CN102533664A

CN102533664A - 分泌抗水稻黑条矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

Info

Publication number: CN102533664A
Application number: CN2012100041642A
Authority: CN
Inventors: 吴建祥; 周雪平; 倪跃群; 刘欢; 饶黎霞
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-01-09
Filing date: 2012-01-09
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2032-01-09
Also published as: CN102533664B

Abstract

本发明公开了一种分泌抗水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用原核表达的方法表达水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）的外壳蛋白CP为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗RBSDV单克隆抗体（MAb）的杂交瘤细胞株5G1，其保藏号为CGMCCNo.5537。5G1单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-6以上，抗体类型及亚类为IgG1，kappa链。该株细胞分泌的单抗与RBSDV的外壳蛋白有特异免疫结合反应。利用5G1单抗为核心建立的检测稻飞虱和水稻中RBSDV的dot-ELISA检测方法，当单头灰飞虱稀释到1600μL时，病叶1:160倍稀释(w/v,g/mL)时仍能检测到病毒。抗RBSDV单抗的制备及其检测方法的建立为该水稻病毒病的诊断、预报及科学防控提供技术和物质支撑。

Description

分泌抗水稻黑条矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

水稻黑条矮缩病曾于1960 年代中期在浙江及华东诸省市不少地区的稻、麦和玉米等禾谷类粮食作物上严重为害，其中浙江发病较重致使当时以东阳为中心的浙中玉米种植区被迫改变栽培制度，此后20 年发病面积迅速下降直至70 年代销声匿迹。近年来由于受耕作栽培制度改变、气候变暖、灰飞虱暴发等多种因素影响导致黑条矮缩病在浙江、上海、江苏、安徽、江西等地发生、流行。

水稻黑条矮缩病由水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)引起，该病毒属于呼肠孤病毒科 (Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)。该病毒可侵染水稻、大麦、小麦、玉米、高粱、马唐、白草和稗草等多种禾本科作物和杂草，引起水稻的黑条矮缩病和玉米的矮缩病。病毒粒体球状，直径70～75 nm。病毒基因组为双链RNA(dsRNA)，共10个片段，由大到小分别命名为SI～S10，其中S10编码病毒的外壳蛋白。细胞质中病毒粒子以三种形式存在：一种是分散或不规则聚集，另一种是有规则的晶状排列，再一种病毒粒子排列成串，外包一层膜，呈豆荚状、鞘状或管状构造。

水稻黑条矮缩病毒是一种由灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallen）为主要传播媒介的病毒，极具暴发性、间歇性和迁移性。水稻一旦感染上该病毒就无法防治。其中秧苗2叶～4 叶心叶期为最易感病期，且极显著高于其他生育期。因此秧苗期是防治灰飞虱传毒的关键时期。感病水稻的症状表现为分蘖增加，叶片短阔、僵直，叶色深绿，叶背的叶脉和茎秆上初现蜡白色，后变褐色的短条瘤状隆起，不抽穗或穗小，结实不良。不同生育期染病后的症状略有差异，具体表现为：苗期发病心叶生长缓慢，叶片短宽、僵直、浓绿，叶脉有不规则蜡白色瘤状突起，后变黑褐色，根短小，植株矮小，不抽穗，大田移栽后枯死；分蘖期发病新生分蘖先显症，主茎和早期分蘖尚能抽出短小病穗，但病穗缩藏于叶鞘内；拔节期发病剑叶短阔，穗颈短缩，结实率低，叶背和茎秆上有短条状瘤突。

水稻黑条矮缩病毒传毒介体灰飞虱一经获毒，终身带毒，但不经卵传毒。病毒主要在大麦、小麦病株上越冬，有部分也在灰飞虱体内越冬。田间病毒通过麦-早稻-晚稻的途径完成侵染循环。第一代灰飞虱在病麦上接毒后传到早稻、单季稻、晚稻和青玉米上传毒。稻田中繁殖的2、3代灰飞虱，在水稻病株上吸毒后，迁入晚稻和秋玉米传毒，晚稻上繁殖的灰飞虱成虫和越冬代若虫又进行传毒，传给大麦、小麦。灰飞虱最短获毒时间30分钟，1-2天即可充分获毒，病毒在灰飞虱体内循回期为8-35天，接毒时间仅1分钟。灰飞虱带毒情况及发生数量成为水稻黑条矮缩病发病流行的重要因素。为了掌握灰飞虱自然种群带毒及水稻发病状况，强化我国水稻黑条矮缩病早期监测和预警，科学指导防控，急需建立检测灰飞虱体内及水稻中RBSDV的高通量的检测方法，而目前没有这种高通量的检测方法，仅用低效率的电镜观察、RT-PCR方法等方法进行小样本检测。本发明以RBSDV外壳蛋白（CP）为抗原通过杂交瘤技术制备了1株抗RBSDV的特异性单克隆抗体，以制备的单抗为核心建立了检测RBSDV的高通量的血清学方法，并成功应用于田间RBSDV的检测，从而为我国水稻黑条矮缩病早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

