CN104357401B

CN104357401B - 可分泌抗ii型登革病毒ns1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用

Info

Publication number: CN104357401B
Application number: CN201410606685.4A
Authority: CN
Inventors: 张田; 谭军; 王益琼; 宋涛
Original assignee: Dongguan Biotechnology Industry Development Co ltd
Current assignee: Fapon Biotech Inc; Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
Priority date: 2014-10-30
Filing date: 2014-10-30
Publication date: 2018-01-09
Anticipated expiration: 2034-10-30
Also published as: CN104357401A

Abstract

本发明涉及一种灵敏度较高且特异性较强的II型登革病毒检测试纸，该检测试纸通过使用上述杂交瘤细胞分泌的抗II型登革病毒NS1单克隆抗体，在标记物为较大的纳米颗粒时，间接标记可以降低标记抗原的使用量，在提高灵敏度的同时改善特异性。此外，本发明还涉及一种可分泌抗II型登革病毒NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用。该杂交瘤细胞为两株，保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏号是CCTCC No：C2014183和CCTCC No：C2014182。

Description

可分泌抗II型登革病毒NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，尤其是涉及一种可分泌抗II型登革病毒NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用。

背景技术

登革病毒属于黄病毒科黄病毒属，主要通过埃及伊蚊传播，登革病毒包括4种血清型(I～IV型)，任何型别的登革病毒感染均可引起一系列的临床症状，表现为隐形感染、发热、登革热或更为严重的登革出血热和登革休克综合征。登革病毒主要流行于热带和亚热带地区，目前，全球有超过100个国家报告了登革热疫情，25亿人生活在感染的高危地区，每年有5千万～一亿的病例报告，其中有20万～50万例登革热感染成为登革出血热。在登革疫区中，多见4型登革病毒交替流行，更增加了不同型别反复感染的危险性。从发病率、死亡率和经济成本来说，登革热是世界上通过蚊媒传播的最严重的病毒性疾病。初次感染登革病毒所获得的免疫力对于同型病毒的再次感染可产生终身的免疫保护作用，但是对于其它型别登革病毒的再次感染仅能产生部分而且短暂的免疫保护作用。由于存在抗体依赖的感染增强作用，异型登革病毒再次感染是发生登革出血热/登革休克综合征的主要危险因素。

登革病毒基因组为单股正链RNA，由11000个核苷酸组成，病毒有3种结构蛋白和7种非结构蛋白。编码结构蛋白的基因区集中于5’端，编码非结构蛋白的基因区位于3’端，其顺序为：5’C–PreM–M–E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3’。目前使用的登革热诊断试剂主要是以全病毒或者重组E蛋白为抗原，检测抗登革病毒的IgM和IgG抗体。由于黄病毒结构蛋白之间具有共同抗原决定簇，存在交叉反应，用登革病毒结构蛋白为抗原的诊断试剂不能很好地满足临床诊断需要。NS1蛋白是登革病毒的一种非结构糖蛋白，在登革发病早期的血清中可以检测到登革病毒NS1蛋白，且其出现时间早于IgM抗体，因此检测急性期病人血清中的NS1抗原可用于早期诊断登革病毒感染。并且，有研究表明及早的临床处理可以减少登革出血热的发病率和致死率，那么，在尚未成功研制具有保护性的登革病毒疫苗和建立具有特异性的治疗措施以前，登革热的早期诊断就显得尤为重要。

发明内容

基于此，有必要提供一种可以用于II型登革病毒早期检测的II型登革病毒检测试剂盒，以及可应用在该II型登革病毒检测试剂盒中的可分泌抗II型登革病毒NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用。

一种可分泌抗II型登革病毒NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCC No：C2014183。

上述的杂交瘤细胞在制备II型登革病毒检测试剂或II型登革病毒检测设备中的应用。

在一个实施例中，所述抗II型登革病毒NS1单克隆抗体记为DN2-25，DN2-25作为检测抗体。

一种可分泌抗II型登革病毒NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCC No：C2014182。

