CN105974127A - 一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体定量装置 - Google Patents

一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体定量装置 Download PDF

Info

Publication number
CN105974127A
CN105974127A CN201610404140.4A CN201610404140A CN105974127A CN 105974127 A CN105974127 A CN 105974127A CN 201610404140 A CN201610404140 A CN 201610404140A CN 105974127 A CN105974127 A CN 105974127A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hnl
antibody
mmp
solution
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610404140.4A
Other languages
English (en)
Inventor
蔡林君
杨津
姜春来
孔维
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin University
Original Assignee
Jilin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin University filed Critical Jilin University
Priority to CN201610404140.4A priority Critical patent/CN105974127A/zh
Publication of CN105974127A publication Critical patent/CN105974127A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体(HNL/MMP‑9)定量装置，属于免疫学检测技术领域。由5倍样品稀释液、25倍洗液、HNL/MMP‑9标准品浓度梯度冻干粉一套、抗MMP9抗体或抗HNL抗体包被的96孔酶标板、酶标抗HNL抗体溶液溶液或酶标抗MMP9抗体溶液、U型底96孔板、封板膜、酶底物溶液及终止液组成，所述HNL/MMP‑9标准品为人源HNL/MMP‑9。本发明特异性检出HNL/MMP‑9，而不检出游离MMP‑9、HNL及HNL同源二聚体。本试装置使用时孵育只需两步和清洗只需一步，显著缩短检测时间。因此，本发明具有特异性强和测试时间短等优点。本发明具有以HNL/MMP‑9为标志物诊断疾病(如乳腺癌)的实验室研究和潜在临床应用价值。

