CN106290847A - 一种登革热病毒ns1抗原乳胶法检测试剂盒 - Google Patents

一种登革热病毒ns1抗原乳胶法检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN106290847A
CN106290847A CN201510242995.7A CN201510242995A CN106290847A CN 106290847 A CN106290847 A CN 106290847A CN 201510242995 A CN201510242995 A CN 201510242995A CN 106290847 A CN106290847 A CN 106290847A
Authority
CN
China
Prior art keywords
latex
dengue
polyester film
sensitization
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510242995.7A
Other languages
English (en)
Inventor
白春梦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANGHAI CHEMTRON BIOTECH CO Ltd
Original Assignee
SHANGHAI CHEMTRON BIOTECH CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI CHEMTRON BIOTECH CO Ltd filed Critical SHANGHAI CHEMTRON BIOTECH CO Ltd
Priority to CN201510242995.7A priority Critical patent/CN106290847A/zh
Publication of CN106290847A publication Critical patent/CN106290847A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/545—Synthetic resin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及乳胶法免疫层析领域，具体公开了一种登革热NS1抗原乳胶法检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上，所述致敏乳胶聚酯膜上包被有彩色乳胶颗粒标记的抗登革热NS1单克隆抗体-1，免疫硝酸纤维素膜上设有包被了抗登革热NS1单克隆抗体-2的检测线和包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线。本发明的登革热NS1抗原乳胶法检测试剂盒反应灵敏，检测方便、检测结果稳定，节约成本。

Description

一种登革热病毒NS1抗原乳胶法检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，用于检测登革热NS1抗原的检测试剂盒及其制备方法，系利用免疫层析技术及双抗体夹心法的原理，以乳胶法作为标记物，定性检测人类血清或血浆中的登革热NS1抗原。
背景技术
登革热(Dengue Fever)是登革热病毒引起的一种急性传染病。登革热病毒是一种小型黄病毒，属于黄热病毒属，能引起登革热急性传染病，通常由伊蚊传播，登革热病毒能够引起一系列临床症状，感染登革热病毒轻则突然发热、剧烈肌肉疼痛、骨关节痛，重则广泛出血、迅速休克，甚至死亡，对人危害大，是《中华人民共和国传染病防治法》规定必须上报的乙类传染病。
登革热病毒NS1抗原是登革热病毒在侵染和复制过程中表达的一种非结构特异性抗原。血液(血清或血浆)中登革热NS1的检出，对诊断登革热有重要临床意义。
登革热病毒广泛流行于全球热带及亚热带的60多个国家和地区，每年超过一亿人受感染，25亿以上的人受到威胁，登革病毒的传播现已经成为热带、亚热带地区严重的公共卫生问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术缺陷，从提高检测灵敏度出发，提供一种检测灵敏度高、特异性强、检测快速的登革热NS1抗原乳胶法检测试剂盒。