分泌抗水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCC No.5537，它能分泌抗水稻黑条矮缩病毒的单克隆抗体。

抗水稻黑条矮缩病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-6以上，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与水稻黑条矮缩病毒 56kD的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反应。

抗水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1）提供的杂交瘤细胞株分泌抗水稻黑条矮缩病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISA、和TAS-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测水稻黑条矮缩病毒；2）利用本发明所制备的单克隆抗体检测水稻黑条矮缩病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3）利用本发明所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间作物及灰飞虱中的水稻黑条矮缩病毒的检测。

附图说明

图1 是dot-ELISA方法检测水稻RBSDV的灵敏度分析；

图2 是dot-ELISA方法检测水稻田间样品中RBSDV的结果；

图3 是dot-ELISA方法检测灰飞虱体内RBSDV的灵敏度分析；

图4是 dot-ELISA方法检测田间灰飞虱体内RBSDV的结果。

具体实施方式

分泌抗水稻黑条矮缩病毒单抗杂交瘤细胞，于2011年11月28日，保藏于中国科学院微生物研究所，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5537，它能分泌抗水稻黑条矮缩病毒的单克隆抗体。

本发明提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗水稻黑条矮缩病毒单抗，且其特异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立了检测RBSDV的高通量的血清学方法，并可应用于田间RBSDV的检测，从而为我国水稻黑条矮缩病早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备

1.免疫原及检测抗原的制备

根据GenBank中报道的水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）的衣壳蛋白基因（CP基因）序列设计引物: CP-F：5-CGGGATCCATGGCTGACATAAGACTCGA-3和CP–R：5-CG GTCGACTCATCTTGTCACTTTGTTTAG-3，上游引物对应于日本分离物(Accession No.D00606) 的22-41 nt，下划线处为 BamH I酶切位点，下游引物与中国浙江分离物(Accession No.AJ297433) 的1678-1698 nt互补，下划线处为 Sal I酶切位点，引物由上海英俊生物技术有限公司合成。利用Trizol试剂提取水稻病样的总RNA，第一链cDNA的合成按照RevertAidTM 逆转录试剂盒说明书进行，即模板RNA 2 μl，下游引物1 μl，RNase Free H₂O 9 μl。混匀后70℃下5 min，取出置冰上3-5 min；加入4 μl 5×RT Buffer，2 μl dNTP Mix，1 μl Rnasin Inhibitor，混匀后37℃下5 min；加入1 μl Reverse Transcriptase，混合后42℃下反应1h，70℃下10 min使逆转录酶失活。以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系如下：预变性94℃ 3 min，变性94℃ 1 min，退火52℃ 1 min，延伸72℃ 2 min 30 sec，循环扩增35次，最后延伸72℃ 10 min。扩增产物于0.8% 琼脂糖凝胶进行电泳分析，并用PCR凝胶回收试剂盒(AxyGEN)回收DNA片段，具体操作参考试剂盒说明书进行。将回收的目的基因片段与克隆载体pMD-18T vector连接，重组质粒命名为pMD18-T-CP，并转化到大肠杆菌DH 5α的感受态细胞中，用质粒提取试剂盒(AxyGEN)提取重组质粒，对提取的重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，并通过测序验证重组克隆载体pMD18-T-CP中所携带的CP基因序列及读码框的正确性，序列分析软件为DNAstar、NCBI-BLAST，所用的数据库为GeneBank等。重组质粒pMD18-T-CP中CP基因片段经BamH I和Sal I双酶切后定向插入经同样酶切的pET-32a表达载体中。PCR、酶切筛选阳性克隆，并通过测序验证重组原核表达载体pET-32a-CP中所携带CP基因序列未突变且读码框正确。并把原核表达质粒pET-32a-CP热击转化入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中，挑取单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养过夜，按1﹕100的比例将培养物接种于含氨卞青霉素抗性的新鲜TB培养基中，振荡培养至OD600≈0.5加入终浓度为1 mmol﹒L-1 IPTG诱导表达4 h，离心收集菌体。部分菌体加入1×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水中处理5-l0 min,12 000 rpm离心后取上清10 μ1进行12.5％SDS-PAGE电泳分析，其余菌体经超声波破碎，收集上清按照产品说明书进行用Ni+ NTA亲和层析柱纯化目的蛋白。以纯化的重组CP蛋白作为免疫原及检测抗原。