Description

一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二 聚体定量装置
技术领域
本发明属于免疫学检测技术领域，具体涉及一种基于酶联免疫吸附(ELISA)技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体(HNL/MMP-9)快速定量装置。
背景技术
人中性粒细胞脂质运载蛋白(human neutrophil lipocalin,HNL)也称中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)，是一脂质运载蛋白(J.Biol.Chem.1993,268:10425-10432；Scand.J.Clin.Lab.Invest.1994,54:365-376)。单体(momomer)、同源二聚体(homomer)及单体与MMP-9分子形成异源二聚体(HNL/MMP-9)是HNL在体液中的分子存在形式，不同分子形式HNL与不同的病理过程有关。如单体HNL可能与急性肾损伤有相对较高的相关性(Lancet 2005,365:1231-1238；Am.J.Nephrol.2004,24:307-315)，HNL/MMP-9可能与肿瘤侵袭有关。Cecilia A.Fernandez等人研究发现HNL/MMP-9与乳腺癌存在相关性，具有作为乳腺癌诊断生物标准物的潜力(Clin.Cancer Res.2005,11:5390-5395)。
单独定量HNL方法已经有很多公开报道，如国际专利WO/1995/029404A1、欧洲专利EP 2225268和中国专利ZL200980155194、ZL201220323587、ZL201420423962、201510184818等；定量MMP-9的方法如中国专利(申请号：201410180514.X)SPR(表面等离子共振)法检测溶液中的MMP-9,Andrea Staack等报道了酶联免疫吸附法(ELISA)定量MMP-9(BMC Urology2006,6:1-19)
除R&D Systems公司有一款HNL/MMP-9定量试剂盒产品(DM9L20)外，至今没有其他关于HNL/MMP-9的准确定量方法相关专利和文献的报道。R&D Systems HNL/MMP-9定量装置产品说明书表明采用该装置定量HNL/MMP-9需要用时约4.5小时，可见该产品十分费时。
发明内容
为了实现HNL/MMP-9分子的特异性快速定量，本发明设计并开发出基于酶联免疫吸附(ELISA)技术的HNL/MMP-9快速定量装置。该装置具有操作简单和使用快捷等优异性能，在HNL/MMP-9作为肿瘤等疾病生物标志物的实验室研究和未来临床应用方面具有极大应用潜力。
为了实现上述目标，本发明采取以下技术方案：
一种基于酶联免疫吸附技术(ELISA)的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体(HNL/MMP-9)快速定量装置，其特征在于：由5倍样品稀释液、25倍洗液、HNL/MMP-9标准品浓度梯度冻干粉一套、抗MMP-9抗体包被的96孔酶标板或抗HNL抗体包被的96孔酶标板、酶标抗HNL抗体或酶标抗MMP-9抗体、U型底96孔板、封板膜、酶底物溶液及终止液组成，所述HNL/MMP-9标准品为人源HNL/MMP-9；所述酶标抗体所标记的酶可用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等；所述定量装置是指经两步法可快速定量HNL/MMP-9，所述两步法快速定量HNL/MMP-9是指装置使用过程中孵育过程只需两次，所述两次孵育过程第一次是指将酶标抗HNL抗体加入抗MMP-9抗体包被的96孔酶标板或酶标抗MMP-9抗体加入到抗HNL抗体包被的96孔酶标板后快速加入标准品浓度梯度溶液和样品溶液后孵育20～40min，所述两次孵育过程第二次是指第一次孵育后将抗MMP-9抗体包被的96孔酶标板或抗HNL抗体包被的96孔酶标板经洗液工作液清洗后指加入酶底物溶液孵育10～20min后加入终止液。
将5倍样品稀释液用去离子水稀释5倍获得样品稀释液工作液；将25倍洗液用去离子水稀释25倍制成洗液工作液；所述标准品浓度梯度溶液是指将HNL/MMP-9标准品浓度梯度冻干粉加入200μL样品稀释液工作液制成；所述样品溶液是指经样品稀释液工作液稀释后的体液样本，所述体液样本包括尿液、血清、血浆、脑脊液、唾液等。
本发明装置具体组成、制备及使用方法如下：
1)本发明装置组成
表1：为本发明装置组成
2)制备方法
a)抗体包被的96孔酶标板的制备
(1)抗体包被酶标板
将抗MMP-9抗体或抗HNL抗体用25～100mmol/L Na2CO3-NaHCO3、pH 9.6的碳酸钠缓冲液稀释到2～6μg/mL制成抗体包被液；向96孔酶标板每孔加100μL抗体包被液；37℃孵育2h、室温孵育4h或4℃过夜；
