CN101402960A - 一种重组风疹病毒e1蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组风疹病毒E1蛋白及其应用。采用的技术方案是：一种重组风疹病毒E1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，采用重组风疹病毒E1蛋白制备的检测风疹病毒IgM抗体感染的试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了风疹病毒感染临床诊断的需要。本发明还提供了该重组风疹病毒E1蛋白在制备单抗、多抗及蛋白芯片中的应用。

Description

一种重组风疹病毒E1蛋白及其应用

技术领域：

本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种重组风疹病毒E1蛋白及其应用。

背景技术：

风疹病毒(rubella virus，RV)RV是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员，人是其唯一的自然宿主。风疹本身并不严重，后天感染主要表现为急性发热、颌下淋巴结肿大等症状。RV最大的威胁是它的致畸性。孕妇感染RV可对胎儿产生先天性伤害，尤其是妊娠前3个月如感染RV，可通过胎盘感染胎儿，导致流产、死胎，或新生儿的一系列器官畸形，即先天性风疹综合征。建立RV感染的快速、准确检测方法是预防RV感染的关键所在。

目前，风疹病毒感染诊断方法主要有病毒分离法、酶联免疫吸附法(ELISA)、IgG抗体亲和试验、放射免疫技术、核酸杂交法、逆转录PCR，荧光定量PCR，这些方法多基于高特异性的抗原建立。

目前常用的抗原是从病毒中提取抗原，全病毒抗原组成的诊断试剂盒：即风疹病毒感染BHK21或非洲绿猴肾上皮细胞，病变大于80％以上时收集培养物，超速离心后分离病毒，经过反复冻融，超声破碎后制得全病毒抗原。这是目前商业化风疹抗体诊断试剂盒的主要应用抗原，但病毒产量低，所得病毒抗原纯度较低，在检测中，与其它病毒易有交叉，特异性差，准确性较低等。

部分纯化的病毒抗原组成的诊断试剂盒：

将全病毒抗原采用一些或一系列生化方法如分级沉淀、离子交换、分子筛等方法，分离出病毒的某些特定成分，用于血清学诊断。但是，风疹病毒的E1/E2/C抗原成分的分离较为困难，特别是主要抗原成分E1的分离纯化更加困难，基本没有用于商业化诊断试剂盒的研究和开发。

发明内容：

本发明的目的是提供一种用基因工程方法生产，与常用的病毒提取抗原组分相比，可为风疹病毒感染IgM抗体的检测提供更为特异、准确的抗原原料，即重组风疹病毒E1蛋白。

本发明的第二目的是提供一种重组风疹病毒E1蛋白在检测风疹病毒IgM抗体感染的试剂盒中应用。

本发明的第三目的是提供该重组风疹病毒E1蛋白在制备单抗、多抗及蛋白芯片中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种编码风疹病毒E1蛋白的重组DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。同时提供了由该重组DNA序列编码的重组风疹病毒E1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一种重组风疹病毒E1蛋白的表达载体，它是将如SEQ ID NO：1所示的重组DNA序列插入到质粒pET-32a上得到的重组质粒pET-32a-E1，其质粒图谱如附图1所示。将表达载体pET-32a-E1导入大肠杆菌中，得到表达重组风疹病毒E1蛋白的工程菌株。

一种检测风疹病毒IgM抗体感染的试剂盒，该试剂盒中含有SEQ ID NO：2所示的重组风疹病毒E1蛋白。

所述的检测风疹病毒IgM抗体感染的试剂盒，该试剂盒组成如下：

1)反应板：用抗人IgM抗体包被液包被空白板，40ng/100μl/孔，4℃静置16～24小时，洗涤扣干后，加入封闭液，200μl/孔，37℃静置2小时，弃液、干燥后封装；

