CN1194991C - 重组弓形虫融合蛋白抗原及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明重组弓形虫融合蛋白及其制备方法、应用涉及基因工程技术和诊断试剂领域。本发明是利用基因工程技术制备一种新型的重组弓形虫蛋白，即弓形虫GRA6蛋白N端从第43个氨基酸到第152个氨基酸的110个氨基酸和P30蛋白的第56个氨基酸到第313个氨基酸的258个氨基酸串联形成的融合蛋白，GRA6蛋白N端的110个氨基酸在融合蛋白N端，P30蛋白的258个氨基酸在融合蛋白的C端，两者之间由甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)2个氨基酸连接，融合蛋白的N端增加了1个蛋基酸(Met)，全长371个氨基酸。该蛋白用于检测弓形虫抗体或抗原及用于免疫制备抗弓形虫单抗和多抗。

Description

重组弓形虫融合蛋白抗原及其制备方法、应用

技术领域

本发明是利用基因工程技术，制备重组弓形虫融合蛋白。融合蛋白的两个片段分别来自于的弓形体GRA6蛋白和P30蛋白，两个片段利用基因工程技术连接表达，形成新的融合蛋白，产生的新型融合蛋白可用作抗原，用于弓形虫抗体或抗原的检测等。本发明涉及基因工程技术和诊断试剂领域。

背景技术

弓形虫病又称弓形体病，是一种人兽共患寄生虫病，该病属于寄生虫病的范畴，呈世界性分布。弓形虫病它的病原体是一种球虫，弓形虫的整个生活史发育过程需两个宿主，猫科动物，如家猫为终末宿主，但它对中间宿主的选择极不严格，无论哺乳类或鸟类都可以作为中间宿主。若家中的宠物(如猫、狗、鸟等)感染了弓形体或您吃了感染了弓形体却煮得不熟的肉制品、奶制品、蛋类及输入了感染有弓形体的血浆，都将有机会得弓形体病。另据报道，蚊子、苍蝇、蟑螂等昆虫也会将弓形体携带到人的食物上或饮水中，从而会引起人的感染。

人体感染一般为隐性感染，多数可能是无症状的带虫者，仅少数人发病。虫体可侵犯多种脏器与组织，该病临床表现复杂，轻者为隐性感染，重者可表现为多器官的严重损害，如弓形虫脑病、眼病、肾病、肝病、肺病及弓形体心肌炎等各系统的病变。并可通过母婴垂直传播而造成胎儿畸形，神经系统发育障碍，脉络膜视网膜炎等。值得注意的是，弓形体对妊娠有很重要的影响。被弓形体感染的孕妇，不论其有无临床症状，常可通过胎盘将弓形虫传给胎儿，从而直接影响胎儿的发育，使胎儿严重致畸，甚至死亡，亦可发生流产、死产、早产或增加妊娠合并症。感染发生得越早，胎儿受损越严重。感染发生在妊娠头三个月，多会引起流产、死产、或生下无生活能力的和发育有缺陷的婴儿；在妊娠中三个月感染，多会出现死胎、早产和严重的脑、眼疾患；在妊娠晚期，因胎儿已逐渐成熟，此时母体如受到感染，胎儿可发育正常，亦可出现早产或出生后才出现症状，表现为各系统不同程度的损坏。据报道，偶见孕期感染弓形虫的胎儿在出生后数年甚至成人后才表现出弓形虫病。可见弓形虫对人类危害极大，尤其是孕妇。因此，防治弓形虫病的重点对象应为育龄期妇女。另外，近来的研究显示，弓形虫感染与不孕不育有一定关系，夫妻间性行为可能是弓形虫传播的一种途径(中国人兽共患病杂志，2000；16(3))。建立弓形虫感染的快速检测方法对育龄期妇女进行检测，对优生优育又重要意义。

目前弓形虫病诊断方法主要包括：(1)活体组织检查和动物接种。该法成功率低、耗时长。(2)PCR检测弓形虫基因。该法有较高的敏感性，但是有假阳性。(3)ELISA法检测弓形虫特异的IgG与IgM。这是应用较多的方法，血清内的弓形虫特异的IgM阳性说明近期感染了弓形虫，如果是孕妇则最好终止怀孕。

多种弓形虫蛋白可刺激机体产生相应的抗体。研制弓形虫特异的抗体检测试剂，应选用抗原性强、特异性好的蛋白抗原。我国使用的弓形虫蛋白抗原多是培养的弓形虫提取物，含有多个蛋白产物，抗原特异性不强，易产生假阳性。国外的研究证实，弓形虫的GRA6蛋白[Lecordier L，Fourmaux MP，Mercier C.et al.Clin DiagnLab Immunol.2000 Jul；7(4)：607-11]和P30蛋白[Nam HW，Im KS，Baek EJ，et al.Korean J Parasitol.1996；34(2)：135-41]具有较强的抗原性，在弓形虫感染者的血清中其相应的抗体检出率较高。根据GRA6蛋白和P30蛋白的氨基酸序列，通过计算机分析，我们筛选出选用其内较强的抗原决定簇，用PCR方法分别扩增了GRA6蛋白和P30蛋白内含抗原决定簇的基因片段，将两个基因片段串联克隆至同一质粒表达载体，构建成功了高效表达两者融合蛋白的工程菌，建立了表达蛋白的纯化方法，纯化获得了高纯度的融合蛋白，并用作抗原检测弓形虫抗体。

发明内容

本发明是利用基因工程技术制备一种新型的重组弓形虫蛋白，即弓形虫GRA6蛋白N端从第43个氨基酸到第152个氨基酸的110个氨基酸和P30蛋白的第56个氨基酸到第313个氨基酸的258个氨基酸串联形成的融合蛋白，GRA6蛋白N端的110个氨基酸在融合蛋白N端，P30蛋白的258个氨基酸在融合蛋白的C端，两者之间由甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)2个氨基酸连接，融合蛋白的N端增加了1个蛋基酸(Met)，全长371个氨基酸。该蛋白用于检测弓形虫抗体或抗原及用于免疫制备抗弓形虫单抗和多抗。

重组弓形虫融合蛋白及其制备方法、应用是采取以下步骤实施的：

弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白抗原表位的筛选及基因片段的克隆：

1)抗原表位的筛选

利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析弓形虫GRA6蛋白的全部氨基酸序列(GeneBank，接通号：L33814)和P30蛋白的全部氨基酸序列(GeneBank，接通号：S73634)，筛选出弓形虫GRA6蛋白内的强抗原表位位于第43个氨基酸到第152个氨基酸；P30蛋白内的强抗原表位位于第56个氨基酸到第313个氨基酸。它们的氨基酸序列和DNA序列如下：

