CN102435733A - 一种AFP-IgM检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
一种AFP-IgM检测试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102435733A CN102435733A CN2011102310530A CN201110231053A CN102435733A CN 102435733 A CN102435733 A CN 102435733A CN 2011102310530 A CN2011102310530 A CN 2011102310530A CN 201110231053 A CN201110231053 A CN 201110231053A CN 102435733 A CN102435733 A CN 102435733A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- igm
- afp
- standard items
- antibody
- kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 title abstract 2
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 title abstract 2
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 25
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 23
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 21
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 19
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 14
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 14
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 claims description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 12
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 11
- WBODDOZXDKQEFS-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetramethyl-5-phenylbenzene Chemical group CC1=C(C)C(C)=CC(C=2C=CC=CC=2)=C1C WBODDOZXDKQEFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 10
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 10
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- LXHQGXIAGLQVCC-UHFFFAOYSA-N C(C)O.CN(C1=CC=C(C2=CC=C(N(C)C)C=C2)C=C1)C Chemical compound C(C)O.CN(C1=CC=C(C2=CC=C(N(C)C)C=C2)C=C1)C LXHQGXIAGLQVCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 3
- 230000002277 temperature effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 abstract description 25
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 abstract description 25
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 abstract 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 abstract 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 abstract 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 30
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 3
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 3
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 2
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003726 plant lectin Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及一种检测患者体内AFP-IgM含量的试剂盒，包括下列试剂：作为标准品的人免疫球蛋白IgM、作为标准品包被抗体的抗IgM抗体、作为检测样品包被抗体的抗AFP抗体、作为酶标记检测抗体的抗IgM辣根过氧化物酶标记物、作为显色剂的四甲基联苯胺溶液、作为终止液的2M H2SO4溶液、包被缓冲液、洗涤缓冲液、稀释缓冲液。本发明还涉及使用该试剂盒检测人体内AFP-IgM含量的方法。本发明的AFP-IgM试剂盒对肝癌的诊断较AFP试剂盒具有更高的敏感度，更适合人群中肝癌的筛检实验，同时联合AFP-IgM试剂盒、AFP试剂盒对肝癌进行诊断将会提高对肝癌诊断准确度，两者具有很好的互补性。
Description
技术领域