抗MMP-9抗体可为商品化的抗MMP-9抗体(如Abcam的ab38898或ab51203等)或通过常规方法以MMP-9免疫动物制备的抗体或基因工程方法制备的抗MMP-9抗体，所述抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。
抗HNL抗体可为商品化的抗HNL抗体(如Abcam的ab63929、ab23477或P&M VengeDiagnostics Development公司的HNL mab 697等)或通过常规方法(Current protocolsin molecular biology.New York:John Wiley，2008 11.10.1-11.10.10)以人HNL免疫动物制备的抗体或基因工程方法制备的抗HNL抗体，所述抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。
(2)封闭酶标板
弃包被液；向96孔酶标板每孔加200～300μL封闭液(封闭液为含2％BSA(wt/vol)的25～100mmol/L Na2CO3-NaHCO3,pH 9.6的碳酸钠缓冲液)；37℃孵育2h、室温孵育4h或4℃过夜。
(3)固定酶标板
弃封闭液；向96孔酶标板每孔加200～300μL固定液(固定液为含50％蔗糖(wt/vol)、50％海藻糖(wt/vol)或25％蔗糖(wt/vol)和25％海藻糖(wt/vol)的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3,pH 9.6的碳酸钠缓冲液)；室温固定30min～2h。
(4)密封酶标板
弃固定液，室温晾干或25～30℃真空干燥；将酶标板和袋装干燥剂装进锡箔袋然后抽真空，4℃保存。
b)5倍样品稀释液
为含有2.5％BSA(wt/vol)、0.5％Tween-20(vol/vol)、0.5％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(wt/vol)、2％PEG-600(聚乙二醇600)(vol/vol)和0.1％NaN3(wt/vol)的磷酸根摩尔浓度为50mmol/L、pH 7.4的PBS缓冲液；
c)标准品浓度梯度冻干粉的制备
标准品浓度梯度冻干粉为不同浓度HNL/MMP-9溶液制备的冻干粉，HNL/MMP-9以文献方法从中性粒细胞分离纯化获得(J.Biol.Chem.1993,268:10425-10432；Scand.J.Clin.Lab.Invest.1994,54:365-376)。具体是将10ng纯化的HNL/MMP-9溶解在400μL样品稀释液工作液中，充分混匀，HNL/MMP-9的浓度为25ng/mL；然后将上述溶液用样品稀释液工作液进行2倍法梯度稀释获得浓度分别为12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.13ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL、0.39ng/mL的HNL/MMP-9标准品溶液各200μL，将以上溶液通过常规方法进行冻干，获得标准品浓度梯度冻干粉①-⑦一套。
样品稀释液工作液是将5倍样品稀释液用去离子水稀释5倍获得。
d)酶标抗体溶液的制备
酶标抗体是指通过常规的方法(Abcam的ab102850、ab102890、ab102887等)将辣根氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)等酶分子共价标记在抗HNL抗体或抗MMP-9抗体上。如果步骤a)抗体包被的酶标板中的抗体是抗MMP-9抗体，那么酶标抗体中的抗体就是抗HNL抗体；反过来如果步骤a)抗体包被的酶标板中的抗体是抗HNL抗体，那么酶标抗体中的抗体就是抗MMP-9抗体。
酶标抗体溶液为含有1％BSA(wt/vol)、0.1％NaN3(wt/vol)和0.5～1μg/mL酶标抗体的磷酸根摩尔浓度为50mmol/L、pH7.4的PBS缓冲液。
e)25倍洗液
为含有2.5％Tween-20(vol/vol)的磷酸根摩尔浓度为250mmol/L、pH 7.4的PBS缓冲液。
f)酶底物溶液和终止液
对应酶标抗体所标记的酶采用不同的酶底物溶液和终止液。该体系是已经公开成熟的常规方法，也有相应的商品化产品可供选择,如表2。
表2：酶标抗体的酶底物溶液和终止液体系
3)使用方法
使用步骤如下：
(1)取出上述制备的溶液、标准品浓度梯度冻干粉、抗体包被的96孔酶标板等，放置于室温环境平衡；
(2)将5倍样品稀释液和25倍洗液用去离子水分别稀释5倍和25倍，制成样品稀释液工作液和洗液工作液；
(3)将生物样本(血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液)用样品稀释液工作液(血清和血浆通常稀释50倍，尿液通常稀释25倍，唾液和脑脊液通常稀释5倍)稀释后制成样品溶液；
(4)向每管标准品浓度梯度冻干粉中加200μL的样品稀释液工作液，充分混匀制成标准品浓度梯度溶液；
(5)将步骤(4)和步骤(3)制备的标准品溶液和样品溶液各100μL加至U型底96孔板；