筛选弓形虫GRA6蛋白内的抗原表位氨基酸序列(43aa～152aa)：

Ala Ala Asp Ser Gly Gly Val Lys Gln Thr Pro Ser Glu Thr Gly Ser Ser Gly Gly

Gln Gln Glu Ala Val Gly Thr Thr Glu Asp Tyr Val Asn Ser Ser Ala Met Gly Gly

Gly Gln Gly Asp Ser Leu Ala Glu Asp Asp Thr Thr Ser Glu Ala Ala Glu Gly Asp

Val Asp Pro Phe Pro Val Leu Ala Asn Glu Gly Lys Ser Glu Ala Arg Gly Pro Ser

Leu Glu Glu Arg Ile Glu Glu Gln Gly Thr Arg Arg Arg Tyr Ser Ser Val Gln Glu

Pro Gln Ala Lys Val Pro Cys Lys Arg Thr Gln Lys Arg His Arg

筛选的弓形虫GRA6蛋白抗原表位的DNA序列(547～876bp)：

GCA GCA GAC AGC GGT GGT GTT AAG CAG ACC CCT TCG GAA ACC GGT TCG AGC GGT GGA

CAG CAA GAA GCA GTG GGG ACC ACT GAA GAC TAT GTC AAC TCT TCG GCG ATG GGC GGT

GGC CAA GGC GAC TCG TTA GCT GAA GAT GAT ACA ACC TCC GAA GCG GCG GAG GGC GAC

GTT GAC CCT TTT CCC GTG CTG GCG AAT GAG GGG AAG TCG GAG GCG CGT GGC CCG TCG

CTC GAG GAA AGA ATC GAA GAA CAG GGC ACA AGA CGA CGT TAC TCC TCT GTT CAA GAA

CCA CAA GCG AAG GTG CCT AGC AAA CGA ACA CAG AAA CGC CAC AGA

筛选弓形虫P30蛋白内的抗原表位氨基酸序列(56aa～313aa)：

Gln Val Val Thr Cys Pro His Lys Lys Ser Thr Ala Ala Val Ile Leu Thr Pro Thr

Glu Asn His Phe Thr Leu Lys Cys Pro Lys Thr Ala Leu Thr Glu Pro Pro Thr Leu

Ala Tyr Ser Pro Asn Arg Gln Ile Cys Pro Ala Gly Thr Thr Ser Ser Cys Thr Ser

Lys Ala Val Thr Leu Ser Ser Leu Ile Pro Glu Ala Glu Asp Ser Trp Trp Thr Gly

Asp Ser Ala Ser Leu Asp Thr Ala Gly Ile Lys Leu Thr Val Pro Ile Glu Lys Phe

Pro Val Thr Thr Gln Thr Phe Val Val Gly Cys Ile Lys Gly Asp Asp Ala Gln Ser

Cys Met Val Thr Glu Thr Val Gln Ala Arg Ala Ser Ser Val Val Asn Asn Val Ala

Arg Cys Ser Tyr Gly Ala Asp Ser Thr Leu Gly Pro Val Lys Val Ser Ala Glu Glu

Pro Thr Thr Met Thr Leu Val Cys Gly Lys Asp Gly Val Lys Val Pro Gln Asp Asn

Asn Gln Tyr Cys Ser Gly Thr Thr Leu Thr Gly Cys Asn Glu Lys Ser Phe Lys Asp

Ile Leu Pro Lys Leu Thr Glu Asn Pro Trp Gln Gly Asn Ala Ser Ser Asp Lys Gly

Ala Thr Leu Thr Ile Lys Lys Glu Ala Phe Pro Ala Glu Ser Lys Ser Val Ile Ile

Gly Cys Thr Gly Gly Ser Pro Glu Lys His His Cys Thr Val Lys Leu Glu Phe Ala

Gly Ala Ala Gly Ser Ala Lys Ser Ala Ala Gly

筛选的弓形虫P30蛋白抗原表位的DNA序列(166bp～939bp)：

CAA GTT GTC ACC TGC CCA CAT AAA AAA TCG ACA GCC GCG GTC ATT CTC ACA CCG ACG

GAG AAC CAC TTC ACT CTC AAG TGC CCT AAA ACA GCG CTC ACA GAG CCT CCC ACT CTT

GCG TAC TCA CCC AAC AGG CAA ATC TGC CCA GCG GGT ACT ACA AGT AGC TGT ACA TCA

AAG GCT GTA ACA TTG AGC TCC TTG ATT CCT GAA GCA GAA GAT AGC TGG TGG ACG GGG

GAT TCT GCT AGT CTG GAC ACG GCA GGC ATC AAA CTC ACA GTT CCA ATC GAG AAG TTC

CCC GTG ACA ACG CAG ACG TTT GTG GTC GGT TGC ATC AAG GGA GAC GAC GCA CAG AGC

TGT ATG GTC ACG GAG ACA GTA CAA GCC AGA GCC TCA TCG GTC GTC AAT AAT GTC GCA

AGG TGC TCC TAC GGT GCA GAC AGC ACT CTT GGT CCT GTC AAG GTG TCT GCG GAA GAA

CCC ACT ACA ATG ACC CTC GTG TGC GGG AAA GAT GGA GTC AAA GTT CCT CAA GAC AAC

AAT CAG TAC TGT TCC GGG ACG ACG CTG ACT GGT TGC AAC GAG AAA TCG TTC AAA GAT

ATT TTG CCA AAA TTA ACT GAG AAC CCG TGG CAG GGT AAC GCT TCG AGT GAT AAG GGT

GCC ACG CTA ACG ATC AAG AAG GAA GCA TTT CCA GCC GAG TCA AAA AGC GTC ATT ATT

GGA TGC ACA GGG GGA TCG CCT GAG AAG CAT CAC TGT ACC GTG AAA CTG GAG TTT GCC

GGG GCT GCA GGG TCA GCA AAA TCG GCT GCG GGA

2)弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白抗原表位的基因克隆

在弓形虫GRA6蛋白抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物。设计的上游引物为GRA6P1(547-565bp)：5’-GCGAGTCA CCATGGCAGCAGACAGCGGTGGTG-3’；下游引物为GRA6P2(856-876bp)：5’-CGC GGATCCTCTGTGGCGTTTCTGTGTTCG-3’。在上游引物上增加了Nco I酶切位点(下画线部分)，并在5’端增加了8个保护碱基，以利于Nco I酶切割。在下游引物上增加BamHI酶切位点(下画线部分)。

在弓形虫P30蛋白抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物。设计的上游引物为P30P3(166-184bp)：5’-CTG GGATCCCAAGTTGTCACCTGCCCA-3’；下游引物为P30P4(922-939bp)：5’-GTC GAATTCTTATCCCGCAGCCGATTTTGC-3’。在上游引物上增加了BamHI酶切位点(下画线部分)，并在5’端增加了3个保护碱基，以利于BamHI酶切割。在下游引物上增加EcoRI酶切位点(下画线部分)和终止密码子(斜体)。

取小鼠培养的弓形虫100μl(南京农业大学提供)，离心，收集沉淀虫体，用200μl TE溶液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5mmol/L EDTA)悬浮，加100μl蛋白酶K(10mg/ml)，置56℃水浴4小时。用酚/氯仿法纯化弓形虫DNA，将获得的弓形虫DNA溶于20μl去离子水内，置-20℃冻存备用。

以上述提纯的弓形虫DNA为模板，用引物GRA6P1和GRA6P2 PCR扩增弓形虫GRA6蛋白抗原表位的基因片段，用引物P30P3和P30P4 PCR扩增弓形虫P30蛋白抗原表位的基因片段。扩增条件均为：94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 60秒，35个循环；最后72℃延伸7分钟。电泳回收、纯化扩增的基因片段，溶于去离子水内，置-20℃冻存备用。

表达弓形虫GRA6和P30融合蛋白重组质粒的构建：

提取质粒pET28a(+)(美国Novagen公司产品)，用Nco I和EcoR I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内。用Nco I和BamH I双酶切弓形虫GRA6基因片段，其5’形成Nco I粘性末端，3’端形成BamH I粘性末端电泳回收后，溶于去离子水内。用EcoR I和BamH I双酶切纯化的P30蛋白基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内。

取等摩尔浓度的上述三种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA连接酶连接，使弓形虫GRA6基因片段与P30蛋白基因片段串联插入到载体pET28a(+)内的Nco I和EcoR I位点之间，两者翻译框架一致，表达一个融合蛋白。

重组质粒的筛选与鉴定：

将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含卡那霉素(60μg/ml)LB平板，置37℃过夜。次日随机挑取转化菌落和对照菌(质粒pET28a转化菌)，分别提取质粒。首先用引物GRA6P1和引物P30P4组成引物对，以提取的质粒为模板进行PCR鉴定，含有弓形虫GRA6基因片段与P30蛋白基因片段串联基因的质粒，应扩增出一条1132bp基因片段。提取含弓形虫GRA6蛋白基因片段与P30蛋白基因片段串联基因的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有串联的弓形虫GRA6基因片段与P30蛋白基因片段，序列完全正确：

