CN105624121B - 分泌抗番茄黑环病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分泌抗番茄黑环病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用纯化的番茄黑环病毒(TBRV)粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗TBRV单抗杂交瘤细胞株12H3，其保藏号为CGMCC No.12005。该杂交瘤细胞株分泌的单抗腹水间接ELISA效价达10‑7，抗体类型及亚类为IgG1，kappa轻链。该单抗与50kDa TBRV外壳蛋白有特异性免疫反应。利用12H3单抗建立检测番茄中TBRV的ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法，这两种方法检测病叶的灵敏度分别达到1:163,840和1:5,120倍稀释(w/v,g/mL)。杂交瘤细胞株12H3及其单抗的获得和血清学检测方法的建立为该病毒的检测和检疫及科学防控提供物质和技术支撑。

Description

分泌抗番茄黑环病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗番茄黑环病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
背景技术
番茄黑环病毒(Tomato black ring nepovirus，TBRV)隶属豇豆花叶病毒科(Comoviridae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)，最早由史密斯于1946年在英国的番茄上发现，随后意大利、德国、罗马尼亚、匈牙利、法国、波兰、英国等地的科研人员也相继从各种植物上分离出番茄黑环病毒。它既可以通过种子，也可以通过土壤和植物繁殖材料进行远距离传播。因此，TBRV已成为一种全球性的作物病毒，它在许多欧洲国家如法国、芬兰、瑞典、俄国、德国均有分布，在一些亚洲国家如印度、日本和土耳其也有分布，美国、加拿大、肯尼亚和巴西也有发现，在中国的局部地区也有发生。由于该病毒传播的广泛性和为害的严重性，已被列入我国口岸十分关注的检疫性有害生物。
TBRV病毒粒子呈球形，直径为28nm，病毒粒子带有突起。蛋白质外壳可能由排列在T＝1的二十面体结构的60个多肽亚单位组成。TBRV的钝化温度为60-65℃；室温下体外保毒期为14-21d，稀释限点为10-3-10-4。病毒纯化时分为顶部组分(T)、中部组分(M)和底部组分(B)，沉降系数分别为53S(T)、97S(M)和121S(B)，在CsCl中的浮力密度为1.5g.cm-3(B)、1.44g.cm-3(M)和1.285g.cm-3(T)。病毒含有两个基因组ssRNA，即存在于B组分中的RNA-1和M组分中的RNA-2。据报道，番茄黑环病毒有两个血清型，即德国血清型和苏格兰血清型。Greif等(1988年)和Meyer等(1986年)发现德国血清型的全基因组序列测定 为7,356nt(RNA-1)和4,662nt(RNA-2)。LeGall等(1995年)发现苏格兰血清型的RNA-2为4,618nt。Robinson等(1980年)认为RNA-1可独立于RNA-2进行复制，但是Murant等(1973年)研究发现：两个基因组RNA-1和RNA-2是TBRV侵染植物所必需的。其中RNA-1编码的蛋白与病毒在植物体内的复制有关，RNA-2编码的蛋白为外壳蛋白和胞间运动蛋白。
番茄黑环病毒的寄主范围很广，能够侵染单子叶和双子叶植物，包括许多重要的经济作物，如葡萄和一些果树、甜菜、马铃薯和蔬菜(葱属、甜菜属、芸薹属、莴苣属、番茄属和菜豆属的一些种)以及观赏植物，还能侵染乔木和灌木以及一些杂草品种，最主要的寄主是悬钩子属、茶属、草莓属和李属植物中的一些种(特别是桃)。它可以使番茄上产生黑色环斑，在菜豆、甜菜、莴苣、悬钩子上引起环斑，还引起芹菜的黄脉，马铃薯的“花束和假珊瑚状”，桃子的新枝矮缩等症状。感染TBRV还可导致浆果变小溃疡，产果率下降。对于正常生长可以产果20年的果树，感染TBRV后其产果时间缩短至4-5年。番茄黑环病毒以线虫传播和种子传播为主，其中TBRV马铃薯花束株系可以通过菟丝子传毒。由于线虫介体只能短距离传播，因此被害的种子和苗木等植物繁殖材料是该病毒国际间传播和扩散的重要根源。草本植物可以通过机械摩擦传毒，当机械接种草本试验植株时，大多数TBRV株系侵染不同植物产生不同的症状：如侵染昆诺藜，7d内变色或局部坏死，以后系统性褪绿斑驳、坏死或叶片变形。侵染不同烟草品种表现不同的症状，有些烟草晚期叶片虽然无症状，但仍含有病毒。木质植物机械接种很难，试验发现为了减少植物多酚对抑制病毒侵染性的影响，用2％烟碱溶液或者高pH(9.3)缓冲液研磨病组织接种木本植物可以获得成功。
