CN102492696B

CN102492696B - 一种重组弓形虫蛋白及其应用

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Publication number: CN102492696B
Application number: CN201110415726.8A
Authority: CN
Inventors: 张晓刚; 张秀杰
Original assignee: BEIJING INNOTE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Beijing Innotech Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2011-12-13
Filing date: 2011-12-13
Publication date: 2014-01-29
Anticipated expiration: 2031-12-13
Also published as: CN102492696A

Abstract

本发明提供了一种弓形虫重组蛋白，还提供了该重组蛋白在制备检测试剂盒中的应用。采用本发明提供的弓形虫重组蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了人弓形虫感染临床诊断的需要。

Description

一种重组弓形虫蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程、疫苗研制和诊断试剂等领域，具体地涉及一种重组弓形虫蛋白及其应用。

背景技术

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii Nicolle & Manceaux，1908)是猫科动物的肠道球虫，由法国学者Nicolle及Manceaux在刚地梳趾鼠(Ctenodactylusgondii)单核细胞内发现，虫体呈弓形，命名为刚地弓形虫。该虫呈世界性分布，人和许多动物都能感染，引起人畜共患的弓形虫病，尤其在宿主免疫功能低下时，可造成严重后果，属机会致病原虫(opportunistic protozoan)。

先天性弓形虫病只发生于初孕妇女，经胎盘血流传播。受染胎儿或婴儿多数表现为隐性感染，有的出生后数月甚至数年才出现症状；也可造成孕妇流产、早产、畸胎或死产，尤以早孕期感染，畸胎发生率高。据研究表明，婴儿出生时出现症状或发生畸形者病死率为12％，而存活中80％有精神发育障碍，50％有视力障碍[1]。以脑积水、大脑钙化灶、视网膜脉络膜炎和精神、运动的障碍为先天性弓形虫病典型症侯。

获得性弓形虫病可因虫体侵袭部位和机体反应性而呈现不同的临床表现。多数隐性感染者，当患有恶性肿瘤，施行器官移植，长期接受免疫抑制剂、放射治疗、细胞毒剂等医源性免疫受损情况下或先天性、后天性免疫缺陷者，如艾滋病患者、孕期妇女等都可使隐性感染状态转为急性重症，使原有病症恶化。建立TOX感染的快速、准确检测方法是预防TOX感染的关键所在。

目前弓形虫感染诊断方法主要有免疫学检测、直接镜检、病原体分离和聚合酶链反应(PCR)检测等。免疫学方法由于操作简便快捷适于临床使用。本发明提供了一种用基因工程方法生产的重组抗原，能够避免由于蛋白质抗原纯度低或特异性差造成假阳性而降低检测特异性等问题，为弓形虫感染的检测提供更为特异、准确的原料。

在全球范围内，目前缺乏有效治疗弓形虫感染药物的情况下，通过接种疫苗预防弓形虫感染成为一种重要的医学干预手段。同时，弓形虫疫苗的研制也是进行弓形虫研究的重要领域之一。本发明提供的弓形虫重组蛋白具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，在弓形虫疫苗研制领域具有实际应用价值。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种重组弓形虫蛋白，本发明的另一目的是提供该重组弓形虫蛋白在制备检测试剂盒中的应用。

(二)本发明的技术方案

本发明提供了一种如SEQ ID NO：1所示的编码人弓形虫蛋白的核酸。还提供了由该核酸编码的人弓形虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种包含SEQ ID NO：1所述核酸的表达载体pET-28a-TOX，它是将序列SEQ ID NO：1所述的重组DNA序列插入到质粒pET-28a上得到的重组质粒，其质粒图谱如附图2所示。

将表达载体pET-28a-TOX导入大肠杆菌中，得到表达人弓形虫蛋白的工程菌株。

本发明还提供一种编码人弓形虫蛋白的制备方法，用SEQ ID NO：1的核酸构建表达载体，并在所述载体所适合的原核宿主细胞中表达权利要求1所述核酸编码的人弓形虫蛋白。

