CN104450624A

CN104450624A - 分泌抗玉米褪绿斑驳病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

Info

Publication number: CN104450624A
Application number: CN201410627333.7A
Authority: CN
Inventors: 吴建祥; 周雪平
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-11-10
Filing date: 2014-11-10
Publication date: 2015-03-25

Abstract

本发明公开了一种分泌抗玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用纯化的玉米褪绿斑驳病毒（MCMV）的病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗MCMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株24F6，其保藏号为CGMCC No.9339。杂交瘤细胞株分泌的单抗腹水间接ELISA效价达10^-8，抗体类型及亚类为IgG1，kappa链。该株单抗仅与MCMV有特异性反应。用24F6单抗建立的检测传毒介体蓟马和玉米植物及种子中MCMV的免疫学检测方法。杂交瘤细胞株24F6及单抗的获得和相关血清学检测方法的建立为该病毒病的检疫、检测、预测及科学防控提供技术支撑。

Description

分泌抗玉米褪绿斑驳病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus，MCMV)属于番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)，是危害玉米的重要病毒，1974年MCMV首次在秘鲁被发现因感病植株症状表现为叶片逐渐失绿、变黄、整片叶表现呈黄绿相间的斑驳条斑，故命名为玉米褪绿斑驳病毒。寄主被侵染后，症状表现为坏死斑驳、卷曲、叶尖坏死、矮化、植株死亡等。自然侵染作物导致损失10％一15％，试验玉米损失达59％，与玉米褪绿矮缩病毒(Maize chlorotic dwalf virus，MCDV)或小麦线条花叶病毒(Wheat streak mosaic virus，WSMV)或甘蔗花叶病毒(SCMV)共同侵染损失高达100％。该病毒已被列入我国新修订的禁止进境的有害生物名录之中。2010年报道我国已在云南、四川发生流行。玉米褪绿斑驳病毒主要寄主是玉米，还可侵染小麦、大麦、燕麦、高粱等多达15～19种植物。该病毒可以种子传毒，也可机械摩擦传毒，也可以由传毒介体蓟马传播。首次在秘鲁玉米病株上发现，然后在北卡罗来纳州首府罗利市发生，直到 1976年在堪萨斯州暴发，造成严重危害。据当时堪萨斯州作物和家畜服务中心预测，玉米褪绿斑驳病毒造成玉米产量的损失达565kg/hm²,而玉米平均产量为6280kg /hm² 。

MCMV病毒粒子为等轴对称二十面体（T=3），用磷钨酸负染色直径约30nm，用醋酸铀负染色直径约33nm，无包膜，粒子外形呈六边形。基因组全长4473bp，病毒基因组共有四个阅读框，编码蛋白大小分别是：31.6KD，50KD，8.9KD，25.1KD。

为了掌握玉米褪绿斑驳病毒（MCMV）病害在我国的发病危害状况，强化我国玉米褪绿斑驳病毒病早期监测和预警，科学指导防控，急需建立检测玉米褪绿斑驳病毒病的高通量检测方法，而目前没有这种高通量的检测方法，仅用低效率的电镜观察、RT-PCR方法、核酸电泳等方法进行小样本检测。本发明提纯的MCMV病毒为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌抗MCMV的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞24F6，以制备的单抗为核心可建立检测MCMV的高通量的血清学方法及其试剂盒，从而为我国玉米褪绿斑驳病毒病检测、检疫、早期监测和预警、科学指导防控提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

分泌抗玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株24F6，它能分泌抗玉米褪绿斑驳病毒的特异性单克隆抗体, 杂交瘤细胞株24F6于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 9339。

抗玉米褪绿斑驳病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-8，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与玉米褪绿斑驳病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，能检测出带毒种子及传毒介体蓟马体内的玉米褪绿斑驳病毒。

