CN1510421A

CN1510421A - 一种乙肝病毒前s1抗原酶联免疫测定试剂盒及制备方法

Info

Publication number: CN1510421A
Application number: CNA021576637A
Authority: CN
Inventors: 杜凤鸣
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-12-23
Filing date: 2002-12-23
Publication date: 2004-07-07

Abstract

本发明涉及一种“一步法乙肝病毒前S1蛋白酶免测定试剂盒”。该试剂盒能检出完整HBV，并且具有简便、灵敏和稳定等特点，操作简便快速，可以补充或替代常规的“两对半”和PCR检测法。本发明提供了制备方法。

Description

一种乙肝病毒前S1抗原酶联免疫测定试剂盒及制备方法

技术领域

本发明书属生物制剂技术领域。具体涉及一种一步法(立可读)乙肝病毒前S1(PreS1)抗原(Ag)酶联免疫测定试剂盒及制备方法。

背景技术

长期以来，临床医生是根据“二对半”试剂盒检验结果判断乙肝患者的病情。但是“二对半”试剂查的是与乙型肝炎病毒(HBV)相关的表面和核内抗原和抗体，不是直接查HBV。因此该方法不能确定患者有无HBV。此外，用“二对半”试剂盒检查结果表明全世界约有3亿人为乙肝表面抗原(HbsAg)携带者，我国约有1.3亿，已成为世界之最，但实际上其中的部分人既无临床症状，转氨酶也不高，因此，并非所有HbsAg阳性者都携带HBV。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，设计并建成了一步法PreS1 Ag的试剂盒。

为了克服上述检测HBV的缺陷，我们发明了“一步法(立可读)乙肝病毒PreS1 Ag酶免测定试剂盒”。因为已证明PreS1 Ag是HBV-DNA复制的必然标志物，若检测出病人PreS1 Ag阳性，说明其HBV-DNA存在。

本发明提供了一种“一步法(立可读)PreS1 Ag酶联免疫测定试剂盒”，该试剂盒是包括主要成份为抗体预包被反应条、酶标记抗前S1抗体、次要成份为阳性对照液1支、阴性对照液1支、20倍浓洗涤液1瓶、底物缓冲液甲1瓶、底物缓冲液乙1瓶和终止液1瓶组成。

本发明的试剂盒中所述抗体预包被反应条为48-96孔；酶标记PreS 1抗体为辣根过氧化物酶；阳性对照液为HBV-DNA和HbeAg均阳性血清；阴性对照液为正常人血清；浓洗涤液为磷酸-Tween-20；底物缓冲液甲为H₂O₂；底物缓冲液乙为3，3’5.5’一四甲基联苯胺(TMB)和终止液为4NH₂SO₄。

本发明的“一步法乙肝病毒前S1抗原酶联免疫测定试剂盒”的临床应用结果如下：

1998年9月至2000年3月上海第二医科大学附属新华医院、上海中医药大学附属曙光医院和上海市传染病医院使用我们研制、生产的“一步法乙型肝炎病毒PreS1 Ag双抗体夹心ELISA试剂盒，检测各种急、慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染后的血清标本，并与常规乙肝病毒免疫标志物(HBV-M)和HBV-DNA(PCR法)进行比较。现将结果总结报告如下。

材料和方法

1.临床血清标本

各医院临床收集血清标本总数为1445份，其中新华医院437份，曙光医院324份和传染病医院648份。

2.实验方法

2.1.PreS1蛋白检测：按“一步法乙肝病毒前S1抗原酶联免疫测定试剂盒”说明书进行操作。即取已包被抗体板条，孔内加血清标本50μl，同时设空白对照一孔，阳性和阴性标准孔，立即加稀释后的酶标记抗PreS1抗体50μl，37℃温育30min，弃液并充分洗涤5遍。用底物甲H₂O₂及乙TMB显色、终止反应，在酶标仪上读波长为450nm处的吸光度值(OD值)。