本发明的第一方面公开了一种登革热NS1抗原乳胶法检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上，所述致敏乳胶聚酯膜上包被有彩色乳胶颗粒标记的抗登革热NS1单克隆抗体-1，免疫硝酸纤维素膜上设有包被了抗登革热NS1单克隆抗体-2的检测线和包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线。
较优的，所述彩色乳胶颗粒为粒径290～300nm的聚苯乙烯颗粒。
较优的，所述彩色乳胶颗粒的颜色为红色。
抗登革热NS1单克隆抗体-1可以与抗登革热NS1单克隆抗体-2为相同的单克隆抗体，也可以为不同的单克隆抗体。
本发明的另一方面，提供了一种登革热NS1抗原乳胶法检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)致敏乳胶颗粒的制备：用羧基化的聚苯乙烯标记抗登革热NS1单克隆抗体-1，获得致敏乳胶颗粒；
2)致敏乳胶聚酯膜的制备：用步骤1)获得的致敏乳胶颗粒包被聚酯膜，获得致敏乳胶聚酯膜；
3)将抗登革热NS1单克隆抗体-2和羊抗鼠IgG多克隆抗体分别喷在硝酸纤维素膜检测线(T线)和质控线(C线)的位置上，烘干备用，制得免疫硝酸纤维素膜；
4)将滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC片上，切裁制得试剂条；
5)将试剂条装入塑料盒，获得登革热NS1抗原乳胶法检测试剂盒。
较优的，所述步骤1)致敏乳胶颗粒的制备为：
a.取一定体积的羧基化的聚苯乙烯，用2～3倍体积20mM pH 6.0的碳酸缓冲溶液多次冲洗、离心、弃上清，获得羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀；
b.用1～1.5倍体积20mM pH6.0的磷酸缓冲溶液悬浮上一步获得的羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀，并加入1～1.5倍体积的水溶性炭化二亚胺，室温下搅拌20～30分钟，最后用2～3倍体积0.01M pH 8.0的硼酸缓冲溶液多次冲洗、离心、弃上清，获得待标记物；
c.向步骤b获得的所述待标记物中加入2～3倍体积0.2M pH 7.0的硼酸缓冲液制成乳胶悬液，并向所述乳胶悬液中加入抗登革热NS1单克隆抗体-1；
d.充分反应过夜，加入终止剂终止反应，获得致敏乳胶颗粒。
在致敏乳胶颗粒的制备过程中，加入的水溶性炭化二亚胺、各缓冲溶液的体积均以初始所取的羧基化的聚苯乙烯的体积为基准，按本发明所述的体积倍数加入：如所取的羧基化的聚苯乙烯颗粒的体积为1ml，则需要加入的pH 6.0 20mM的磷酸缓冲溶液体积可以为1～1.5ml，pH 7.0 0.2M的硼酸缓冲液的体积为2～3ml。
更优的，所述步骤a中碳酸缓冲溶液为20mM pH 6.0含0.01％SDS的碳酸缓冲溶液。添加有SDS的碳酸缓冲溶液可以更好的洗去乳胶的表面活性物，清洗效果更好。
更优的，所述步骤a中羧基化的聚苯乙烯浓度为6～12w/v％。
更优的，所述步骤a中的离心条件为12000～14000rpm，离心10min。
更优的，所述步骤b中水溶性炭化二亚胺的浓度为9～10mg/ml。
更优的，所述步骤b中的离心条件为12000～14000rpm，离心10min。
更优的，所述步骤c乳胶悬液中羧基化的聚苯乙烯颗粒偶联抗登革热NS1单克隆抗体-1的量为：0.5mg抗登革热NS1单克隆抗体-1/10mg聚苯乙烯颗粒。
更优的，所述步骤d中终止剂为50mM pH 8.2的Tris-HCl。
本发明中，v％指体积百分比；w/v％指重量体积百分比，如1w/v％即为100ml溶液中含1g物质。
较优的，所述步骤2)中致敏乳胶聚酯膜的制备具体步骤为：
A.用乳胶缓冲液稀释致敏乳胶颗粒，获得0.3～0.5w/v％的致敏乳胶溶液；
B.用步骤A制备好的致敏乳胶溶液喷涂聚酯膜，干燥，制得致敏乳胶聚酯膜。
更优的，所述步骤A中的乳胶缓冲液配方如下：9～11v％1.0M Tris液，0.25～0.35w/v％聚乙二醇20000，0.18～0.20w/v％牛血清白蛋白，0.15～0.25w/v％脱脂牛奶，0.28～0.30w/v％酪蛋白，和0.04～0.06w/v％叠氮化钠，用盐酸调节pH至8.0±0.02，余量为水。
最优的，所述步骤A中的乳胶缓冲液配方如下：10v％1.0M Tris液、0.3w/v％聚乙二醇20000、0.2w/v％牛血清白蛋白，0.2w/v％脱脂牛奶、0.3w/v％酪蛋白，和0.05w/v％叠氮化钠，用盐酸调节pH至8.0±0.02，余量为水。
进一步较优的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，本发明所述的乳胶缓冲液还包括下列组分：果糖、氯化钾和甘氨酸，且果糖、氯化钾和甘氨酸的总浓度为3.25～4.75g/L，缓冲液的pH值为7.3－7.5。