抗玉米褪绿斑驳病毒的单克隆抗体仅与玉米褪绿斑驳病毒有特异性免疫反应，而与黄瓜花叶病毒、番茄花叶病毒、齿兰环斑病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、小西葫芦黄化花叶病毒、烟草花叶病毒、瓜类褪绿黄化病毒、菜豆普通花叶病毒、水稻矮缩病毒、芜菁花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒、油菜花叶病毒、番茄斑萎病毒、建兰花叶病毒、水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、小麦线条花叶病毒、甘蔗花叶病毒均不发生免疫反应。

抗玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体在抗玉米褪绿斑驳病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1）提供的杂交瘤细胞株24F6分泌抗玉米褪绿斑驳病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA和ACP-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测玉米褪绿斑驳病毒；2）利用本发明所制备的单克隆抗体检测玉米褪绿斑驳病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3）利用本发明所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间作物、带毒种子和传毒介体蓟马中的玉米褪绿斑驳病毒的检测。

附图说明

图1是dot-ELISA方法检测MCMV的灵敏度分析。

具体实施方式

分泌抗玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株24F6于2014年7月3日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCC No. 9339，它能分泌抗玉米褪绿斑驳病毒的单克隆抗体。

抗玉米褪绿斑驳病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-8，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与玉米褪绿斑驳病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，能检测出带毒种子及传毒介体蚜虫体内的玉米褪绿斑驳病毒。

抗玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。

本发明提供的杂交瘤细胞株24F6能大量分泌抗玉米褪绿斑驳病毒单抗，且其分泌的单抗特异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立的检测MCMV的高通量的血清学方法及其检测试剂盒可成功应用于田间MCMV的检测，从而为我国玉米褪绿斑驳病毒病早期监测和预警、检测检疫和科学指导防控提供物质和技术支持。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、杂交瘤细胞的获得及其单克隆抗体的制备

1.免疫原及检测抗原的制备

用下面的操作步骤提纯MCMV病毒粒子：

1)将大研钵和组织搅拌器预冷；

2)称取500g玉米病叶，每100g病叶中加入 pH 7.5的0.5M磷酸盐缓冲液(即 PB缓冲液）200ml（含0.01M Na-EDTA和0.1%巯基乙醇），匀浆2分钟后用双层尼龙纱布过滤，滤液离心（6000r/min, 20min）去植物组织残渣；

3) 所得上清液边搅拌边滴加2.5% Triton X-100, 4% PEG（分子量为6000）和0.1 mol/L NaCl, 4℃搅拌4h以上；

4)离心（11000r/min, 15min）得沉淀；

5)沉淀用pH 7.5的0.5M PB (含0.01M MgCl₂和0.5M脲)充分洗涤，离心（6000r/min, 15min）后吸出上清置于离心管，沉淀再洗涤，离心反复3次；

6)合并上清液，超速离心（33000r/min，100min）所得沉淀悬浮后离心（8000r/min, 15min）；

7)合并上清液再超离心（33000r/min，100min），离心管底部加有20%-30%蔗糖垫；

8)所得沉淀用pH 7.5的0.5M PB (含0.01M MgCl₂）悬浮，悬浮液即为病毒提纯液；

9）用电子显微镜观察提纯样品，发现大量高纯度的玉米褪绿斑驳病毒粒子。

2.免疫动物

用MCMV提纯病毒免疫四周龄体重18-20g BALB/C 雌性小鼠。即MCMV提纯病毒粒子35μL/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.2ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按10：1的比例，在无血清的RPMI-1640（Gibco）培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50 % PEG（Sigma，分子量1500）作为融合剂，在37℃下水浴下加入1ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5 % CO2的细胞培养箱中培养。

4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆

细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-30%时，以感染MCMV病毒的烟草叶片和提纯病毒为抗原包被，用常规间接ELISA方法筛选分泌单抗的阳性孔，共获54个阳性孔。选择11个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗MCMV的特异性单抗的杂交瘤细胞株24F6。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