ATG GCA GCA GAC AGC GGT GGT GTT AAG CAG ACC CCT TCG GAA ACC GGT TCG AGC GGT

GGA CAG CAA GAA GCA GTG GGG ACC ACT GAA GAC TAT GTC AAC TCT TCG GCG ATG GGC

GGT GGC CAA GGC GAC TCG TTA GCT GAA GAT GAT ACA ACC TCC GAA GCG GCG GAG GGC

GAC GTT GAC CCT TTT CCC GTG CTG GCG AAT GAG GGG AAG TCG GAG GCG CGT GGC CCG

TCG CTC GAG GAA AGA ATC GAA GAA CAG GGC ACA AGA CGA CGT TAC TCC TCT GTT CAA

GAA CCA CAA GCG AAG GTG CCT AGC AAA CGA ACA CAG AAA CGC CAC AGA GGA TCCCAA

GTT GTC ACC TGC CCA CAT AAA AAA TCG ACA GCC GCG GTC ATT CTC ACA CCG ACG GAG

AAC CAC TTC ACT CTC AAG TGC CCT AAA ACA GCG CTC ACA GAG CCT CCC ACT CTT GCG

TAC TCA CCC AAC AGG CAA ATC TGC CCA GCG GGT ACT ACA AGT AGC TGT ACA TCA AAG

GCT GTA ACA TTG AGC TCC TTG ATT CCT GAA GCA GAA GAT AGC TGG TGG ACG GGG GAT

TCT GCT AGT CTG GAC ACG GCA GGC ATC AAA CTC ACA GTT CCA ATC GAG AAG TTC CCC

GTG ACA ACG CAG ACG TTT GTG GTC GGT TGC ATC AAG GGA GAC GAC GCA CAG AGC TGT

ATG GTC ACG GAG ACA GTA CAA GCC AGA GCC TCA TCG GTC GTC AAT AAT GTC GCA AGG

TGC TCC TAC GGT GCA GAC AGC ACT CTT GGT CCT GTC AAG GTG TCT GCG GAA GAA CCC

ACT ACA ATG ACC CTC GTG TGC GGG AAA GAT GGA GTC AAA GTT CCT CAA GAC AAC AAT

CAG TAC TGT TCC GGG ACG ACG CTG ACT GGT TGC AAC GAG AAA TCG TTC AAA GAT ATT

TTG CCA AAA TTA ACT GAG AAC CCG TGG CAG GGT AAC GCT TCG AGT GAT AAG GGT GCC

ACG CTA ACG ATC AAG AAG GAA GCA TTT CCA GCC GAG TCA AAA AGC GTC ATT ATT GGA

TGC ACA GGG GGA TCG CCT GAG AAG CAT CAC TGT ACC GTG AAA CTG GAG TTT GCC GGG

GCT GCA GGG TCA GCA AAA TCG GCT GCG GGA TAA

构建的重组质粒表达弓形虫GRA6蛋白与P30蛋白的融合蛋白，两者之间由甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)2个氨基酸连接，其中弓形虫GRA6蛋白在融合蛋白的N端，P30蛋白在融合蛋白的C端。其氨基酸序列如下：

Met Ala Ala Asp Ser Gly Gly Val Lys Gln Thr Pro Ser Glu Thr Gly Ser Ser Gly

Gly Gln Gln Glu Ala Val Gly Thr Thr Glu Asp Tyr Val Asn Ser Ser Ala Met Gly

Gly Gly Gln Gly Asp Ser Leu Ala Glu Asp Asp Thr Thr Ser Glu Ala Ala Glu Gly

Asp Val Asp Pro Phe Pro Val Leu Ala Asn Glu Gly Lys Ser Glu Ala Arg Gly Pro

Ser Leu Glu Glu Arg Ile Glu Glu Gln Gly Thr Arg Arg Arg Tyr Ser Ser Val Gln

Glu Pro Gln Ala Lys Val Pro Cys Lys Arg Thr Gln Lys Arg His Arg Gly Ser Gln

Val Val Thr Cys Pro His Lys Lys Ser Thr Ala Ala Val Ile Leu Thr Pro Thr Glu

Asn His Phe Thr Leu Lys Cys Pro Lys Thr Ala Leu Thr Glu Pro Pro Thr Leu Ala

Tyr Ser Pro Asn Arg Gln Ile Cys Pro Ala Gly Thr Thr Ser Ser Cys Thr Ser Lys

Ala Val Thr Leu Ser Ser Leu Ile Pro Glu Ala Glu Asp Ser Trp Trp Thr Gly Asp

Ser Ala Ser Leu Asp Thr Ala Gly Ile Lys Leu Thr Val Pro Ile Glu Lys Phe Pro

Val Thr Thr Gln Thr Phe Val Val Gly Cys Ile Lys Gly Asp Asp Ala Gln Ser Cys

Met Val Thr Glu Thr Val Gln Ala Arg Ala Ser Ser Val Val Asn Asn Val Ala Arg

Cys Ser Tyr Gly Ala Asp Ser Thr Leu Gly Pro Val Lys Val Ser Ala Glu Glu Pro

Thr Thr Met Thr Leu Val Cys Gly Lys Asp Gly Val Lys Val Pro Gln Asp Asn Asn

Gln Tyr Cys Ser Gly Thr Thr Leu Thr Gly Cys Asn Glu Lys Ser Phe Lys Asp Ile

Leu Pro Lys Leu Thr Glu Asn Pro Trp Gln Gly Asn Ala Ser Ser Asp Lys Gly Ala

Thr Leu Thr Ile Lys Lys Glu Ala Phe Pro Ala Glu Ser Lys Ser Val Ile Ile Gly

Cys Thr Gly Gly Ser Pro Glu Lys His His Cys Thr Val Lys Leu Glu Phe Ala Gly

Ala Ala Gly Ser Ala Lys Ser Ala Ala Gly

表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定：

将转化子接种至含3ml LB培养基(含卡那毒素60μg/ml)的试管内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5mmol/L，继续振荡培养诱导6h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，重组子表达相对分子量约为39000的融合蛋白，表达量约为28％，而对照菌BL21(DE3)无此蛋白带。

表达融合蛋白的纯化：

1)表达融合蛋白工程菌的超声裂解

将诱导表达融合蛋白的工程菌离心(8000rpm、10min、4℃)收菌，菌体重悬于原培养液1/10体积的裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH8.14、10mmol/L EDTA、10mmol/L DTT、5％的甘油)内，冰浴超声破菌10min，离心(12000rpm、20min、4℃)收集沉淀包涵体。

2)包涵体的裂解

包涵体用0.5％SKL(用50mmol/L Tris-HCl pH8.14、0.5mmol/L EDTA、0.25mmol/L DTT平衡液配制)溶液悬浮，室温裂解包涵体1h，离心(12000rpm、20min、4℃)，收集上清，装入透析袋内对1000ml平衡液(50mmol/L Tris-HCl pH8.14、0.5mmol/L EDTA、0.25mmol/L DTT)透析。4℃透析过夜，次日换透析液2次，每次1000ml。离心(8000rpm、20min、4℃)，收集上清上DEAE-Sepharose FF阴离子柱纯化。

3)DEAE-Sepharose FF阴离子柱纯化

将DEAE-Sepharose FF阴离子柱连接至常压层析系统，先用平衡液(50mmol/LTris-HCl pH8.14、0.5mmol/L EDTA、0.25mmol/L DTT)冲洗平衡，然后将上步获得的裂解上清直接上样，上样流速为1.5ml/min。收集穿过峰。上样后用平衡液冲洗，然后依次用含50、100、200、300、1000mmol/L NaCl的平衡液洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白。用12％SDS-PAGE检测穿过峰该峰和各洗脱峰蛋白，确定那个组份内含有融合蛋白。

纯化的融合蛋白用作抗原检测弓形虫抗体：

将纯化的融合蛋白用50mmol/L的碳酸盐(pH9.6)倍比稀释后包被酶联板，间接酶联免疫法检测已知的抗弓形虫IgM(或IgG)阳性血清及正常人血清，结果显示，融合蛋白能与抗弓形虫IgM(或IgG)阳性血清反应，不与正常人血清反应，说明该融合蛋白有较好的抗原性和特异性。

同样用辣根过氧化物酶(HRP)标记该融合蛋白，用扑获法检测抗弓形虫IgM或IgG抗体，有较高的敏感性和特异性。该融合蛋白用作抗原，用金标法检测抗弓形虫IgM或IgG抗体，亦有较高的敏感性和特异性。

本发明与现有技术相比具有的优点

目前我国使用的弓形虫蛋白抗原多是培养病毒提取物，含有多个蛋白产物，抗原特异性不强，易产生假阳性。国外使用的弓形虫全长GRA6蛋白和P30蛋白具有较强的抗原性，在弓形虫感染者的血清中其相应的抗体检出率较高，但是用全长GRA6蛋白和P30蛋白作抗原检测弓形虫抗体有两个缺点：一是会出现假阳性。二是用捕获法检测抗弓形虫IgM时，需标记GRA6蛋白和P30蛋白两个蛋白。