本发明涉及一种AFP-IgM检测试剂盒及检测方法。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是常见的恶性肿瘤之一，每年在世界范围内约有100万新发的病例。其主要诱因为乙型(中国与东南亚地区)和丙型(欧洲)肝炎病毒，早期缺乏典型的临床表现、恶性程度高，难以早期诊断，且预后较差。
甲胎蛋白(AFP)在肝癌病人体内以两种形式存在：即游离AFP(fAFP)和循环IgM复合型AFP(AFP-IgM IC)。游离AFP又根据对植物凝集素(lectin)亲和力的不同分为：AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3三个亚型，其中AFP-L3可作为衡量肝癌细胞恶性程度的一个标志物。AFP作为诊断HCC的首选肿瘤标志物，在肝癌的诊断方面占据着主要的地位，自应用于临床以来使HCC诊断的准确性得到较大的提高，文献报道其敏感性为41％～65％，但也易受如慢性肝炎、肝硬化与妊娠等其他因素影响。对于早期HCC的诊断，AFP假阴性率可达40％以上，进展期AFP的假阴性率为15％～20％，如何提高肝癌临床检出率是提高其生存率的关键因素。
AFP-IgM复合物是近年发现的新型肝癌标志物，AFP-IgM与AFP之间存在很好的互补性。游离AFP和循环IgM复合型AFP不会发生交迭，AFP-IgM是一种补充血清标志物，两类标志物的联合检测有助于肝癌的诊断。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提高肝癌检出率。为此本发明提供了一种AFP-IgM检测试剂盒及检测方法，使用该试剂盒同时联合现有AFP检测技术能提高肝癌诊断准确度。
本发明提供了一种检测患者体内AFP-IgM含量的试剂盒，包括下列试剂：作为标准品的人免疫球蛋白IgM、作为标准品包被抗体的抗IgM抗体、作为检测样品包被抗体的抗AFP抗体、作为酶标记检测抗体的抗IgM辣根过氧化物酶标记物(IgM-HRP)、作为显色剂的四甲基联苯胺溶液(TMB)、作为终止液的2M H2SO4溶液、包被缓冲液、洗涤缓冲液、稀释缓冲液。
作为优选，标准品包被抗体IgM抗体为羊抗人IgM多克隆抗体，0.2μg/ml，0.3ml。
作为优选，检测样品包被抗体抗AFP抗体为鼠抗人AFP单克隆抗体，0.2μg/ml，0.3ml。
作为优选，抗IgM辣根过氧化物酶标记物为兔抗人辣根过氧化物酶标记物，0.5mg/L，0.1ml。
作为优选，包被缓冲液为PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液。该缓冲液可由Na2CO3 1.59克NaHCO32.93克，加蒸馏水至1000ml，调PH至9.6制得。
作为优选，洗涤缓冲液为PH7.40.15M磷酸盐缓冲溶液。该溶液可由KH2PO4 0.2克、Na2HPO4·12H2O 2.9克、NaCl 8.0克、KCl 0.2克、0.05％Tween-20 0.5ml、加蒸馏水至1000ml，调PH至7.4制得。
作为优选，稀释缓冲液为牛血清白蛋白(BSA)与洗涤缓冲溶液配成质量分数0.1％(g/ml)使用或以羊血清、兔血清血清与洗涤缓冲溶液配成质量分数5～10％(g/ml)使用。
作为优选，四甲基联苯胺溶液可由2mg/ml四甲基联苯胺无水乙醇溶液0.5ml、PH5.0底物缓冲液10ml、0.75％H2O2 32μl制得，其中PH5.0底物缓冲液可由0.2M Na2HPO425.7ml、0.1M柠檬酸24.3ml，加蒸馏水50ml制得。
本发明提供了一种使用上述试剂盒检测患者体内体内AFP-IgM含量的方法，具体方法是：
第一步：包被
(2)标准品孔用IgM抗体包被于酶标板孔内；
(2)检测孔用AFP抗体包被于酶标板孔内；
第二步：洗涤酶标板孔，移去包被液；
第三步：通过倍比稀释建立标准品浓度梯度，标准品孔分别加入各个浓度的人免疫球蛋白IgM标准品；样品孔加入稀释的血清或血浆被检标本；并建立阴性、阳性对照，阴性对照为稀释缓冲液，阳性对照为阳性血清；37℃作用2小时，IgM标准品与包被的IgM抗体结合，被检标本中AFP及AFP-IgM与包被的AFP抗体结合；
第四步：洗涤酶标板孔，将未结合的多余样品去除；
第五步：每个凹孔加入兔抗人IgM辣根过氧化物酶标记物溶液，与复合物的IgM端结合；
第六步：洗涤酶标板孔，去除多余的抗IgM-HRP；
第七步：加入底物四甲基联苯胺溶液于每个凹孔，显色；
第八步：每个凹孔加终止剂H2SO4；
第九步：观察记录结果，在450nm波长下用酶标仪测定OD值；
第十步：计算检测样品中AFP-IgM浓度，通过倍比稀释建立标准品浓度拟合曲线：y＝ax+b，x为标准品OD值，y为标准品浓度，获得a、b值；测得待测样品OD值为x1，则可计算待测样品浓度y1＝ax1+b。
作为优选，AFP-IgM含量的检测方法是：
第一步：包被
(1)标准品孔包被：用包被缓冲液稀释羊抗人IgM多克隆抗体至0.2μg/ml，96孔酶标板的凹孔加0.3ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱；
(2)检测孔包被：用包被缓冲液稀释鼠抗人AFP单克隆抗体至0.2μg/ml，96孔酶标板的凹孔加0.3ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱；
第二步：每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，移去包被液；
第三步：通过倍比稀释建立标准品浓度梯度，为0μg/L、2μg/L、4μg/L、8μg/L、16μg/L、32μg/L，标准品孔包括6孔，分别加入0.1ml各浓度的人免疫球蛋白IgM标准品，于第五、第六孔各加浓度为32μg/L的标准品0.1ml；样品孔加入0.1ml 5倍稀释血清或血浆被检标本；并建立阴性、阳性对照，阴性对照为稀释缓冲液，阳性对照为阳性血清；37℃作用2小时；
血清或血浆被检标本5倍稀释一方面，降低了标本中其它因子的浓度，避免其对实验的干扰，增加试剂的特异性；另一方面，可使试剂与标本中的抗体/抗原达到最佳反应浓度，提高试剂的灵敏度，根据AFP-IgM在血清中的含量确定大概的稀释度。
第四步：每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，将未结合的多余样品去除；
第五步：加入酶标抗体，每凹孔加入0.1ml用稀释缓冲液稀释的兔抗人IgM辣根过氧化物酶标记物溶液，浓度为0.5mg/L，37℃作用1小时；