其中，优选，包被抗人IgM抗体的浓度是40ng/孔；

2)酶结合物：将重组风疹病毒E1蛋白与酶标抗原稀释液混合均匀；

其中，优选，重组风疹病毒E1蛋白的浓度为4mg/mL。

3)浓缩洗液：pH7.4，0.2M PBS，2％吐温-20；

4)底物液A：pH4.5，0.1M柠檬酸-醋酸盐缓冲液，0.05％过氧化氢；

5)底物液B：50％甲醇，0.05％3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)；

6)终止液：1M硫酸。

检测风疹病毒IgM抗体感染的试剂盒，其组分中的抗原是所述的重组风疹病毒E1蛋白。用于标记重组风疹病毒E1蛋白的标记物选自酶、荧光物质、胶体金中的一种或多种，标记物的制备采用本领域技术人员所熟知的常规方法。所述试剂盒还包括固定抗体的固相，固相可以是本领域技术人员所熟知的常用固相，例如聚苯乙烯、微量滴定板、免疫层析用滤纸等。

优选地，本发明所述的试剂盒采用酶标抗原，其中，包被抗人IgM抗体的浓度是40ng/孔，包被液由0.05mol/L的碳酸盐缓冲组成，pH＝9.6；封闭液由0.01mol/L PBS、0.2％酪蛋白和0.1％硫柳汞钠组成，pH＝8.0；酶标抗原稀释液由0.01mol/L PBS、0.5％酪蛋白和0.1％硫柳汞钠组成，pH＝7.2。

所述的重组风疹病毒E1蛋白在制备单抗、多抗及蛋白芯片中的应用。

本发明的有益效果是：

采用本发明提供的重组风疹病毒E1蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了风疹病毒感染临床诊断的需要。

附图说明：

图1是表达质粒pET-32a-E1的构建流程图；

图2是表达质粒pET-32a-E1酶切产物电泳图，其中1表示DNA Marker，2、3、4分别表示酶切后的三个阳性菌，5表示酶切前的重组质粒；

图3是15％SDS-PAGE电泳图，其中M表示Marker，其中1表示细胞裂解后的上清，2表示细胞裂解后的沉淀，3表示纯化的E1蛋白；

图4是重组风疹病毒E1蛋白Western Blot鉴定图，其中1表示诱导前菌体总蛋白，2表示诱导后菌体总蛋白。

具体实施方式：

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1重组风疹病毒E1蛋白的制备

重组风疹病毒E1蛋白的氨基酸序列是根据RV包膜糖蛋白E1(glycoprotein E1)的氨基酸序列设计的，该序列为RV包膜糖蛋白E1(glycoprotein E1)的氨基酸序列的203-295位氨基酸。

1.1风疹病毒E1蛋白的重组DNA的合成

通过计算机分析RV包膜糖蛋白E1(glycoprotein E1)的氨基酸序列，并结合已经证实的抗原表位，选取其中抗原性很强部分序列。

RV包膜糖蛋白E1(glycoprotein E1)氨基酸全序列如下：

EEAFTYLCTAPGCATQAPVPVRLAGVRFESKIVDGGCFAPWDLEATGACICEIPTDVSCEGLGAWVPAAPCARIWNGTQRACTFWAVNAYSSGGYAQLASYFNPGGSYYKQYHPTACEVEPAFGHSDAACWGFPTDTVMSVFALASYVQHPHKTVRVKFHTETRTVWQLSVAGVSCNVTTEHPFCNTPHGQLEVQVPPDPGDLVEYIMNYTGNQQSRWGLGSPNCHGPDWASPVCQRHSPDCSRLVGATPERPRLRLVDADDPL LRTAPGPGEVWVTPVIGSQARKCGLHIRAGPYGHATVEMPEWIHAHTTSDPWHPPGPLGLKFKTVRPVALPRTLAPPRNVRVTGCYQCGTPALVEGLAPGGGNCHLTVNGEDLGAVPPGKFVTAALLNTPPP YQVSCGGESDRATARVIDPAAQSFTGVVYGTHTTAVSETRQTWAEWAAAHWWQLTLGAICALPLAG LLACCAKCLYYLRGAIAPR

