分混匀后加入到孔中，100μl/孔)；实验组和阴性对照组的对照孔中同时加入南芥菜花叶病毒兔多克隆抗体和山羊抗兔酶标抗体(将上述2种抗体按照使用浓度同时稀释到所需体积的酶标抗体稀释缓冲液中，充分混匀后加入到孔中，100μl/孔)。实验孔中同时加入南芥菜花叶病毒兔多克隆抗体、兔抗山羊酶标抗体和山羊抗兔酶标抗体(将上述3种抗体按照使用浓度同时稀释到所需体积的酶标抗体稀释缓冲液中，充分混匀后加入到孔中，100μl/孔)，具体如表2所示。37℃孵育4h，洗酶标板。

4、加入底物溶液，用酶标仪读OD_405nm值。

实验设3次重复，结果取平均值。结果如表2所示。

表2酶联反应读数

从表中看出，山羊抗小鼠抗体0.75μg/ml处理的读数与南芥菜花叶病毒昆藜病叶片10倍稀释的读数相当，可以在酶联试剂盒中起到很好的阳性对照作用。

当山羊抗小鼠抗体浓度为0.75μg/ml时，互为抗原抗体的2个酶标抗体同时加入能够比单加入兔抗山羊1个酶标时的酶联读数高0.832；当南芥菜花叶病毒昆藜病汁液10倍稀释时，互为抗原抗体的2个酶标抗体同时加入能够比单加入山羊抗兔1个酶标时的酶联读数高0.89；当昆藜健康叶片10倍稀释时，2个互为抗原抗体的酶标抗体同时加入能够比单加入山羊抗兔1个酶标时的酶联读数只高0.026，读数增加很少。因此在试剂盒中加入了2个互为抗原抗体的酶标抗体，在不明显增加本底反应的情况下，加强了酶联反应的强度，减少了假阴性反应的发生。

实施例3、试剂盒的灵敏度和特异性检测

一、南芥菜花叶病毒检测试剂盒的灵敏度：

按照1g叶片：不同体积样品抽提缓冲液的比例将昆藜病叶片与样品抽提缓冲液混合，在研钵中研磨，研磨后得到的液体为检测样品。按照实施例2中所述方法检测，结果见表2。试剂盒检测南芥菜花叶病毒病汁液灵敏度为1600倍(即1g叶片：1600ml样品抽提缓冲液)。

实验设3次重复，结果取平均值。结果如表3所示。

表3试剂盒检测南芥菜花叶病毒灵敏度

处理	OD_405nm值
		昆藜病叶10倍稀释	3.841
昆藜病叶100倍稀释	2.341
		昆藜病叶200倍稀释	1.194
昆藜病叶400倍稀释	0.887
		昆藜病叶800倍稀释	0.485
昆藜病叶1600倍稀释	0.377
		昆藜病叶3200倍稀释	0.172
昆藜健康叶10倍稀释	0.104

二、南芥菜花叶病毒试剂盒特异性：

烟草环斑病毒购自ATCC，产品目录号为PV-125；番茄环斑病毒购自ATCC，产品目录号为PV-239。南芥菜花叶病毒兔多克隆抗体购自美国ACD公司，产品目录号为V165-C1。

选取与南芥菜花叶病毒同属的病毒番茄环斑病毒、烟草环斑病毒用本发明试剂盒进行检测。

番杏病叶的获得：将番茄环斑病毒摩擦接种在番杏苗的叶片上，接种后放隔离温室中培养，获得感病的番杏叶片。

白肋烟病叶的获得：将烟草环斑病毒摩擦接种在白肋烟植株的叶片上，接种后放隔离温室中培养，获得感病的白肋烟叶片。

实验设3次重复，结果取平均值。结果如表4所示。本发明试剂盒不与番茄环斑病毒、烟草环斑病毒反应。因此本发明试剂盒特异性好。

表4南芥菜花叶病毒试剂盒的特异性

处理	OD_405nm值
		南芥菜花叶病毒昆藜10倍稀释病叶	3.674
昆藜健康叶片10倍稀释	0.113
		番茄环斑病毒番杏10倍稀释病叶	0.127
番杏健康叶片10倍稀释	0.118
		烟草环斑病毒白肋烟10倍稀释病叶	0.119
白肋烟健康叶片10倍稀释	0.102

Claims

1.一种用于检测样品中是否含有目标物质的酶联免疫试剂盒，包括用于包被的抗体A，用于检测的抗体B，作为阳性对照的抗体C和用于显色的酶标抗体；所述抗体A为动物I来源的抗目标物质的抗体，所述抗体B为动物II来源的抗目标物质的抗体，所述抗体C为抗所述抗体A的抗体；动物I和动物II为不同物种的动物；

所述抗体A为分泌抗南芥菜花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株4G10 CGMCC No.3672分泌的单克隆抗体；

所述目标物质为南芥菜花叶病毒。

2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述酶标抗体为酶标抗体D和酶标抗体E，所述抗体D为抗所述抗体B的抗体，所述抗体E为抗所述抗体D的抗体；所述抗体D为抗所述抗体C的抗体。

3.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述酶标抗体为酶标抗体D和酶标抗体E，所述抗体D为抗所述抗体B的抗体，所述抗体E为抗所述抗体D的抗体，所述抗体D为抗所述抗体E的抗体；所述抗体E为抗所述抗体C的抗体。

4.根据权利要求3所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述抗体A为小鼠来源的抗目标物质的抗体，所述抗体B为兔来源的抗目标物质的抗体，所述抗体C为山羊抗小鼠多克隆抗体，所述抗体D为山羊抗兔抗体，所述抗体E为兔抗山羊抗体。

5.根据权利要求1-4中任一所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述抗体B为兔来源的抗南芥菜花叶病毒的多克隆抗体。

6.根据权利要求1-4中任一所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括包被缓冲液、样品抽提缓冲液、酶标抗体稀释缓冲液、洗涤缓冲液、底物溶液；

每1升所述包被缓冲液按照如下方法配制：将碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g和叠氮化钠0.20g溶于水，用水定容至1L；包被缓冲液的pH值为9.6；

每1升所述样品抽提缓冲液按照如下方法配制：将亚硫酸钠1.3g和聚乙烯基吡咯烷酮20g溶于PBST缓冲液中，用PBST缓冲液定容至1L；

每1升所述洗涤缓冲液按照如下方法配制：将氯化钠8.0g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠1.15g，氯化钾0.2g，吐温20 0.5mL，叠氮化钠0.2g溶于水中，用水定容至1L；所述洗涤缓冲液的pH值为7.4；

每1升所述底物溶液按照如下方法配制：将二乙醇胺97mL和硝基苯磷酸二钠1g溶于水中，调节pH值至9.8，然后用水定容至1L；

所述酶标抗体中的酶是碱性磷酸酯酶。

7.一种检测样品中是否含有目标植物病毒的方法，包括如下步骤：用权利要求1-5中任一所述酶联免疫试剂盒对待测样品进行检测。

8.一种检测样品中是否含有目标植物病毒的方法，包括如下步骤：用权利要求6所述酶联免疫试剂盒对待测样品进行检测。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法中，在进行所述检测前，包括如下样品前处理的步骤：所述待测样品为植物组织，将所述植物组织与所述样品抽提缓冲液混合，得到混合物I；将所述混合物磨碎，得到混合物II，即为待检测液体。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述植物组织为植物叶片。

11.保藏编号为CGMCC No.3672的分泌抗南芥菜花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株4G10。

12.由分泌抗南芥菜花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株4G10 CGMCC No.3672分泌得到的单克隆抗体。