TBRV寄主范围广、传播途径多、适生性强，伴随着我国进出境贸易的高速 增长，番茄黑环病毒传入我国并危害流行的可能性极大，给我国的农林生产带来了潜在的威胁。当前，国内外关于番茄黑环病毒的检验检疫分子生物学技术已有较多报道，但应用血清学检测的报道较少，分子生物学方法虽然特异、灵敏，但需昂贵精密的仪器且对操作人员技术要求较高，并不适合大批量样品检测。而血清学的方法操作简单、特异性好，且可以规模化检测大量样品，但其必须依赖于特异、灵敏的优质抗体。因此，本发明专利主要针对番茄黑环病毒单克隆抗体的制备及其检测应用开展工作，利用杂交瘤技术制备了1株能分泌抗TBRV单抗杂交瘤细胞12H3，并用其分泌的单抗建立了检测该病毒的血清学方法和检测试剂盒，从而为我国番茄黑环病毒病的检验检疫，科学指导防控提供物质和技术支持。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗番茄黑环病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
分泌抗番茄黑环病毒单抗的杂交瘤细胞株12H3，它能分泌抗番茄黑环病毒的特异性单抗,杂交瘤细胞株12H3于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12005。
一种所述的杂交瘤细胞株12H3分泌的抗番茄黑环病毒单抗，抗番茄黑环病毒的单抗腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗与50kDa的番茄黑环病毒外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA方法分析发现该单抗检测感染TBRV病叶的灵敏度达到1:163,840倍稀释(w/v,g/mL)。
抗番茄黑环病毒的单抗仅与番茄黑环病毒有特异性免疫反应，而与番茄花叶病毒、番茄褪绿病毒、烟草环斑病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄斑萎病毒和 健康的番茄叶片粗提液均不发生任何免疫反应。
抗番茄黑环病毒单抗在抗番茄黑环病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。
本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株12H3分泌抗番茄黑环病毒特异性单抗，以该单抗为核心建立的dot-ELISA和ACP-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏地检测番茄黑环病毒；2)利用本发明所制备的单抗检测番茄黑环病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本发明所制备的单抗可有效地用于田间及口岸作物中的番茄黑环病毒的检验检疫和检测。
附图说明
图1是dot-ELISA方法检测TBRV的灵敏度分析；
图2是dot-ELISA方法检测TBRV的特异性分析；
1列上下2个斑点为2个感染TBRV的番茄叶片样品，2列上下2个斑点为2个感染番茄花叶病毒的番茄叶片样品，3列上下2个斑点为2个感染番茄褪绿病毒的番茄叶片样品，4列上下2个斑点为2个感染烟草环斑病毒的番茄叶片样品，5列上下2个斑点为2个感染番茄黄化曲叶病毒的番茄叶片样品，6列上下2个斑点为2个感染番茄斑萎病毒的番茄叶片样品，7列上下2个斑点为2个健康番茄叶片样品，8列上下2个斑点为2个健康烟草叶片样品。
图3是dot-ELISA方法检测口岸植物样品中TBRV的代表性结果；
图4是RT-PCR方法检测口岸植物样品中TBRV的代表性结果。
生物保藏
杂交瘤细胞株12H3于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101， 保藏号为CGMCCNo.12005，其分类命名为：分泌抗番茄黑斑病毒(TBRV)单抗杂交瘤细胞。
具体实施方式
分泌抗番茄黑环病毒单抗杂交瘤细胞株12H3于2016年1月7日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.12005，它能分泌抗番茄黑环病毒的单克隆抗体。
一种所述的杂交瘤细胞株12H3分泌的抗番茄黑环病毒单抗，抗番茄黑环病毒的单抗腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，与50kDa番茄黑环病毒的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA方法分析发现该单抗检测病叶的灵敏度达到1:163,840倍稀释(w/v,g/mL)。
抗番茄黑环病毒的单抗仅与番茄黑环病毒有特异性免疫反应，而与番茄花叶病毒、番茄褪绿病毒、烟草环斑病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄斑萎病毒和健康番茄叶片粗提液均不发生任何免疫反应。
抗番茄黑环病毒单抗在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。
本发明提供的杂交瘤细胞株12H3能大量分泌抗番茄黑环病毒单抗，且其分泌的单抗效价高、特异性强、灵敏度高、稳定性好。以该单抗为核心建立的检测TBRV的高通量的血清学方法及其检测试剂盒可成功应用于田间及口岸TBRV的检验检疫和检测，从而为我国番茄黑环病毒的口岸检疫和预警、科学指导防控提供物质和技术支持。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