2.免疫动物

用免疫原表达的重组RBSDV外壳蛋白CP免疫四周龄体重18-20g BALB/C 雌性小鼠。用免疫原RBSDV CP外壳蛋白100μL/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.2ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按5-10：1的比例，在无血清的RPMI-1640（Gibco）培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50 % PEG（Sigma，分子量1500）作为融合剂，在37℃下水浴下加入1ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5 % CO₂的细胞培养箱中培养。

4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆

细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底5%-50%时，以RBSDV P10蛋白为检测抗原包被，用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获72个阳性孔。选择10个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗RBSDV的特异性单抗的杂交瘤细胞株5G1。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

5. 单克隆抗体的特异性检测

用感染芜菁花叶病毒（TuMV）、番茄花叶病毒（ToMV）、烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、马铃薯X病毒（PVX）和马铃薯Y病毒(PVY)、水稻矮缩病毒（RDV）、水稻条纹病毒（RSV）、水稻齿叶矮缩病毒（RRSV）的病叶汁包被ELISA反应板，以相应的健叶提取液作阴性对照，以水稻黑条矮缩病毒为阳性对照，用间接ELISA法测定单抗的特异性反应。间接ELISA方法具体为上述病毒感染的病叶用液氮研磨成粉末，按1: 30（w/v, g /mL）加入ELISA包被液研磨后100ul/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2小时，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用1-10％的脱脂奶粉或1-3％ BSA或3-6％牛血清封闭30-60min;加入单抗100ul/孔，37℃ 1-2 小时；PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37℃ 1-2小时，PBST洗涤四次后，用PNPP底物显色，2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD₄₀₅的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，5G1单抗对RBSDV有特异性反应，而与TuMV、TMV、ToMV、CMV、PVY、PVX、RDV、RSV、RRSV其他病毒均无特异性反应。

6.单克隆抗体腹水制备及纯化

取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06 M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。

7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定

将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgG₁、 IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM抗体作双向琼脂扩散试验，结果为5G1单抗亚类为IgG1、kappa链。用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果为上述单抗腹水效价在10^－6以上。

二、病毒免疫学检测方法及其检测试剂盒

1.用单抗建立抗原包被ELISA（ACP-ELISA）方法检测病毒

ACP-ELISA方法的操作步骤

（1）用0.05M碳酸盐缓冲液（pH9.6）按1: 30（w/v, g /mL）倍稀释的病叶汁液或按150 ul碳酸盐缓冲液每头灰飞虱加入后捣烂的上清100ul/孔加入ELISA板，以RBSDV病叶或携带RBSDV灰飞虱为阳性对照，相应健叶或非带毒灰飞虱为阴性对照，37℃ 2h，或4℃过夜；

（2）PBST洗涤后用5%脱脂奶粉封闭30min；

（3）单抗腹水5000倍稀释后100ul/孔，37℃ 1h；

（4）PBST洗涤后加入5000倍稀释的碱性磷酸脂酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG二抗（Sigma），100ul/孔，37℃，1h；

（5）用PBST洗涤后加入硝基磷酸盐底物或TMB 底物100ul/孔，室温30min；

（6）用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色或蓝色的孔为阳性，或用2mol/L 氢氧化钠或硫酸终止反应后，用酶联免疫检测仪测OD405或450值，以P/N> 2.1作为阳性判断标准。

ACP-ELISA方法检测灵敏度检测

单抗腹水工作浓度为5000倍稀释，对病叶从1：10至5120作倍比稀释或单头灰飞虱进行倍比稀释50uL/头至12800uL/头，分别以相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，进行上述ACP-ELISA方法检测。结果表明ACP-ELISA方法对1：10～160倍稀释的病叶汁液及单头灰飞虱稀释到50 uL～1600uL/头均呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到1：160，对灰飞虱的检测灵敏度达到1600 uL/头，表明ACP-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。

