CN1603824A - 人尿中Apo AI蛋白定量酶联免疫吸附试验试剂盒及制备方法 - Google Patents
人尿中Apo AI蛋白定量酶联免疫吸附试验试剂盒及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术产品技术领域。本发明公开了一种人尿中Apo AI含量酶联免疫吸附试验试剂盒及制备方法。本发明的试剂盒经临床试验结果表明能判断肾病患者的病情轻重以及预后和糖尿病的病情。方法简便快速，特异性强，灵敏度高，有较好的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术产品，具体涉及一种人尿中Apo AI(Apolipoprotein AI Apo AI)定量的酶联免疫吸附试验试剂盒及制备方法。
背景技术
目前对肾脏病人及糖尿病患者各种蛋白质的检测项目日益增多，但尿中Apo AI定量的测定至今未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服以往检测方法的不足之处，研制一种尿中Apo AI定量的高灵敏度和高特异性的诊断试剂盒。
本发明提供了一种Apo AI含量酶免试剂盒，该试剂盒是Apo AI纯品为标准品，用Apo AI抗体IgG包被，Apo AI抗体IgG联接辣根过氧化物酶为检测抗体的Apo AI定量的一步及二步夹心法，检测人尿中的Apo AI含量。并由下列试剂组成：
(1)Apo AI标准品(2500、1250、625、56、10、0ng/ml)各1瓶
(2)Apo AI抗体IgG预包被板1块，(48T/96T)
(3)Apo AI抗体IgG酶标记液1瓶
(4)浓缩洗涤液1瓶
(5)底物液冲液甲、乙各1瓶
(6)终止液1瓶
本发明的另一所要解决的技术问题是提供了上述尿中Apo AI定量的ELISA试剂盒的制备方法，该方法包括下列步骤：
一、原料料及其规格
正常人血清
动物：新西兰大白兔，健康雄性，体重2～3kg
酶联免疫测定仪：Labosystems Dragon Multiskan MK3
UV754分光光度计
旋涡混合器，XW-80型
PHS-20型精密酸度计
电泳仪(上海)
酶标板，华东理工大学ELISA测定CV％(％)＜10％
辣根过氧化物酶(RZ3.0，SigMA)
NaIO4 A.R(进口分装)
NaBH4 A.R(进口分装)
其他试剂
Na2HPO4.12H2O A.R
柠檬酸 A.R
Nacl A.R
甘油 化学纯
H2O2 A.R
Tween-20 化学纯
邻苯二胺 化学纯
H2SO4 A.R
人Apolipoprotein AI标准品及免疫源(SigMA)
蒸馏水必需符合《中国药典》(1990)之规定
二、Apo AI多克隆抗体IgG的制备和亲和层析纯化
首先用人Apo AI(SigMA)溶于0.01M PH7.4磷酸缓冲液中，加等量的福氏完全佐剂乳化后，给新西兰大白兔，颈背部多点及脚垫内注射2.0mg，为基础免疫。每两周加强一次，共免疫6次。最后一次免疫后8-10天抽血测试效价，效价满意者由心脏抽血收集抗血清，抗血清再经硫酸铵两次盐析，50％及33％饱和(NH4)2SO4分步沉淀纯化后，再用Sepharose 4B亲和层析纯化，用高压液相色普(HPLC)测纯度为单一峰，纯度高达96％以上的兔抗人Apo AI抗体IgG(简称Apo AI抗体IgG)。
三、辣根过氧化物酶(HRP)与Apo AI抗体IgG偶联
经纯化所得的兔抗人Apo AI抗体IgG与辣根过氧化物酶用改良的过碘酸钠法交联获得“酶标抗体IgG”。试剂配制和操作步骤如下：
1.过碘酸钠标记法试剂
(1)0.06M NaIO4(0.13克NaIO4，加水至10ml)
(2)0.16M乙二醇溶液0.1ml加水至10ml
(3)NaBH4(5mg/ml，NaBH45mg加水至1ml)
(4)0.05M PH9.5碳酸盐缓冲液
甲液：无水碳酸钠10.6克加水至500ml
乙液：无水碳酸氢钠16.8克加水至1000ml
取甲液16ml+乙液34ml，加水至200ml
(5)0.02M PH7.4PBS(用0.1M PH7.4PBS稀释)
2.过碘酸标记法的操作步骤
7.5mg HRP+0.5ml蒸馏水溶解
↓
加0.06M NaIO4 0.5ml，混合后置4℃，30分钟
↓
加0.16M乙二醇0.5ml室温30分钟
↓
加兔抗人载脂蛋白抗体Apo AI IgG0.5ml
(约含Apo AI抗体IgG7mg)，混合后装透析袋，用0.05M，PH9.6碳酸缓冲液透析过液
↓
次日吸出透析物，加NaBH4溶液0.2ml(5mg/ml)置冰箱2小时
↓