上述的抗II型登革病毒NS1单克隆抗体在制备II型登革病毒检测试剂或检测设备中的应用。

在一个实施例中，所述抗II型登革病毒NS1单克隆抗体记为DN2-9，DN2-9作为捕获抗体。

一种II型登革病毒检测试纸，包括上述的DN2-25和如权利要求6所述的DN2-9。

在一个实施例中，包括支撑薄片、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、检测线及质控线，所述样品垫、所述金标垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸收垫从所述支撑薄片的一端向另一端依次设置在所述支撑薄片上，所述样品垫与所述金标垫部分重叠，所述金标垫与所述硝酸纤维素膜部分重叠，所述硝酸纤维素膜与所述吸收垫部分重叠，所述检测线及所述质控线设在所述硝酸纤维素膜上，且所述检测线设在靠近所述金标垫的一端，所述质控线设在靠近所述吸收垫的一端，所述金标垫上涂覆有DN2-25包附胶体金颗粒形成的胶体金标记的单克隆抗体，所述检测线为DN2-9，所述质控线为羊抗鼠IgG抗体。

一种II型登革病毒检测试剂盒，包括上述的II型登革病毒检测试纸。

上述杂交瘤细胞的分泌产量高，分泌得到的抗登革病毒NS1单克隆抗体具有高敏感性、高特异性等优点，可广泛应用在制备登革热早期分型诊断的检测领域，如检测试剂或检测设备的制备领域等，可以实现准确、快速地检测出II型登革病毒，而与其它I型、III型和IV型登革病毒无交叉，有利于对II型登革病毒作出早期分型诊断，且在特异性、灵敏度等方面较之传统的检测方法具有显著的优势，可以应用于II型登革病毒早期检测。

附图说明

图1为一实施方式的检测试纸的正面示意图；

图2为图1中检测试纸的纵截面示意图；

图3为检测试剂盒示意图；

图4为实施例1中Highfive细胞表达的NS1蛋白的SDS-PAGE照片；

图5为实施例1中小鼠腹水提取的纯化的DN2-25和纯化的DN2-9的SDS-PAGE照片。

具体实施方式

下面主要结合附图及具体实施例对可分泌抗II型登革病毒NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用作进一步详细的说明。

一实施方式的可分泌抗II型登革病毒NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞于2013年11月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC No：C2014183。该杂交瘤细胞可分泌出抗II型登革病毒NS1单克隆抗体的单克隆抗体，记为DN2-25，DN2-25可以作为检测抗体。DN2-25可以应用于II型登革病毒检测试剂或I型登革病毒检测设备的制备领域中。

另一实施方式的可分泌抗II型登革病毒NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞于2013年11月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC No：C2014182。该杂交瘤细胞也可分泌出抗II型登革病毒NS1单克隆抗体的单克隆抗体，记为DN2-9，DN2-9可以作为捕获抗体。DN2-9可以应用于II型登革病毒检测试剂或I型登革病毒检测设备的制备领域中。

一实施方式的II型登革病毒检测试剂盒包括壳体、II型登革病毒检测试纸和其他检测试剂。

如图1和图2所示，本实施方式的II型登革病毒检测试纸100包括支撑薄片110、样品垫120、金标垫130、硝酸纤维素膜140、吸收垫150、检测线160及质控线170。样品垫120、金标垫130、硝酸纤维素膜140及吸收垫150从支撑薄片110的一端向另一端依次设置在支撑薄片110上。样品垫120与金标垫130部分重叠，金标垫130与硝酸纤维素膜140部分重叠，硝酸纤维素膜140与吸收垫150部分重叠。检测线160及质控线170设在硝酸纤维素膜140上，且检测线160设在靠近金标垫130的一端，质控线170设在靠近吸收垫150的一端。支撑薄片110采用不吸水的材料制作。样品垫120用于样品点样。金标垫130上涂覆有DN2-25包附胶体金颗粒形成的胶体金标记的DN2-25。检测线160为DN2-9。质控线170为羊抗鼠IgG抗体。