我们分别选择弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白内的抗原性强、特异性好的部分片段，利用基因工程技术表达两者的融合蛋白，表达的GRA6蛋白和P30蛋白的融合蛋白，有较多优点：

①用这两个蛋白作抗原检测抗弓形虫IgM血清时，不再需要分别制备这两种蛋白，也不需要调整两个抗原的使用比例，因此应用方便且成本较低。

②当用捕获法检测抗弓形虫IgM时，只需酶标记这一种融合蛋白，不再需要分别标记两个蛋白。因此，当检测抗体需要多个蛋白抗原时，制备多价融合蛋白抗原，是理想的发展方向之一。

③本文构建的表达弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白融合蛋白的工程菌，表达量可达菌体可溶性蛋白的28％，以包涵体和可溶性两种形式存在，易于纯化，可大量纯化制备该融合蛋白。目前未见表达该融合蛋白的报道。

附图说明

以下将结合附图对本发明作进一步说明：

图1是用多种分子生物学软件对弓形虫GRA6蛋白内的抗原表位进行分析结果。结果显示，在弓形虫GRA6蛋白的第43个氨基酸到第152个氨基酸含有强的亲水性抗原表位，即图内箭头标示的位置。

图2是用多种分子生物学软件对弓形虫P30蛋白内的抗原表位进行分析结果。结果显示，在弓形虫P30蛋白的第56个氨基酸到第313个氨基酸含有强的亲水性抗原表位，即图内箭头标示的位置。

图3是用1.2％的Agarose凝胶检测PCR扩增弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的基因片段。1：352bp的GRA6基因片段；2：795bp的P30基因片段；M：核酸标准分子量(TaKaRa DL2000)。

图4是表达弓形虫GRA6和P30融合蛋白的重组质粒构建流程图。

图5是用1.2％的Agarose凝胶检测6个转化子的PCR扩增产物，6个转化子中有4个(第1、2、4、6号重组子)扩增出1132bp的目的基因片段，2个转化子(第3、5号重组子)没有扩增出该基因片段。C：含质粒pET28a(+)的对照菌，M：核酸标准分子量(TaKaRa DL2000)。

图6是表达弓形虫GRA6和P30融合蛋白重组菌的SDS-PAGE分析结果。1～6号：1、2、4、6号重组菌均表达相对分子量约为39000的融合蛋白，即图内箭头标示的位置；3、5号2个重组子不表达融合蛋白。C：对照菌E.coli BL21(DE3)。

图7是表达弓形虫GRA6和P30融合蛋白纯化前后的SDS-PAGE分析结果。M：低分子量蛋白标准(Pharmacia)；1：对照菌BL21(DE3)；2：表达GRA6和P30融合蛋白的工程菌；3：工程菌超声裂解上清；4：用DEAE-Sepharose FF阴离子柱纯化的GRA6和P30融合蛋白融合蛋白。

具体实施方式

本发明实施方式的详细说明：

                    弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白融合表达

用PCR方法扩增弓形虫GRA6蛋白基因片段和P30蛋白基因片段。将这两个基因片段克隆至同一质粒pET28a(+)内的NcoI/BamHI和BamHI/EcoRI位点，使两者串联在一起，并且翻译框架一致，可表达一个融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选获得了高效表达该融合蛋白的工程菌，表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的28％左右，以包涵体和可溶性两种形式存在。

材料与方法

1.菌种与质粒：宿主菌BL21(DE3)及表达载体pET28a(+)为美国Novagen公司产品。

2.分子生物学试剂：限制性内切酶NcoI、BamHI、EcoRI、及T4 DNA连接酶为TaKaRa公司产品。质粒纯化试剂盒及从琼脂糖凝胶内回收DNA片段的试剂盒为德国QIAGEN公司产品。DTT及IPTG为Promega公司产品。其它试剂为进口或国产分析纯试剂。

3.基因片段的合成：由大连TaKaRa公司帮助合成。

4.基因克隆方法：DNA的酶切、连接、电泳；质粒的提取、转化；蛋白的SDS-PAGE分析等一般分子克隆方法按常规方法进行。其它试剂盒按说明书进行操作。

5.DNA序列分析：用QIAGEN公司质粒纯化试剂盒纯化质粒，用DNA全自动测序仪测序。

结果

1.弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白抗原表位的筛选：

利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析弓形虫GRA6蛋白的全部氨基酸序列(GeneBank，接通号：L33814)和P30蛋白的全部氨基酸序列(GeneBank，接通号：S73634)，筛选出弓形虫GRA6蛋白内的强抗原表位位于第43个氨基酸到第152个氨基酸(见图1)；P30蛋白内的强抗原表位位于第56个氨基酸到第313个氨基酸(见图2)。

2.弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白抗原表位的基因克隆：

在形虫GRA6蛋白抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物。设计的上游引物为GRA6P1(547-565bp)：5’-GCGAGTCA CCATGGCAGCAGACAGCGGTGGTG-3’；下游引物为GRA6P2(856-876bp)：5’-CGC GGATCCTCTGTGGCGTTTCTGTGTTCG-3’。在上游引物上增加了Nco I酶切位点(下画线部分)，并在5’短增加了8个保护碱基，以利于Nco I酶切割。在下游引物上增加BamHI酶切位点(下画线部分)。

在形虫P30蛋白抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物。设计的上游引物为P30P3(166-184bp)：5’-CTG GGATCCCAAGTTGTCACCTGCCCA-3’；下游引物为P30P4(922-939bp)：5’-GTC GAATTCTTATCCCGCAGCCGATTTTGC-3’。在上游引物上增加了BamHI酶切位点(下画线部分)，并在5’短增加了3个保护碱基，以利于BamHI酶切割。在下游引物上增加EcoRI酶切位点(下画线部分)给终止密码子(斜体)。

取小鼠培养的弓形虫100μl(南京农业大学提供)，离心，收集沉淀虫体，用200μl TE溶液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5mmol/L EDTA)悬浮，加100μl蛋白酶K(10mg/ml)，置56℃水浴4小时。用酚/氯仿法纯化弓形虫DNA，将获得的弓形虫DNA溶于20μl去离子水内，置-20℃冻存备用。

以上述提纯的弓形虫DNA为模板，用引物GRA6P1和GRA6P2 PCR扩增弓形虫GRA6蛋白抗原表位的基因片段，用引物P30P3和P30P4 PCR扩增弓形虫P30蛋白抗原表位的基因片段。反应浓度为：弓形虫DNA为模板2μl、引物P1、P2各1μl、10xbuffer5.0μl、2.5mmol/L dNTP 4.0μl、Taq DNA聚合酶0.5μl(2.5U)、去离子水36.5μl，总体积50μl。扩增条件为：94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 60秒，35个循环；最后72℃延伸7分钟。各取PCR产物5μl，用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果扩出了352bp的GRA6基因片段和795bp的P30基因片段(图3)。电泳回收、纯化扩增的基因片段，溶于20μl去离子水内，置-20℃冻存备用。

3.表达融合蛋白重组质粒的构建：

提取质粒pET28a(+)(美国Novagen公司产品)，用Nco I和EcoR I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于20μl去离子水内。用Nco I和BamH I双酶切弓形虫GRA6基因片段，其5’形成Nco I粘性末端，3’端形成BamH I粘性末端电泳回收后，溶于去离子水内。用EcoR I和BamH I双酶切纯化的P30蛋白基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内。

取上述三种酶切后DNA片段，按等摩尔浓度混匀，在同一离心管内用T4 DNA连接酶连接(置16℃连接过夜)，使GRA6基因片段与P30基因片段串联插入到载体pET28a(+)内的Nco I和EcoR I位点之间(构建流程见图4)，两者翻译框架一致，表达一个融合蛋白。

4.重组质粒的筛选：

将上步连接的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，将转化产物涂布含卡那霉素(60μg/ml)的固体LB培养基上，置37℃培养过夜。次日随机挑选6个转化子菌落和一个含有质粒pET28a(+)的对照菌，分别接种到含4ml液体LB培养基(含卡那霉素60μg/ml)的试管内，置37℃振荡培养6h，取菌液1ml，离心收菌。分别用50μl去离子水悬浮菌体，沸水煮5min，离心(4℃，12000rpm)5min，取上清(内有质粒)2μl用作PCR模板。用引物GRA6P1和引物P30P4组成引物对，以提取的质粒为模板进行PCR鉴定，含有弓形虫GRA6基因片段与P30蛋白基因片段串联基因的重组质粒，应扩增出一条1132bp基因片段。