5. 单克隆抗体的特异性检测

用感染黄瓜花叶病毒、番茄花叶病毒、齿兰环斑病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、小西葫芦黄化花叶病毒、烟草花叶病毒、瓜类褪绿黄化病毒、菜豆普通花叶病毒、水稻矮缩病毒、芜菁花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒、油菜花叶病毒、番茄斑萎病毒、建兰花叶病毒、水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、小麦线条花叶病毒、甘蔗花叶病毒、玉米褪绿斑驳病毒的病叶汁包被ELISA板，以相应的健叶提取液作阴性对照，以感染玉米褪绿斑驳病毒的病叶汁液为阳性对照，用ACP-ELISA法测定单抗的特异性反应。ACP-ELISA方法具体为：上述病毒感染的病叶用液氮研磨成粉末，按1: 30（w/v, g /mL）加入ELISA包被液研磨后100ul/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2小时，使其吸附于ELISA聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用1-10％的脱脂奶粉或1-3％ BSA或3-6％牛血清封闭30-60min；加入适当稀释的单抗100ul/孔，37℃ 1-2 小时；PBST洗涤三次后加入10000倍稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记羊抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37℃ 1-2小时，PBST洗涤四次后，用PNPP底物显色，2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD₄₀₅的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，24F6单抗对MCMV有特异性反应，而与黄瓜花叶病毒、番茄花叶病毒、齿兰环斑病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、小西葫芦黄化花叶病毒、烟草花叶病毒、瓜类褪绿黄化病毒、菜豆普通花叶病毒、水稻矮缩病毒、芜菁花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒、油菜花叶病毒、番茄斑萎病毒、建兰花叶病毒、水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、小麦线条花叶病毒、甘蔗花叶病毒和健康植物均无特异性反应。

6.单克隆抗体腹水制备及纯化

取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。

7.单克隆抗体的类型及亚类鉴定和腹水效价测定

将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgG₁、 IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM抗体作双向琼脂扩散试验，结果显示，24F6单抗亚类为IgG1、kappa链。用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果为上述单抗腹水效价达到10^－8。

二、病毒免疫学检测方法及其试剂盒

1.以单抗为核心建立抗原包被ELISA（ACP-ELISA）方法检测玉米植物和玉米种子中MCMV病毒的操作步骤：

（1）用0.05M碳酸盐缓冲液（pH9.6）按1: 30（w/v, g /mL）倍稀释的病叶汁液，或1颗玉米种子加1 mL 0.05M碳酸盐缓冲液匀浆或1头蓟马加100ul后用牙签捣烂成匀浆液，上述病叶汁液或种子匀浆液或蓟马匀浆液100ul/孔加入ELISA板，以MCMV病叶为阳性对照，健叶为阴性对照，或非带毒的种子和带毒种子分别为阴性和阳性对照，或非带毒的蓟马和带毒的蓟马为为阴性和阳性对照，37℃ 2h，或4℃过夜；

（2）PBST洗涤后用5%脱脂奶粉封闭30min；

（3）单抗腹水5000倍稀释后100ul/孔，37℃ 1h；

（4）PBST洗涤后加入10000倍稀释的碱性磷酸脂酶（AP）标记的羊抗鼠IgG二抗（Sigma），100ul/孔，37℃，1h；

（5）用PBST洗涤后加入硝基磷酸盐底物100ul/孔，室温30min；

（6）用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，或用2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用酶联免疫检测仪测OD405，以P/N> 2.1作为阳性判断标准。

2.以单抗为核心建立抗原包被ELISA（ACP-ELISA）方法检测传毒介体蓟马中MCMV病毒的操作步骤：

（1）用0.05M碳酸盐缓冲液（pH9.6）按1头蓟马加100ul后用牙签捣烂成匀浆液，上述蓟马匀浆液100ul/孔加入ELISA板，以非带毒的蓟马和带毒的蓟马为为阴性和阳性对照，37℃ 2h，或4℃过夜；