结果判定：阴性对照(A值)×2.5＝临床值(cut off值)，阴性对照高于0.05时按实际OD值算，阴性对照小于0.05按0.05计算，凡待检标本孔A值大于临界值即为阳性。

2.2.HBV-M检测：均采用国产或进口EIA试剂盒检测。

2.3.HBV-DNA PCR法。

结果

1.大三阳与PreS1 Ag阳性符合率：

二对半的大三阳血清中，三家医院应用报告PreS1 Ag阳性率结果，新华医院为87.1％(见表1)，曙光医院为91.9％(见表2)和传染病医院为83.4％(见表3)。

2.HbeAg与PreS1 Ag阳性符合率：

新华医院 121例PreS1 Ag(+)中有74例HBeAg(+)(见表4)

曙光医院 270例PreS1 Ag(+)中有148例HBeAg(+)(见表5)

传染病医院390例PreS1 Ag(+)有267例HBeAg(+)(见表6及9)

3.HBV-DNA(PCR法)与PreS1 Ag阳性符合率：

新华医院140例HBV-DNA(PCR法)(+)血清中有128例PreS1Ag(+)阳性率为91.4％。(见表7)

曙光医院68例HBV-DNA(PCR法)(+)血清中有64例PreS1Ag(+)阳性率为94.1％。(见表8)

传染病医院464例HBV-DNA(PCR法)(+)血清中有390例PreS1 Ag(+)阳性率为84.1％。(见表9)

4.一步法PreS1 Ag酶免试剂盒与二步法PreS1 Ag酶免试剂盒检测的比较。用中国药品生物制品检定所拟定的二步法PreS1 Ag酶免试剂盒61份标准参考品来检定二步法和“一步法PreS1 Ag酶免试剂盒“其检定结果完全一致，如下：

检验项目标准规定检验结果

阴性参考品符合率不得出现假阳性(0/27)(+/-) 0/27

阳性参考品符合率允许出现1份假阴性(1/30)(-/+) 1/30

精密性CV(％) ≤15 15

灵敏度：1# ≥1：64 1：512

2# ≥1：128 1：1024

3# ≥1：32 1：256

稳定性： 37℃放3天后，检定指标达到要求合格

5.三家医院使用结果

三家医院使用一步法测定1445份乙肝患者血清中PreS1 Ag与HbeAg及HBV-DNA(PCR法)的比较，见下列表1-11。

表1 PreS1 Ag与HBV-M的关系(新华)

HBV-M N PreS1-positive PreS1-positive(％)

HBsAg(+)+HBeAg(+)+anti-HBc(+) 85 74 87.1

HBsAg(+)+anti-HBe(+)+anti-HBc(+) 106 34 32.1

HBsAg(+)+anti-HBc(+) 46 7 15.2

HBsAg(+)+the other mode 74 6 8.1

合计 311 121 38.9

表2 PreS1 Ag在各HBV-M中的阳性率(曙光)

HBV-M模式血清份数前S1蛋白(+) (％)

HBsAg(+)HBeAg(+)抗HBc(+) 161 148 91.9

HBsAg(+)抗HBe(+)抗HBc(+) 356 81 22.7

HBsAg(+)抗HBc(+) 395 32 8.1

HBsAg(+)抗HBe(+) 42 4 9.5

HBsAg(+) 86 5 5.8

HBsAg(-)抗HBs(+)抗HBc(+) 178 0 0

HBsAg(-)的其它模式 304 0 0

合计 1522 270 17.7

表3 不同的HBV-M模式和PreS1Ag、PreS1Ab及HBV DNA

的关系或检出率(传染)

HBV-M 例 Pre-S₁Ag Pre-S₁Ab HBVDNA

+ ％ + ％ + ％

HBsAg HBeAg HBcAb阳性 265 221 83.4 10 3.7 251 94.7

HBsAg HBeAb HBcAb阳性 192 98 51 16 8.3 120 62.5

HBsAg HBcAb阳性 121 71 58.7 5 4.1 90 74.4

HBsAb HBeAb HBcAb阳性 38 0 0 0 0 0 0

HBsAb阳性 17 0 0 0 0 0 0

HBV-M阴性 15 0 0 0 0 0 0

表4 PreS1 Ag与E系统的关系(新华)