2. 检测RBSDV的TAS-ELISA检测方法

2.1. TAS-ELISA 方法的操作流程：

1) 1:5000倍稀释的抗RBSDV的兔抗血清（由纯化的原核表达TYLCV-CP免疫兔子制备）100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，过夜；

2)PBST洗涤三次后加1-10％的脱脂奶粉或1-3％ BSA或3-6％牛血清封闭200ul/孔于37℃封闭30-60min

3)加入检测样品100ul/孔。以RBSDV病叶或携带RBSDV的灰飞虱为阳性对照，以相应的健康样品或非带RBSDV的灰飞虱为阴性对照，37℃ 1-2h；

4)洗涤后用封闭液稀释5000倍的单抗腹水100ul/孔，37℃ 1-2h

5)PBST洗涤后加入10000倍稀释的AP或HRP标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma）100ul/孔，37℃ 1-2h

6)PBST洗涤后加PNPP底物或TMB底物于室温显色5-30min，肉眼观察底物颜色变成黄绿色或蓝色的孔为阳性，2mol/L 氢氧化钠或硫酸终止反应后，用680型酶联免疫检测仪测405nm或450nm的OD值，以P/N> 2.1作为阳性判断标准。

2.2.TAS-ELISA 检测方法最适条件的确定：

采用TAS-ELISA 方阵试验进行，即横向分别加用包被缓冲液从1﹕100至1﹕102400倍比稀释的兔抗RBSDV血清；加入RBSDV 病叶汁或灰飞虱匀浆液；纵向分别加用封闭液从1﹕5至1﹕2048000倍比稀释单抗腹水；AP标或HRP记的兔抗鼠IgG二抗按Sigma公司说明书稀释，1﹕10000倍；按TAS-ELISA方法流程进行操作。结果表明水稻黑条矮缩病毒RBSDV的兔抗血清及单抗的最适稀释度分别为1﹕5000、1﹕5000。

2.3.TAS-ELISA 方法检测灵敏度的确定

在兔抗血清和单抗腹水最适工作浓度下，将RBSDV病叶汁或灰飞虱匀浆液用PBS液进行倍比稀释后进行TAS-ELISA测定，测定结果为：TAS-ELISA 检测病叶和灰飞虱的灵敏度分别达到1:600倍稀释（w/v, g /mL）和1600 uL/头，说明本方法具有很好的灵敏度。

3. dot-ELISA方法的建立及田间检测应用

3.1 dot-ELISA检测水稻中RBSDV方法的建立及其田间样品检测

将水稻叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10～30（w/v, g /mL）加入0.01 mol/L PBS（pH7.4）后研磨；病汁液 5000 rpm离心3 min; 取3 μl上清点到NC上，同时设置健康和感病水稻叶汁分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min； NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30-60 min；用PBST洗膜3～4次，每次3 min； NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30~60 min; PBST洗膜4～5次，每次3 min; 66 μL NBT和33 μL BCIP底物(Promega)加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris Cl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果。待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

用方阵试验确定检测水稻病叶的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明5G1单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:3000和1:8000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测RBSDV病叶的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当水稻叶片稀释到1:160倍（w/v, g/mL）时，以5G1单抗建立的dot-ELISA 检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:160倍稀释（图1）。

用建立的dot-ELISA方法对2010、2011年采自江苏苏州、南京土桥、江苏连云港、浙江湖州等水稻田间疑似发病水稻样品进行检测，结果发现，50个水稻检测样品中有38个样品产生紫色的阳性斑点（图2），阳性样品进一步用RT-PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到RBSDV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染RBSDV。说明该dot- ELISA方法能准确、可靠地用于水稻样品中水稻黑条矮缩病毒的检测。

3.2 dot-ELISA检测灰飞虱体内RBSDV方法的建立及其田间样品检测

单头灰飞虱放入1.5 mL的eppendorf的离心管中，并加入100 μL PBS (0.01mol/L，pH7.4)，用牙签捣烂灰飞虱后、稍静置，取3 μL上清点到NC膜上，膜干燥、单抗孵育、二抗孵育、显色步骤与dot-ELISA检测水稻中RBSDV方法相同，不同的只是二抗为适度稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，显色底物是HRP的显色底物，即TMB显色底物。同时设非带毒和带毒的灰飞虱作为阴性和阳性对照。