吸出上述结合物混合液，加入等体积饱和硫酸铵，冰箱4℃30’后，离心4000转/分×15分钟弃上清，沉淀溶于1ml PH7.4 0.02M PBS中透析过液，换液三次，每次1000ml
↓
次日，再离心除去不溶物即得“酶标抗体IgG”，分装于安瓿中密封后，置-40℃保存
四、最佳酶标记Apo AI抗体IgG 工作浓度的选择
用方阵滴定法，选择最佳酶标记Apo AI抗体IgG 工作浓度如下表1。
表1酶标记Apo AI抗体IgG最佳工作浓度
A450 Apo AI抗体IgG-HRP浓度
样本 1∶500 1∶1000 1∶2000 1∶4000 1∶8000
阳性尿1 1.215 1.184 1.021 0.844 0.620
阳性尿2 1.043 0.976 0.893 0.713 0.478
正常人尿3 0.135 0.127 0.106 0.097 0.085
正常人尿4 0.128 0.114 0.096 0.090 0.072
P/N值 8.55 8.92 9.48 8.59 7.42
测定结果为以1∶2000稀释的Apo AI抗体IgG-HRP作为工作浓度实验结果最好。
五、最佳Apo AI抗体IgG包被量的选择
用方阵滴定法选择最佳Apo AI抗体IgG包被量结果如下表2。
表2 Apo AI包被浓度
A450 Apo AI抗体IgG包被浓度(μg/ml)
样本 80 40 20 15 10 5
阳性尿1 1.346 1.274 1.126 0.820 0.710 0.524
阳性尿2 0.963 0.761 0.671 0.499 0.367 0.300
正常人尿3 0.137 0.128 0.105 0.086 0.082 0.071
正常人尿4 0.120 0.103 0.090 0.077 0.068 0.059
P/N值 8.95 8.77 9.17 8.04 7.18 6.34
包被浓度越高，阳性孔显色越深，但随之阴性显色也越深，P/N值反而会越低，但包被浓度过低时，阳性孔显色明显减弱，而阴性孔显色下降不明显，此时P/N值也低，通过实验滴定，Apo AI抗体IgG最佳包被浓度是20μg/ml。
六、载脂蛋白Apo AI酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法的一步法及二步法操作步骤如下：
(一)二步法：
尿样：原液
包被稀释液：Na2CO3 0.16克，NaHCO3 2.9克，NaN3 0.02克，加水至100ml成为PH9.6碳酸盐缓冲液。
样品稀释液：NaCL 8克，KH2PO4 0.2克，Na2HPO4 2.9克，KCL0.2克，Tween-20 0.5ml，NaN3 0.2克，加水至1000ml，用前每100ml加10ml小牛血清成为PH7.4PBS-Tween20样品稀释液。
洗涤液：Tris2.42g，1N HCL13ml，Tween-20 0.5ml加水至1000ml成为PH7.4 0.02M Tween 20洗涤液。
基质液：0.1M Na2HPO4 5.14ml(3.6克Na2HPO4加水100ml)，0.05M柠檬酸4.86ml(1克柠檬酸加水100ml)邻苯二胺4mg，3％H2O2 0.05ml成为基质液。
双抗体夹心法操作程序：
0.1ml抗体Apo AI IgG包被(20μg/ml IgG 4℃过夜)
↓洗涤
0.1ml样品(0.1ml尿原液)(37℃ 2小时)
0.1ml载脂蛋白标准液Apo AI标准品(SigMA进口)0-2500ng/ml
↓洗涤
0.1ml酶标抗体IgG(1∶2000)(37℃ 2小时)
↓洗涤
0.1ml基质液(邻苯二胺4mg溶于10ml)
柠檬酸磷酸氢(37℃ 10分钟)
二钠缓冲液加3％H2O2 0.05ml
↓
0.05ml 3M H2SO4终止反应
↓
450nM测OD MultisKan MK3酶免测定仪
↓
计算含量
(二)一步法：尿原液及标准品加完后，立即加Apo AI抗体IgG-HRP，其余步骤完全同二步法。二步法比一步法OD值稍有增加。
七、抗体IgG的鉴定
经两次盐析纯化的Apo AI抗体IgG，经长海医院实验诊断科血清室用免疫电泳鉴定结果，Apo AI为单一沉淀线。
八、标准曲线的制备
倍比稀释的Apo AI(SigMA进口)标准液，作双抗体夹心法ELISA测定，分别绘出标准曲线图。曲线呈“S”型，灵敏度良好，Apo AI-蛋白质(Apo AI-P)最低检测量约为80ng。标准曲线测定Apo AI含量范围为80-1000ng/ml。在ELISA双抗夹心法的酶标板上的标准曲线的梯度浓度良好。
九、精密度试验
为了明确和证明本研究的载脂蛋白(Apo AI)ELISA的精密度，作了批内、批间和各医院实验室间重复性试验。