如图3所示，检测试纸100可置于检测试剂盒的壳体200内。壳体200上开设有加样孔210及观察窗220。加样孔210对应样品垫120的位置。检测线160及质控线170裸露于观察窗220中，方便观察。

其他检测试剂可以根据需要直接在实验室制备。

上述检测试剂盒利用双抗体夹心法来检测被检材料中的是否含有NS1蛋白。检测时，NS1蛋白先和胶体金标记的DN2-25结合形成NS1-胶体金标记的DN2-25复合物，由于毛细管作用，NS1-胶体金标记的DN2-25复合物沿硝酸纤维素膜140向前泳动，到达检测线160时，NS1-胶体金标记的DN2-25复合物会与DN2-9结合，形成DN2-9-NS1-胶体金标记的DN2-25的复合物，从而富集在检测线160上，形成红色沉淀线。未结合NS1蛋白的胶体金标记的DN2-25则通过检测线160，被羊抗鼠IgG抗体捕获，富集在质控线170上，形成红色沉淀线。当检测线160与质控线170上同时有红色沉淀线时判为阳性结果。若样品中不含有NS1蛋白，未结合NS1蛋白的胶体金标记的DN2-25到达检测线160时，不会形成DN2-9-NS1蛋白-胶体金标记的DN2-25复合物，未结合NS1蛋白的胶体金标记的DN2-25通过检测线160，仅富集在质控线170上形成红色沉淀线，此时判为阴性结果。

此外，在其他实施方式中，该检测试剂盒的结构不限于上文描述。上述单克隆抗体除应用在上述胶体金标记的单抗检测试剂盒外，还可以用于其他II型登革病毒检测试剂盒或设备中。本领域技术人员可以理解，将本实施方式的单克隆抗体直接或间接结合其他信号基团(如磁性微球、辣根过氧化酶等)，或将本实施方式的单克隆抗体作为包被抗体(例如ELISA)，则可用于其他形式的NS1蛋白检测试剂或设备。故本实施方式所制备得到的杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体可广泛适用于制备NS1蛋白检测试剂或设备。

通过使用上述杂交瘤细胞分泌的抗II型登革病毒NS1单克隆抗体，在标记物为较大的纳米颗粒如胶体金、乳胶或其他纳米颗粒类标记物时，间接标记可以降低标记抗原的使用量，在提高灵敏度的同时改善特异性。间接标记相对于传统双抗原夹心法的两部特异识别而言相对于多了一步特异识别，即三步特异识别，可以提高检测试剂盒的特异性，而且相对标记抗原的纯度要求降低又可以降低检测试剂盒的成本。通过使用上述抗II型登革病毒NS1单克隆抗体，制备得到的试剂盒与现有II型登革病毒检测试剂盒相比，在特异性、灵敏度及检出率方面都具有显著的优势。

下面主要结合附图及具体实施例对可分泌抗NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞及相关应用作进一步详细的说明。

实施例1

杂交瘤细胞的建立与抗II型登革病毒NS1单克隆抗体的制备。

1、免疫原的制备。

用昆虫细胞(本实施例中为sf9细胞和High Five细胞)表达的重组II型登革病毒NS1蛋白作为免疫原。将II型登革病毒NS1基因(上海生工生物工程股份有限公司)与杆状病毒的基因组(购自上海英骏生物技术有限公司)进行同源重组，构建携带II型登革病毒NS1基因的杆状病毒，再通过转染sf9细胞(购自上海英骏生物技术有限公司，由本公司保藏)，对重组杆状病毒进行大量扩增，将扩增好的重组杆状病毒感染High Five细胞(购自上海英骏生物技术有限公司，由本公司保藏)，通过Highfive细胞高效分泌表达目的NS1蛋白。