其中带下划线的序列为表位序列。根据分布情况，选择了含有强表位比较集中的203-295位氨基酸用于合成。选择的表位区的氨基酸序列如下：

LVEYIMNYTGNQQSRWGLGSPNCHGPDWASPVCQRHSPDCSRLVGATPERPRLRLVDADDPL LRTAPGPGEVWVTPVIGSQARKCGLHIRAGP

其中带下划线的序列为抗原表位所在的区域。

根据氨基酸的序列，用大肠杆菌的密码子，翻译成核甘酸序列，在核甘酸序列两侧分别添加BamHI和SalI酶切位点。得到的核甘酸序列如下：

GGATCCCTGGTTGAATACATCATGAACTACACCGGTAACCAGCAGTCTCGTTGGGGTCTGGGTTCTCCGAACTGCCACGGTCCGGACTGGGCTTCTCCGGTTTGCCAGCGTCACTCTCCGGACTGCTCTCGTCTGGTTGGTGCTACCCCGGAACGTCCGCGTCTGCGTCTGGTTGACGCTGACGACCCGCTGCTGCGTACCGCTCCGGGTCCGGGTGAAGTTTGGGTTACCCCGGTTATCGGTTCTCAGGCTCGTAAATGCGGTCTGCACATCCGTGCTGGTCCGGTCGAC

其中下划线序列为酶切位点的序列。

将以上设计的DNA序列送专业的生物工程公司进行基因合成，在本发明中送上海生工生物工程技术有限公司进行基因合成。合成产物克隆到pUC19质粒中，得到pUC19-E1。

1.2表达载体pET-32a-E1的构建及鉴定

表达载体pET-32a质粒(购自华美生物技术有限公司)具有卡拉霉素抗性，并携带BamHI、SalI酶切位点。将pET-32a质粒转化JM109感受态细胞(购自华美生物技术有限公司)，挑单菌落培养，并用碱裂解法抽提质粒(具体操作参见《分子克隆》第三版，科学出版社，2002年8月出版)。

表达质粒构建过程如附图2所示。

将pET-32a质粒和pUC19-E1质粒分别用BamHI和SalI酶进行双酶切，酶切体系为(50μl)：

10×buffer                            5.0μl

酶切底物(pET-32a质粒或克隆的目的基因) 12μl

BamHI          15U

SalI           15U

ddH₂O          补足50μl。

37℃水浴6h后取出，用1％的琼脂糖凝胶电泳分离，分别切胶回收pET-32a线性质粒和大小约为300bp的E1目的基因。切取含目的DNA条带的胶块，用DNA快速纯化试剂盒(购自北京天根公司，胶回收试剂盒，货号为DP209-02)回收目的DNA，操作按产品说明书进行。

然后进行连接反应，连接体系(20μl)为：

ddH₂O                 15.0μl

10×buffer            2.0μl

pET-32a质粒酶切产物   2.0μl

E1酶切产物            1.0μl

T₄DNA连接酶           20U。

按上述比例加样后混匀、离心，14-16℃连接过夜。

从液氮罐中取1管JM109感受态细胞(购自华美生物技术有限公司)融化后置于冰水浴中10min。取10μl上述连接产物加入于100μl大肠杆菌JM109感受态细胞中，混匀，依次进行如下处理：0℃ 30min，42℃ 2min，0℃ 2min。然后加入400μl LB培养基，混匀，在37℃轻摇45min；离心，弃去400μl上清，将沉淀悬浮、混匀，铺LB琼脂平板(含50μg/ml卡那霉素)，将平板上的液体吸干后倒置，于37℃培养过夜。取1μl未酶切的质粒做对照，进行转化。结果连接产物转化感受态细胞后形成83个菌落，从中随机挑选8个菌落培养过夜，碱裂解法抽提质粒。选择可疑重组质粒作为模板进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，对有扩增产物的重组子质粒经BamHI和SalI双酶切鉴定，其中有3个重组质粒的双酶切产物可见一条约300bpDNA条带，则这3个重组子为阳性重组子。从3个阳性重组子中选一个送奥科公司测序，测序结果表明该质粒上确实插入了目的基因，且插入方向正确，将此重组质粒命名为表达质粒pET-32a-E1。

1.3表达重组E1蛋白的工程菌的构建

将表达质粒pET-32a-E1转化大肠杆菌BL21感受态细胞(购自华美生物技术有限公司)，铺LB琼脂平板(含50μg/ml卡拉霉素)，于37℃培养过夜。然后挑单菌落于LB液体培养基(含50μg/ml卡拉霉素)，37℃培养过夜。再按体积比1％的接种量接种于新鲜LB液体培养基(含50μg/ml卡拉霉素)，37℃培养至对数生长期，加0.4mmol/L IPTG诱导4h。诱导菌体用15％SDS-PAGE分析，结果如附图3所示，表达E1蛋白的菌株即为所需的工程菌株，用甘油冷冻保存。