批内及批间实验，用混合血清分别作Apo AI批内测定，结果见表3。用混合血清作Apo AI批间含量测定，结果见表4。所得变异系数(CV％)，说明本法重复性良好。
表3 ELISA法测血中载脂蛋白之批内实验
类别 稀释倍数 n X(g/L) SD CV％
Apo B100 1∶2000 30 0.80 0.05 7.0
1∶4000 30 0.82 0.05 6.6
Apo AI 1∶2000 30 0.29 0.03 5.0
1∶4000 30 0.25 0.02 10
表4 ELISA法测定血中载脂蛋白之批间实验
类别 稀释倍数 n X(g/L) SD CV％
Apo B100 1∶2000 45 0.70 0.04 8.6
Apo AI 1∶2000 30 0.22 0.02 9.0
十、特异性检定
正常人尿液11份，分别加入IgA、IgM、IgG、C3、β2M、α巨球蛋白、转铁蛋白、白蛋白、纤维蛋白降解产物(FDP)、Apo B100及Apo AI各1000ng/ml尿，用Apo AI试剂盒检测只测出Apo AI的结果见表5：
表5 正常人尿中加不同蛋白的检出量
蛋白种类 正常人尿中各 检测结果 回收率
蛋白的加入量
IgA 1000ng/ml尿 阴性 0
IgM 1000ng/ml尿 阴性 0
IgG 1000ng/ml尿 阴性 0
C3 1000ng/ml尿 阴性 0
2M 1000ng/ml尿 阴性 0
α巨球蛋白 1000ng/ml尿 阴性 0
转铁蛋白 1000ng/ml尿 阴性 0
白蛋 1000ng/ml尿 阴性 0
FDP 1000ng/ml尿 阴性 0
Apo B100 1000ng/ml尿 阴性 0
Apo AI 1000ng/ml尿 960ng/ml尿 96％
以上试验说明本ELISA试剂盒具有Apo AI的特异性。
十一、灵敏度(最低检出量)试验：
根据本ELISA法Apo AI标准曲线的制定，其检测范围的直线范围在80-1000ng/ml尿之间，因此，本法的灵敏度(最低检出量)为80ng/ml尿。
十二、稳定性试验
将Apo AI ELISA试剂盒放置37℃0、1、2、3、4、5天，每天分别测定同一阳性尿样，活性下降很少，说明本试剂盒稳定性好，结果见表。
表6 Apo AI试剂盒稳定性试验
| 年月日A450nm | 2001.5.10 | 2001.5.11 | 2001.5.12 | 2001.5.13 | 2001.5.14 |
| 阳性尿 | 0.912 | 0.908 | 0.901 | 0.890 | 0.880 |
注：阳性尿液在4℃冰箱放置5天。
上海长海医院肾内科用本发明试剂盒进行尿载脂蛋白Apo AI测定的试验：
目前对肾脏病人尿中各种蛋白质的检测项目日益增多，而尿载脂蛋白测定至今未见报道。本文测定65例各种慢性肾脏病患者尿中载脂蛋白Apo AI和载脂蛋白Apo B100。并对其临床意义进行初步探讨。
检测对象均为各种慢性肾脏病患者，其中原发性肾病综合症(肾病)25例(I型12例，II型13例)；慢性肾功能衰竭(慢性肾衰)20例，慢性肾炎8例；其它肾病包括隐匿性肾炎、肝硬化性肾炎、狼疮性肾炎、痛风性肾病和双肾钙化，糖尿病肾病各2例。所有检测对象均留24小时尿，以酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定尿中(Apo AI)和(ApoB100)，以μg/L为单位。另设对照组21例，均为正常成人。方法：用Apo AI及Apo B100试剂盒，以ELISA法进行检测。
结果：
一、正常人尿中Apo AI和Apo B100的含量：
对照组正常人21例尿中Apo AI和Apo B100均为“0”。
二、肾病病人尿中Apo AI和Apo B100的含量：
肾病病人25例，尿中Apo AI全部阳性，其中I型平均为226±178.09μg/L；II型为357.86±172.14μg/L。I型尿Apo B100全部阴性(均为0)；II型则全部为阳性。平均105.63±112.96μg/L，且全部病例尿中Apo AI均＞Apo B100，无1例Apo B100＞Apo AI。
三、慢性肾衰病人尿中Apo AI和Apo B100的含量：
慢性肾炎病人19例，尿中Apo AI阳性者16例(84％)，平均为411.63±392.24μg/L；尿中Apo B100阳性者12例(63％)，平均为353.33±295.91μg/L。尿中Apo AI＞Apo B100者5例(26％)。
四、慢性肾炎病人Apo AI和Apo B100的含量：
慢性肾炎病人6例，尿中Apo AI阳性者与Apo B100均阳性，Apo AI平均为3.01±162.50μg/L，Apo B100平均为164.50±127.90μg/L。全部病例尿中Apo AI均＞Apo B100。