(6)将50μL酶标抗体溶液加至抗体包被的96孔酶标板；
(7)用多道移液器取50μL步骤(5)制备的U型底96孔板中的标准品溶液和样品溶液移至步骤(6)制备的96孔酶标板上；
(8)用封板膜盖住96孔酶标板，将96孔酶标板放置于酶标板震荡器上，150～180rpm、37℃孵育20～40min；
(9)倾倒96孔酶标板中的物质，用洗液工作液对96孔酶标板进行常规3～5次清洗；
(10)向96孔酶标板每孔中加入酶底物溶液100μL，避光条件下孵育10～20min；
(11)向96孔酶标板每孔中加入终止液100μL，轻轻混匀，30min内利用常规的分光光度计测定450nm处的吸光值；
(12)以标准品浓度梯度溶液的浓度值为横纵标，以标准品浓度梯度溶液450nm处的吸光值为纵坐标作标准曲线，再根据标准曲线及样品溶液450nm处的吸光值计算出样品溶液中异源二聚体(HNL/MMP-9)的浓度。
由于采取了以上技术方案，使本发明具有以下显著有益效果：
(1)本发明根据HNL异源二聚体是由HN L单体和MMP-9组成，因此HNL/MMP-9异源二聚体既有抗HNL抗体识别的表位也有抗MMP-9抗体识别的表位；而HNL单体和HNL同源二聚体只有抗HNL抗体识别的表位而没有抗MMP-9抗体识别的表位，游离MMP-9只有抗MMP-9抗体识别的表位而没有抗HNL抗体识别的表位。所以利用抗HNL抗体和抗MMP-9抗体组成的夹心ELISA能特异性检测出HNL/MMP-9，而不检出游离的HNL或MMP-9，也不检出HNL同源二聚体(图1)
(2)本发明利用酶对抗HNL抗体或抗MMP-9抗体直接标记得到酶标抗体，从而使本装置只需孵育两次、清洗一次就能完成整个实验，因此本发明测试时间显著缩短，只需常规夹心ELISA测试时间的1/5～1/4。
(3)本发明可用于以HNL/MMP-9为标志物诊断疾病(如乳腺癌)的实验室研究和潜在临床应用研究。
附图说明
图1为本发明一种人中性粒细胞载脂蛋白(HNL/MMP-9)异源二聚体的定量装置能特异性快速定量HNL/MMP-9的原理图。其中24代表用于抗体包被的96孔酶标板的一个孔，26代表用于包被96孔酶标板的抗HNL抗体、27代表用于包被96孔酶标板的抗MMP-9抗体，28代表HNL同源二聚体(由两个相同的(30)组成)、29代表HNL/MMP-9异源二聚体(由(30)和(31)组成)、30代表HNL单体、31代表MMP-9，32代表酶标抗MMP-9抗体、33代表酶标抗HNL抗体。图1左图由26包被24,26能识别HNL上的表位从而能结合30、28及29，32能识别MMP-9上的表位从而特异性结合29，因此该体系能特异性检测29(HNL/MMP-9)；32利用其上所标记的酶催化酶底物溶液产生有色产物，进而利用分光光度计获取特定波长下产物的吸光度值。图1右图由27包被24,27能识别MMP-9上的表位从而你们结合31和29,33能识别HNL上的表位从而特异性识别结合在27上的29，因此该体系能特异性检测29(HNL/MMP-9)，33利用其上所标记的酶催化酶底物溶液产生有色产物，进而利用分光光度计获取特定波长下产物的吸光度值。
图2为本发明一种基于酶联免疫吸附技术的异源二聚体人中性粒细胞载脂蛋白(HNL/MMP-9)快速定量装置实施例5绘制的参考标准曲线。
具体实施方式
下面将用实施例进一步说明本发明。需要声明的是：(1)本发明实施例是用于本发明的进一步解释而不是对本发明的限定；(2)根据本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的简单变化均包括在本专利的保护范围内；(3)本领域技术人员对所描述的具体实施例做各种修改或补充或替代，只要不偏离本发明权利要求书所定义的范围，均属于本发明的保护范围。
实施例1：一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体(HNL/MMP-9)快速定量装置的组成
表3：为实施例1装置的组成
实施例2：一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体(HNL/MMP-9)快速定量装置的组成
本实施例装置由以下部分组成(见表4)。
表4：实施例2装置的组成
序号 名称 数量
1 抗MMP-9抗体包被的96孔酶标板 1块(96孔)
2 5倍样品稀释液 1瓶(80mL)
3 HNL/MMP-9标准品浓度梯度冻干粉①-⑦ 1组共7管
4 ALP-抗HNL抗体 1管(5.5mL)
5 25倍洗液 1瓶(35mL)
6-A 碱性磷酸酶缓冲溶液 1瓶(15mL)
6-B NBT溶液 1管(200μL)
6-C BCIP溶液 1管(100μL)
7 3mol/L NaOH终止液 1瓶12mL
8 常规U型底96孔板 1块
9 封板膜 1张
10 使用说明书 1本
实施例3：一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体(HNL/MMP-9)快速定量装置的组成