收集培养基上清，通过离子交换层析获得纯化的重组NS1蛋白，其SDS-PAGE分析跑胶得到图4。如图4所示，泳道1为纯化的重组NS1抗原，泳道2为蛋白Marker，纯化的重组NS1抗原的分子量约为40kD～50kD。

2、抗原免疫。

将昆虫细胞表达的II型重组登革病毒NS1抗原(1.3mg/ml，深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号AG-DN2-NS1-HP 0002)与等体积的弗氏完全佐剂(外观：琥珀色细胞悬浮液；组份：Paraffin Oil 85％，Mannide Monooleate 15％，Mycobacterium smegmatis1mg/ml)混合，得到油状乳液。将该油状乳液以0.2ml的剂量皮下施给BALB/c小鼠(广州省实验动物中心，6周龄雌性，5只)背部位点，第一次免疫14天后腹腔增强免疫(抗原与等量弗氏不完全佐剂混合)，增强免疫到四针后，采尾血进行效价检测，效价达到融合要求。

融合前3天，用相同剂量抗原腹腔注射追加免疫，免疫方法同上。

3、杂交瘤细胞的制备。

(1)饲养细胞的制备。

以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，将BALB/c鼠拉颈处死并用75％酒精全身浸泡，在超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI 1640基础培养液5ml，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用RPMI 1640筛选培养液(含HAT的RPMI 1640完全培养液中)重悬，调整细胞浓度1×10⁵个/ml，加入96孔板，150μl/孔，在37℃、5％CO₂环境中培养过夜。

(2)免疫脾细胞的制备。

小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI 1640基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清，RPMI 1640基础培养液重悬，如此重复三次，得到免疫脾细胞，计数。

(3)骨髓瘤细胞的制备。

将小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(深圳市菲鹏生物股份有限公司保存)经8-氮鸟嘌呤筛选后，培养至对数生长期，取两大瓶制成细胞悬液，离心，弃上清，用RPMI 1640基础培养液重悬，如些重复三次，得到骨髓瘤细胞，计数。

(4)细胞融合及HAT选择杂交瘤。

将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:10的细胞数量比例混合，在50ml塑胶离心管内用RPMI 1640基础培养液洗1次，在1200rpm下离心8分钟，弃上清，将细胞混匀，缓慢加入1ml50％的PEG1500融合，融合1分钟后加入15ml的RPMI 1640基础培养液终止细胞融合。1000rpm，离心5分钟，弃上清，用50ml的RPMI 1640筛选培养液轻轻混悬，平分于10块96孔板，50μl/孔，在37℃、5％CO₂环境中培养。培养至第六天，换HT培养液(含HT的RPMI 1640完全培养液)两次。

(5)抗体的检测。

用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释重组II型登革病毒NS1抗原(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号AG-DN2-NS1-HP 0002)，使其终浓度为8μg/ml。加入96孔聚苯乙烯板，每孔0.1ml，37℃2小时或4℃过夜。次日，用含10％小牛血清或1％脱脂奶粉的0.02MpH7.2PBS，0.15ml/孔，37℃封闭2小时，用于检测。重组融合后第七天，取细胞上清0.1ml于上述96孔检测板中，37℃30分钟，水洗六次后加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-MU0001)，37℃30分钟同上洗后，每孔加入100μl含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃15分钟，加入稀硫酸溶液，每孔50μl，测450nm吸收值。RPMI 1640完全培养液作为阴性对照，以测定值与对照值得比≧2.0为阳性细胞孔。

分泌抗体阳性细胞孔以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性孔依上法连续克隆三次，扩大培养后，用含10％DMSO的培养液冻存，细胞密度为10⁶个/ml。细胞融合一次共获得2株能稳定分泌抗II型登革病毒NS1单克隆抗体的细胞株，于2013年11月13日保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心(即中国典型培养物保藏中心)，保藏号是分别为CCTCC No：C2014183和CCTCC No：C2014182，二者分别分泌单抗DN2-25和单抗DN2-9。