1.4重组风疹病毒E1蛋白的制备和纯化

1.4.1重组风疹病毒E1蛋白的诱导及表达条件优化

取保存的工程菌种，融化，接种环取菌液划线接种LB琼脂平板(含50μg/ml卡那霉素)，37℃培养过夜。挑单菌落于5ml LB培养基(含50μg/ml卡那霉素)，37℃培养过夜，按体积比1％的接种量接种于5ml LB培养基(含50μg/ml卡那霉素)，37℃培养至对数生长期，不同培养试管加不同IPTG浓度诱导，诱导浓度分别是0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L。37℃继续培养3h，离心收集菌体，用15％SDS-PAGE分析菌体蛋白。结果用0.4mmol/L IPTG和1.0mmol/L IPTG诱导表达E1的表达量最大，确定IPTG诱导浓度为0.4mmol/L。

将上述单菌落过夜培养的菌液按体积比1％的接种量接种于20ml LB培养基(含50μg/ml卡那霉素)，37℃培养至对数生长期，加IPTG 0.4mmol/L，37℃培养，分别于0h、1h、2h、3h、4h、5h取1.5ml菌液，离心收集菌体，用15％SDS-PAGE分析菌体蛋白。结果显示诱导4h效果最好。用0.4mmol/L IPTG诱导4h，表达的E1的量占全菌体蛋白的20-25％。

重组风疹病毒E1蛋白表达：按上述方法诱导培养100ml工程菌，诱导条件为上述确定的条件。5000rpm离心5min，每g菌湿重加3ml裂解缓冲液[Tris.Cl(pH8.0)50mmol/L，EDTA 1mmol/L，NaCl 100mmol/L]，加溶菌酶至0.3mg/ml，PMSF至0.1mmol/L，其间搅拌20min；超声波破碎菌体，功率50W，超声1min，间隙1min，共超声10次；4℃12000rpm离心15min，上清为可溶部分，沉淀为包涵体。用2ml包涵体溶解液[8M尿素、50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]溶解包涵体。分别取超声上清和包涵体溶解液上清各0.1ml，加0.1ml 2×SDS加样缓冲液，混匀，沸水浴3min，用15％SDS-PAGE分析。蛋白凝胶电泳显示包涵体和包涵体溶解上清液中有大量E1。

1.4.2重组风疹病毒E1蛋白的纯化

摇床振荡培养2L菌液可获得约13.6g菌体，用于纯化预实验，经过实验确定E1制备工艺为：诱导菌液在5000rpm离心5min，每g菌湿重加3ml裂解缓冲液[Tris.Cl(pH8.0)50mmol/L，EDTA 1mmol/L，NaCl 100mmol/L]，加溶菌酶至0.3mg/ml，PMSF至0.1mmol/L，其间不断搅拌20min；超声波破碎菌体，功率300W，超声20sec，间隙20sec，共超声80次；4℃12 000rpm离心15min，弃上清，沉淀分别用含1％Triton-X100、2％Triton-X100、2％Triton-X100的裂解缓冲液各洗涤包涵体1次。20mmol/LTris.Cl/8M尿素(pH8.0)溶解包涵体，置4℃至大部分包涵体溶解，然后在4℃下12,000rpm离心15min，收集上清。

20mmol/L Tris.Cl/8M尿素(pH8.0)DEAE-52平衡离子交换柱，将包涵体溶解液上清上样于DEAE-52离子交换柱；上样完毕，用20mmol/L Tris.Cl/8M尿素(pH8.0)充分洗去未结合的蛋白，然后用0.1M-0.3M NaCl梯度洗脱，同时收集蛋白。SDS-PAGE电泳检测洗脱峰对应收集管的溶液，含目的蛋白的收集管合并，透析脱盐后，再上PEI离子柱，用0.1M-0.5M NaCl梯度洗脱，15％SDS-PAGE检测洗脱峰，含目的蛋白较多且较纯的收集管合并，透析除盐复性。