更优选的，各组分在乳胶缓冲液中的浓度为：
果糖1.0-2.0g/L；氯化钾0.25-0.5g/L；甘氨酸2.0-2.25g/L。
更优的，步骤B中用致敏乳胶溶液喷涂聚酯膜，每261mm×220mm聚酯膜上喷涂1.28ml致敏乳胶溶液，干燥，制得致敏乳胶聚酯膜。
较优的，所述步骤3)中，喷在硝酸纤维素膜质控线(C线)上的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为1.0～2.0mg/ml，喷在硝酸纤维素膜检测线(T线)上的抗登革热NS1单克隆抗体-2浓度为1.0～2.0mg/ml。较优的，每50m长硝酸纤维素膜分别包被有6ml的羊抗鼠IgG多克隆抗体和6ml的抗登革热NS1单克隆抗体-2溶液，检测线和质控线的间距为4.0～6.0mm。
本发明制备的登革热NS1抗原乳胶法检测试剂盒灵敏度高，特异性强此外本发明的试剂盒还具有操作简单，价格低，储存和运输方便等优点。
本发明登革热NS1抗原检测试剂盒的使用方法：
1.样品的检测：用吸管吸取样品液2-3滴加入到样品槽中，待检样品在毛细作用下向吸水纸端层析，依次通过聚酯膜、硝酸纤维素膜。到达聚酯膜后，被乳胶标记的抗体充分识别并结合，继续层析到硝酸纤维素膜上，与硝酸纤维素膜上包被的抗登革热NS1单克隆抗体-2发生免疫反应，显现出相应的红色线条。
2.结果的判读：在滴加样品后8-15分钟判读结果。
阳性：在检测试剂条的检测线和质控线位置各出现一条红色线条，表示样品中有登革热NS1抗原的存在。
阴性：只在质控线位置出现一条红色线条，表示样品中无登革热NS1抗原的存在。
无效：质控线位置无红线出现，表示结果无效，应重试。
本发明的有益效果在于：本发明的登革热NS1抗原乳胶法检测试剂盒灵敏度高，特异性强；此外本发明的试剂盒还具有操作简单，价格低，储存和运输方便等优点。
附图说明
图1：登革热NS1抗原乳胶法检测试剂盒试剂条示意图(1.滤样纸2.致敏乳胶聚酯膜3.免疫硝酸纤维素膜4.吸水纸5.检测线6.质控线)
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1登革热NS1抗原乳胶法检测试剂盒的制备
制备步骤：
方法1：
1.致敏乳胶颗粒的制备：
a.取0.4ml 10％羧基化的聚苯乙烯乳胶放入离心管中，加入1ml pH 6.0含0.01％SDS 20mM的碳酸缓冲液冲洗两次，14000g/min离心10min，弃上清，获得羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀。
b.用0.5ml pH 6.0 20mM的磷酸缓冲溶液悬浮上一步获得的羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀，并加入0.5ml 10％水溶性炭化二亚胺，室温下搅拌30分钟，最后用0.8ml 0.01M pH 8.0的硼酸缓冲溶液冲洗三次、离心、弃上清，获得待标记物。
c.向步骤b获得的待标记物中加入1ml 0.2M pH 7.0的硼酸缓冲液制成乳胶悬液，并向该乳胶悬液中加入2mg抗登革热NS1单克隆抗体-1。
d.充分反应12小时后，加入50mM pH8.2的Tris-HCl作为终止剂终止反应，获得致敏乳胶颗粒。
2.致敏乳胶聚酯膜的制备：
(1)乳胶缓冲液的制备：取800ml纯化水，往里加入100ml 1.0M Tris液，准确称取3.0g聚乙二醇20000、2.0g牛血清白蛋白，2.0g脱脂牛奶，3.0g酪蛋白溶液，0.5g叠氮化钠，1.5g果糖，0.4g氯化钾，2.20g甘氨酸，加入溶液中，充分溶解，混合均匀，用盐酸调节pH至8.0，加纯化水至总体积1000ml。
(2)用上一步的乳胶缓冲液稀释致敏乳胶颗粒，获得0.4w/v％的致敏乳胶溶液。
(3)取1.28ml致敏乳胶溶液用点乳胶机喷点在预处理后的聚酯膜上，置于37℃的温度下烘干2小时，密封4-30℃下避光保存，制得致敏乳胶聚酯膜。
3.免疫硝酸纤维素膜的制备：
将2.0mg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗体和1.5mg/ml抗登革热NS1单克隆抗体-2分别喷在硝酸纤维素膜质控线和检测线的位置上，37℃下烘干2小时，密封4-30℃下避光保存，制得免疫硝酸纤维素膜。每50m长硝酸纤维素膜分别包被有6ml的羊抗鼠IgG多克隆抗体和抗登革热NS1单克隆抗体-2溶液，检测线和质控线的间距为5mm。