4、单克隆抗体的制备。

选6～8周健壮的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml的降植烷；10天后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞。接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10ml腹水。收集腹水，离心取上清，放于-20℃冰箱保存。

取腹水上清，用滤纸过滤。在所得的滤液中加入2倍腹水体积的0.06M、pH4.4乙酸钠缓冲液，一边搅拌一边按40ul/ml腹水体积逐滴缓慢加入辛酸，在室温下搅拌反应30min后，离心30min，取上清经定性滤纸过滤后，用1M NaOH调pH至7.4，再加入与上清相同体积的饱和硫酸铵，4度反应2h，离心30min后，用适量的0.01M pH7.4PBS将沉淀复溶，再将复溶液4℃过夜透析，充分透析后的抗体用紫外分光光度法测量蛋白浓度，测定A280，蛋白浓度计算公式为：C＝A280/1.4×稀释倍数。

5、效价测定。

以间接ELISA法检测，上述能稳定分泌抗II型登革病毒NS1单克隆抗体的细胞株培养上清效价2.35×10³，腹水抗体效价1.41×10⁶。具体实验步骤如下：

(1)包被：将免疫的NS1抗原稀释至8ug/ml，100ul/孔加至酶标板，37度2小时或者4度过夜；

(2)用洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350ul，停留20秒；最后拍干；

(3)用洗涤液洗去包被液，用封闭液封闭，每孔150ul，37度放置1.5h-2h；

(4)洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350ul，停留20秒；最后拍干；

(5)加样品：分别将稀释成不同梯度的细胞培养上清和腹水加入用NS1蛋白包被好的酶标板，100ul/孔，37度反应1小时(同时做阴性对照孔和阳性对照孔)；

(6)洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350ul，停留20秒；最后拍干；

(7)加辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(用封闭液稀释2000倍)，100ul/孔，37度反应1小时；

(8)洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350ul，停留20秒；最后拍干；

(9)加显色液TMB：即用即配，100ul/孔，37度避光反应30分钟；

(10)终止反应：于各反应孔中加入2M的硫酸，50ul/孔；

(11)酶标仪读数：450nm，630nm波长测定，最终测定能稳定分泌抗II型登革病毒NS1单克隆抗体的细胞株培养上清与重组NS1抗原的反应效价为2.35×10³，腹水抗体与重组NS1抗原反应效价为1.41×10⁶。

6、单克隆抗体特性鉴定。

(1)免疫球蛋白亚类鉴定。

采用间接ELISA，包被纯化好的重组II型登革病毒NS1抗原，封闭后与杂交瘤细胞培养上清孵育，再分别与HRP标记羊抗小鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体反应，充分洗涤后TMB显色，测A450值。结果显示，本专利发明的两株单抗，其中单抗DN2-25为IgG2a，单抗DN2-9为IgM。为了进一步确定两株单抗的特性，分别进行了SDS-PAGE分析和序列测定，具体见图5。图5中泳道1为蛋白Marker，泳道2为纯化的DN2-25，泳道3为纯化的DN2-9。测得的DN2-25的基因序列包括重链序列和轻链序列，DN2-25的重链序列如SEQ ID NO.1所示，DN2-25的轻链序列如SEQ ID NO.2所示。测得的DN2-9的基因序列包括重链序列和轻链序列DN2-9的重链序列如SEQ ID NO.3所示，DN2-9的轻链序列如SEQ ID NO.4所示。

(2)单克隆抗体特异性鉴定。

采用间接ELISA法，分别用4个型的重组登革病毒NS1抗原和天然的登革病毒培养液包被微孔板，按照常规间接ELISA法进行检测。结果显示本专利发明的两株单克隆抗体均为II型特异性单抗。