HBeAg(-)

HBeAg(+) anti-HBe(-) Total

anti-HBe(+)

Pre-S1(+) 74 35 12 121

Pre-S1(-) 11 74 105 190

Total 85 109 117 311

表5 PreS1 Ag与E系统间的关系(曙光)

前S1蛋白 HBeAg(+) HBeAg(-)

抗HBe(+) 抗HBe(-) 合计

前S1蛋白(+) 148 85 37 270

前S1蛋白(-) 13 313 444 770

合计 161 398 481 1040

表6 HBeAg与HBV DNA的关系(传染)

HBeAg 合计

+ -

HBVDNA + 251 210 464

- 15 172 187

合计 267 382 648

表7 PreS1 Ag HBeAg和HBV DNA检测结果(新华)

HBeAg Pre-S1

HBVDNA Total

+ - + -

+ 84 56 128 8 140

- 4 90 6 88 94

Total 88 142 134 96 234

表8 PreS1 Ag、HbeAg和HBV DNA检测结果(曙光)

HBV DNA HBeAg(+) 前S1蛋白合计

+ - + -

+ 42 26 64 4 68

- 2 45 3 44 47

合计 44 71 67 48 115

表9 PreS1 Ag与HBV DNA的关系(传染)

PreS1 Ag 合计

+ -

HBVDNA + 340 124 464

- 49 135 184

合计 390 258 648

表10 PreS1 Ag检测阳性率(新华)

诊断 N PreS1-positive PreS1-positive(％)

急性乙型肝炎 48 45 93.8

慢性活动性肝炎 86 44 51

慢性迁延性肝炎 120 29 24.2

HBsAg(+)携带者 57 3 5.3

BsAg阴性者 162 0 0

表11 Pre-S₁Ag、Pre-S₁Ab在不同乙肝患者中的检测情况(传染)

例数 Pre-S₁Ag Pre-S₁Ab HBVDNA HBeAg

+ - + - + - + -

HBV携带 25 12 13 0 26 20 5 20 5

急性肝炎 81 35 46 10 71 38 43 20 61

慢性肝炎 317 210 107 9 308 252 65 156 161

亚重肝 5 1 4 0 5 2 3 1 4

慢重肝 48 28 20 7 41 37 11 17 31

肝硬化 128 97 31 4 124 107 21 53 75

肝癌 11 7 4 1 10 7 4 2 9

讨论

PreS1蛋白是HBVS区基因编码产物，它和PreS2蛋白一起在HBV附着和侵入肝细胞的机制中起重要作用。PreS1蛋白主要存在于Dane颗粒中。已证实HBV的PreS1蛋白的P21-47肽是吸附于靶细胞受体的配体。

目前，通过血清学检查以判断HBV感染状态的常用手段是检测HBV-M，即所谓“两对半”：FbsAg-HbsAb，HbeAg-HbeAb和HbcAb，其中HbeAg和HbcAb阳性，表明HBV在肝内复制。然而，常规HBBV-M检测方法繁琐、耗时，且结果分析比较复杂。PCR法测定HBV-DNA(PCR法)亦已在一些大医院开展，但是尽管该方法有敏感性高等特点，亦因其操作步骤繁琐、费时、技术要求高、消耗性试剂昂贵收费价又高，很难被普遍应用。Theilman等首先报告用western blot技术检测了HbsAg阳性病人血清PreS1蛋白，认为该蛋白与HbeAg和HBV-DNA有良好的相关性，是HBV在体内复制的标志。我们用重组PreS1 Ag免疫豚鼠制备多体或免疫Balb/c小鼠得抗PreS1单抗，经过(MH₄)₂SO₄粗提，再柱层析(DE₅₂)，获高效价多体或单抗，在国内首先建成了一步法(立可读)乙肝病毒PreS1 Ag酶免试剂盒。经过临床应用结果表明，PreS1 Ag检测在下述几个方面具有重要价值如下：