（2）PBST洗涤后用5%脱脂奶粉封闭30min；

（3）单抗腹水4000倍稀释后100ul/孔，37℃ 1h；

（4）PBST洗涤后加入10000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗（Sigma），100ul/孔，37℃，1h；

（5）用PBST洗涤后加入TMV底物100ul/孔，室温30min；

（6）用肉眼观察，底物颜色变成蓝色的孔为阳性，或用2mol/L 硫酸终止反应后，用酶联免疫检测仪测OD450，以P/N> 2.1作为阳性判断标准。

检测结果表明该单抗为核心建立的ACP-ELISA能检测发表玉米植物、带毒玉米种子及传毒介体蓟马中的MCMV。

ACP-ELISA方法进行灵敏度检测：

单抗腹水工作浓度为5000倍稀释，对病叶作倍比稀释分别以相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，进行上述ACP-ELISA方法检测。结果表明ACP-ELISA方法对1：340000倍稀释（w/v, g/ml）的病叶汁液检测仍呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到1：340000，表明ACP-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。

3. dot-ELISA方法的建立及田间检测应用

3.1 dot-ELISA检测植物中MCMV方法的建立及其田间样品检测

将病叶称重后用液氮研磨成粉末，按1:10-30（w/v, g /mL）加入0.01 mol/L PBS（pH7.4）后研磨；病汁液 5000 rpm离心3 min; 取3 μl上清点到硝酸纤维素膜（NC）上，同时设置健康和感病病叶汁分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min； NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30-60 min；用PBST洗膜3-4次，每次3 min；NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60 min; PBST洗膜4-5次，每次3 min; 66 μL NBT和33 μL BCIP底物(Promega)加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris Cl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果。待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

用方阵试验确定检测病叶的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明24F6单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5000和1:7000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测MCMV的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当烟草叶片稀释到1: 819210倍（w/v, g/mL）时，以24F6单抗建立的dot-ELISA 检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1: 819210倍稀释（图1）。

用建立的dot-ELISA方法对田间疑似发病样品进行检测，结果发现，123个检测样品中有8个样品产生紫色的阳性斑点，阳性样品进一步用PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到MCMV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染MCMV。说明该dot-ELISA方法能准确、可靠地用于植物样品中玉米褪绿斑驳病毒的检测。

2.2 dot-ELISA检测蓟马体内MCMV方法的建立及其田间样品检测

单头蓟马放入0.5 mL的eppendorf的离心管中，并加入20 μL PBS (0.01mol/L，pH7.4)，用牙签捣烂虫子后，取3 μL 上清点到NC膜上，膜干燥、单抗孵育、二抗孵育、显色步骤与dot-ELISA检测植物中MCMV方法相同，不同的只是二抗为适度稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，显色底物是HRP的显色底物，即TMB显色底物。同时设非带毒和带毒的蓟马作为阴性和阳性对照。

用方阵试验确定检测蚜虫的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明制备单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:4000和1:5000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测蓟马体内MCMV的dot-ELISA方法，检测结果表明携带MCMV的蓟马呈现蓝色斑点，而无毒的蓟马没有任何显色反应，即建立的dot-ELISA方法能特异性地检测蓟马体内的MCMV。

用建立的dot-ELISA方法对人工饲喂获毒的和无毒的蓟马进行检测。结果发现，123头蓟马检测样品中有54头产生蓝色的阳性斑点，而无毒的蓟马没有产生任何蓝色斑点。阳性样品进一步用RT-PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到MCMV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染MCMV。说明该dot- ELISA方法能准确、可靠地用于蓟马样品中MCMV的检测。