本实施例装置由以下部分组成(见表5)。
表5：实施例3装置的组成
实施例4：一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体(HNL/MMP-9)快速定量装置的酶标板的制备
(1)抗体包被酶标板
将抗MMP-9抗体(Abcam的ab38898)用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3，pH 9.6的碳酸钠缓冲液稀释到2μg/mL制成抗体包被液；向96孔酶标板(Nuncflat-bottom 96wellplate)每孔加100μL抗体包被液；4℃过夜。
(2)封闭酶标板
弃包被液；向96孔酶标板每孔加200μL封闭液(封闭液为含2％BSA(wt/vol)的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3,pH 9.6的碳酸钠缓冲液)；37℃孵育2h。
(3)固定酶标板
弃封闭液；向96孔酶标板每孔加300μL固定液(固定液为25％的蔗糖(wt/vol)和25％的海藻糖(wt/vol)的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3,pH 9.6的碳酸钠缓冲液；室温固定1h。
(4)密封酶标板
弃固定液，25～30℃真空干燥；将酶标板和袋装干燥剂装进锡箔袋然后抽真空，4℃保存。
实施例5：一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体(HNL/MMP-9)快速定量装置的具体使用步骤
现以实施例1装置的使用为例说明本装置的具体使用步骤。
(1)取出上述制备的溶液、标准品浓度梯度冻干粉、抗体包被的96孔酶标板等，放置于室温环境平衡；
(2)将5倍样品稀释液和25倍洗液用去离子水分别稀释5倍和25倍，制成样品稀释液工作液和洗液工作液；
(3)将血清用样品稀释液工作液稀释50倍，得到样品溶液；
(4)向每管标准品浓度梯度冻干粉中加200μL样品稀释液工作液，充分混匀制成标准品浓度梯度溶液；
(5)将步骤(4)和(3)制备的标准品浓度梯度溶液和样品溶液各100μL加至U型底96孔板；
(6)将50μL HRP-抗HNL抗体加至抗MMP-9抗体包被的96孔酶标板；
(7)用多道移液器取50μL步骤(5)制备的U型底96孔板中的标准品浓度梯度溶液和样品溶液加至步骤(6)中的96孔酶标板上；
(8)用封板膜盖住96孔酶标板，将96孔酶标板放置于酶标板震荡器上，180rpm,37℃孵育20min；
(9)倾倒96孔酶标板中的物质，用洗液工作液对96孔酶标板进行3次清洗，最后一次清洗后将96孔酶标板倒扣在吸水滤纸上10s；
(10)在清洗结束前，将TMB底物溶液A和TMB底物溶液B分别通过颠倒试剂瓶混匀，取等体积溶液A和溶液B混匀制成TMB底物工作液；
(11)加入TMB底物100μL至96孔酶标板，盖上封板膜和锡箔纸，孵育15min；
(12)加入100μL、2mol/L H2SO4的终止液，轻轻混匀30S，30min内利用常规的分光光度计以540nm波长为参考、读取450nm波长下的吸光值；
(13)以浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线趋势线公式计算样品中HNL浓度。
表6：不同浓度HNL/MMP-9标准品溶液对应的450nm波长处的吸光度值
HNL/MMP-9浓度(ng/mL) O.D.1 O.D.2 平均值
0 0.008 0.009 0.0085
0.20 0.032 0.040 0.036
0.39 0.077 0.064 0.0705
0.78 0.149 0.152 0.1505
1.56 0.341 0.368 0.3545
3.13 0.751 0.703 0.727
6.25 1.425 1.440 1.4325
12.50 2.643 2.601 2.622
根据表6绘制实施例5的标准曲线(图2)。由表6可以得出本装置定量异源二聚体的浓度可低至0.2ng/mL，结合图2可以得出本装置定量同源二聚体的线性范围为0.2ng.mL～12.5ng/mL。
本实施例装置的批内差异CV平均值为5.94％(范围0.78％～9.03％,n＝12)，批间差异CV平均值为8.25％(范围为1.22％～14.30％,n＝3)。
通过向已知HNL/MMP-9浓度(C0)的尿液中加入已知浓度(C1)的HNL/MMP-9、MMP-9、HNL及同源二聚体HNL,利用本实施例获得尿溶液中的HNL/MMP-9测定值浓度(C2)；理论值浓度为C3。根据公式(1)回收率1(％)＝C3÷C2×100％和公式(2)回收率2(％)＝(C2-C0)÷C1×100％计算得到以上分子在尿样中的回收率(表7)。
表7：HNL/MMP-9、MMP-9、HNL及HNL同源二聚体在尿液中的回收率
表7数据显示本装置能特异性定量尿液样本中的HNL异源二聚体，而对游离的MMP-9、单体HNL及同源二聚体HNL则不检出。由此可以得出本方法有很高的特异性和灵敏度。