1.5重组风疹病毒E1蛋白的性质检定

Lowry法测蛋白浓度：工程菌发酵培养，13L培养液可获得359.97g菌体湿重，经纯化可获得447.5mg纯度在90％以上的重组风疹病毒E1蛋白。

重组风疹病毒E1蛋白纯度：20μl E1纯化产品加等体积2×SDS凝胶加样缓冲液[Tris.Cl(pH6.8)100mM，DTT 200mM，SDS 4％，溴酚蓝0.2％，甘油20％]，沸水浴3min。浓缩胶5％，分离胶12％；恒电流20mA电泳。加样量≥10μg，凝胶经考马斯亮蓝染色和甲醇-冰乙酸脱色呈一条蛋白带；经扫描，不同批纯化E1占总蛋白的比例分别是96.2％、97.14％、95.8％。

高效液相测蛋白纯度：所用仪器-色谱泵：Waters 600Pump；检测器：PDA 966；色谱柱：Protein-pak 300SW；色谱工作站：Millnnium 2010。检测条件-检测波长：280nm；流速：0.5ml/min；上样量：20μl；流动相：0.05M磷酸缓冲液；灵敏度：0.005AUFS。三批纯化E1的其主峰的面积占总面积分别是97.5％、97.3％、97.1％；主峰≥总面积的95％。

ELISA法检测重组风疹病毒E1蛋白特异性：意大利进口试剂盒的风疹感染病人血清IgM抗体检测总敏感性分别为69.0％、75.2％，而本发明得到的重组风疹病毒E1蛋白检测血清特异性分别为97.1％、94.3％。

实施例2检测风疹病毒IgM抗体感染的试剂盒的制备和性能检定

2.1检测风疹病毒IgM抗体感染的试剂盒的制备

将实施例01制得的重组风疹病毒E1蛋白用作试剂盒酶标抗原制备的底物，用ELISA法测定RVIgM抗体。

该试剂盒的研制和使用如下：

1)试剂盒原理：本品系用抗人IgM(μ链)包被的微孔板，辣根过氧化物酶(HRP)标记重组风疹病毒E1为示踪物，TMB显色系统，应用捕获法原理检测人血清或血浆中的抗风疹病毒IgM抗体。

2)试剂盒主要组成成分：

a)预包被板：

b)包被液：0.05mol/l，pH9.6的碳酸盐缓冲系统

c)封闭液：由0.01mol/L PBS、0.2％酪蛋白和0.1％硫柳汞钠组成，pH＝8.0；

d)酶标抗原稀释液：由0.01mol/L PBS、0.5％酪蛋白和0.1％硫柳汞钠组成，pH＝7.2。

e)重组风疹病毒E1

f)浓缩洗液：pH7.4 0.2M PBS，2％吐温-20

g)底物液A：pH4.5 0.1M柠檬酸-醋酸盐缓冲液，0.05％过氧化氢

h)底物液B：50％甲醇，0.05％3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)

i)终止液：1M硫酸

3)试剂盒性能优化：

按照最大结合，运用ELISA方法，确定试剂盒中的包被抗人IgM抗体和重组风疹病毒E1的最佳浓度，结果如表1、2。

表1最佳抗人IgM抗体包被浓度的选择

表2重组风疹病毒E1浓度的选择

由上述结果可看出，包被抗人IgM(μ链)抗体的最佳浓度为40ng/孔，重组风疹病毒E1最佳工作浓度4mg/ml。

根据三种不同包被系统灵敏度、特异性及均一性比较的结果，选择抗体包被缓冲系统，结果见表3。

表3不同包被系统各项性能指标比较

由表3结果可见，pH值9.6，0.05mol/l碳酸盐缓冲液包被系统综合指标较其它两种包被系统更好一些，因此本发明确定包被系统是：0.05mol/l，pH9.6的碳酸盐缓冲系统。

根据三种不同封闭系统灵敏度、特异性及均一性比较的结果，选择抗体封闭缓冲系统，结果见表4。

表4不同封闭系统各项性能指标比较

由表4结果可见，含酪蛋白的缓冲液封闭系统综合指标较其它两种包被系统更好一些，因此本发明确定封闭系统是：由0.01mol/L PBS、0.2％酪蛋白和0.1％硫柳汞钠组成，pH＝8.0的封闭液。