五、其他肾脏病人尿中Apo AI和Apo B100的含量
其他肾脏病人共6例，尿中Apo AI除1例狼疮性肾炎外，共余5例均阳性；但尿中Apo B100有3例阴性(狼疮性肾炎、肝硬化肾炎和痛风性肾病各1例)，两者均阳性者，Apo AI和Apo B100。
结果：
1.正常人21例对照尿中Apo AI和Apo B100均为“0”。
2.肾病综合症病人尿中Apo AI和Apo B100的含量见下表7。
表7 12例肾病综合症病人尿中Apo AI和Apo B100的含量(μg/L)
I型 II型
Apo AI Apo B100 Apo AI Apo B100
250 0 450 100
300 0 350 200
400 0 300 100
450 0 400 300
500 0 800 600
350 0 600 400
300 0 500 300
250 0 400 200
300 0 600 300
350 0 400 200
400 0 650 350
450 0 600 400
3.慢性肾衰病人尿中Apo AI和Apo B100含量：
慢性肾衰病人20例尿中Apo AI阳性比例数比Apo B100多，Apo AI含量＞Apo B100含量。
4.慢性肾炎病人9例尿中Apo AI和Apo B100均呈阳性，尿中ApoAI含量＞Apo B100含量。
讨论：
正常人尿中未检测到Apo AI和Apo B100。
肾病综合症病人中I型者尿中Apo AI均阳性，而Apo B100均阴性。II型者尿中Apo AI及Apo B100均呈阳性，而且Apo AI含量＞Apo B100含量。因此作为肾病综合症I型与II型鉴别的指标。一般认为I型肾小球滤过膜损伤比II型较轻。
初步认为尿中载脂蛋白Apo AI和Apo B100测定可做为选择性载脂蛋白尿与非选择性载脂蛋白尿的鉴别指标之一。
采用尿中Apo AI及Apo B100ELISA法试剂盒是一种简单、快速、灵敏和特异，而优于肾脏病尿中其他检测方法。对肾脏病的诊断和分型有重要的临床应用价值。
上海第二医科大学附属新华医院用ELISA法测定尿中载脂蛋白的试验：
在某些疾病中，尿中可出现载脂蛋白。本文用酶联免疫吸附试验(简称ELISA法)，在我院首次用于临床定量检测38例慢性肾脏疾患尿中载脂蛋白AI(Apo AI)和载脂蛋白B100(Apo B100)，现将结果公布如下：
一、方法：
用Apo AI及Apo B100试剂盒，以ELISA法进行检测。
二、对象
(1)选正常人3个年龄组，4～16岁组(男25人，女12人)，17～23岁组(男28人，女17人)，45～60岁组(男40人，女27人)。测定血中Apo AI及Apo B100含量。
(2)选正常人15人，慢性肾脏疾患38例，其中肾病综合症18例。测定其尿中Apo AI及Apo B100含量。
三、结果
1.Apo AI和Apo B100的标准曲线，曲线呈“S”状，可测范围在80～1000ng/ml之间。
2.正常人尿中脂蛋白含量：检测正常人对照15例，尿中Apo AI及Apo B100均为阴性。检测肾病综合症20例，结果见表8。I型(10例)肾病综合症尿中Apo AI为阳性，Apo B100为阴性，II型(10例)肾病综合症尿中Apo AI和Apo B100均为阳性。
表8 肾病尿中Apo AI及Apo B100含量(μg/L)
I型 II型
Apo AI Apo B100 Apo AI Apo B100
300 0 400 100
500 0 300 100
300 0 500 200
400 0 600 400
450 0 400 200
250 0 850 800
300 0 600 400
400 0 500 300
500 0 600 400
300 0 400 200
四、讨论
根据我院试用ELISA方法结果，呈“S”型的标准曲线与长海医院基本一致。同做一组样品呈显著相关。说明该法准确性及重演性均较好。
15例正常人尿中均未见Apo AI及Apo B100，而肾病综合症组患者，I型(轻型)尿中只出现Apo AI，而II型(重型)尿中出现Apo AI及ApoB100。由于呈球状的Apo Lipopretein分子颗粒大小不一样，Apo B100分子直径约为Apo AI数倍，因此尿中Apolipopretein出现的种类不同不仅说明肾小球泸过膜受到损害，而且还能说明其损害的程度，故用ELISA法对肾病综合症进行分型比其他方法更为敏感，而Apo AI经Apo B100又更敏感些。ELISA法简便、快速、特异性强、灵敏度高，用于临床有较大的社会效益和经济效益。