本发明还提供SEQ ID NO：1所述重组DNA的人弓形虫感染检测试剂盒，以及SEQ ID NO：1所述的重组DNA在制备人弓形虫感染检测试剂盒中的应用。

本发明利用SEQ ID NO：1所示核苷酸序列通过基因工程方法制备弓形虫蛋白可以通过如下步骤实现：

1)获得具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

2)将该核苷酸序列导入质粒，优选pET-28a质粒；

3)将该质粒导入原核宿主细胞，优选大肠杆菌宿主细胞，更优选BL21(DE3)菌株中；

4)在有利于所述核苷酸序列表达的条件下培养所述宿主细胞；

5)回收、纯化及复性所表达的重组蛋白。

本发明还涉及包含本发明弓形虫蛋白的组合物以及试剂盒。所述的组合物可作为检测弓形虫感染的试剂或作为检测弓形虫感染的试剂盒。

本发明提供的弓形虫蛋白抗原具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，因此，本发明的弓形虫蛋白可用于制备弓形虫疫苗，如亚单位疫苗等，同样，本发明所公开的如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列也可用来制备DNA疫苗。

以下将更具体地描述本发明的内容。

本发明公开了一种如SEQ ID NO：1所示的编码弓形虫蛋白的核苷酸序列，和利用该核苷酸序列制备弓形虫蛋白的方法，和由该方法制备的包含SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的弓形虫蛋白，以及包含该蛋白的组合物和用于检测弓形虫感染的试剂盒。另外，本发明的弓形虫蛋白及本发明的核酸还可用于制备弓形虫疫苗。

SEQ ID NO：1所示核苷酸序列可以通过本领域常规的方法制备，优选根据目的片段的DNA序列，即TOX的P30和P35上目的肽段的cDNA序列和质粒上的酶切位点，设计两对PCR引物(P1，P2)和(P3，P4)。P1和P2用于扩增P30第319位到第906位核苷酸，P3和P4用于扩增P35第508位到第1110位核苷酸；引物P1和P4分别带有NdeI和XhoI的酶切位点，引物P2和P3顺序互补，并共同对应于P30上述片段的3’末端和P35上述片段的5’末端序列。

设计的二对PCR引物如下：

P1：ATCGCATATGGCCAATCAAGTTGTCACCTG

P2：CTCAGTTAATTTTGGCAAAA

P3：GCCAAAATTAACTGAGAACCCGTGGCAGGGTAACGC

P4：ATCGCTCGAGTTACTGCTGATCATCGTATG

本发明对上述核苷酸序列的核酸分子采用适当载体和宿主细胞表达时可以大大提高表达产率。

本发明的一个实施方案涉及应用如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列制备弓形虫蛋白的方法。根据常规方法，可将含编码弓形虫蛋白的如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核酸分子连接到一个表达载体中，然后通过常规方法转化细胞。通常，优选原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本发明的载体构建。例如大肠杆菌等肠科杆菌。

编码本发明蛋白的核酸与pET-28a形成的杂合质粒具有高度的稳定性，有利于本发明的蛋白的表达。

在本发明的一个实施方案中，如图2所示，制备含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核酸分子和pET-28a质粒的表达构建体，并将该构建体转化BL21(DE3)，经IPTG诱导培养后收集菌体。可采用常规的纯化方法纯化所得到的蛋白。

本发明的一个实施方案涉及用上述方法制备、纯化的弓形虫蛋白，该蛋白具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。

本发明的一个实施方案涉及包含本发明弓形虫蛋白的组合物和试剂盒。所述组合物或试剂盒可制备成检测弓形虫感染的试剂或试剂盒形式。

本发明的另一实施方案涉及含本发明的弓形虫蛋白的弓形虫感染检测试剂盒，在临床上用于方便、快速和准确的弓形虫感染。

本文所述“试剂盒”是指利用本发明蛋白完成弓形虫感染检测而组配制成的成套试剂。该试剂盒用于诊断弓形虫感染。本发明试剂盒可包括其它多个容器，其中可分别含有检测所用的标准品，抗体或经过标记的抗体、酶，底物或缓冲液等。在该试剂盒中，还包括标签和包装插页用以提供试剂盒的使用说明。还可包括符合用户需要的其它材料，如微量滴定板等。