一、杂交瘤细胞的获得及其单克隆抗体的制备
1.免疫原及检测抗原的制备
用下面的操作步骤提纯病毒粒子：
1)称取病叶50g,以1:2的比例(w/v)加入0.1M PB缓冲液(含1mM乙二胺四乙酸和1％巯基乙醇)，匀浆仪匀浆5min。
2)加入Triton X-100至终浓度为0.5％(v/v)，室温搅拌30min；
3)4层棉纱布过滤，滤液中加入1/5体积的氯仿:正丁醇(1:1,v/v)；
4)保鲜膜覆盖室温搅拌30min；
5)8,000rpm离心15min，取上清；
6)量取上清体积，先加入NaCl至0.25M，然后慢慢加入PEG 6000至终溶度为10％(w/v,g/mL)；
7)溶解后4℃冰浴放置90-120min。
8)4℃下10,000rpm离心20min，弃上清，加入30mL 0.01M PB悬浮沉淀，4℃搅拌过夜；
9)5,000rpm离心10min，弃沉淀，上清加到30％的蔗糖垫离心管中；
10)44,000rpm离心2h；
11)弃上清，沉淀悬浮于1mL ddH2O中，4℃用搅拌过夜，悬浮液即为病毒提纯粒子；
12)用电子显微镜观察提纯样品，发现大量高纯度的28nm大小的球形番茄黑环病毒粒子。
2.免疫动物
用TBRV提纯病毒免疫六周龄BALB/c雌性小鼠。即TBRV提纯病毒粒子60μL/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后经背腹部皮下多点注射0.2mL/只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2mL/只，再过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取 脾细胞进行融合。
3.细胞融合
取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按6:1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1,500rpm离心5min去除培养基，用50％PEG(分子量1,500)作为融合剂，在37℃水浴中加入1mL，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1,500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔细胞板中，并置于37℃含5％CO2的细胞培养箱中培养。
4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆
细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10-30％时，以感染TBRV病毒的番茄叶片为包被抗原，用常规间接ELISA方法筛选分泌单抗的阳性孔，共获169个阳性孔。选择3个呈强阳性反应的细胞孔，进行3次有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗TBRV的特异性单抗的杂交瘤细胞株12H3。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。
5.单克隆抗体腹水制备及纯化
取8周龄左右BALB/c小鼠，腹腔注射0.3-0.5mL降植烷，7-10d后腹腔注入6×105个杂交瘤细胞，注射后7-10d可见小鼠腹部明显膨大，针头采取腹水，3,000rpm离心3min，收集上清液即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M pH4.8醋酸缓冲液稀释，室温下边搅边加辛酸(30uL/mL腹水)，4℃澄清1h，12,000rpm离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2h，3,000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶解，在4℃流动透析24h后即获纯化的单抗，-70℃保存。
6.单克隆抗体的类型及亚类鉴定和腹水效价测定
将纯化的单抗与Sigma公司的标准抗BALB/c小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM抗体进行DAS-ELISA试验，结果显示，12H3单抗亚类为IgG1、kappa轻链。用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果表明12H3单抗腹水效价达到10-7。
7.单克隆抗体的特异性检测
