CN107121552B - 一株分泌3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺单抗的杂交瘤细胞株zy-2g5-3及其应用 - Google Patents
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Abstract
一株分泌3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺单抗的杂交瘤细胞株ZY‑2G5‑3及其应用,属于免疫检测技术领域。本发明一株能特异性分泌3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZY‑2G5‑3,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,保藏编号为CGMCC No.13090。本发明在小鼠血清筛选和细胞株筛选的过程中均采用尿样基质,已得到可以耐受尿样基质,且特异性识别3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)的单克隆抗体,用于尿样中MDMA的检测,可以满足目前市场上对尿液中MDMA免疫检测产品的需求。
Description
技术领域
本发明涉及一株分泌3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺单抗的杂交瘤细胞株ZY-2G5-3及其应用,涉及摇头丸单克隆抗体的制备方法,以及尿样中3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)的间接竞争酶联免疫检测方法的测定,属于免疫检测技术领域。
背景技术
摇头丸是新型人工合成毒品的一种,一般以 MDMA(3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺)、MDA(4,5-亚甲基二氧基苯丙胺)、AM(苯丙胺)及 MAM(甲基苯丙胺)为主要有效成分。摇头丸同阿片类毒品一样,具有很强的精神依赖性,不论用何种方法脱毒,半年内复吸率仍高达95%以上。
在毒品的检测中,国内外主要采用免疫层析法,酶联免疫吸附法(ELISA),PCR,放射性免疫等方法对尿液、血液、组织以及毛发等样本进行检测。
发明内容
本发明的目的在于制备一种能够特异性分泌MDMA单克隆抗体的细胞株,建立检测MDMA的免疫学检测方法。
本发明的技术方案:一株能特异性分泌3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZY-2G5-3,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,保藏编号为CGMCC No.13090。
提供的MDMA杂交瘤细胞株ZY-2G5-3的制备方法,采用MDMA与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物MDMA-BSA作为免疫原,与弗氏佐剂混合均匀后,通过皮下注射免疫BALB/c小鼠;用MDMA与鸡蛋清白蛋白(OVA)的偶联物MDMA-OVA作为包被抗原,运用间接竞争酶联免疫检测法(ic-ELISA)对小鼠血清和细胞上清进行筛选。将免疫小鼠的脾细胞通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合,经过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选和三次亚克隆,得到一株能特异性分泌MDMA抗体的杂交瘤细胞株ZY-2G5-3。基本步骤为:
(1)动物免疫与效价测定:采用MDMA与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物MDMA-BSA作为免疫原,采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c小鼠,首次免疫用100μg 偶联抗原与等量弗氏完全佐剂混匀后进行皮下注射,间隔3周后,再用100μg 偶联抗原与等量弗氏不完全佐剂加强免疫,此后每隔3周用半量偶联抗原加强免疫一次;冲刺免疫剂量减半,与等体积的生理盐水混合后采用腹腔免疫。用MDMA与鸡蛋清白蛋白(OVA)的偶联物MDMA-OVA作为包被抗原,通过间接竞争ELISA检测血清效价和抑制;
其具体ELISA 程序如下:
1)包被:将包被抗原用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液梯度稀释,100μL/孔,37℃孵育2h。
2)洗涤:将板内溶液倾去,每孔注入200μL PBST溶液,置于摇床上振荡3min,甩干,洗涤3次。以下洗涤方法相同。
3)封闭:拍干后,加入200μL /孔封闭液,37℃孵育2h。洗涤后烘干备用。
4)加样:酶标板上半部分加入阴性尿样,50μL/孔(上半部分称为0标),下半部分加入不同浓度的用阴性尿样稀释的MDMA标准品,将抗血清从1︰1000开始梯度稀释,50μL/孔(下半部分称为加标),上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原的孔中,37℃孵育30min;充分洗涤后,加入1︰3000稀释的鼠二抗,100μL/孔,37℃孵育30min,洗涤后拍干。
5)显色:将酶标板取出,充分洗涤后,每孔加入100μL的显色液(TMB与底物液体积比例1︰5),37℃避光反应15min。
6)终止和测定:取出酶标板,每孔加入50μL终止液(2mol/L的硫酸)终止反应,然后用酶标仪测定各孔的吸光值OD450。
7)结果判读:以OD450值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍(即P/N≥2.1)所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。上下部分对照,加标OD450值为0标一半的即是所加的标准品浓度。
(2)细胞融合与筛选:在冲击免疫三天后,按照常规PEG(聚乙二醇,分子量为1450)方法进行细胞融合,具体步骤如下:
a、无菌取小鼠脾脏,研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液,并进行细胞计数;
b、收集SP2/0细胞,悬浮于RPMI-1640基础培养液中,进行细胞计数;
c、将脾细胞和SP2/0细胞按照10︰1(数量比)的比例混合,离心后用50% PEG融合,时间1 min,之后按照从慢到快,加入RPMI-1640基础培养液,离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中,加到96孔细胞培养板,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液,第6天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液,在第9天取细胞上清进行筛选。
筛选分两步:第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔,第二步选用含MDMA的尿样标准品,用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选出对MDMA具有较好抑制的孔,采用有限稀释法进行亚克隆,用同样的方法进行检测。重复三次,即可得到能稳定分泌MDMA单克隆抗体的细胞株。
(3)单克隆抗体的制备与鉴定:取8-10周龄BALB/c小鼠,每只小鼠腹腔注射石蜡油1 mL;7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞,从第七天开始收集腹水,将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化,获得的单抗置于 -20℃保存。
生物材料样品保藏:一株能特异性分泌3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZY-2G5-3,分类命名为单克隆细胞株,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏日期2016年10月31日,保藏编号为CGMCC No.13090。