(3)单克隆抗体竞争表位分析。

采用竞争抑制实验。纯化的NS1蛋白1ug/ml包被酶标板，先加入1mg/ml纯化的单抗50ul，再加入稀释的生物素标记单抗50ul，37℃孵育1h后用0.5％Tween 20的PBS洗板，加入100ulHRP标记亲和素，26℃孵育30min后洗板，TMB显色，测定A450值。以单抗对同一生物素标记单抗的抑制为阳性对照，以已知的无关单抗对标记单抗的抑制为阴性对照，计算各单抗间的抑制率。抑制率计算公式为：(1-各孔测定值/阴性对照值)×100。抑制率＞75％判定为表位相关，＞50％为不完全相关，＜50％为不相关，＜25％为完全不相关。结果显示2株单抗识别2个不完全相同的抗原位点。

实施例2

II型登革病毒NS1抗原胶体金检测试纸的制备。

1、硝酸纤维素膜的制备

包被缓冲液的配制：含6％甲醇、0.01M pH7.2PBS缓冲液为包被缓冲液，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期一周。1000ml 6％甲醇的0.01M pH 7.2PBS缓冲液配方：NaCL 8g、KCL 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KH₂PO₄0.2g、甲醇60ml，双蒸去离子水定容至1000ml。

硝酸纤维素膜的制备：用包被缓冲液将实施例1制得的单克隆抗体DN2-9稀释到1～5mg/ml，调整机器，划线为T线，即为检测线，T线靠近金标垫端，距金标垫端约5mm；用包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-MU0001)稀释到1～5mg/ml，调整机器，划线为C线，即为控制线，C线靠近吸收垫，距吸收垫约3mm。两线距离5～8mm，均匀。37℃烘干，封装备用。

2、胶体金、金标记单克隆抗体的制备。

(1)溶液的配制。

①氯金酸的配制：用双蒸去离子水溶解氯金酸，配成1％溶液，置4℃备用，有效期四个月。1000ml 1％氯金酸溶液配方：10g氯金酸：双蒸去离子水定容至1000ml。

②柠檬酸三钠的配制：用双蒸去离子水溶解柠檬酸钠，配成1％溶液，0.22μm膜滤过，置4度备用，有效期容至1000ml。

③0.1M碳酸钾的配制：用双蒸去离子水配制，0.22μm膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000ml0.1M碳酸钾溶液配方：13.8g碳酸钾；双蒸去离子水定容至1000ml。

④2％PEG-20000的配制：用双蒸去离子水配制，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml 2％PEG-20000溶液配方：20g PEG-20000；双蒸去离子水定容至1000ml。

⑤标记洗涤保存液的配制：2％牛血清白蛋白(BSA)，0.05％叠氮钠(NaN₃)，0.01MpH7.2PBS溶液，0.22μ膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml标记洗涤保存液配方：20gBSA，0.5g NaN₃、0.01M pH7.2PBS溶液定容至1000ml。

(2)胶体金的制备。

用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％，置电炉煮沸，按每100ml 0.01％氯金酸加入2ml 1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期一周。

(3)胶体金标记单克隆抗体的制备。

用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，按8～10μg抗体/ml胶体金加入实施例1中制备得到的单克隆抗体DN2-25，磁力搅拌器混匀30min，搅拌下加入BSA至终浓度为1％静置1小时。13000rpm、4℃离心30min，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的标记洗涤保存液将沉淀重悬，置4℃备用，有效期一周。

3、金标垫的制备

(1)封闭液的配制。

2％BSA，0.1％TritonX-100、0.05％NaN₃，0.01M pH7.2PBS溶液，0.22μm膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000ml封闭液配方：20g BSA，0.5g NaN₃、1ml TritonX-100、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。

(2)金标垫的制备。

将金标垫浸泡于封闭液中30min后，于37℃烘干。然后将制备好的金标记抗体均匀的铺在金标垫上，每毫升溶液铺20平方厘米，冷冻干燥，封装，置4℃备用。

4、试纸条样品垫的制备

(1)封闭液的配制。

2％BSA，0.1％TrtionX-100、0.05％NaN₃，0.01M pH7.2PBS溶液，0.22μm膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000ml封闭液配方：20g BSA，0.5g NaN₃、1ml TrtionX-100、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。