用方阵试验确定检测稻飞虱的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明5G1单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:3000和1:5000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测飞虱体内RBSDV的dot-ELISA方法，检测结果表明携带RBSDV的灰飞虱呈现蓝色斑点，而无毒的灰飞虱没有任何显色反应，即建立的dot-ELISA方法能特异性地检测灰飞虱体内的RBSDV。灵敏度分析表明，当单头灰飞虱加1600 μL PBS时，以5G1单抗建立的dot-ELISA检测仍呈现蓝色的阳性斑点，即其检测灰飞虱的灵敏度达到1：1600稀释（头/μL）（图3）。

用建立的dot-ELISA方法对2010、2011年采自江苏苏州、南京土桥、江苏连云港、浙江湖州等水稻发病田间的灰飞虱、人工饲喂获毒的和无毒的灰飞虱进行检测。结果发现， 130头灰飞虱检测样品中有61头产生蓝色的阳性斑点，而无毒的灰飞虱没有产生任何蓝色斑点（图4）。阳性样品进一步用RT-PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到RBSDV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染RBSDV。说明该dot- ELISA方法能准确、可靠地用于灰飞虱样品中水稻黑条矮缩病毒的检测。

3.3水稻黑条矮缩病毒dot-ELISA检测试剂盒（水稻和灰飞虱样品）

1）试剂盒主要成分：

RBSDV 单克隆抗体1管 0.2 ml

AP标记羊抗鼠IgG二抗 1管 0.1 ml

HRP标记的羊抗鼠IgG二抗 1管 0.1 ml

NBT/BCIP底物各1瓶分别为2 ml和1ml

TMB底物 1瓶 10 ml

阳性对照1 （含RBSDV水稻叶片汁液） 1管 2 ml

阳性对照2 （带毒RBSDV灰飞虱匀浆液） 1管 2ml

阴性对照1（健康水稻叶片汁液） 1管 2 ml

阴性对照2（非带毒灰飞虱匀浆液） 1管 2 ml

抗体稀释液（10X） 1瓶 80ml

以上试剂均保存于4℃下

硝酸纤维素膜(NC)10张

2）检测水稻样品的操作步骤：

a.将水稻叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10～30（w/v, g /mL）加入0.01 mol/L PBS（pH7.4）后研磨；

b.病汁液 5000 rpm离心3 min;

c. 取3 μl上清点到NC上，同时设置健康和感病水稻叶汁分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20 min;

d. NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min；

e. NC膜放入1:2000倍稀释的单抗中室温孵育30～60 min；

f. 用PBST洗膜3～4次，每次3 min； NC膜放入1:3000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30～60 min;

g. PBST洗膜4～5次，每次3 min; 66 μL NBT和33 μL BCIP底物加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris Cl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果；

h. 待阳性对照显色明显（紫色），而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

3）检测灰飞虱样品的操作步骤：

a.单头灰飞虱放入1.5 mL的eppendorf的离心管中，并加入50-100 μL PBS (0.01mol/L，pH7.4)，用牙签捣烂灰飞虱后、稍静置，取3 μL上清点到NC膜上，同时设置带毒和非带毒的灰飞虱分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20 min;

b. NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min；

c. NC膜放入1:3000倍稀释的单抗中室温孵育30～60 min；

d. 用PBST洗膜3～4次，每次3 min； NC膜放入1:3000倍稀释的HRP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30～60 min;

e. PBST洗膜4～5次，每次3 min; 膜放入TMB底物液中反应，肉眼观察结果；

f. 待阳性对照显色明显(蓝色)，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

4）保存及有效期于2～8℃避光保存，有效期12个月。

5）缓冲液配方：

磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH7.4）：

NaCl 8 g

KCl 0.2 g

KH₂PO₄ 0.2 g

Na₂HPO₄12H₂O 3g

叠氮化钠 0.2 g

加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000 ml

ELISA洗涤液（0.01 mol/L PBST）：

1000 ml 0.01mol/L PBS中加0.5 ml Tween-20

ELISA封闭液：

0.01 mol/L PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5%（W/V）。

Claims

1. 一种分泌抗水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCC No.5537，其特征在于能分泌抗水稻黑条矮缩病毒的单克隆抗体。

2. 一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的抗水稻黑条矮缩病毒的单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-6以上，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与水稻黑条矮缩病毒 56kD的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反应。

3. 一种如权利要求2所述的抗水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用，其特征在于以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。