在用于弓形虫感染检测的试剂盒中，本发明的弓形虫蛋白也可以是经过标记的。具体可使用酶、金属螯合物等标记。优选的标记性酶例如，辣根过氧化物酶，过氧化物酶，碱性磷酸酶等。优选的金属物质有胶体金等。

与上述标记物结合的方法是已知的。当标记物为酶时，其底物和显色剂可用于测定其活性。当使用过辣根过氧化物酶时，以3′，3′，5′，5′，-四甲基联苯胺作为底物溶液，并使用TMB显色系统。当使用过氧化物酶时，以H₂O₂作为底物溶液，并以邻苯二胺、4-氨基氨替比林等作为显色剂。当使用碱性磷酸酶时，可用邻硝基苯磷酸、对硝基苯磷酸等作为底物。

本发明涉及弓形虫感染检测方法，所述检测通过应用包含本发明弓形虫蛋白的试剂或试剂盒，采用常规的血清学方法来实现，例如，可以使用包含本发明的弓形虫蛋白的试剂或试剂盒检测血清等体液中的抗弓形虫抗体。检测抗弓形虫抗体的方法有间接试验，如将本发明弓形虫蛋白抗原吸附于固相载体(固相可以是本领域技术人员所熟知的常用固相，例如聚苯乙烯、免疫层析用滤纸等)，然后加入待检血清，如有相应抗体存在，则与抗原在载体上形成抗原-抗体复合物，洗涤后加入酶标抗抗体或胶体金标记抗抗体，显色观察结果。所述的间接试验方法例如ELISA法、斑点金标免疫渗滤法等。

任何生物学样品，只要它们含有弓形虫抗体，就可用本发明蛋白，包含该蛋白的组合物或试剂盒来检测。

在上述弓形虫感染检测中所用到的包含本发明弓形虫蛋白的所有试剂或试剂盒都包括在本发明的范围内。

(三)有益效果

采用本发明提供的重组弓形虫蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了弓形虫感染临床诊断的需要。本发明提供的TOX蛋白抗原具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，在TOX疫苗研制领域具有实际应用价值。

附图说明

图1PCR扩增产物的凝胶电泳图；

图2是表达质粒pET-28a-TOX的构建流程图；

图3是诱导后菌体12％SDS-PAGE电泳图，其中M表示Marker，1表示目的蛋白。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1 重组弓形虫蛋白的制备

1.1弓形虫蛋白抗原表位筛选及目的基因克隆

通过计算机分析弓形虫的全部氨基酸序列筛选出弓形虫体内蛋白的优势抗原表位，包括P30从N-末端第104位到302位的199个氨基酸和P35从N-末端第170位到370位的201个氨基酸。所述重组蛋白质的DNA序列如SEQ ID No.1所示。其中，P30目的肽段DNA序列是P30第310位到第906位核苷酸，P35目的肽段DNA序列是P35第508位到第1110位核苷酸。

根据目的片段的DNA序列，即TOX的P30和P35上目的肽段的cDNA序列和质粒上的酶切位点，设计两对PCR引物(P1，P2)和(P3，P4)。P1和P2用于扩增P30第319位到第906位核苷酸，P3和P4用于扩增P35第508位到第1110位核苷酸；引物P1和P4分别带有NdeI和XhoI的酶切位点，引物P2和P3顺序互补，并共同对应于P30上述片段的3’末端和P35上述片段的5’末端序列。