本发明的有益效果:本发明获得了能够分泌MDMA单克隆抗体且耐受尿样基质的杂交瘤细胞株ZY-2G5-3,其在小鼠血清筛选和细胞株筛选中均采用尿样基质,已得到可以耐受尿样基质,且特异性识别3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺的单克隆抗体,用于尿样中3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺的检测,可以满足目前市场上对尿液中MDMA免疫检测产品的需求。
附图说明
图1该单克隆抗体在尿样基质中的标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明,不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将完全抗原免疫小鼠,通过细胞融合,HAT选择性培养基培养,通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清,采用阴性尿样作为基质,最终得到了具有较好灵敏度且耐受尿样的MDMA单克隆抗体。
实施例1 MDMA单克隆抗体的制备
1、动物免疫:采用MDMA与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物MDMA-BSA作为免疫原,选择健康的6~8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取免疫原与等体积弗氏完全佐剂混合均匀后,通过皮下注射免疫BALB/c小鼠,每只100μg;每间隔21天,采用免疫原与等体积弗氏不完全佐剂进行加强免疫,三免后7~10天采血,使用间接竞争ELISA方法测定小鼠血清效价和抑制,选择抑制最好的小鼠,在四免后21天冲击免疫,不使用佐剂,腹腔注射。用MDMA与鸡蛋清白蛋白(OVA)的偶联物MDMA-OVA作为包被抗原,通过间接竞争ELISA检测血清效价和抑制;
其具体ELISA 程序如下:
1)包被:将包被抗原用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液梯度稀释,100μL/孔,37℃孵育2h。
2)洗涤:将板内溶液倾去,每孔注入200μL PBST溶液,置于摇床上振荡3min,甩干,洗洗涤3次。以下洗涤方法相同。
3)封闭:拍干后,加入200μL /孔封闭液,37℃孵育2h。洗涤后烘干备用。
4)加样:酶标板上半部分加入阴性尿样,50μL/孔(上半部分称为0标),下半部分加入不同浓度的用阴性尿样稀释的MDMA标准品,将抗血清从1︰1000开始梯度稀释,50μL/孔(下半部分称为加标),上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原的孔中,37℃孵育30min;充分洗涤后,加入1︰3000稀释的鼠二抗,100μL/孔,37℃孵育30min,洗涤后拍干。
5)显色:将酶标板取出,充分洗涤后,每孔加入100μL的显色液(TMB与底物液体积比例1︰5),37℃避光反应15min。
6)终止和测定:取出酶标板,每孔加入50μL终止液(2mol/L的硫酸)终止反应,然后用酶标仪测定各孔的吸光值OD450。
7)结果判读:以OD450值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍(即P/N≥2.1)所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。上下部分对照,加标OD450值为0标一半的即是所加的标准品浓度。
2、细胞融合:在冲击免疫三天后,按照常规PEG(聚乙二醇,分子量为1450)方法进行细胞融合,具体步骤如下:
(1)无菌取小鼠脾脏,研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液,并进行细胞计数;
(2)收集SP2/0细胞,悬浮于RPMI-1640基础培养液中,进行细胞计数;
(3)将脾细胞和SP2/0细胞按照10︰1(数量比)的比例混合,离心后用50% PEG融合,时间1 min,之后按照从慢到快,加入RPMI-1640基础培养液,离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中,加到96孔细胞培养板,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
3、细胞筛选与细胞株建立:在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液,第6天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液,在第9天取细胞上清进行筛选。
筛选分两步:第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔,第二步选用含MDMA的尿样为标准品,用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选出对MDMA具有较好抑制的孔,采用有限稀释法进行亚克隆,用同样的方法进行检测。重复三次,即可得到能稳定分泌MDMA单克隆抗体的细胞株。
4、单克隆抗体的制备与鉴定:取8-10周龄BALB/c小鼠,每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL;7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞,从第七天开始收集腹水,将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化,获得的单抗置于-20℃保存。
使用间接竞争ELISA和间接ELISA,测定单克隆抗体对MDMA的半数抑制率IC50为1.96ng/mL;可以用于尿样中MDMA的检测。
该单克隆抗体在尿样基质中的标准曲线如图1所示。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明专利申请范围的内容所作的等效变化与修饰,都应为本发明的技术范畴。
Claims (3)
1.一株能特异性分泌3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZY-2G5-3,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,保藏编号为CGMCC No.13090。
2.3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺单克隆抗体,其特征在于:它由保藏编号为CGMCCNo.13090的杂交瘤细胞株ZY-2G5-3分泌产生。
3.权利要求2所述3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺单克隆抗体的应用,其特征在于:用于尿样中3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺的检测。
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Address after: 214002 Liangxi Food Science and Technology Park, 7 Floors South Building, 898 Tongsha Road, Liangxi District, Wuxi City, Jiangsu Province Patentee after: Jiangnan University Address before: Food College of Jiangnan University No. 1800 Li Lake Avenue 214122 in Jiangsu province Wuxi City Binhu District Patentee before: Jiangnan University |
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