(2)样品垫的制备。

将样品垫浸泡于封闭液中30min后，于37℃烘干，封装，置4℃备用。

5.检测试纸的组装

将吸收垫(购自Millipore公司)、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫设置在不吸水的支撑薄片上，切成3mm宽的小条。每十小条一包，加入干燥剂，真空封装，得到所述检测试纸。

实施例3

检测II型登革病毒NS1蛋白的试剂盒。

1、快速检测II型登革病毒NS1蛋白的试剂盒包括：实施例2制作的检测试纸及样品稀释液。

样品稀释液为8％NaCl溶液。配制方法：80gNaCl，加蒸馏水定容至1000ml。

2、胶体金法检测II型登革病毒NS1蛋白。

(1)直接吸取120μl采集好的人血清或血浆加入到试纸卡加样孔，等待15min后即可观察结果。

(2)结果判定：当试纸条出现肉眼可见的红色质控线，没有出现肉眼可见的红色检测线，结果判为阴性；当试纸条出现肉眼可见的红色质控线，同时也出现肉眼可见的红色检测线，结果判为阳性。检测线颜色越深说明被检测样品的II型登革病毒NS1蛋白水平越高。当试纸条没有出现肉眼可见的紫红色质控线，不管有没有出现肉眼可见的紫红色检测线，结果都判为检测试纸条失效，应废弃。

实施例4

快速检测II型登革病毒NS1蛋白试剂盒的应用。

以Panbio Dengue Early ELISA试剂盒(E-DEN02P)检出的NS1阳性样本和阴性样本作为本试剂盒的检测样本，其中89例登革NS1检出阳性样本，500例检出阴性样本，89例阳性标本再通过商品化的登革病毒分型多重PCR试剂盒进行RT-PCR分型检测，其中37份为II型登革病毒，剩下的52份阳性标本中18份为I型登革病毒、13份为III型登革病毒、21份为IV型登革病毒。采用本专利发明的II型登革病毒NS1检测试剂盒检测上述89份阳性样本和500份阴性样本，检出结果见表1。

表1：实施例3的II型登革病毒NS1检测试剂盒的检测结果

由表1可以看出，本试剂盒检出II型阳性标本33份，相对灵敏度为89.19％；其他3个型的标本均未检出，500份阴性样本检出500份，相对特异性为100％。该结果与PanbioDengue Early ELISA试剂盒及商品化的登革病毒分型多重PCR试剂盒的结果符合率为99.32％。说明实施例3制作的检测试剂盒完全可以用于登革病毒早期分型快速诊断。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种II型登革病毒检测试纸，其特征在于，包括支撑薄片、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、检测线及质控线，所述样品垫、所述金标垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸收垫从所述支撑薄片的一端向另一端依次设置在所述支撑薄片上，所述样品垫与所述金标垫部分重叠，所述金标垫与所述硝酸纤维素膜部分重叠，所述硝酸纤维素膜与所述吸收垫部分重叠，所述检测线及所述质控线设在所述硝酸纤维素膜上，且所述检测线设在靠近所述金标垫的一端，所述质控线设在靠近所述吸收垫的一端，所述金标垫上涂覆有DN2-25包附胶体金颗粒形成的胶体金标记的单克隆抗体，所述检测线为DN2-9，所述质控线为羊抗鼠IgG抗体；

所述DN2-25为保藏号为CCTCC No：C2014183的杂交瘤细胞分泌的抗II型登革病毒NS1单克隆抗体；

所述DN2-9为保藏号为CCTCC No：C2014182的杂交瘤细胞分泌的抗II型登革病毒NS1单克隆抗体。

2.一种II型登革病毒检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的II型登革病毒检测试纸。