设计的二对PCR引物如下：

P1：ATCGCATATGGCCAATCAAGTTGTCACCTG

P2：CTCAGTTAATTTTGGCAAAA

P3：GCCAAAATTAACTGAGAACCCGTGGCAGGGTAACGC

P4：ATCGCTCGAGTTACTGCTGATCATCGTATG

以上引物由(华美生物技术有限公司)合成。

以弓形虫培养物(国际标准株RH株中国预防医学科学院病毒研究所赠)为模板，以引物P1和P2扩增P30目的DNA片段，以引物P3和P4扩增P35目的DNA片段。以第一轮PCR扩增得到的P30目的DNA片段和P35目的DNA片段为模板，加入引物P1和P4，扩增P30P35目的DNA片段。得到完整的目的DNA重组片段：P30P35。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1所示。切割含目的DNA条带的胶块，用DNA快速纯化试剂盒(购自六合通-北京TAKARA公司，产品名称：TAKARA MiniBEST Plasmidpurification)回收目的DNA，操作按产品说明书进行。

1.2表达载体pET-28a-TOX的构建及鉴定

pET-28a载体(购自华美生物技术有限公司)与PCR扩增产物P30P35目的DNA片段经NdeI和XhoI双酶切，产物纯化(采用TAKARA MiniBESTPlasmid purification试剂盒，购自六合通-北京TAKARA公司)后经T₄DNA连接酶与载体连接，连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态(购自华美生物技术有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37℃倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落，碱裂解法抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳选择可疑重组质粒作为模板进行PCR扩增，对有扩增产物的重组子质粒经内切酶NdeI和EcoRI双酶切、鉴定，其中有2个重组子为阳性重组子。从2个阳性重组子中选一个阳性重组子送赛百胜公司测序鉴定，结果表明该质粒上确实插入了目的基因，且插入方向正确，将此重组质粒命名为表达质粒pET-28a-TOX。

1.3表达重组弓形虫蛋白的工程菌的构建

将表达质粒pET-28a-TOX转入表达菌株BL21(DE3)(购自华美生物技术有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37℃倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落用含卡那霉素的LB培养基培养，用IPTG诱导表达5小时，诱导菌体用12％SDS-PAGE分析((美)J.萨姆布鲁克(JosephSambrook)，(美)D.W.拉塞尔(DavidW.Russell)著，黄培堂等译.分子克隆实验指南.北京：科学出版社，2002)，结果如附图3所示，确定表达弓形虫蛋白的菌株即为所需的工程菌株，用甘油冷冻保存。

1.4重组弓形虫蛋白的制备和纯化

诱导培养已构建的表达弓形虫蛋白的工程菌株，用IPTG诱导表达5小时，离心收集菌体，以1∶10(W/V)加入菌体裂解液(50mm pH8.0 Tris-Cl，50mm NaCl，50％甘油)，加入磁力搅拌转子搅拌30分钟，经超声破菌(冰浴，功率200W，超声3秒，间隔5秒，超声80次)、组氨酸亲和柱(300ml200mm的NiCl₂过柱，流速5ml/min；500ml PBS缓冲液洗注，流速10ml/min；超声离心后的上清液用200ml PBS稀释后上样，流速3ml/min，500ml PBS缓冲液洗注，流速5ml/min；用分别含咪唑20mm、50mm、100mm、200mm各100ml的PBS缓冲液洗脱，紫外检测仪280nm检测吸收值，收集洗脱峰；SDS-PAGE电泳检测纯化组分)得到纯化的重组蛋白。

1.5重组蛋白Western-blot验证

为验证重组TOX蛋白质与抗TOX抗血清反应性及重组目的基因获得表达并具有抗原性，用Western-blot法进行了测试。阳性血清为：10份用TOX培养物免疫兔子收获的兔抗TOX抗体阳性血清和30份人抗TOX抗体阳性血清(经ELISA法检测证实)。阴性血清为：10份对照正常兔血清和30份人抗TOX抗体阴性血清(经ELISA法检测证实)。结果如表1。