4.将滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC片上，切裁制得试剂条；将试剂条装入塑料盒制得检测试剂盒，获得登革热NS1抗原乳胶法检测试剂盒。
(如图1所示)。
方法2：
1.致敏乳胶颗粒的制备：
a.取1ml 6％羧基化的聚苯乙烯乳胶放入离心管中，加入2ml pH 6.0含0.01％SDS20mM的碳酸缓冲液冲洗三次，12000g/min离心10min，弃上清，获得羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀。
b.用1.5ml pH 6.0 20mM的磷酸缓冲溶液悬浮上一步获得的羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀，并加入1.5ml 9％水溶性炭化二亚胺，室温下搅拌20分钟，最后用3ml 0.01M pH 8.0的硼酸缓冲溶液冲洗三次、离心、弃上清，获得待标记物。
c.向步骤b获得的待标记物中加入2ml pH 7.0 0.2M的硼酸缓冲液制成乳胶悬液，并向该乳胶悬液中加入2.5mg抗登革热NS1单克隆抗体-1。
d.充分反应过夜后，加入终止剂终止反应，获得致敏乳胶颗粒。
2.致敏乳胶聚酯膜的制备：
(1)乳胶缓冲液的制备：取800ml纯化水，往里加入90ml 1.0M Tris液，准确称取3.5g聚乙二醇20000、1.8g牛血清白蛋白，1.5g脱脂牛奶，3.0g酪蛋白溶液，0.6g叠氮化钠1.0g果糖，0.25g氯化钾，2.00g甘氨酸，加入溶液中，充分溶解，混合均匀，用盐酸调节pH至8.0，加纯化水至总体积1000ml。
(2)用上一步的乳胶缓冲液稀释致敏乳胶颗粒，获得0.2w/v％的致敏乳胶溶液。
(3)取1.28ml致敏乳胶溶液用点乳胶机喷点在预处理后的聚酯膜上，置于37℃的温度下烘干2小时，密封4-30℃下避光保存，制得致敏乳胶聚酯膜。
3.免疫硝酸纤维素膜的制备：
将1.5mg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗体和2.0mg/ml抗登革热NS1单克隆抗体-2分别喷在硝酸纤维素膜质控线和检测线的位置上，37℃下烘干2小时，密封4-30℃下避光保存，制得免疫硝酸纤维素膜。每50m长硝酸纤维素膜分别包被有6ml的羊抗鼠IgG多克隆抗体和抗登革热NS1单克隆抗体-2溶液，检测线和质控线的间距为5mm。
4.同方法1。
方法3：
1.致敏乳胶颗粒的制备：
a.取0.5ml 12％羧基化的聚苯乙烯乳胶放入离心管中，加入1.5ml pH 6.0含0.01％SDS20mM的碳酸缓冲液冲洗两次，13000g/min离心10min，弃上清，获得羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀。
b.用0.5ml pH 6.0 20mM的磷酸缓冲溶液悬浮上一步获得的羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀，并加入0.5ml 10％水溶性炭化二亚胺，室温下搅拌25分钟，最后用1.5ml 0.01M pH8.0的硼酸缓冲溶液冲洗两次、离心、弃上清，获得待标记物。
c.向步骤b获得的待标记物中加入1.5ml pH 7.0 0.2M的硼酸缓冲液制成乳胶悬液，并向该乳胶悬液中加入3.75mg抗登革热NS1单克隆抗体-1。
d.充分反应过夜后，加入终止剂终止反应，获得致敏乳胶颗粒。
2.致敏乳胶聚酯膜的制备：
(1)乳胶缓冲液的制备：取800ml纯化水，往里加入110ml 1.0M Tris液，准确称取2.5g聚乙二醇20000、1.9g牛血清白蛋白，2.5g脱脂牛奶，2.8g酪蛋白溶液和0.4g叠氮化钠2.0g果糖，0.5g氯化钾，2.25g甘氨酸加入溶液中，充分溶解，混合均匀，用盐酸调节pH至8.0，加纯化水至总体积1000ml。
(2)用上一步的乳胶缓冲液稀释致敏乳胶颗粒，获得0.6w/v％的致敏乳胶溶液。
(3)取1.28ml致敏乳胶溶液用点乳胶机喷点在预处理后的聚酯膜上，置于37℃的温度下烘干2小时，密封4-30℃下避光保存，制得致敏乳胶聚酯膜。
3.免疫硝酸纤维素膜的制备：
将1.0mg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗体和1.0mg/ml抗登革热NS1单克隆抗体-2分别喷在硝酸纤维素膜质控线和检测线的位置上，37℃下烘干2小时，密封4-30℃下避光保存，制得免疫硝酸纤维素膜。每50m长硝酸纤维素膜分别包被有6ml的羊抗鼠IgG多克隆抗体和抗登革热NS1单克隆抗体-2溶液，检测线和质控线的间距为4mm。