同济大学上海放射免疫研究所用ELISA法测定人尿中载脂蛋白的试验：
在某些肾脏疾病中，尿中可出现不同类型的脂蛋白，但以往没有见过这方面的报导。我所首先运用杜凤鸣教授创立的定量酶联免疫吸附试验(简称ELISA)法检测人尿中载脂蛋白Apo AI和载脂蛋白ApoB100。
现将结果公布如下：
一、方法
用Apo AI及Apo B100试剂盒，以ELISA法进行检测。
二、对象
(1)选正常健康人3个年龄组，4～16岁组(男20人，女30人)，17～23岁组(男25人，女20人)，45～60岁组(男35人，女30人)。测定血中载脂蛋白AI(Apo AI)及载脂蛋白B100(Apo B100)含量。
(2)选正常人12人，慢性肾脏疾患28例，其中肾病综合症15例，慢性肾炎13例，测定其尿中Apo AI及Apo B100含量。
三、结果
(1)Apo AI及Apo B100的标准曲线，曲线呈“S”状。可测范围在80～1000ng/ml之间。
(2)检测正常健康人尿中脂蛋白组分含量尿中Apo AI及Apo B100均为“0”。检测肾病综合症15例，其中I型13例，II型13例，尿中载脂蛋白含量见表9。
表9 肾病综合症病人尿中载脂蛋白含量(μg/L)
I型 II型
Apo AI Apo B100 Apo AI Apo B100
300 0 500 200
300 0 600 400
450 0 350 200
400 0 300 100
500 0 400 200
350 0 800 600
400 0 700 400
300 0 600 350
400 0 500 200
500 0 750 400
400 0 400 200
400 0 600 400
250 0 300 200
四、讨论
根据我所试用ELISA方法结果，呈“S”型的标准曲线与长海医院基本一致。同做一组样品呈显著相关。说明该法准确及重演性均好。10例健康人尿中均未见Apo AI和Apo B100。
有意义的是肾病综合症，I型(轻型)尿中只出现Apo AI，而II型(重型)尿中出现Apo AI和Apo B100。由于呈球状的Apo分子颗粒大小不一样，Apo B100分子直径约比Apo AI大，因此尿中ApoLipoprotein出现的种类不同不仅说明肾小球泸过膜受到损害，而且还能说明其损害的程度，故用ELISA法对肾病综合症进行分型比其他方法更为敏感。可根据该病人尿中是否出现Apo Lipoprotein，以及出现的种类，含量的多少，来判断肾炎病人的病情轻重，以及预后。ELISA法简便快速，特异性强，灵敏度高，用于临床有较大的社会效益和经济效益。
具体实施方式
实施例1
一、原材料及其规格
正常人血清
动物：新西兰大白兔，健康雄性，体重2-3kg
721分光光度计
旋涡混合器，XW-80型
PHS-20型精密酸度计
酶标板，华东理工大学ELISA测定CV％(％)＜10％
辣根过氧化物酶(RZ3.0，SigMA)
NaIO4 A.R(进口分装)
NaBH4 A.R(进口分装)
其他试剂
Na2HPO4.12H2O A.R
柠檬酸 A.R
Nacl A.R
甘油 化学纯
H2O2 A.R
Tween-20 化学纯
邻苯二胺 化学纯
H2SO4 A.R
人Apolipoprotein AI标准品及免疫源(SigMA)蒸馏水必需符合《中国药典》(1990)之规定
二、Apo AI多克隆抗体IgG的制备和亲和层析纯化首先用Apo AI制备抗血清Apo AI(SigMA)溶于0.01MPH7.4磷酸缓冲液中，加等量的福氏完全佐剂乳化后，给新西兰大白兔，颈背部多点及脚垫内注射2.0mg，为基础免疫。每两周加强一次，共免疫6次，最后一次免疫8-10天抽血测试效价，效价满意者，由心脏抽血收集血清，抗血清再经硫酸铵两次盐析(50％及33％饱和(NH4)2SO4分步沉淀纯化后，再用Sepharose 4B亲和层析纯化，用高压液相色普(HPLC)测纯度为单一峰，纯度高达96％以上的兔抗人Apo AI抗体IgG(简称Apo AI抗体IgG)。
三、辣根过氧化物酶(HRP)与Apo AI抗体IgG偶联。
经纯化所得的兔抗人Apo AI抗体IgG与辣根过氧化物酶用改良的过碘酸钠法交联获得“酶标抗体IgG”。试剂配制和操作步骤如下：
1.过碘酸钠标记法试剂
(1)0.06M NalO4(0.13克NalO4，加水至10ml)
(2)0.16M乙二醇溶液0.1ml加水至10ml
(3)NaBH4(5mg/ml，NaBH4 5mg加水至1ml)
(4)0.05M PH9.5碳酸盐缓冲液
甲液：无水碳酸钠10.6克加水至500ml
乙液：无水碳酸氢钠16.8克加水至1000ml
取甲液16ml+乙液34ml，加水至200ml