4 玉米褪绿斑驳病毒dot-ELISA检测试剂盒检测玉米植物及其种子

1）试剂盒主要成分：

MCMV 单克隆抗体1管 0.2 ml

AP标记羊抗鼠IgG二抗 1管 0.1 ml

HRP标记的羊抗鼠IgG二抗 1管 0.1 ml

NBT/BCIP底物各1瓶分别为2 ml和1ml

TMB底物 1瓶 10 ml

阳性对照1（含MCMV叶片汁液） 1管 2 ml

阴性对照1（健康玉米叶片汁液）1管 2 ml

阳性对照2 （带毒MCMV蓟马匀浆液） 1管 2 ml

阴性对照2（非带毒蓟马匀浆液） 1管 2 ml

抗体稀释液（10X） 1瓶 80ml

以上试剂均保存于4℃下

硝酸纤维素膜(NC)10张

2）玉米病株及玉米种子样品检测的操作步骤：

a.将植物叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10～30（w/v, g /mL）加入0.01 mol/L PBS（pH7.4）后研磨匀浆，或每颗玉米种子加入1mL 0.01 mol/L PBS（pH7.4）后研磨匀浆；

b.匀浆液 5000 rpm离心3 min;

c. 取3 μl上清点到NC上，同时设置健康和感病烟草叶汁分别作为阴性和阳性对照，或非带毒的玉米种子和带毒的玉米种子为阴性和阳性对照，室温干燥10-20 min;

d. NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min；

e. NC膜放入1:5000倍稀释的单抗中室温孵育30-60 min；

f. 用PBST洗膜3-4次，每次3 min； NC膜放入1:7000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60 min;

g. PBST洗膜4-5次，每次3 min; 66 μL NBT和33 μL BCIP底物加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris Cl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果；

h. 待阳性对照显色明显（紫色），而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

3）检测蓟马样品的操作步骤：

a.单头蓟马放入0.5 mL的eppendorf的离心管中，并加入10 μL PBS (0.01mol/L，pH7.4)，用牙签捣烂虫子后，取3 μL 上清点到NC膜上，同时设置带毒和非带毒的蓟马分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20 min；

b. NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min；

c. NC膜放入1:4000倍稀释的单抗中室温孵育30～60 min；

d. 用PBST洗膜3～4次，每次3 min； NC膜放入1:5000倍稀释的HRP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30～60 min；

e. PBST洗膜4～5次，每次3 min；膜放入TMB底物液中反应，肉眼观察结果；

f.待阳性对照显色明显(蓝色)，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

4）保存及有效期于2～8℃避光保存，有效期12个月。

5）缓冲液配方：

磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH7.4）：

NaCl 8 g

KCl 0.2 g

KH₂PO₄ 0.2 g

Na₂HPO₄·12H₂O 3g

叠氮化钠 0.2 g

加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000 ml

ELISA洗涤液（0.01 mol/L PBST）：

1000 ml 0.01mol/L PBS中加0.5 ml Tween-20

ELISA封闭液：

0.01 mol/L PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5%（W/V）。

Claims

1.一种分泌抗玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株24F6，其特征在于能分泌抗玉米褪绿斑驳病毒的特异性单克隆抗体，杂交瘤细胞株24F6于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9339。

2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株24F6分泌的抗玉米褪绿斑驳病毒的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-8，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与玉米褪绿斑驳病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，能检测出带毒种子及传毒介体蓟马体内的玉米褪绿斑驳病毒。

3.如权利要求2所述的杂交瘤细胞株24F6分泌的抗玉米褪绿斑驳病毒的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体仅与玉米褪绿斑驳病毒有特异性免疫反应，而与黄瓜花叶病毒、番茄花叶病毒、齿兰环斑病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、小西葫芦黄化花叶病毒、烟草花叶病毒、瓜类褪绿黄化病毒、菜豆普通花叶病毒、水稻矮缩病毒、芜菁花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒、油菜花叶病毒、番茄斑萎病毒、建兰花叶病毒、水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、小麦线条花叶病毒、甘蔗花叶病毒均不发生免疫反应。

4.一种如权利要求2所述的抗玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体在玉米褪绿斑驳病毒检测上的应用，其特征在于应用于以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。