表1重组蛋白Western-blot验证结果

结果显示，用TOX培养物免疫兔子所得的10份兔抗TOX抗体阳性血清和30份人抗TOX抗体阳性血清全部与表达抗原产生阳性反应，10份对照正常兔血清和30份人抗TOX抗体阴性血清与表达抗原均产生阴性反应。结果提示重组目的基因获得表达，重组TOX蛋白质与全TOX蛋白质有明显的交叉反应性，并具有很强的特异性，具有实际应用意义。

实施例2弓形虫IgG抗体检测试剂盒的制备和性能检定

2.1弓形虫IgG抗体检测试剂盒的制备

将实施例1制得的重组TOX蛋白用作试剂盒标记抗原，用胶体金法测定TOX IgG抗体。

该试剂盒的研制和使用如下：

(1)试剂盒原理：本品采用免疫间接法原理，用抗人IgG抗体包被硝酸纤维素膜，胶体金标记基因工程重组弓形虫(TOX)抗原为示踪物。使用时加入待检血清，如样品中含有抗TOX特异性IgG抗体，则可与膜表面的抗人IgG抗体结合形成复合物，该复合物与胶体金标记的TOX抗原结合而呈现紫红色条带。

(2)试剂盒性能优化

以阳性和阴性质控品(收集多家医院经临床验证的抗弓形虫IgG抗体阳性、阴性血清，用意大利SORIN公司提供的抗弓形虫IgG抗体酶联试剂盒进行复检筛选，得到的抗弓形虫IgG阳性、阴性血清，建立阳性和阴性质控品)为测试样品，采用方阵滴定确定最佳抗人IgG和TOX抗原胶体金(TOX-Ag.G)结合物的工作浓度，结果如表2，由结果得出，抗人IgG抗体划线包被浓度为2.0mg/ml、TOX-Ag.G复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫。

表2最佳抗人IgG和TOX-Ag.G结合物工作浓度的选择

-：阴性反应；±：可疑阳性，质控线隐约可见；+：阳性反应，出现质控线；

++：较强阳性反应，质控线清晰；+++强阳性反应，质控线清晰粗大。

在已确定抗人IgG抗体划线包被浓度为2.0mg/ml、TOX-Ag.G复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫的基础上，以上述阳性和阴性质控品(来源和标准同上)为测试样品，滴定选择最佳抗人IgG抗体划线量(喷金量为20μl/cm)为1.0μl/cm。结果见表3。

表3最佳抗人IgG抗体划线量的确定

在已确定抗人IgG划线浓度为2.0mg/ml，划线量为1.0μl/cm和弓形虫抗原胶体金复合物喷点浓度为浓缩原液到稀释一倍之间的基础上，以内部质控阳性和阴性质控品(来源和标准同上)为测试样品，采用方阵滴定选择最佳胶体金结合物喷点量为25.0μl/cm。结果见表4。

表4最佳抗原胶体金复合物喷点量的确定

在已确定抗原胶体金复合物包被量的基础上来选择质控线兔抗弓形虫抗体的包被浓度。兔抗弓形虫抗体包被量为1.0μl/cm，包被浓度为5.0mg/ml。结果见表5。

表5质控线兔抗弓形虫抗体包被浓度的选择

抗人IgG划线包被后，分别用下述缓冲系统进行封闭，比较封闭效果，结果表明含PEG₂₀₀₀₀的封闭系统封闭后灵敏度和特异性都有所下降，其他封闭和不封闭的结果没有区别，所以选择不封闭硝酸纤维素膜。结果见表6。