(5)0.02M PH7.4PBS(用0.1M PH7.4 PBS稀释)
2.过碘酸标记法的操作步骤
7.5mg HRP+0.5ml蒸馏水溶解
↓
加0.06M NaIO4 0.5ml，混合后置4℃，30分钟
↓
加0.16乙二醇0.5ml室温30分钟
↓
加兔抗人载脂蛋白抗体Apo AI抗体IgG 0.5ml(约含Apo AI抗体IgG7mg)，混合后装透析袋，用0.05M，PH9.6碳酸缓冲液透析过夜
↓
次日吸出透析物，加NaBH4溶液0.2ml(5mg/ml)置冰箱2小时吸出上述结合物混合液，加入等体积饱和硫酸铵，4℃30分钟后，离心4000转/分×15分钟弃上清，沉淀溶于1ml PH7.4 0.02M PBS中透析过液，换液三次，每次1000ml
↓
次日，在离心出去不溶物即得“酶标抗体IgG”，分装于安中密封后，置-40℃保存
四、最佳酶标记Apo AI抗体IgG工作浓度的选择
用方阵滴定法，选择最佳酶标记Apo AI抗体IgG工作浓度为1∶2000稀释(其阳性OD/阴性OD的P/N值最大为9.48)。
五、最佳Apo AI抗体IgG包被量选择
用方阵滴定法，选择最佳Apo AI抗体IgG包被浓度为20μg/ml(其阳性OD值/阴性OD值的P/N值为最大9.17)。
六、载脂蛋白Apo AI酶联免疫吸附实验(ELISA)双抗体夹心法的一步法及二步法操作步骤如下：
(一)二步法：
尿样：原液
包被稀释液：Na2CO30.16克，NaHCO32.9克，NaN30.02克，加水至100ml成为pH9.6碳酸盐缓冲液。
样品稀释液：NaCL 8克，KH2PO4 0.2克，Na2HPO4 2.9克，KCL0.2克，Tween-20 0.5ml NaN30.2克，加水至1000ml，用前每100ml加10ml小牛血清成为pH 7.4PBS-Tween20样品稀释液。
洗涤液：Tris2.42，1N HCL13ml，Tween-20 0.5ml加水至1000ml成为pH 7.4 0.02M Tris-Tween 20洗涤液。
基质液：0.1M Na2HPO4 5.14ml(3.6克Na2HPO4加水100ml)，0.05M柠檬酸4.86ml(1克柠檬酸加水100ml)邻苯二胺4mg，3％H2O2 0.05ml成为基质液。
双抗体夹心法操作程序：
0.1ml抗体Apo AI IgG包被(20μg/ml IgG4℃过夜)
↓洗涤
0.1ml样品(0.1ml尿样液)(37℃ 2小时)
0.1ml脂蛋白标准液Apo AI标准品(SigMA进口)0-2500ng/ml
↓洗涤
0.1ml酶标抗体Apo AI IgG(1∶2000)(37℃ 2小时)
↓洗涤
0.1ml基质液(邻苯二胺4mg溶于10ml柠檬酸磷酸氢(37℃ 10分钟)二钠缓冲液加3％H2O2 0.05ml)
↓
0.05ml 3M H2SO4终止反应
↓
450nm测OD Multiskam MK3酶免测定仪
↓
计算含量
(二)一步法：尿原液及标准品加完后，立即加Apo AI抗体IgG-HRP，其余步骤完全同二步法，二步法比一步法OD值稍有增加。
七、Apo AI抗体IgG的检定为单一沉淀线。
八、标准曲线的制备
倍比稀释的Apo AI(SigMA进口)标准液，做双抗体夹心法ELISA测定，分别绘出标准曲线图。曲线呈“S”型，灵敏度良好，Apo AI-蛋白质(Apo B100-P)最低检测量约为80ng。标准曲线测定Apo B100-P含量范围为80-1000ng/ml。在ELISA双抗体夹心法的酶标板上的标准曲线的梯度浓度良好。
九、精密度试验
为了明确和证明本研究的载脂蛋白Apo AI ELISA的精密度，作了批内、批间和各医院实验室间重复试验。
批内及批间实验，用混合血清分别作Apo AI批内测定，结果见表10。用混合血清作Apo AI批间含量测定，结果见表11。所得变异系数(CV％)，说明本法重复性良好。
表10 ELISA法测定血中各载脂蛋白之批内实验
类别 稀释倍数 n X(g/L) SD CV％
LDL-P 1∶2000 30 0.80 0.05 7.0
Apo B100 1∶4000 30 0.82 0.05 6.5
HDL-P 1∶2000 30 0.29 0.03 5.0
Apo AI 1∶4000 30 0.25 0.02 10
表11 ELISA法测定血中各载脂蛋白之批间实验
类别 稀释倍数 n X(g/L) SD CV％
Apo B100 1∶2000 45 0.70 0.04 8.6
Apo AI 1∶2000 30 0.22 0.02 9.0
十、特异性检定
取正常人尿液11份，分别加入IgA、IgM、IgG、C3、β2m、α巨球蛋白、转铁蛋白、白蛋白、纤维蛋白降解产物(FDP)Apo B100及Apo AI各1000ng/ml，用本试剂盒检测，只查出Apo AI 960ng/ml，回收高达96％，说明特异性强。