PCR反应浓度为：质粒模板2μl、引物GRA6P1和引物P30P4各1μl、10x buffer5.0μl、2.5mmol/L dNTP 4.0μl、Taq DNA聚合酶0.5μl(2.5U)、去离子水36.5μl，总体积50μl。扩增条件为：94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 60秒，35个循环；最后72℃延伸7分钟。取PCR扩增产物5μl，用1.2％的Agarose凝胶检测，结果，6个转化子中有4个(第1、2、4、6号重组子)扩增出1132bp的目的基因片段(见图5)，2个转化子(第3、5号重组子)和含质粒pET28a(+)的对照菌没有扩增出该基因片段。初步证实，有4个转化子含有串联的弓形虫GRA6基因片段与P30蛋白基因片段。

5.表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定：

将上述6个转化子分别接种至含3ml LB培养基(含卡那毒素60μg/ml)的试管内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5mmol/L，继续振荡培养诱导6h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测。电泳检测显示(图6)，4个PCR鉴定阳性的重组子均表达相对分子量约为39000的融合蛋白，表达量约为28％，而对照菌和2个PCR鉴定阴性的重组子均无此蛋白带。获得了高表达弓形虫GRA6基因片段与P30蛋白基因片段融合蛋白的工程菌。

6.DNA序列分析结果：

将表达目的蛋白的1号转化子，提取质粒进行DNA序列测定，重组质粒内的GRA6基因片段与P30基因片段的DNA序列完全正确，结果如下：

ATG GCA GCA GAC AGC GGT GGT GTT AAG CAG ACC CCT TCG GAA ACC GGT TCG AGC GGT

GGA CAG CAA GAA GCA GTG GGG ACC ACT GAA GAC TAT GTC AAC TCT TCG GCG ATG GGC

GGT GGC CAA GGC GAC TCG TTA GCT GAA GAT GAT ACA ACC TCC GAA GCG GCG GAG GGC

GAC GTT GAC CCT TTT CCC GTG CTG GCG AAT GAG GGG AAG TCG GAG GCG CGT GGC CCG

TCG CTC GAG GAA AGA ATC GAA GAA CAG GGC ACA AGA CGA CGT TAC TCC TCT GTT CAA

GAA CCA CAA GCG AAG GTG CCT AGC AAA CGA ACA CAG AAA CGC CAC AGA GGA TCCCAA

GTT GTC ACC TGC CCA CAT AAA AAA TCG ACA GCC GCG GTC ATT CTC ACA CCG ACG GAG

AAC CAC TTC ACT CTC AAG TGC CCT AAA ACA GCG CTC ACA GAG CCT CCC ACT CTT GCG

TAC TCA CCC AAC AGG CAA ATC TGC CCA GCG GGT ACT ACA AGT AGC TGT ACA TCA AAG

GCT GTA ACA TTG AGC TCC TTG ATT CCT GAA GCA GAA GAT AGC TGG TGG ACG GGG GAT

TCT GCT AGT CTG GAC ACG GCA GGC ATC AAA CTC ACA GTT CCA ATC GAG AAG TTC CCC

GTG ACA ACG CAG ACG TTT GTG GTC GGT TGC ATC AAG GGA GAC GAC GCA CAG AGC TGT

ATG GTC ACG GAG ACA GTA CAA GCC AGA GCC TCA TCG GTC GTC AAT AAT GTC GCA AGG

TGC TCC TAC GGT GCA GAC AGC ACT CTT GGT CCT GTC AAG GTG TCT GCG GAA GAA CCC

ACT ACA ATG ACC CTC GTG TGC GGG AAA GAT GGA GTC AAA GTT CCT CAA GAC AAC AAT

CAG TAC TGT TCC GGG ACG ACG CTG ACT GGT TGC AAC GAG AAA TCG TTC AAA GAT ATT

TTG CCA AAA TTA ACT GAG AAC CCG TGG CAG GGT AAC GCT TCG AGT GAT AAG GGT GCC

ACG CTA ACG ATC AAG AAG GAA GCA TTT CCA GCC GAG TCA AAA AGC GTC ATT ATT GGA

TGC ACA GGG GGA TCG CCT GAG AAG CAT CAC TGT ACC GTG AAA CTG GAG TTT GCC GGG

GCT GCA GGG TCA GCA AAA TCG GCT GCG GGA TAA

                    表达重组弓形虫融合蛋白的纯化

材料和方法

1.主要试剂

DEAE-SepharoseFF阴离子凝胶为Pharmacia公司产品，IPTG、DTT为Promega公司产品。其它试剂为国产或进口分析纯试剂。

2.表达弓形虫融合蛋白工程菌的超声裂解

将培养的表达弓形虫融合蛋白的工程菌离心(8000rpm，10mins，4℃)，弃上清，菌体重悬于原培养液1/10体积的裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0、10mmol/L EDTA、10mmol/L DTT、5％甘油)内，冰浴超声破菌10mins，离心(12000rpm、20mins，4℃)收集沉淀包涵体。

3.包涵体的裂解

包涵体用0.5％SKL(用50mmol/L Tris-HCl pH8.14、0.5mmol/L EDTA、0.25mmol/L DTT平衡液配制)溶液悬浮，室温裂解包涵体1h，离心(12000rpm、20min、4℃)，收集上清，装入透析袋内对1000ml平衡液(50mmol/L Tris-HCl pH8.14、0.5mmol/L EDTA、0.25mmol/L DTT)透析。4℃透析过夜，次日换透析液2次，每次1000ml。离心(8000rpm、20min、4℃)，收集上清上DEAE-Sepharose FF阴离子柱纯化。

4.DEAE-Sepharose FF阴离子柱纯化

将DEAE-Sepharose FF阴离子柱连接至常压层析系统，先用平衡液(50mmol/LTris-HCl pH8.14、0.5mmol/L EDTA、0.25mmol/L DTT)冲洗平衡，然后将上步获得的裂解上清直接上样，上样流速为1.5ml/min。收集穿过峰。上样后用平衡液冲洗，然后依次用含50、100、200、300、1000mmol/L NaCl的平衡液洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白。用12％SDS-PAGE检测穿过峰该峰和各洗脱峰蛋白，确定那个组份内含有融合蛋白。

结果

1.DEAE-Sepharose FF阴离子柱纯化弓形虫融合蛋白

将穿过峰及不同浓度NaCl洗脱的各峰蛋白进行SDS-PAGE分析显示，弓形虫融合蛋白(分子量39000)主要存在于300mmol/L NaCl洗脱峰内，有很高的纯度；在200mmol/L NaCl洗脱峰内亦有形虫融合蛋白，但含有其它蛋白峰；其它浓度NaCl洗脱峰内无此蛋白带(见图7)。

                纯化重组弓形虫融合蛋白的鉴定及应用

将纯化的重组弓形虫融合蛋白用作抗原，间接ELISA方法，检测弓形虫抗体(IgM或IgG)阳性及阴性血清，以鉴定该重组蛋白抗原的特异性和抗原性。实验结果显示，该重组蛋白有很好的特异性和抗原性，可用作抗原检测弓形虫抗体。

材料和方法

1.抗弓形虫IgM阳性血清：由南京军区总医院等单位提供。

2.酶联反应材料：酶联板为深圳产96孔板，辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人μ链单克隆抗体购自Sigama公司。其它材料为酶联反应的常规材料。