根据三种不同酶标抗原稀释液灵敏度、特异性、变异性及对酶标抗原热稳定性比较结果，选择抗体封闭缓冲系统，结果见表5。

表5不同酶标抗原稀释系统各项性能指标比较

由表5结果可见，含0.5％酪蛋白的酶标缓冲液系统对酶标抗原的热稳定性保护作用较好，综合指标较其它两种包被系统更好一些，因此本发明确定酶标抗原稀释液是：由0.01mol/L PBS、0.5％酪蛋白和0.1％硫柳汞钠组成，pH＝7.2的酶标抗原稀释液。

4)试剂盒的制备

反应板的制备：用抗人IgM(μ链)抗体包被液(包被液浓度40ng/孔，0.05mol/l，pH9.6碳酸盐缓冲系统)包被空白板，100μl/孔，4℃静置16～24小时。洗涤扣干后，加入封闭液(0.01mol/l PBS，0.2％酪蛋白，0.1％硫柳汞钠)200μl/孔，37℃静置2小时。弃液、干燥后封装。

酶结合物的制备：将重组风疹病毒E1蛋白与酶标抗原稀释液(由0.01mol/LPBS、0.5％酪蛋白和0.1％硫柳汞钠组成，pH＝7.2)混合均匀；重组风疹病毒E1蛋白的浓度为4mg/mL。

5)试剂盒操作方法：

平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30分钟后使用。

配液：将浓缩洗液用蒸馏水或去离子水20倍稀释备用。

设定：每次试验应预设空白对照1孔(暂不加任何液体)，阴性对照3孔，阳性对照2孔。

加样：按顺序在各反应孔中分别加入20μl待检标本和阴、阳性对照。

加酶：依次向每孔加入100μl酶结合物(空白对照孔不加)，振荡混匀。

温育：在反应板上加盖封板膜，置37℃温箱或水浴锅中，反应60分钟。

洗板：将孔内液体甩干，在各反应孔加入稀释后的洗涤液300μl，静置15秒钟，甩弃洗涤液；如此洗涤5遍，最后一次扣干反应板。

显色：每孔依次加入底物A、B液各50μl(包括空白对照孔)，加盖封板膜，振荡混匀，37℃避光显色15分钟。

终止：每孔加入终止液各50μl(包括空白对照孔)，振荡混匀终止反应。

测定：用空白对照孔调零，并尽快用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值。也可用双波长450nm/630-690nm测定各孔OD值。

试验结果判定：

临界值(cut-off值)计算：

临界值＝0.10+阴性对照OD平均值(阴性对照OD平均值≤0.05按0.05计算)。

结果判定：测定标本OD值≥临界值时为抗RV抗体阳性。

测定标本OD值＜临界值时为抗RV抗体阴性。

2.2试剂盒性能检测实验

特异性(准确性)测定：按前述实验确定的捕获ELISA测定方法，检测几种其他血清物质，观察反应特异性。结果显示，使用本发明试剂盒检测10份阴性血清(临床已确定)，符合率为100％；检测类风湿因子阳性血清标本、丙型肝炎阳性血清标本、梅毒阳性血清标本和其他病原感染标本，以及内源性干扰物标本，合计800份，无一阳性，表明类风湿因子等基本不会造成试剂盒的假阳性，特异性很好。

灵敏度(特异性)测定：按前述实验确定的捕获ELISA测定方法，检测本试剂盒的灵敏性。使用本发明试剂盒检测10份阳性血清(临床已确定)，符合率为100％。

精密性测定：用1份抗RV-IgM中阳性血清进行CV检测，方法如下：在40块板中，每10块中随机抽取一块，每块取24孔。合并一块，进行实验。结果：平均值X＝0.799，标准差S＝0.042，精密性CV＝5.2％，可见试剂盒的重复性良好。

与国内外同类产品的比较试验：本发明试剂盒与意大利SORIN试剂盒检测9810份血清样本的比较实验结果如表6。

表6与意大利SORIN抗体检测试剂盒的比较检测结果

真实性和预示值计算分析：灵敏度92.8％，特异性99.9％，假阳性率0.5％，假阴性率0.6％，粗一致性99.8％。表明本试剂盒的灵敏度及特异性均达到甚至优于进口试剂盒的标准。