十一、灵敏度(最低检出量)试验
Apo AI标准曲线直线范围在80-1000ng/ml尿之间，本试剂盒灵敏度(最低检出量)为80ng/ml尿。
十二、稳定性试验将Apo AI试剂盒放置37℃ 0、1、2、3、4、5天分别查同一尿样(4℃保存)活性下降很少，说明试剂盒稳定性好。
Claims (6)
1.一种人尿中载脂蛋白AI(ApoAI)定量酶联免疫吸附试验试剂盒，其特征在于该试剂盒包括下列试剂组成的：
(1)ApoAI标准品(2500、1250、625、56、10、0ng/ml)各1瓶
(2)ApoAI抗体IgG预包被板1块，48T/96T
(3)ApoAI抗体IgG酶标记液1瓶
(4)浓缩洗涤液1瓶
(5)显色剂甲、乙各1瓶
(6)终止液1瓶
2.一种如权利要求1所述的一种人尿ApoAI、定量酶联免疫吸附试验试剂盒的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
一、原材料及其规格
动物：新西兰大白兔，健康雄性，体2~3kg
酶联免疫测定仪：Labosystems Dragon Multiskan MK3
UV754分光光度计
旋涡混合器，XW-80型
PHS-20型精密酸度计
电泳仪，上海
酶标板，华东理工大学 ELISA测定CV％＜10％
辣根过氧化物酶，RZ3.0，SigMA
NaIO4 A.R(进口分装)
NaBH4 A.R(进口分装)
其他试剂
Na2HPO4.12H2O A.R
柠檬酸 A.R
Nacl A.R
甘油 化学纯
H2O2 A.R
Tween-20 化学纯
邻苯二胺 化学纯
H2SO4 A.R
人Apolipoprotein AI标准品及免疫源(SigMA)
蒸馏水必需符合《中国药典》(1990)之规定
二、Apo AI多克隆抗体IgG的制备和亲和层析纯化
首先用人Apo AI(SigMA)溶于0.01M PH7.4磷酸缓冲液中，加等量的福氏完全佐剂乳化后，给新西兰大白兔，颈背部多点及脚垫内注射2.0mg，为基础免疫，每两周加强一次，共免疫6次，最后一次免疫后8-10天抽血测试效价，效价满意者，由心脏抽血收集抗血清，抗血清再经硫酸铵两次盐析，50％及33％饱和(NH4)2SO4分步沉淀纯化后，再用Sepharose 4B亲和层析纯化，用高压液相色普(HPLC)测纯度为单一峰，纯度高达96％以上的兔抗人Apo AI抗体IgG，简称Apo AI抗体IgG；
三、辣根过氧化物酶(HRP)与Apo AI抗体IgG偶联
经纯化所得的兔抗人Apo AI抗体IgG与辣根过氧化物酶用改良的过碘酸钠法交联获得“酶标抗体IgG”，试剂配制和操作步骤如下：
1.过碘酸钠标记法试剂
(1)0.06M NaIO4，0.13克NaIO4，加水至10ml
(2)0.16M 乙二醇溶液0.1ml 加水至10ml
(3)NaBH4，5mg/ml，NaBH4 5mg加水至1ml
(4)0.05M PH9.5碳酸盐缓冲液
甲液：无水碳酸钠10.6克加水至500ml
乙液：无水碳酸氢钠16.8克加水至1000ml
取甲液16ml+乙液34ml，加水至200m1
(5)0.02M PH7.4 PBS，用0.1M PH7.4 PBS稀释
2.过碘酸标记法的操作步骤
7.5mg HRP+0.5ml蒸馏水溶解
↓
加0.06M NaIO4 0.5ml，混合后置4℃，30分钟
↓
加0.16M乙二醇 0.5ml室温30分钟
↓
加兔抗人载脂蛋白抗体Apo AI IgG0.5ml
(约含Apo AI抗体IgG7mg)，混合后装透析袋，用0.05M，PH9.6碳酸缓冲液透析过液
↓
次日吸出透析物，加NaBH4溶液0.2ml(5mg/ml)置冰箱2小时
↓
吸出上述结合物混合液，加入等体积饱和硫酸铵，冰箱4℃ 30’后，离心4000转/分×15分钟弃上清，沉淀溶于1ml PH7.4 0.02M PBS中透析过液，换液三次，每次1000ml
↓
次日，再离心除去不溶物即得“酶标抗体IgG”，分装于安瓿中密封后，置-40℃保存
四、最佳酶标记Apo AI抗体IgG工作浓度的选择
用方阵滴定法，选择最佳酶标记Apo AI抗体IgG工作浓度为1：2000稀释(其阳性OD值/阴性OD值的P/N值最大为9.48)；
五、最佳Apo AI抗体IgG包被量选择
用方阵滴定法，选择最佳Apo AI抗体IgG包被浓度为20μg/ml(其阳性OD值/阴性OD值的P/N值为最大为9.17)；
六、Apo AI酶联免疫吸附试验ELISA双抗体夹心法的一步法和二步法操作步骤如下：
(一)二步法：
尿样：原液