3.ELISA试验：采用间接ELISA检测血清中的IgM抗体。基本步骤为：用50mmol/L碳酸盐溶液(pH9.6)稀释重组蛋白包被酶联板，每孔100μl，4℃过夜。次日用封闭液(10mmol/L磷酸盐缓冲液、pH7.4，10％山羊血清，20％小牛血清，0.5％casein，0.05％硫硫汞，5％蔗糖)封闭，每孔130μl，37℃ 1h(或4℃过夜)。将待测的抗弓形虫IgM阴、阳性血清用样本稀释液(10mmol/L磷酸盐缓冲液、pH7.4，10％山羊血清，20％小牛血清，0.5％casein，0.05％硫硫汞，0.5mmol/L NaCl)1∶100稀释后，分别加至封闭后的酶联板孔内，每孔100μl，每个样本加2孔，37℃反应30min，用PBST液(10mmol/L磷酸盐缓冲液、pH7.4，0.5％吐温-20)洗5遍后，加1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗人μ链单抗，每孔100μl，37℃反应30min，PBST洗5遍，加底物TMB溶液100μl，37℃避光显色10min，加50μl 4N硫酸混匀终止反应，用酶联仪测定A450值。

结果

1.间接ELISA检测血清中的弓形虫IgM抗体

将纯化的弓形虫GRA6与P30融合蛋白1∶500～1∶8000倍比稀释包被酶联板，检测已知的1份抗弓形虫IgM阳性血清和1份正常人血清，结果显示(见表1)，融合蛋白能与抗弓形虫IgM阳性血清反应，不与正常人血清反应，初步说明该融合蛋有较好的抗原性和特异性。

表1融合蛋白的ELISA实验结果(A450值)

包被融合蛋白              1∶500   1∶1000  1∶2000  1∶4000  1∶8000

抗弓形虫IgM阳性血清       1.632    1.216    0.970    0.541    0.216

正常人血清                0.120    0.052    0.036    0.022    0.027

将纯化的融合蛋白与已知不同浓度的牛血清白蛋白(第五部分)共同电泳、显色后比较，确定纯化的重组融合蛋白浓度约为2mg/ml。用50mmol/L碳酸盐溶液(pH9.6)1∶1000稀释后包被酶联板，检测已知6份抗弓形虫阴性血清和6份抗弓形虫阳性血清。结果显示，6份抗弓形虫IgM阴性血清均不显色，6份抗弓形虫IgM阳性血清均出现显色反应，说明该融合蛋白有较好的抗原性和特异性。用酶联仪测定各孔样本的A450值(见表2)。另外又检测了实验室保存的184份正常人血清，它们的A450值均小于0.05，进一步证实了该融合蛋白有较好的特异性。

表2纯化融合蛋白ELISA实验结果(A450)*

1       2     3     4     5     6     7     8     9     10    11    12

0.051 0.043 0.028 0.036 0.436 0.530 0.703 0.805 0.949 0.698 1.319 1.207

0.048 0.050 0.030 0.040 0.419 0.571 0.730 0.814 0.930 0.718 1.401 1.216

^*：1～6：抗弓形虫IgM阴性血清，7～12：抗弓形虫IgM阳性血清

重组弓形虫融合蛋白序列表

<110>李越希

<120>重组人弓形虫融合蛋白及其制备方法、应用

<160>2

<210>1

<211>371

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>1一种重组弓形虫融合蛋白，即弓形虫GRA6蛋白N端从第43个氨基酸到第152个氨基酸的110个氨基酸和P30蛋白的第56个氨基酸到第313个氨基酸的258个氨基酸串联形成的融合蛋白，GRA6蛋白N端的110个氨基酸在融合蛋白N端，P30蛋白的258个氨基酸在融合蛋白的C端，两者之间由甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)2个氨基酸连接，融合蛋白的N端增加了1个蛋基酸(Met)，全长371个氨基酸。

<400>1

Met Ala Ala Asp Ser Gly Gly Val Lys Gln Thr Pro Ser Glu Thr Gly

1               5                   10                  15

Ser Ser Gly Gly Gln Gln Glu Ala Val Gly Thr Thr Glu Asp Tyr Val

            20                  25                  30

Asn Ser Ser Ala Met Gly Gly Gly Gln Gly Asp Ser Leu Ala Glu Asp

        35                  40                  45

Asp Thr Thr Ser Glu Ala Ala Glu Gly Asp Val Asp Pro Phe Pro Val

    50                  55                  60

Leu Ala Asn Glu Gly Lys Ser Glu Ala Arg Gly Pro Ser Leu Glu Glu

65                  70                  75                  80

Arg Ile Glu Glu Gln Gly Thr Arg Arg Arg Tyr Ser Ser Val Gln Glu

                85                  90                  95

Pro Gln Ala Lys Val Pro Cys Lys Arg Thr Gln Lys Arg His Arg Gly

            100                 105                 110

Ser Gln Val Val Thr Cys Pro His Lys Lys Ser Thr Ala Ala Val Ile

        115                 120                 125

Leu Thr Pro Thr Glu Asn His Phe Thr Leu Lys Cys Pro Lys Thr Ala

    130                 135                 140

Leu Thr Glu Pro Pro Thr Leu Ala Tyr Ser Pro Asn Arg Gln Ile Cys

145                 150                 155                 160

Pro Ala Gly Thr Thr Ser Ser Cys Thr Ser Lys Ala Val Thr Leu Ser

                165                 170                 175

Ser Leu Ile Pro Glu Ala Glu Asp Ser Trp Trp Thr Gly Asp Ser Ala

            180                 185                 190

Ser Leu Asp Thr Ala Gly Ile Lys Leu Thr Val Pro Ile Glu Lys Phe

        195                 200                 205

Pro Val Thr Thr Gln Thr Phe Val Val Gly Cys Ile Lys Gly Asp Asp

    210                 215                 220

Ala Gln Ser Cys Met Val Thr Glu Thr Val Gln Ala Arg Ala Ser Ser

225                 230                 235                 240

Val Val Asn Asn Val Ala Arg Cys Ser Tyr Gly Ala Asp Ser Thr Leu

                245                 250                 255

Gly Pro Val Lys Val Ser Ala Glu Glu Pro Thr Thr Met Thr Leu Val

            260                 265                 270

Cys Gly Lys Asp Gly Val Lys Val Pro Gln Asp Asn Asn Gln Tyr Cys

        275                 280                 285

Ser Gly Thr Thr Leu Thr Gly Cys Asn Glu Lys Ser Phe Lys Asp Ile

    290                 295                 300

Leu Pro Lys Leu Thr Glu Asn Pro Trp Gln Gly Asn Ala Ser Ser Asp

305                 310                 315                 320

Lys Gly Ala Thr Leu Thr Ile Lys Lys Glu Ala Phe Pro Ala Glu Ser

                325                 330                 335

Lys Ser Val Ile Ile Gly Cys Thr Gly Gly Ser Pro Glu Lys His His

            340                 345                 350

Cys Thr Val Lys Leu Glu Phe Ala Gly Ala Ala Gly Ser Ala Lys Ser

        355                 360                 365

Ala Ala Gly

    370

<210>2

<211>1116

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1116)

<220>

<221>mis-feature

<222>(1)…(3)

<223>扩增GRA6基因片段时增加的起始密码子。

<220>

<221>mis-feature

<222>(4)…(333)

<223>GRA6基因片段基因片段序列。

<220>

<221>mis-feature

<222>(334)…(339)

<223>连接GRA6片段基因和P30基因片段的BamHI酶切位点。

<220>

<221>mis-feature

<222>(340)…(1116)