1.PreS₁ Ag是很好的HBV复制标志：

本文三家医院检测的1445份乙肝患者血清中结果，发现一步法乙肝病毒PreS1 Ag酶免法的阳性与HBV-DNA(PCR法)的阳性符合率较高，显示本一步法PreS₁ Ag酶免试剂盒与HBV-DNA(PCR法)有良好的相关性。HBV-M和HBV-DNA阴性者血清标本也未检出PreS₁蛋白，因而本一步法PreS₁ Ag试剂盒能很好判断病人是否有乙肝病毒复制。

2.PreS₁ Ag的检测结果与乙型肝炎活动程度有关

从表10显示，在乙型肝炎的急性期PreS₁ Ag多为阳性(93.8％)与乙型肝炎HBV高度复制状态相吻合；慢性活动性肝炎(51.0％)明显高于慢性迁延性肝炎(24.2％)和HbsAg携带者(5.3％)HbsAg阴性者(0％)。

3.PreS₁ Ag的检测比HBeAg的检测更有临床意义

本文三家医院均发现一步法PreS₁ Ag和HBeAg同时与HBV-DNA(PCR法)作比较，显示出HBV-DNA(PCR法)阳性血清中一步法PreS₁ Ag酶免试剂盒的阳性率比HBeAg阳性率高，因此PreS1 Ag的检测比HBeAg检测更有临床意义。

4.一步法比二步法更受欢迎

用中国药品生物制品检定所拟定二步法PreS₁ Ag酶免试剂盒75份标准参考品检测一步法PreS₁ Ag酶免试剂盒其阳性和阳性参考品符合率、精密性、灵敏度和稳定性与二步法酶免试剂盒一样。

由于一步法在40分钟左右内出结果，所以普遍叫“立可读”。一步法比二步法PreS₁ Ag酶免试剂盒更具有操作简便、迅速和经济的特点，所以更受临床检验工作者和广大乙肝患者的欢迎。

本发明的另一目的是提供了上述“一步法PreS1 Ag酶免测定试剂盒”的制备方法。该方法包括下列步骤：

1.抗体制各：

1.1.制备抗原：HBV-DNA重组PreS1 Ag基因片断的21-47aa及1-199aa；

1.2.制备抗体：

1.2.1.用上述重组抗原免疫豚鼠，得抗PreS1抗血清或免疫Balb/C小鼠得阳性鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，筛选阳性克隆建株，得腹水；

1.2.2.抗血清或腹水用(NH₄)₂SO₄或正辛酸沉淀处理，得粗提抗PreS1抗体；

1.2.3.用DE₅₂离子交换层析法得纯抗PreS1抗体；

1.2.4.经高压液相色谱(HPLC)检定，纯抗PreS1抗体呈单一峰，其纯度95％以上。

2.HRP-抗前S1抗体制备：辣根过氧化物酶(HRP)与纯化的抗前S1抗体偶联；

3.包被抗体成为予包被反应条：用抗HBS或抗PreS1豚抗；

4.分装试剂盒其余7种成份，按试剂盒需要量分装在小瓶或尖底离心管中；

5.检定试剂盒的特异性、灵敏度、精密度、稳定性合格；

6.组装成为成品。

本发明的试剂盒在使用时可以如下操作：

1.取出已包被条孔，插入支架上，用胶布固定，以防脱落。

2.每孔加待检血清50μ1，各板设阳性对照1孔(50μl)阴性对照1孔(50μl)，空白对照1孔(加蒸馏水50μl)，然后除空白对照孔外各孔加酶标记液50μl，置37℃中反应30分钟。

3.取出反应板甩去孔内液体后停留30秒钟，每次甩去洗涤液后都要在草纸上拍干，以便洗涤彻底。(20倍浓洗涤液1ml+19ml蒸馏水即为工作洗涤液)