4.同方法1。
实施例2对比试剂盒的制备
对比试剂盒的制备方法：乳胶缓冲液中不含果糖、氯化钾和甘氨酸，其他试剂及实验方法均同实施例1中方法1～3。
实施例4登革热NS1抗原乳胶法检测试剂盒的特异性实验
检测方法：
1.取实施例1制备的登革热NS1抗原乳胶法检测试剂盒和实施例2的对比试剂盒，将试剂盒放置在水平台面上。
2.待测样品的制备：按表1的四类实验对象，准备一个样品处理管，竖直放于处理管支架上，并在样品管里加入0.6ml蒸馏水；以人血清作为样品，将等体积血清倒入样品管中，充分搅拌均匀作为待测样品。
3.每类实验对象为100人，检测结果如表1：
表1登革热NS1抗原乳胶法检测试剂盒特异性试验结果
由上表可知，本发明的登革热NS1抗原乳胶法检测试剂盒对大肠杆菌及痢疾杆菌均无交叉反应，特异性良好。

Claims (10)

1.一种登革热NS1抗原检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上，其特征在于，所述致敏乳胶聚酯膜上包被有彩色乳胶颗粒标记的抗登革热NS1单克隆抗体-1，免疫硝酸纤维素膜上设有包被了抗登革热NS1单克隆抗体-2的检测线和包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述彩色乳胶颗粒为粒径290～300nm的聚苯乙烯颗粒。
3.权利要求1-2任一权利要求所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)致敏乳胶颗粒的制备：用羧基化的聚苯乙烯标记抗登革热NS1单克隆抗体-1，获得致敏乳胶颗粒；
2)致敏乳胶聚酯膜的制备：用步骤1)获得的致敏乳胶颗粒包被聚酯膜，获得致敏乳胶聚酯膜；
3)将抗登革热NS1单克隆抗体-2和羊抗鼠IgG多克隆抗体分别喷在硝酸纤维素膜检测线和质控线的位置上，烘干备用，制得免疫硝酸纤维素膜；
4)将滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC片上，切裁制得试剂条；
5)将试剂条装入塑料盒，获得登革热NS1抗原乳胶法检测试剂盒。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)致敏乳胶颗粒的制备为：
a.取一定体积的羧基化的聚苯乙烯，用2～3倍体积20mM pH 6.0的碳酸缓冲溶液多次冲洗、离心、弃上清，获得羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀；
b.用1～1.5倍体积20mM pH6.0的磷酸缓冲溶液悬浮上一步获得的羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀，并加入1～1.5倍体积的水溶性炭化二亚胺，室温下搅拌20～30分钟，最后用2～3倍体积0.01M pH 8.0的硼酸缓冲溶液多次冲洗、离心、弃上清，获得待标记物；
c.向步骤b获得的所述待标记物中加入2～3倍体积0.2M pH 7.0的硼酸缓冲液制成乳胶悬液，并向所述乳胶悬液中加入抗登革热NS1单克隆抗体-1；
d.充分反应过夜，加入终止剂终止反应，获得致敏乳胶颗粒。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a中碳酸缓冲溶液为20mM pH 6.0含0.01％SDS的碳酸缓冲溶液。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a中羧基化的聚苯乙烯浓度为6～12w/v％，所述步骤b中水溶性炭化二亚胺的浓度为9～10mg/ml。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c乳胶悬液中羧基化的聚苯乙烯颗粒偶联抗登革热NS1单克隆抗体-1的量为：0.5mg抗登革热NS1单克隆抗体-1/10mg聚苯乙烯颗粒。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中致敏乳胶聚酯膜的制备具体步骤为：
A.用乳胶缓冲液稀释致敏乳胶颗粒，获得0.3～0.5w/v％的致敏乳胶溶液；
B.用步骤A制备好的致敏乳胶溶液喷涂聚酯膜，干燥，制得致敏乳胶聚酯膜。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A中的乳胶缓冲液配方如下：9～11v％1.0M Tris液，0.25～0.35w/v％聚乙二醇20000，0.18～0.20w/v％牛血清白蛋白，0.15～0.25w/v％脱脂牛奶，0.28～0.30w/v％酪蛋白，和0.04～0.06w/v％叠氮化钠，用盐酸调节pH至8.0±0.02，余量为水。