序列表

<110>吴丽霞、赵玉红、于庭

<120>一种重组风疹病毒E1蛋白及其应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>279

<212>DNA

<213>风疹病毒(rubella virus)

<400>1

ctggttgaat acatcatgaa ctacaccggt aaccagcagt ctcgttgggg tctgggttct 60

ccgaactgcc acggtccgga ctgggcttct ccggtttgcc agcgtcactc tccggactgc 120

tctcgtctgg ttggtgctac cccggaacgt ccgcgtctgc gtctggttga cgctgacgac 180

ccgctgctgc gtaccgctcc gggtccgggt gaagtttggg ttaccccggt tatcggttct 240

caggctcgta aatgcggtct gcacatccgt gctggtccg                        279

<210>2

<211>93

<212>PRT

<213>风疹病毒(rubella virus)

<400>2

Leu Val Glu Tyr Ile Met Asn Tyr Thr Gly Asn Gln Gln Ser Arg

1               5                   10                  15

Trp Gly Leu Gly Ser Pro Asn Cys His Gly Pro Asp Trp Ala Ser

                20                  25                  30

Pro Val Cys Gln Arg His Ser Pro Asp Cys Ser Arg Leu Val Gly

                35                  40                  45

Ala Thr Pro Glu Arg Pro Arg Leu Arg Leu Val Asp Ala Asp Asp

                50                  55                  60

Pro Leu Leu Arg Thr Ala Pro Gly Pro Gly Glu Val Trp Val Thr

                65                  70                  75

Pro Val Iie Gly Ser Gln Ala Arg Lys Cys Gly Leu His Ile Arg

                80                  85                  90

Ala Gly Pro

Claims (9)

1、一种编码风疹病毒E1蛋白的重组DNA，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2、一种重组风疹病毒E1蛋白，其特征在于：它由权利要求1所述的重组DNA序列编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3、一种重组风疹病毒E1蛋白的表达载体，其特征在于：它是将如SEQ IDNO：1所示的重组DNA序列插入到质粒pET-32a上得到的重组质粒pET-32a-E1。

4、一种表达重组风疹病毒E1蛋白的工程菌株，其特征在于：它含有权利要求3所述的表达载体pET-32a-E1，宿主菌为大肠杆菌。

5、一种检测风疹病毒IgM抗体感染的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中含有SEQ ID NO：2所示的重组风疹病毒E1蛋白。

6、按照权利要求5所述的检测风疹病毒IgM抗体感染的试剂盒，其特征在于：该试剂盒组成如下：

1)反应板：用抗人IgM抗体包被液包被空白板，40ng/100μl/孔，4℃静置16～24小时，洗涤扣干后，加入封闭液，200μl/孔，37℃静置2小时，弃液、干燥后封装；

2)酶结合物：将重组风疹病毒E1蛋白与酶标抗原稀释液混合均匀；

3)浓缩洗液：pH7.4，0.2M PBS，2％吐温-20；

4)底物液A：pH4.5，0.1M柠檬酸-醋酸盐缓冲液，0.05％过氧化氢；

5)底物液B：50％甲醇，0.05％3，3，5，5-四甲基联苯胺；

6)终止液：1M硫酸。

7、根据权利要求6所述的检测风疹病毒IgM抗体感染的试剂盒，其特征在于：包被抗人IgM抗体的浓度是40ng/孔；酶结合物中，重组风疹病毒E1蛋白的浓度为4mg/mL。

8、按照权利要求6或7所述的检测风疹病毒IgM抗体感染的试剂盒，其特征在于：所述的包被液是0.05mol/l、pH9.6的碳酸盐缓冲系统；所述的封闭液由0.01mol/L PBS、0.2％酪蛋白和0.1％硫柳汞钠组成，pH＝8.0；所述的酶标抗原稀释液由0.01mol/L PBS、0.5％酪蛋白和0.1％硫柳汞钠组成，pH＝7.2。

9、权利要求2所述的重组风疹病毒E1蛋白在制备单抗、多抗及蛋白芯片中的应用。

Images