4.各孔滴加底物缓冲液甲、乙各1滴，室温避光10-15分钟后再每孔滴加终止液1滴，置酶标仪中450nm波长读数。

结果判定

阴性对照(A值)×2.5＝临界值(cut off值)，阴性对照高于0.05时按实际OD值计算，阴性对照小于0.05按0.05计算，凡待检标本孔A值大于临界值即为阳性。

本发明的试剂盒能非常专一地检测患者血清中HbsAg-PreS1蛋白的浓度。它具有简便、灵敏和稳定等特点。且本试剂盒操作简便快速，采用一步法可在40分钟左右获得实验结果，比PCR检测法省时(PCR法最快需6-8小时完成实验)，经临床试用PreS1蛋白检测阳性与PCR检测的HBV-DNA阳性有很好的符合率，试剂盒的临床阴阳性预示值为90％。因而本试剂盒对判断病人是否有病毒复制，确定乙肝感染病程及预后具有十分重要的参考意义。本试剂盒与PCR法相比，PCR法需贵重的仪器设备，消耗性试剂昂贵，收费价又高，而本试剂盒整个实验中无需贵重仪器设备，消耗性试剂便宜且收费价低廉，能适用于各级医院及临床测试中心，也可用于流行病学普查。一步法PreS1 Ag试剂盒，具有简便、灵敏、重复性好的优点，能检出完整HBV，将可被普遍使用，做为HBV感染，复制和乙肝病人诊断、治疗和预后的一个新的标志，与其抗PreS1抗体联合可成为新的乙肝检测系统。

具体实施方式

实施例1

制备一步法乙肝病毒前S1蛋白酶免试剂盒的生产步骤

(一)纯化包被抗体(HbsAb)：HbsAg免疫豚鼠得单抗或用重组PreS1 Ag免疫豚鼠得抗PreS1多抗。加等体积的饱和(NH₄)₂SO₄沉淀，粗提后再经DE-52柱纯化，收集蛋白峰，PBS透析得抗HBs或抗PreS1多抗纯品。经HPLC检定得纯抗PreS1抗体，呈现单一峰。纯度＞95％，效价＞10万。

(二)酶标记抗体制备

1.抗体制备：

基因重组的PreS1 Ag(21-47aa)及(1-119aa)免疫豚鼠得抗PreS1抗体或重组PreS1 Ag免疫Balb/c小鼠得腹水。用饱和(NH₄)₂SO₄沉淀粗提两次，再经DE-52柱纯化，得纯抗PreS1抗体或单克隆抗体。效价＞10万，经HPLC鉴定纯度在95％以上。

2.酶标记抗体制备

抗PreS1抗体用过碘酸钠法与辣根过氧化物偶联

对PBS充分透析，加等体积甘油，-20℃以下保存。效价＞2000。

3.酶标记抗体浓度选定

采用方阵滴定法选择酶标记抗体的工作浓度大于1∶2000。

PreS1重组抗原从10μg/ml倍增稀释，包被酶标板，加梯度稀释的酶标抗体测定，以确定最适稀释度。

(三)预包被抗体板的制备

1.包被

Na₂CO₃ 0.6g

NaHCO₃ 1.58g

重蒸水 500ml

加入适量Anti-S抗体，调整PH至9.5，加入微孔板各孔中，置湿盒中加盖，4℃过液甩干。

2.洗涤

Na₂HPO₄·12H₂O 2.6g

NaH₂PO₄·2H₂O 0.4g

20％Tween-20 2.5ml

NaCL 8.2g

重蒸水 100ml

调整PH至7.2，1∶10稀释后，加入微孔板各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复三次，以除去剩余抗体。