包被稀释液：Na2CO3 0.16克，NaHCO3 2.9克，NaN3 0.02克，加水至100ml成为PH9.6碳酸盐缓冲液
样品稀释液：NaCL 8克，KH2PO4 0.2克，Na2HPO4 2.9克，KCL 0.2克，Tween-20 0.5ml，NaN3 0.2克，加水至1000ml，用前每100ml加10ml小牛血清成为PH7.4PBS-T ween 20样品稀释液
洗涤液：Tris 2.42g，1N HCL 13ml，Tween-20 0.5ml加水至1000ml成为PH7.4 0.02M Tris-Tween 20洗涤液
基质液：0.1M Na2HPO4 5.14ml，3.6克Na2HPO4加水100ml，0.05M柠檬酸4.86ml，1克柠檬酸加水100ml邻苯二胺4mg，3％H2O2 0.05ml成为基质液
双抗体夹心法操作程序：
0.1ml抗体Apo AI IgG包被(20μg/ml IgG 4℃过夜)
↓洗涤
0.1ml样品(0.1ml尿原液)(37℃ 2小时)
0.1ml载脂蛋白标准液Apo AI标准品(SigMA进口)0-2500ng/ml
↓洗涤
0.1ml酶标抗体IgG(1∶2000)(37℃ 2小时)
↓洗涤
0.1ml基质液(邻苯二胺4mg溶于10ml)
柠檬酸磷酸氢(37℃ 10分钟)
二钠缓冲液加3％H2O2 0.05ml
↓
0.05ml 3M H2SO4终止反应
↓
450nM 测OD MultisKan MK3酶免测定仪
↓
计算含量；
(二)一步法：尿原液及标准品加完后，立即加Apo AI抗体IgG-HRP，其余步骤完全同二步法，二步法比一步法OD值稍有增加；
七、抗体IgG的鉴定
经两次盐析纯化的Apo AI抗体IgG，经长海医院实验诊断科血清室用免疫电泳鉴定结果；
八、标准曲线的制备
倍比稀释的Apo AI，SigMA进口标准液，作双抗体夹心法ELISA测定，分别绘出标准曲线图，曲线呈“S”型，灵敏度良好，Apo AI蛋白质(Apo AI-P)最低检测量约为80ng，标准曲线测定Apo AI-P含量范围为80-1000ng/ml；
九、精密度试验
为了明确和证明本研究的载脂蛋白Apo AI ELISA的精密度，作了批内、批间和各医院实验室间重复性试验；
批内及批间实验，用混合血清分别作Apo AI批内测定，结果见表12，用混合血清作Apo AI-蛋白质(Apo AI-P)批间含量测定，结果见表13，所得变异系数CV％；
表12 ELISA法测血中载脂蛋白之批内实验
类别 稀释倍数 n X(g/L) SD CV％
Apo B100 1∶2000 30 0.80 0.05 7.0
1∶4000 30 0.82 0.05 6.6
Apo AI 1∶2000 30 0.29 0.03 5.0
1∶4000 30 0.25 0.02 10
表13 ELISA法测定血中载脂蛋白之批间实验
类别 稀释倍数 n X(g/L) SD CV％
Apo B100 1∶2000 45 0.70 0.04 8.6
Apo AI 1∶2000 30 0.22 0.02 9.0
十、特异性检定
取正常人尿液11份，分别加入IgA、IgM、IgG、C3、β2m、α巨球蛋白、转铁蛋白、白蛋白、纤维蛋白降解产物(FDP)Apo B100及Apo AI各1000ng/ml，用本试剂盒检测，只查出Apo AI 960ng/ml，回收高达96％；
十一、灵敏度(最低检出量)试验
Apo AI标准曲线直线范围在80-1000ng/ml尿之间，本试剂盒灵敏度(最低检出量)为80ng/ml尿；
十二、稳定性试验将Apo AI试剂盒放置37℃ 0 、1、2、3、4、5天分别查同一尿样(4℃保存)活性下降很少。
3.一种如权利要求1所述的一种人尿中Apo AI定量酶联免疫吸附试剂盒的Apo定量实验方法及其主要试剂：(1)Apo AI标准品(0-2500ng/ml)；(2)Apo AI抗体IgG；(3)酶标记Apo AI抗体IgG；在人尿中的使用。
4.一种如权利要求1所述的一种人尿中Apo AI定量酶联免疫吸附试剂盒的Apo AI标准品，在人尿中Apo AI定量标准品使用。
5.一种如权利要求1所述的一种人尿中Apo AI定量酶联免疫吸附试剂盒的Apo AI抗体IgG及酶标记Apo AI抗体IgG，用于人尿中Apo AI定量的检测。
6.一种如权利要求2所述的一种人尿中Apo AI定量酶联免疫试剂盒的制备方法的11种蛋白质(IgA、IgM、IgG、C3、B2M、α巨球蛋白、转铁蛋白、白蛋白、FDP、Apo AI、Apo B100)用于人尿中特异性Apo AI的检定。
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