<223>P30基因片段。

<400>2

ATG GCA GCA GAC AGC GGT GGT GTT AAG CAG ACC CCT TCG GAA ACC GGT TCG AGC GGT GGA   60

Met Ala Ala Asp Ser Gly Gly Val Lys Gln Thr Pro Ser Glu Thr Gly Ser Ser Gly Gly

1               5                   10                  15                  20

CAG CAA GAA GCA GTG GGG ACC ACT GAA GAC TAT GTC AAC TCT TCG GCG ATG GGC GGT GGC  120

Gln Gln Glu Ala Val Gly Thr Thr Glu Asp Tyr Val Asn Ser Ser Ala Met Gly Gly Gly

                25                  30                  35                  40

CAA GGC GAC TCG TTA GCT GAA GAT GAT ACA ACC TCC GAA GCG GCG GAG GGC GAC GTT GAC  180

Gln Gly Asp Ser Leu Ala Glu Asp Asp Thr Thr Ser Glu Ala Ala Glu Gly Asp Val Asp

                45                  50                  55                  60

CCT TTT CCC GTG CTG GCG AAT GAG GGG AAG TCG GAG GCG CGT GGC CCG TCG CTC GAG GAA  240

Pro Phe Pro Val Leu Ala Asn Glu Gly Lys Ser Glu Ala Arg Gly Pro Ser Leu Glu Glu

                65                  70                  75                  80

AGA ATC GAA GAA CAG GGC ACA AGA CGA CGT TAC TCC TCT GTT CAA GAA CCA CAA GCG AAG  300

Arg Ile Glu Glu Gln Gly Thr Arg Arg Arg Tyr Ser Ser Val Gln Glu Pro Gln Ala Lys

                85                  90                  95                  100

GTG CCT AGC AAA CGA ACA CAG AAA CGC CAC AGA GGA TCC CAA GTT GTC ACC TGC CCA CAT  360

Val Pro Cys Lys Arg Thr Gln Lys Arg His Arg Gly Ser Gln Val Val Thr Cys Pro His

                105                 110                 115                 120

AAA AAA TCG ACA GCC GCG GTC ATT CTC ACA CCG ACG GAG AAC CAC TTC ACT CTC AAG TGC  420

Lys Lys Ser Thr Ala Ala Val Ile Leu Thr Pro Thr Glu Asn His Phe Thr Leu Lys Cys

                125                 130                 135                 140

CCT AAA ACA GCG CTC ACA GAG CCT CCC ACT CTT GCG TAC TCA CCC AAC AGG CAA ATC TGC  480

Pro Lys Thr Ala Leu Thr Glu Pro Pro Thr Leu Ala Tyr Ser Pro Asn Arg Gln Ile Cys

                145                 150                 155                 160

CCA GCG GGT ACT ACA AGT AGC TGT ACA TCA AAG GCT GTA ACA TTG AGC TCC TTG ATT CCT  540

Pro Ala Gly Thr Thr Ser Ser Cys Thr Ser Lys Ala Val Thr Leu Ser Ser Leu Ile Pro

                165                 170                 175                 180

GAA GCA GAA GAT AGC TGG TGG ACG GGG GAT TCT GCT AGT CTG GAC ACG GCA GGC ATC AAA  600

Glu Ala Glu Asp Ser Trp Trp Thr Gly Asp Ser Ala Ser Leu Asp Thr Ala Gly Ile Lys

                185                 190                 195                 200

CTC ACA GTT CCA ATC GAG AAG TTC CCC GTG ACA ACG CAG ACG TTT GTG GTC GGT TGC ATC  660

Leu Thr Val Pro Ile Glu Lys Phe Pro Val Thr Thr Gln Thr Phe Val Val Gly Cys Ile

                205                 210                 215                 220

AAG GGA GAC GAC GCA CAG AGC TGT ATG GTC ACG GAG ACA GTA CAA GCC AGA GCC TCA TCG  720

Lys Gly Asp Asp Ala Gln Ser Cys Met Val Thr Glu Thr Val Gln Ala Arg Ala Ser Ser

                225                 230                 235                 240

GTC GTC AAT AAT GTC GCA AGG TGC TCC TAC GGT GCA GAC AGC ACT CTT GGT CCT GTC AAG  780

Val Val Asn Asn Val Ala Arg Cys Ser Tyr Gly Ala Asp Ser Thr Leu Gly Pro Val Lys

                245                 250                 255                 260

GTG TCT GCG GAA GAA CCC ACT ACA ATG ACC CTC GTG TGC GGG AAA GAT GGA GTC AAA GTT  840

Val Ser Ala Glu Glu Pro Thr Thr Met Thr Leu Val Cys Gly Lys Asp Gly Val Lys Val

                265                 270                 275                 280

CCT CAA GAC AAC AAT CAG TAC TGT TCC GGG ACG ACG CTG ACT GGT TGC AAC GAG AAA TCG  900

Pro Gln Asp Asn Asn Gln Tyr Cys Ser Gly Thr Thr Leu Thr Gly Cys Asn Glu Lys Ser

                285                 290                 295                 300

TTC AAA GAT ATT TTG CCA AAA TTA ACT GAG AAC CCG TGG CAG GGT AAC GCT TCG AGT GAT  960

Phe Lys Asp Ile Leu Pro Lys Leu Thr Glu Asn Pro Trp Gln Gly Asn Ala Ser Ser Asp

                305                 310                 315                 320

AAG GGT GCC ACG CTA ACG ATC AAG AAG GAA GCA TTT CCA GCC GAG TCA AAA AGC GTC ATT 1020

Lys Gly Ala Thr Leu Thr Ile Lys Lys Glu Ala Phe Pro Ala Glu Ser Lys Ser Val Ile

                325                 330                 335                 340

ATT GGA TGC ACA GGG GGA TCG CCT GAG AAG CAT CAC TGT ACC GTG AAA CTG GAG TTT GCC 1080

Ile Gly Cys Thr Gly Gly Ser Pro Glu Lys His His Cys Thr Val Lys Leu Glu Phe Ala

                345                 350                 355                 360

GGG GCT GCA GGG TCA GCA AAA TCG GCT GCG GGA TAA 1116

Gly Ala Ala Gly Ser Ala Lys Ser Ala Ala Gly

                365                 370

Claims (4)

1.一种重组弓形虫融合蛋白，即弓形虫GRA6蛋白N端从第43个氨基酸到第152个氨基酸的110个氨基酸和P30蛋白的第56个氨基酸到第313个氨基酸的258个氨基酸串联形成的融合蛋白，GRA6蛋白N端的110个氨基酸在融合蛋白N端，P30蛋白的258个氨基酸在融合蛋白的C端，两者之间由甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)2个氨基酸连接，融合蛋白的N端增加了1个蛋基酸(Met)，全长371个氨基酸，其氨基酸序列为：

Met Ala Ala Asp Ser Gly Gly Val Lys Gln Thr Pro Ser Glu Thr Gly Ser Ser

Gly Gly Gln Gln Glu Ala Val Gly Thr Thr Glu Asp Tyr Val Asn Ser Ser Ala

Met Gly Gly Gly Gln Gly Asp Ser Leu Ala Glu Asp Asp Thr Thr Ser Glu Ala

Ala Glu Gly Asp Val Asp Pro Phe Pro Val Leu Ala Asn Glu Gly Lys Ser Glu

Ala Arg Gly Pro Ser Leu Glu Glu Arg Ile Glu Glu Gln Gly Thr Arg Arg Arg

Tyr Ser Ser Val Gln Glu Pro Gln Ala Lys Val Pro Cys Lys Arg Thr Gln Lys

Arg His Arg Gly Ser Gln Val Val Thr Cys Pro His Lys Lys Ser Thr Ala Ala

Val Ile Leu Thr Pro Thr Glu Asn His Phe Thr Leu Lys Cys Pro Lys Thr Ala

Leu Thr Glu Pro Pro Thr Leu Ala Tyr Ser Pro Asn Arg Gln Ile Cys Pro Ala

Gly Thr Thr Ser Ser Cys Thr Ser Lys Ala Val Thr Leu Ser Ser Leu Ile Pro

Glu Ala Glu Asp Ser Trp Trp Thr Gly Asp Ser Ala Ser Leu Asp Thr Ala Gly

Ile Lys Leu Thr Val Pro Ile Glu Lys Phe Pro Val Thr Thr Gln Thr Phe Val

Val Gly Cys Ile Lys Gly Asp Asp Ala Gln Ser Cys Met Val Thr Glu Thr Val

Gln Ala Arg Ala Ser Ser Val Val Asn Asn Val Ala Arg Cys Ser Tyr Gly Ala

Asp Ser Thr Leu Gly Pro Val Lys Val Ser Ala Glu Glu Pro Thr Thr Met Thr

Leu Val Cys Gly Lys Asp Gly Val Lys Val Pro Gln Asp Asn Asn Gln Tyr Cys

Ser Gly Thr Thr Leu Thr Gly Cys Asn Glu Lys Ser Phe Lys Asp Ile Leu Pro

Lys Leu Thr Glu Asn Pro Trp Gln Gly Asn Ala Ser Ser Asp Lys Gly Ala Thr

Leu Thr Ile Lys Lys Glu Ala Phe Pro Ala Glu Ser Lys Ser Val Ile Ile Gly

Cys Thr Gly Gly Ser Pro Glu Lys His His Cys Thr Val Lys Leu Glu Phe Ala

Gly Ala Ala Gly Ser Ala Lys Ser Ala Ala Gly。

2.权利要求1所述的重组弓形虫融合蛋白的制备方法，该蛋白是利用基因工程技术制备，具体方法如下：

弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白抗原表位的基因克隆：

在弓形虫GRA6蛋白抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物，设计的上游引物为GRA6P1：5’-GCGAGTCA CCATGGCAGCAGACAGCGGTGGTG-3’；下游引物为GRA6P2：5’-CGC GGATCCTCTGTGGCGTTTCTGTGTTCG-3’，在上游引物上增加了Nco I酶切位点，并在5’端增加了8个保护碱基，以利于NcoI酶切割，在下游引物上增加BamHI酶切位点；