表6不同封闭系统的反应板比较

(3)试剂盒的制备

a.NC膜预切割→粘贴背板→包被鼠抗人IgG(由北京百安天地科技公司购得)和兔抗弓形虫抗体(由北京百安天地科技公司购得)划线包被于NC膜上→干燥。

b.合成胶体金→胶体金溶液检验→抗原标记胶体金→抗原胶体金复合物检验→抗原胶体金复合物的喷点包被→干燥→切割。

c.半成品(母卡)装配→切割成层析条→半成品检验→装配检测卡→密封包装检测卡。

d.组装成品盒→成品检验→保存。

4)试剂盒操作方法：

a.打开检测卡的铝箔袋包装，取出检测卡。

b.将检测卡倾斜成加样孔端低于另一端不少于1.0cm。

c.取100μl待检血清加入到圆形样品孔中，室温(15℃-30℃)放置25分钟。

检验结果判定：

a.25分钟观察并记录结果。

b.阳性：判读窗口出现两条紫红色线条带(C和T位置)；阴性：判读窗口仅出现一条紫红色线条带(C位置)。

c.无效：判读窗口C位置无紫红色线条带。

2.2试剂盒性能检测实验

特异性(准确性)测定：按前述实验确定的胶体金间接测定方法，检测几种其他血清物质，观察反应特异性。结果显示，使用本发明试剂盒检测15份阴性血清(临床已确定)，符合率为100％；检测50份类风湿因子阳性血清标本、50份丙型肝炎阳性血清标本、50份梅毒阳性血清标本等，无一阳性，表明类风湿因子等基本不会造成试剂盒的假阳性，特异性很好。

灵敏度测定：按前述实验确定的胶体金间接测定方法，检测本试剂盒的灵敏性。使用本发明试剂盒检测15份阳性血清(临床已确定)，符合率为100％。

实施例3弓形虫IgG抗体检测试剂盒(酶联免疫法)的性能检定

将实施例1制得的重组TOX蛋白用作试剂盒酶标抗原制备的底物，用ELISA法测定TOX IgG抗体。

3.1该试剂盒原理和组分如下：

(1)试剂盒原理：本品系用抗人IgG包被的微孔板，辣根过氧化物酶(HRP)标记基因工程重组TOX抗原为示踪物，TMB显色系统，应用间接法原理检测人血清或血浆中的抗弓形虫IgG抗体。

(2)试剂盒主要组成成分：

1)预包被板：系用抗人IgG抗体包被的微孔板，1块(9×12孔)；

2)酶结合物：辣根过氧化物酶(HRP)标记本发明的TOX抗原为示踪物。0.2M PB(pH 7.4±0.2)缓冲液100.0ml，NaCl 8.775g，酪蛋白1.0g，20％Tween-20 0.25ml，正常初生牛血清200.0ml，去离子水700.0ml。1瓶，12ml。

3)阴性对照：0.2M PB(pH7.4±0.2)缓冲液100.0ml，蔗糖50.0g，人TOXIgG阴性血清200.0ml，去离子水700.0ml。1瓶，0.4ml。

4)阳性对照：0.2M PB(pH 7.4±0.2)缓冲液100.0ml，蔗糖50.0g，人TOXIgG阳性血清0.5ml，小牛血清200.0ml，去离子水700.0ml。1瓶，0.4ml。

5)浓缩洗液(20×)：十二水磷酸氢二钠58.0g，二水磷酸二氢钠5.93g，氯化钠175.5g，吐温-20 10.0ml，简它素0.035g，去离子水加至1000.0ml。1瓶，50ml。

6)底物液A：三水醋酸钠4.76g，冰醋酸0.9ml，过氧化脲0.5g，去离子水加至1000.0ml。1瓶，6ml。

7)底物液B：一水柠檬酸1.0g，乙二胺四乙酸0.1g，TMB0.32g，DMF2.0ml，浓硫酸0.1ml，甲醇50.0ml，4％PVA 2.0ml，4％硫代硫酸钠0.05ml，去离子水加至950.0ml。1瓶，6ml。

8)终止液：浓硫酸56.25ml，去离子水944.0ml。1瓶，6ml。

3.2试剂盒性能检定

特异性(准确性)测定：按间接ELISA测定方法，检测几种其他血清物质，观察反应特异性。结果显示，使用本发明试剂盒检测15份阴性血清(临床已确定)，符合率为100％，结果见表7；检测50份类风湿因子阳性血清标本、50份丙型肝炎阳性血清标本、50份梅毒阳性血清标本等，无一阳性，表明类风湿因子等基本不会造成试剂盒的假阳性，特异性很好。