10.权利要求1-2任一权利要求所述的试剂盒在制备登革热病毒检测试剂中的应用。
CN201510242995.7A 2015-05-13 2015-05-13 一种登革热病毒ns1抗原乳胶法检测试剂盒 Pending CN106290847A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510242995.7A CN106290847A (zh) 2015-05-13 2015-05-13 一种登革热病毒ns1抗原乳胶法检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510242995.7A CN106290847A (zh) 2015-05-13 2015-05-13 一种登革热病毒ns1抗原乳胶法检测试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106290847A true CN106290847A (zh) 2017-01-04

Family

ID=57630964

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510242995.7A Pending CN106290847A (zh) 2015-05-13 2015-05-13 一种登革热病毒ns1抗原乳胶法检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106290847A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109444414A (zh) * 2018-09-10 2019-03-08 珠海国际旅行卫生保健中心 应用AlphaLISA检测登革病毒的方法及对应的组合物、试剂盒
CN109134647B (zh) * 2018-08-28 2020-08-04 东莞市朋志生物科技有限公司 Ns1蛋白的结合蛋白
CN112162092A (zh) * 2020-09-30 2021-01-01 北京金沃夫生物工程科技有限公司 一种新型冠状病毒检测试剂盒
WO2023078452A1 (zh) * 2021-11-08 2023-05-11 东莞市朋志生物科技有限公司 一种抗登革ns1蛋白的抗体及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1202201A (zh) * 1995-11-14 1998-12-16 巴斯德研究所 抗登革热的多价疫苗
WO2011034678A1 (en) * 2009-09-21 2011-03-24 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Use of superhydrophobic surfaces for liquid agglutination assays
CN102636641A (zh) * 2012-03-26 2012-08-15 上海凯创生物技术有限公司 胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒及其制备工艺
CN104357401A (zh) * 2014-10-30 2015-02-18 深圳市菲鹏生物股份有限公司 可分泌抗ii型登革病毒ns1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1202201A (zh) * 1995-11-14 1998-12-16 巴斯德研究所 抗登革热的多价疫苗
WO2011034678A1 (en) * 2009-09-21 2011-03-24 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Use of superhydrophobic surfaces for liquid agglutination assays
CN102636641A (zh) * 2012-03-26 2012-08-15 上海凯创生物技术有限公司 胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒及其制备工艺