在弓形虫P30蛋白抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物，设计的上游引物为P30P3：5’-CTG GGATCCCAAGTTGTCACCTGCCCA-3’；下游引物为P30P4：5’-GTC GAATTCTTATCCCGCAGCCGATTTTGC-3’，在上游引物上增加了BamHI酶切位点，并在5’端增加了3个保护碱基，以利于BamHI酶切割，在下游引物上增加EcoRI酶切位点和终止密码子；

以提纯的弓形虫DNA为模板，用引物GRA6P1和GRA6P2 PCR扩增弓形虫GRA6蛋白抗原表位的基因片段，用引物P30P3和P30P4 PCR扩增弓形虫P30蛋白抗原表位的基因片段，扩增条件均为：94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 60秒，35个循环；最后72℃延伸7分钟，电泳回收、纯化扩增的基因片段，溶于去离子水内，置-20℃冻存备用；

表达弓形虫GRA6和P30融合蛋白重组质粒的构建：

提取质粒pET28a(+)，用Nco I和EcoR I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内，用Nco I和BamH I双酶切弓形虫GRA6基因片段，其5’形成Nco I粘性末端，3’端形成BamH I粘性末端电泳回收后，溶于去离子水内，用EcoR I和BamH I双酶切纯化的P30蛋白基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内；

取等摩尔浓度的上述三种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA连接酶连接，使弓形虫GRA6基因片段与P30蛋白基因片段串联插入到载体pET28a(+)内的Nco I和EcoR I位点之间，两者翻译框架一致，表达一个融合蛋白；重组质粒的筛选与鉴定：

将重组质粒转化大肠杆菌BL21，涂布含60μg/ml卡那霉素LB平板，置37℃过夜，次日随机挑取转化菌落和转化质粒pET28a(+)的对照菌，分别提取质粒，首先用引物GRA6P1和引物P30P4组成引物对，以提取的质粒为模板进行PCR鉴定，含有弓形虫GRA6基因片段与P30蛋白基因片段串联基因的质粒，应扩增出一条1132bp基因片段，提取含弓形虫GRA6蛋白基因片段与P30蛋白基因片段串联基因的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有串联的弓形虫GRA6基因片段与P30蛋白基因片段，序列完全正确：

ATG GCA GCA GAC AGC GGT GGT GTT AAG CAG ACC CCT TCG GAA ACC GGT TCG AGC

GGT GGA CAG CAA GAA GCA GTG GGG ACC ACT GAA GAC TAT GTC AAC TCT TCG GCG

ATG GGC GGT GGC CAA GGC GAC TCG TTA GCT GAA GAT GAT ACA ACC TCC GAA GCG

GCG GAG GGC GAC GTT GAC CCT TTT CCC GTG CTG GCG AAT GAG GGG AAG TCG GAG

GCG CGT GGC CCG TCG CTC GAG GAA AGA ATC GAA GAA CAG GGC ACA AGA CGA CGT

TAC TCC TCT GTT CAA GAA CCA CAA GCG AAG GTG CCT AGC AAA CGA ACA CAG AAA

CGC CAC AGA  GGA TCC CAA GTT GTC ACC TGC CCA CAT AAA AAA TCG ACA GCC GCG

GTC ATT CTC ACA CCG ACG GAG AAC CAC TTC ACT CTC AAG TGC CCT AAA ACA GCG

CTC ACA GAG CCT CCC ACT CTT GCG TAC TCA CCC AAC AGG CAA ATC TGC CCA GCG

GGT ACT ACA AGT AGC TGT ACA TCA AAG GCT GTA ACA TTG AGC TCC TTG ATT CCT

GAA GCA GAA GAT AGC TGG TGG ACG GGG GAT TCT GCT AGT CTG GAC ACG GCA GGC

ATC AAA CTC ACA GTT CCA ATC GAG AAG TTC CCC GTG ACA ACG CAG ACG TTT GTG

GTC GGT TGC ATC AAG GGA GAC GAC GCA CAG AGC TGT ATG GTC ACG GAG ACA GTA

CAA GCC AGA GCC TCA TCG GTC GTC AAT AAT GTC GCA AGG TGC TCC TAC GGT GCA

GAC AGC ACT CTT GGT CCT GTC AAG GTG TCT GCG GAA GAA CCC ACT ACA ATG ACC

CTC GTG TGC GGG AAA GAT GGA GTC AAA GTT CCT CAA GAC AAC AAT CAG TAC TGT

TCC GGG ACG ACG CTG ACT GGT TGC AAC GAG AAA TCG TTC AAA GAT ATT TTG CCA

AAA TTA ACT GAG AAC CCG TGG CAG GGT AAC GCT TCG AGT GAT AAG GGT GCC ACG

CTA ACG ATC AAG AAG GAA GCA TTT CCA GCC GAG TCA AAA AGC GTC ATT ATT GGA

TGC ACA GGG GGA TCG CCT GAG AAG CAT CAC TGT ACC GTG AAA CTG GAG TTT GCC

GGG GCT GCA GGG TCA GCA AAA TCG GCT GCG GGA TAA

构建的重组质粒表达弓形虫GRA6蛋白与P30蛋白的融合蛋白，两者之间由甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)2个氨基酸连接，其中弓形虫GRA6蛋白在融合蛋白的N端，P30蛋白在融合蛋白的C端；

表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定：

将转化子接种至3ml含卡那霉素60μg/ml的LB培养基内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5mmol/L，继续振荡培养诱导6h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，重组子表达相对分子量约为39000的融合蛋白，表达量约为28％，而对照菌BL21无此蛋白带；

表达融合蛋白的纯化：

1)表达融合蛋白工程菌的超声裂解

将诱导表达融合蛋白的工程菌，8000rpm、4℃离心10min收菌，菌体重悬于原培养液1/10体积的裂解液内，裂解液为50mmol/L Tris-HCl pH8.14、10mmol/L EDTA、10mmol/L DTT、5％的甘油，冰浴超声破菌10min，12000rpm、4℃离心20min)，收集沉淀包涵体；

2)包涵体的裂解

包涵体用0.5％SKL溶液悬浮，SKL溶液用50mmol/L Tris-HCl pH8.14、0.5mmol/L EDTA、0.25mmol/L DTT平衡液配制，室温裂解包涵体1h，12000rpm、4℃离心20min，收集上清，装入透析袋内对1000ml平衡液透析，平衡液为50mmol/L Tris-HCl pH8.14、0.5mmol/L EDTA、0.25mmol/L DTT，4℃透析过夜，次日换透析液2次，每次1000ml，8000rpm、4℃离心20min，收集上清上DEAE-Sepharose FF阴离子柱纯化；

3)DEAE-Sepharose FF阴离子柱纯化

将DEAE-Sepharose FF阴离子柱连接至常压层析系统，先用平衡液冲洗平衡，平衡液为50mmol/L Tris-HCl pH8.14、0.5mmol/L EDTA、0.25mmol/L DTT，然后将上步获得的裂解上清直接上样，上样流速为1.5ml/min，收集穿过峰，上样后用平衡液冲洗，然后依次用含50、100、200、300、1000mmol/L NaCl的平衡液洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白，用12％SDS-PAGE检测穿过峰该峰和各洗脱峰蛋白，收集300mmol/L NaCl洗脱峰即为GRA6与P30融合蛋白。

3.权利要求1所述的重组弓形虫融合蛋白，其特征在于利用基因工程技术，用细菌、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞进行重组表达、制备。

4.权利要求1所述的重组弓形虫融合蛋白在制备检测弓形虫抗体或抗原制剂及在制备抗弓形虫单抗和多抗中的应用。

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