Claims (8)

1.一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体HNL/MMP-9定量装置，其特征在于：由5倍样品稀释液、25倍洗液、HNL/MMP-9标准品浓度梯度冻干粉一套、抗MMP-9抗体包被的96孔酶标板和酶标抗HNL抗体溶液或抗HNL抗体包被的96孔酶标板和酶标抗MMP-9抗体溶液、U型底96孔板、封板膜、酶底物溶液及终止液组成，所述HNL/MMP-9标准品为人源HNL/MMP-9；所述酶标抗体所标记的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述定量装置经两步法快速定量HNL/MMP-9，所述两步法快速定量HNL/MMP-9是指装置使用过程中孵育过程只需两次，所述孵育过程只需两次第一次是指将酶标抗HNL抗体溶液加入抗抗体包被的96孔酶标板或将酶标抗抗体溶液加入抗HNL抗体包被的96孔酶标板后快速加入标准品浓度梯度溶液和样品溶液后孵育20～40min，所述两次孵育过程第二次是指加入酶底物溶液孵育10～20min后加入终止液；所述标准品浓度梯度溶液是指HNL/MMP-9标准品浓度梯度冻干粉加入200μL样品稀释液工作液制成；所述样品溶液是指经样品稀释液工作液稀释后的体液样本，所述体液样本为尿液、血清、血浆、脑脊液或唾液；所述样品稀释液工作液是将5倍样品稀释液用去离子水稀释5倍获得。
2.如权利要求1所述的一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体HNL/MMP-9定量装置，其特征在于：抗MMP-9抗体为商品化的抗MMP-9抗体或通过常规方法以MMP-9免疫动物制备的抗体或基因工程方法制备的抗抗体，所述抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体；抗HNL抗体为商品化的抗HNL抗体或通过常规方法以人HNL免疫动物制备的抗体或基因工程方法制备的抗HNL抗体，所述抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。
3.如权利要求1所述的一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体HNL/MMP-9定量装置，其特征在于：抗体包被的96孔酶标板是由如下步骤制备得到，
(1)抗体包被酶标板
将抗MMP-9抗体或抗HNL抗体用25～100mmol/L Na2CO3-NaHCO3、pH 9.6的碳酸钠缓冲液稀释到2～6μg/mL制成抗体包被液；向96孔酶标板每孔加100μL抗体包被液；37℃孵育2h、室温孵育4h或4℃过夜；
(2)封闭酶标板
弃包被液；向96孔酶标板每孔加200～300μL封闭液，封闭液为含2％BSA(wt/vol)的25～100mmol/L Na2CO3-NaHCO3,pH 9.6的碳酸钠缓冲液；37℃孵育2h、室温孵育4h或4℃过夜；
(3)固定酶标板
弃封闭液；向96孔酶标板每孔加200～300μL固定液，固定液为含50％蔗糖(wt/vol)、50％海藻糖(wt/vol)或25％蔗糖(wt/vol)和25％海藻糖(wt/vol)的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3,pH 9.6的碳酸钠缓冲液；室温固定30min～2h；
(4)密封酶标板
弃固定液，室温晾干或25℃真空干燥；将酶标板和袋装干燥剂装进锡箔袋然后抽真空，4℃保存。
4.如权利要求1所述的一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体HNL/MMP-9定量装置，其特征在于：5倍样品稀释液为含有2.5％BSA(wt/vol)、0.5％Tween-20(vol/vol)、0.5％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(wt/vol)、2％PEG-600(聚乙二醇600)(vol/vol)和0.1％NaN3(wt/vol)的磷酸根摩尔浓度为50mmol/L、pH 7.4的PBS缓冲液。
5.如权利要求1所述的一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体HNL/MMP-9定量装置，其特征在于：25倍洗液为含有2.5％Tween-20(vol/vol)的磷酸根摩尔浓度为250mmol/L、pH 7.4的PBS缓冲液。
6.如权利要求1所述的一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体HNL/MMP-9定量装置，其特征在于：标准品浓度梯度冻干粉为不同浓度HNL/MMP-9溶液制备的冻干粉，具体是将10ng纯化的HNL/MMP-9溶解在400μL样品稀释液工作液中，充分混匀，此溶液HNL/MMP-9的浓度为25ng/mL；然后将上述溶液用样品稀释液工作液进行2倍法梯度稀释获得浓度分别为12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.13ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL、0.39ng/mL的HNL/MMP-9标准品溶液各200μL，将以上溶液通过常规方法进行冻干，获得标准品浓度梯度冻干粉一套。
7.如权利要求1所述的一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体HNL/MMP-9定量装置，其特征在于：酶标抗体的制备是指通过常规的方法将辣根 氧化物酶HRP或碱性磷酸酶(ALP)共价标记在抗HNL抗体或抗抗体上；酶标抗体溶液为含有1％BSA(wt/vol)、0.1％NaN3(wt/vol)和0.5～1μg/mL酶标抗体的磷酸根摩尔浓度为50mmol/L、pH7.4的PBS缓冲液。
8.如权利要求1所述的一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体HNL/MMP-9定量装置，其特征在于：其使用步骤如下，
(1)取出溶液、标准品浓度梯度冻干粉、抗体包被的96孔酶标板，放置于室温环境平衡；
(2)将5倍样品稀释液和25倍洗液用去离子水分别稀释5倍和25倍，制成样品稀释液工作液和洗液工作液；
(3)将生物样品用样品稀释液工作液制成样品溶液；
(4)向每管标准品浓度梯度冻干粉中加200μL的样品稀释液工作液，充分混匀制成标准品溶液；
(5)将步骤(4)和步骤(3)制备的标准品溶液和样品溶液各100μL加至U型底96孔板；
(6)将50μL酶标抗体加至抗体包被的96孔酶标板；
(7)用多道移液器取50μL步骤(5)制备的U型底96孔板中的标准品溶液和样品溶液移至步骤(6)中的96孔酶标板上；
(8)用封板膜盖住96孔酶标板，将96孔酶标板放置于酶标板震荡器上，150～180rpm、37℃孵育20～40min；
(9)倾倒96孔酶标板中的物质，用洗液工作液对酶标板进行常规3～5次清洗；
(10)向96孔酶标板每孔中加入酶底物溶液100μL，避光条件下孵育10～20min；
(11)向96孔酶标板每孔中加入终止液100μL，轻轻混匀，30min内利用常规的分光光度计测定450nm处的吸光值；
(12)以标准品浓度梯度溶液的浓度值为横纵标，以标准品浓度梯度溶液450nm处的吸光值为纵坐标作标准曲线，再根据标准曲线及样品溶液450nm处的吸光值计算出样品溶液中异源二聚体HNL/MMP-9的浓度。
CN201610404140.4A 2016-06-12 2016-06-12 一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体定量装置 Pending CN105974127A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610404140.4A CN105974127A (zh) 2016-06-12 2016-06-12 一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体定量装置