CN104357401A (zh) * 2014-10-30 2015-02-18 深圳市菲鹏生物股份有限公司 可分泌抗ii型登革病毒ns1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109134647B (zh) * 2018-08-28 2020-08-04 东莞市朋志生物科技有限公司 Ns1蛋白的结合蛋白
CN109444414A (zh) * 2018-09-10 2019-03-08 珠海国际旅行卫生保健中心 应用AlphaLISA检测登革病毒的方法及对应的组合物、试剂盒
CN112162092A (zh) * 2020-09-30 2021-01-01 北京金沃夫生物工程科技有限公司 一种新型冠状病毒检测试剂盒
WO2022068641A1 (zh) * 2020-09-30 2022-04-07 北京金沃夫生物工程科技有限公司 一种新型冠状病毒检测试剂盒及制备方法和检测方法
CN112162092B (zh) * 2020-09-30 2024-04-02 北京金沃夫生物工程科技有限公司 一种新型冠状病毒检测试剂盒
WO2023078452A1 (zh) * 2021-11-08 2023-05-11 东莞市朋志生物科技有限公司 一种抗登革ns1蛋白的抗体及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102489679B1 (ko) 바이러스 및 박테리아 감염의 복합 검출을 위한 방법 및 장치
US7785773B1 (en) Method of diagnosis and kit therefor
CN106290847A (zh) 一种登革热病毒ns1抗原乳胶法检测试剂盒
EP2303927A2 (en) Molecularly imprinted polymers for detecting microorganisms
CN101858914B (zh) 梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条及其制备方法
EP2290367A1 (en) Method for detecting objective substance and kit for detecting objective substance
WO2017202007A1 (zh) 检测早期糖尿病肾病的胶体金试纸条的制备方法
JP4486059B2 (ja) 免疫測定用ラテックス組成物
JP2018044920A (ja) イムノクロマトグラフィー用試薬組成物
JP2004245831A (ja) メンブレンアッセイ法
CN106290838A (zh) 一种登革热病毒IgG/IgM抗体乳胶法检测试剂盒
Li et al. Flow cytometry-based multiplexing antibody detection for diagnosis of African swine fever virus
JP2016161329A (ja) イムノクロマト法検査デバイスの試料添加部の形成方法及びイムノクロマト法検査デバイス
CN106632618A (zh) 一种猪戊型肝炎病毒orf2重组蛋白的制备方法及其orf2蛋白和检测试剂盒
JP2002541457A (ja) リポ多糖の免疫測定法と試験装置
WO2023017817A1 (ja) 免疫測定方法、検体希釈液、及びイムノクロマトグラフィーキット
WO2017163341A1 (ja) イムノクロマト法検査デバイスの試料添加部の形成方法及びイムノクロマト法検査デバイス
JP2005291780A (ja) 免疫測定に供する検体浮遊液調製用媒体組成物及びそれを用いる免疫測定方法
JP6676464B2 (ja) クラミジア・ニューモニエを検出する方法及びキット
JP5458344B2 (ja) 抗体固定化担体
Grace et al. Latex agglutination test for rapid on-site serodiagnosis of Japanese encephalitis in pigs using recombinant NS1 antigen
CN111868527B (zh) 试剂盒、测定试剂盒及测定方法
CN105974127A (zh) 一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体定量装置
CN105823892A (zh) 一种检测恶性疟疾的荧光胶乳免疫层析检测试剂及其制备方法
CN106290850A (zh) 霍乱弧菌o139乳胶法检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170104