用感染番茄花叶病毒、番茄褪绿病毒、烟草环斑病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄斑萎病毒的病叶粗提液包被ELISA板，以相应的健叶粗提液作阴性对照，以感染番茄黑环病毒的病叶粗提液为阳性对照，用ACP-ELISA法测定单抗的特异性反应。ACP-ELISA方法具体步骤为：上述病毒感染的病叶按1:30(w/v,g/mL)加入ELISA包被缓冲液研磨匀浆，5,000rpm离心3min，上清100uL/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2h，使其吸附于ELISA聚苯乙烯板孔；PBST洗涤3次后用4％的脱脂奶粉封闭30-60min；加入适当稀释的单抗100uL/孔，37℃1-2h；PBST洗涤3次后加入适当稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记羊抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100uL/孔，37℃1-2h；PBST洗涤4次后用PNPP底物显色，2M氢氧化钠终止反应后用酶标仪读取OD405的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，12H3单抗对TBRV有特异性反应，而与番茄花叶病毒、番茄褪绿病毒、烟草环斑病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄斑萎病毒和健康植物均无特异性反应。
二、检测TBRV的免疫学方法及其试剂盒的建立
1.检测TBRV的ACP-ELISA方法
1.1 ACP-ELISA方法的步骤：
1)按1:30比例(w/v,g/mL)加入0.05M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)匀浆，5,000rpm 离心3min，上清100uL/孔加入ELISA板，以TBRV病叶为阳性对照，健叶为阴性对照，37℃2h，或4℃过夜；
2)PBST洗涤3次后用3％脱脂奶粉封闭30min；
3)加入适当稀释后的单抗腹水，100uL/孔，37℃1h；
4)PBST洗涤3次后加入适当稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记的羊抗鼠IgG二抗(Sigma)，100uL/孔，37℃，1h；
5)用PBST洗涤后加入PNPP硝基磷酸盐底物100uL/孔，室温30min；
6)用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，或用2M氢氧化钠终止反应后，用酶联免疫检测仪测OD405，以P/N>2.1作为阳性判断标准。
1.2 ACP-ELISA方法检测灵敏度和特异性的确定
用常规方阵试验确定ACP-ELISA方法中单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明12H3单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5,000和1:8,000倍稀释，以抗体的最适工作浓度建立检测TBRV的ACP-ELISA方法。对TBRV病叶粗提液从1:20至655,360倍比稀释，分别以相应稀释度的健叶粗提液作阴性对照，分析ACP-ELISA方法的检测灵敏度。结果表明ACP-ELISA方法对1:163,840倍稀释(w/v,g/mL)的病叶粗提液仍呈阳性反应，即对病叶的检测灵敏度可达到1:163,840(w/v,g/mL)倍稀释，表明ACP-ELISA方法具有高的灵敏性。用建立的ACP-ELISA方法检测TBRV、番茄花叶病毒、番茄褪绿病毒、烟草环斑病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄斑萎病毒和健康植物，检测结果表明，建立的ACP-ELISA方法检测TBRV呈强阳性反应，而检测番茄花叶病毒、番茄褪绿病毒、烟草环斑病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄斑萎病毒和健康植物均呈阴性反应，且阴阳性结果对比差异极显著，说明该方法的特异性很好。
2.dot-ELISA方法的建立及田间检测应用
2.1 dot-ELISA方法检测植物中TBRV的操作步骤
将病叶称重后按1:30比例(w/v,g/mL)加入0.01M PBS(pH7.4)后研磨、匀浆；匀浆液5,000rpm离心3min；取2.5μL上清点到硝酸纤维素膜(NC)上，同时设置健康和感病TBRV叶片分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20min；NC膜浸入到含3％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30-60min；用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；PBST洗膜4-5次，每次3min；66μL NBT和33μL BCIP底物(Promega)加入到10mL底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl2、pH9.5)混匀，膜放入底物液中显色约10-20min，肉眼观察结果，待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时，自来水漂洗NC膜终止反应，拍照记录结果。