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610404140.4A CN105974127A (zh) 2016-06-12 2016-06-12 一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体定量装置

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105974127A true CN105974127A (zh) 2016-09-28

Family

ID=57010332

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610404140.4A Pending CN105974127A (zh) 2016-06-12 2016-06-12 一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体定量装置

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105974127A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106501523A (zh) * 2017-01-17 2017-03-15 安徽同致生物工程股份有限公司 基质蛋白酶3测定试剂盒
CN111830261A (zh) * 2020-07-29 2020-10-27 安第斯抗体生物技术衡水有限公司 一种快速检测新冠病毒IgG抗体的方法和试剂盒

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1510421A (zh) * 2002-12-23 2004-07-07 杜凤鸣 一种乙肝病毒前s1抗原酶联免疫测定试剂盒及制备方法
CN101738478A (zh) * 2008-11-27 2010-06-16 浙江大学 Mmp9作为卵巢癌的诊断标记物的用途
CN101968483A (zh) * 2009-07-27 2011-02-09 深圳市菲鹏生物股份有限公司 一步半双抗原夹心免疫检测法
CN103063830A (zh) * 2012-12-21 2013-04-24 杭州茂天赛科技有限公司 一种elisa预包被酶标板的制备方法
CN103076451A (zh) * 2013-01-17 2013-05-01 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种o型口蹄疫146s抗原定量elisa检测试剂盒及其使用方法
CN104988171A (zh) * 2015-07-08 2015-10-21 北京嘉万生物技术有限公司 一种人ngal蛋白重组表达及制备方法
CN206002550U (zh) * 2016-06-12 2017-03-08 吉林大学 一种人中性粒细胞载脂蛋白同源二聚体的定量装置
CN206002549U (zh) * 2016-06-12 2017-03-08 吉林大学 一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体定量装置