3.封闭

明胶 1.1g 微波炉加温注入酶标

BSA 5.0g 至呈透明溶液板各孔中

0.1N PBS 20ml-→冷却至室温-→

蒸馏水至100ml

弃去液体

放入湿盒中(加盖) 吸水纸上拍干重复一次，待干燥后，

——→37℃ 1hr—→放入有干燥剂的塑料袋封口，保存于4℃。

(四)阳性对照的制备

HBeAg和HBV-DNA同时呈阳性的乙肝患者血清，60℃放置1个小时，除菌过滤，用本药盒测定A值＞0.3，备用，分装。

(五)阴性对照的制备

用本试剂盒测定正常人血清A值在0-0.03，加万分之二硫柳汞，分装备用。

(六)酶标单抗配置——————-→

10％小牛血清

90％0.15MPBS

Anti-preS1 HRP——————————→稀释20倍，分装。

(稀释度1∶2000)

(七)酶标单抗稀释液

BSA 0.5g

Na₂HPO₄·12H₂O 2.6g

NaH₂PO₄·2H₂O 0.4g

NaCL 8.2g

20％Tween-20 100ml

调整PH至7.2

(八)底物液A

Na₂HPO₄·12H₂O 1.7g

柠檬酸.H₂O 0.5g

3％H₂O₂ 200μl

重蒸水 100ml

调整PH至5.0

(九)底物液B

Na₂HPO₄·12H₂O 1.7g

柠檬酸.H₂O 0.5g

重蒸水 100ml

调整PH至5.0后，加入10mlDMSO含60mgTMB的溶液25μl

(十)终止液

浓H2SO4 10ml

重蒸水 80ml

(十一)10x洗涤液

Na₂HPO₄·12H₂O 2.6g

NaH₂PO₄·2H₂O 0.4g

20％Tween-20 2.5ml

重蒸水 100ml

调整PH至7.2

(十二)半成品及成品的组成

上述(一)→(十一)步骤所得产品装入小瓶及尖底离心管中，即为半成品。抽出三份经过特异性、稳定性、灵敏度及精密度检定合格才能组装成preS1试剂盒。组装成盒后还需抽出三份同半成品一样经过检定合格才能出售。

Claims

1.一种“一步法乙肝病毒PreS1抗原酶联免疫测定试剂盒”，其特征在于该试剂盒包括由主要成份抗体预包被反应条48-96孔、酶标记前S1抗体和次要成份阳性对照液1支、阴性对照液1支、20倍浓洗涤液1瓶、底物缓冲液甲1瓶、底物缓冲液乙1瓶及终止液(4N H₂SO₄)1瓶组成。

2.一种如权利要求1所述的一种“一步法乙肝病毒PreS1抗原酶联免疫测定试剂盒”的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)制备抗原：

HBV-DNA重组PreS1 Ag基因片断的21-47aa及1-199aa；

(2)制备抗体：

用上述重组抗原免疫豚鼠，得抗PreS1抗血清或免疫Balb/C小鼠得阳性鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，筛选阳性克隆建株，得腹水；

抗血清或腹水用(NH₄)₂SO₄或正辛酸沉淀处理，得粗提抗PreS1抗体；

用DE₅₂离子交换层析法得纯抗PreS1抗体；

经高压液相色谱HPLC检定，纯抗PreS1抗体呈单一峰，其纯度95％以上。

(3)HRP-抗前S1抗体制备：辣根过氧化物酶(HRP)与纯化的抗前S1抗体偶联；

(4)包被抗体成为予包被反应条：用抗HBs或抗PreS1豚抗；

(5)分装试剂盒其余7种成份，按试剂盒需要量分装在小瓶或尖底离心管中；

(6)检定试剂盒的特异性、灵敏度、精密度、稳定性合格；

(7)组装成为成品。

3.根据权利要求1所述的一种一步法乙肝病毒PreS1抗原酶联免疫测定试剂盒，其特征在于其中所述的抗体预包被反应条为48-96孔、酶标记抗体、阳性对照液为HBV-DNA和HBeAg均阳性血清、阴性对照液为正常人血清、浓洗涤液为磷酸-Tween-20、底物缓冲液甲为H₂O₂、底物缓冲液乙为3，3’.5.5’一四甲基联苯胺和终止液为4NH₂SO₄。