2.2 dot-ELISA方法检测灵敏度和特异性的确定
用常规方阵试验确定dot-ELISA方法中TBRV的单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明12H3单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5,000和1:8,000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测TBRV的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当TBRV病叶稀释到1:5,120(w/v,g/mL)倍时，以12H3单抗建立的dot-ELISA方法检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:5,120倍稀释(w/v,g/mL)(图1)。特异性分析表明，该方法检测TBRV有特异性反应，而检测番茄花叶病毒、番茄褪绿病毒、烟草环斑病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄斑萎病毒和健康植物均呈阴性反应(图2)。
2.3 dot-ELISA方法的应用
用建立的dot-ELISA方法对2015年来自上海检验检疫局的疑似发病植物样品进行检测，结果发现，67个检测样品中有23个样品产生紫色的阳性斑点(图 3)，样品同时用RT-PCR方法进行分析，结果表明所有dot-ELISA阳性样品中均扩增到TBRV特异性的基因片段，而所有dot-ELISA检测阴性的样品中均未扩增到基因片段。PCR产物核酸测序表明阳性样品确实感染TBRV，说明该dot-ELISA方法能准确、可靠地用于植物样品中番茄黑环病毒的检测。
3.番茄黑环病毒dot-ELISA检测试剂盒
1)试剂盒主要成分：
以上试剂均保存于4℃下
硝酸纤维素膜(NC) 10张
2)检测植物样品检测的操作步骤：
a.将植物样品叶片称重后按1:10-30的比例(w/v,g/mL)加入0.01M PBS(pH7.4)后研磨、匀浆；
b.匀浆液5,000rpm离心3min；
c.取3μL上清点到NC上，同时设置健康和感病TBRV番茄叶片组织粗提液分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20min；
d.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；
e.NC膜放入1:3,000倍稀释的单抗中室温孵育30-60min；
f.用PBST洗膜3-4次，每次3min，NC膜放入1:5,000倍稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；
g.PBST洗膜4-5次，每次3min，66μL NBT和33μL BCIP底物加入到10mL底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl2、pH9.5)中并混匀，膜放入底物液中显色，肉眼观察结果；
h.待阳性对照显色明显(紫色)，而阴性没有任何显色时自来水漂洗NC膜终止反应，拍照记录结果。
3)保存及有效期
于2-8℃避光保存，有效期12个月。
4)缓冲液配方：
磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH7.4)：
加蒸馏水950mL溶解后调pH至7.4，定容至1000mL
ELISA洗涤液(0.01M PBST)：
1000mL 0.01M PBS中加0.5mL Tween-20
ELISA封闭液：
0.01M PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5％(w/v)。

Claims (3)

1.一种分泌抗番茄黑环病毒单抗的杂交瘤细胞株12H3，其特征在于能分泌抗番茄黑环病毒的特异性单抗，杂交瘤细胞株12H3于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12005。
2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株12H3分泌的抗番茄黑环病毒单抗其特征在于该单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，与50 kDa的番茄黑环病毒外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA方法分析发现该单抗检测病叶的灵敏度达到1:163,840倍稀释；该单抗仅与番茄黑环病毒有特异性免疫反应，而与番茄花叶病毒、番茄褪绿病毒、烟草环斑病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄斑萎病毒和健康番茄叶片粗提液均不发生任何免疫反应。
3.一种如权利要求2所述的抗番茄黑环病毒单抗在番茄黑环病毒检测中 的应用。
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