表7临床阴性性标本的检测

血清编号：	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											OD值	0.023	0.028	0.103	0.036	0.057	0.073	0.050	0.026	0.081	0.069
血清编号：	11	12	13	14	15
											OD值	0.023	0.024	0.021	0.062	0.028

灵敏度测定：按间接ELISA测定方法，检测本试剂盒的灵敏性。使用本发明试剂盒检测15份阳性血清(临床已确定)，符合率为100％，结果见表8。

表8临床阳性标本的检测

精密性测定：按间接ELISA测定方法，检测本试剂盒的精密性。使用本试剂盒对2份抗TOX强阳性血清、1份阳性血清、1份阴性血清以及试剂盒的阳性对照、阴性对照进行每板双孔，共10板的检测，结果如表9，可见试剂盒的重复性良好，对不同血清检测的CV均低于15％。

表9试剂盒的精密性

可见，采用本发明提供的重组弓形虫蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了弓形虫感染临床诊断的需要。本发明提供的TOX蛋白抗原具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，在TOX疫苗研制领域具有实际应用价值。

一序列表一

<110>北京英诺特生物技术有限公司

<120>一种重组弓形虫蛋白及其应用

<130>GD0701

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1200

<212>DNA

<213>弓形虫(Toxoplasma gondii，简称TOX)