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1510421A (zh) * 2002-12-23 2004-07-07 杜凤鸣 一种乙肝病毒前s1抗原酶联免疫测定试剂盒及制备方法
CN101738478A (zh) * 2008-11-27 2010-06-16 浙江大学 Mmp9作为卵巢癌的诊断标记物的用途
CN101968483A (zh) * 2009-07-27 2011-02-09 深圳市菲鹏生物股份有限公司 一步半双抗原夹心免疫检测法
CN103063830A (zh) * 2012-12-21 2013-04-24 杭州茂天赛科技有限公司 一种elisa预包被酶标板的制备方法
CN103076451A (zh) * 2013-01-17 2013-05-01 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种o型口蹄疫146s抗原定量elisa检测试剂盒及其使用方法
CN104988171A (zh) * 2015-07-08 2015-10-21 北京嘉万生物技术有限公司 一种人ngal蛋白重组表达及制备方法
CN206002550U (zh) * 2016-06-12 2017-03-08 吉林大学 一种人中性粒细胞载脂蛋白同源二聚体的定量装置
CN206002549U (zh) * 2016-06-12 2017-03-08 吉林大学 一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体定量装置

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANGELINA DI CARLO: "Evaluation of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), matrix metalloproteinase 9 (MMP 9) and their complex MMP 9/NGAL in sera and urine of patients with kidney tumors", 《ONCOLOGY LETTERS》 *
蔡林君: "HNL/NGAL用于急性肾损伤早期诊断及其免疫学测定方法研究", 《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106501523A (zh) * 2017-01-17 2017-03-15 安徽同致生物工程股份有限公司 基质蛋白酶3测定试剂盒
CN111830261A (zh) * 2020-07-29 2020-10-27 安第斯抗体生物技术衡水有限公司 一种快速检测新冠病毒IgG抗体的方法和试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102393456B (zh) 一种用于检测hps的试剂盒
CN103837674A (zh) 特异性IgE抗体的检测方法、该方法所使用的试剂盒以及该试剂盒的制备和使用方法
CN101358976A (zh) 检测六项肿瘤标志物的微阵列-酶联免疫检测试剂盒
CN107543932A (zh) 一种降钙素的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法
CN107462726B (zh) 一种基于双单抗夹心的磁酶免疫双重定量elisa检测方法
CN102135535B (zh) 一种直接进行半定量分析的免疫胶体金属检测技术及其制备方法和用途
CN109307765A (zh) 胃蛋白酶原ⅱ检测试剂盒
CN108508001A (zh) 化学发光检测试剂盒
CN109061189A (zh) 一种肌钙蛋白i检测试剂盒及其制备方法
CN105548547A (zh) 基于流式细胞仪的检测肺癌标志物的流式阵列免疫分析试剂盒
CN105793707A (zh) 免疫层析辅助的检测方法
CN101363861A (zh) 乙型肝炎病毒表面抗原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法
CN109307766A (zh) 胃蛋白酶原ⅰ检测试剂盒
JP4115728B2 (ja) フロースルー式検査法用組成物、これを用いたキット及び検査法
CN206038696U (zh) 一种定量钙卫蛋白检测免疫层析试纸条
CN105974128A (zh) 一种人中性粒细胞载脂蛋白同源二聚体的定量装置
CN105974127A (zh) 一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体定量装置
KR102075949B1 (ko) 면역분석 방법 및 시약
CN109633163B (zh) 降钙素原/c反应蛋白二合一检测试剂盒
CN102368068B (zh) 检测肺炎衣原体IgM抗体的试剂盒
CN206002549U (zh) 一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体定量装置
CN103713121A (zh) 人血管炎诊断试剂盒及其制备方法
CN106198998A (zh) 人甲胎蛋白异质体3化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN206002550U (zh) 一种人中性粒细胞载脂蛋白同源二聚体的定量装置
CN205910194U (zh) 一种同步联合定量检测不同分子形式人中性粒细胞脂质运载蛋白的免疫层析装置

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160928

RJ01 Rejection of invention patent application after publication