<400>1

gccaatcaag ttgtcacctg cccagataaa aaatcgacag ccgcggtcat tctcacaccg 60

acggagaacc acttcactct caagtgccct aaaacagcgc tcacagagcc tcccactctt 120

gcgtactcac ccaacaggca aatctgccca gcgggtacta caagtagctg tacatcaaag 180

gctgtaacat tgagctcctt gattcctgaa gcagaagata gctggtggac gggggattct 240

gctagtctcg acacggcagg catcaaactc acagttctaa tcgagaagtt ccccgtgaca 300

acgcagacgt ttgtggtcgg ttgcatcaag ggagacgacg cacagagttg tatggtcaca 360

gtgacagtac aagccagagc ctcatcggtc gtcaataatg tcgcaaggtg ctcctacggt 420

gcagacagca ctcttggtcc tgtcaagttg tctgcggaag gacccactac aatgaccctc 480

gtgtgcggga aagatggagt caaagttcct caagacaaca atcagtactg ttccgggacg 540

acgctgactg gttgcaacga gaaatcgttc aaagatattt tgccaaaatt aactgagaac 600

ccgtggcagg gtaacgcttc gagtgataag ggtgccacgc taacgatcaa gaaggaagca 660

tttccagccg agtcaaaaag cgtcattatt ggatgcacag ggggatcgcc tgagaagcat 720

cactgtaccg tggaattcga gctccgtcga caagcttgcc ccaagccaga gaacccggtg 780

cgtccgcctc ctcccggttt ccatccaagc gttattggtg gcgctgcacc gccgcgtgct 840

cctccagtgc caccgcgtat gggcccgagt gatatcagca cgcacgtgcg gggtgcaatc 900

cgtcgtcaac cgggtaccac cgagagtcag cttccgcgtc gcgagccgtt ggagacggag 960

ccagatgaac aagaagaagt tcatttcgct gaagtgaccg acgacaacat ctacgaggag 1020

cacacggatc gcaaggtggt tccgctcaaa tcggagggca agcgcagctt caaagacttg 1080

accgaacagg agctgccgcc atcaaccgaa caggagctgc cgccaccagt gggcgaaggt 1140

caacgtctgc aagtccctgg cgaacatggt ccgcagggtc cgccatacga tgatcagcag 1200

<210>2

<211>400

<212>PRT

<213>人工合成

<223>本发明的弓形虫病毒蛋白的氨基酸序列

<400>2

Ala Asn Gln Val Val Thr Cys Pro Asp Lys Lys Ser Thr Ala Ala

1 5 10 15

Val Ile Leu Thr Pro Thr Glu Asn His Phe Thr Leu Lys Cys Pro

20 25 30

Lys Thr Ala Leu Thr Glu Pro Pro Thr Leu Ala Tyr Ser Pro Asn

35 40 45

Arg Gln Ile Cys Pro Ala Gly Thr Thr Ser Ser Cys Thr Ser Lys

50 55 60

Ala Val Thr Leu Ser Ser Leu Ile Pro Glu Ala Glu Asp Ser Trp

65 70 75

Trp Thr Gly Asp Ser Ala Ser Leu Asp Thr Ala Gly Ile Lys Leu

80 85 90

Thr Val Leu Ile Glu Lys Phe Pro Val Thr Thr Gln Thr Phe Val

95 100 105

Val Gly Cys Ile Lys Gly Asp Asp Ala Gln Ser Cys Met Val Thr

110 115 120

Val Thr Val Gln Ala Arg Ala Ser Ser Val Val Asn Asn Val Ala

125 130 135

Arg Cys Ser Tyr Gly Ala Asp Ser Thr Leu Gly Pro Val Lys Leu

140 145 150

Ser Ala Glu Gly Pro Thr Thr Met Thr Leu Val Cys Gly Lys Asp

155 160 165

Gly Val Lys Val Pro Gln Asp Asn Asn Gln Tyr Cys Ser Gly Thr

170 175 180

Thr Leu Thr Gly Cys Asn Glu Lys Ser Phe Lys Asp Ile Leu Pro

185 190 195

Lys Leu Thr Glu Asn Pro Trp Gln Gly Asn Ala Ser Ser Asp Lys

200 205 210

Gly Ala Thr Leu Thr Ile Lys Lys Glu Ala Phe Pro Ala Glu Ser

215 220 225

Lys Ser Val Ile Ile Gly Cys Thr Gly Gly Ser Pro Glu Lys His

230 235 240

His Cys Thr Val Glu Phe Glu Leu Arg Arg Gln Ala Cys Pro Lys

245 250 255

Pro Glu Asn Pro Val Arg Pro Pro Pro Pro Gly Phe His Pro Ser

260 265 270

Val Ile Gly Gly Ala Ala Pro Pro Arg Ala Pro Pro Val Pro Pro

275 280 285

Arg Met Gly Pro Ser Asp Ile Ser Thr His Val Arg Gly Ala Ile

290 295 300

Arg Arg Gln Pro Gly Thr Thr Glu Ser Gln Leu Pro Arg Arg Glu

305 310 315

Pro Leu Glu Thr Glu Pro Asp Glu Gln Glu Glu Val His Phe Ala

320 325 330

Glu Val Thr Asp Asp Asn Ile Tyr Glu Glu His Thr Asp Arg Lys

335 340 345

Val Val Pro Leu Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ser Phe Lys Asp Leu

350 355 360

Thr Glu Gln Glu Leu Pro Pro Ser Thr Glu Gln Glu Leu Pro Pro

365 370 375

Pro Val Gly Glu Gly Gln Arg Leu Gln Val Pro Gly Glu His Gly

380 385 390

Pro Gln Gly Pro Pro Tyr Asp Asp Gln Gln

395 400 405

Claims

1.一种如SEQ ID NO:1所示的编码人弓形虫蛋白的核酸。

2.由权利要求1所述的核酸编码的人弓形虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.包含权利要求1所述核酸的表达载体，其特征在于所述表达载体为pET-28a-TOX。

4.一株表达人弓形虫蛋白的工程菌株，其特征在于它含有权利要求3所述的表达载体pET-28a-TOX，宿主菌为大肠杆菌。

5.一种编码人弓形虫蛋白的制备方法，其特征在于用权要求1所述的核酸构建表达载体，并在所述载体所适合的原核宿主细胞中表达权利要求1所述核酸编码的人弓形虫蛋白。

6.包含权利要求1所述的编码人弓形虫蛋白的核酸的人弓形虫感染检测试剂盒。

7.权利要求1所述的编码人弓形虫蛋白的核酸在制备人弓形虫感染检测试剂盒中的应用。