第六步：每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，去除多余的抗IgM-HRP；
第七步：加入0.1ml底物四甲基联苯胺溶液于每个凹孔，室温作用30分钟；
第八步：加终止剂，每凹孔加2M H2SO40.05ml；
第九步：观察记录结果，在450nm波长下用酶标仪测定OD值；
第十步：计算检测样品中AFP-IgM浓度，通过倍比稀释建立标准品浓度拟合曲线：y＝ax+b，x为标准品OD值，y为标准品浓度，获得a、b值；测得待测样品OD值为x1，则可计算待测样品浓度y1＝ax1+b。
当血清中AFP-IgM含量大于等于25ug/L，可诊断为肝癌。通过ROC曲线对AFP-IgM诊断肝癌的敏感度、特异度及准确度进行分析；不同参考值对应不同的敏感度、特异度以及准确度；根据不同的诊断目的并结合诊断效率确定参考值；确定25ug/L作为参考值是考虑了用该参考值诊断效率接近最高，并且敏感度较高，能与AFP形成互补。
本发明的技术效果为，本发明的AFP-IgM试剂盒对肝癌的诊断较AFP试剂盒具有更高的敏感度，AFP-IgM更适合人群中肝癌的筛检实验，同时联合AFP-IgM试剂盒、AFP试剂盒对肝癌进行诊断将会提高对肝癌诊断准确度，两者具有很好的互补性。
附图说明
图1：酶标抗体浓度曲线
图2：AFP-IgM诊断肝癌ROC曲线
具体实施方式
实施例1试剂盒的使用方法
第一步：包被
(1)标准品孔包被：用包被缓冲液稀释羊抗人IgM多克隆抗体至0.2μg/ml，96孔酶标板的凹孔加0.3ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱；
(2)检测孔包被：用包被缓冲液稀释鼠抗人AFP单克隆抗体至0.2μg/ml，96孔酶标板的凹孔加0.3ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱；
第二步：每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，移去包被液；
第三步：通过倍比稀释建立标准品浓度梯度，为0μg/L、2μg/L、4μg/L、8μg/L、16μg/L、32μg/L，标准品孔包括6孔，分别加入0.1ml各浓度的人免疫球蛋白IgM标准品，于第五、第六孔各加浓度为32μg/L的标准品0.1ml；样品孔加入0.1ml 5倍稀释血清或血浆被检标本；并建立阴性、阳性对照，阴性对照为稀释缓冲液，阳性对照为阳性血清；37℃作用2小时；
第四步：每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，将未结合的多余样品去除；
第五步：加入酶标抗体，每凹孔加入0.1ml用稀释缓冲液稀释的兔抗人IgM辣根过氧化物酶标记物溶液，浓度为0.5mg/L，37℃作用1小时；
第六步：每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，去除多余的抗IgM-HRP；
第七步：加入0.1ml底物四甲基联苯胺溶液于每个凹孔，室温作用30分钟；
第八步：加终止剂，每凹孔加2M H2SO4 0.05ml；
第九步：观察记录结果，在450nm波长下用酶标仪测定OD值；
第十步：计算检测样品中AFP-IgM浓度，通过倍比稀释建立标准品浓度拟合曲线：y＝ax+b，x为标准品OD值，y为标准品浓度，获得a、b值；测得待测样品OD值为x1，则可计算待测样品浓度y1＝ax1+b。
包被缓冲液为PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液。该缓冲液可由Na2CO3 1.59克NaHCO3 2.93克，加蒸馏水至1000ml，调PH至9.6制得。
洗涤缓冲液为PH7.40.15M PBS溶液。该溶液可由KH2PO40.2克、Na2HPO4·12H2O 2.9克、NaCl 8.0克、KCl 0.2克、0.05％Tween-200.5ml、加蒸馏水至1000ml，调PH至7.4制得。
稀释缓冲液为牛血清白蛋白(BSA)与洗涤缓冲溶液配成质量分数0.1％(g/ml)使用或以羊血清、兔血清等血清与洗涤缓冲溶液配成质量分数5～10％(g/ml)使用。
四甲基联苯胺溶液可由2mg/ml四甲基联苯胺无水乙醇溶液0.5ml、PH5.0底物缓冲液10ml、0.75％H2O2 32μl制得，其中PH5.0底物缓冲液可由0.2M Na2HPO425.7ml、0.1M柠檬酸24.3ml，加蒸馏水50ml制得。
使用的人免疫球蛋白IgM购自北京赛驰生物科技有限公司，产品编号009016，羊抗人IgM多克隆抗体购自北京赛驰生物科技有限公司，产品编号020003，鼠抗人AFP单克隆抗体购自上海博耀生物科技有限公司，兔抗人IgM辣根过氧化物酶标记物购自北京赛驰生物科技有限公司，产品编号030018。
实施例2包被抗体浓度的确定
用不同的抗体浓度0.01、0.1、1.0、10μg/ml等进行包被后，分别按照实施例第1-9步操作，记录阳性标本的OD值，见表1、表2。
表1不同浓度标准品孔包被抗体对应的OD值
表2不同浓度样品孔包被抗体对应的OD值
选择OD值较大而抗体用量较少的浓度作为包被抗体浓度，表1、表2结果表明标准品孔和样品孔合适的包被抗体浓度均为0.1μg/ml，为保证抗体的足量，取0.2μg/ml为包被抗体浓度。
实施例3酶标抗体浓度的确定
将IgM标准品用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg/ml，于聚苯乙烯96孔板内加0.1ml，4℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。原始酶标抗体浓度为0.1mg/ml，用1％BSA-PBS液依次稀释成1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液TMB，每孔0.1ml，37℃10～30分钟。以2MH2SO40.05ml终止反应。读取各孔OD值(表3)，并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线(见图1)。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度，本实验结果酶标抗体浓度取0.5μg/ml。
表3
实施例4参考值的确定
通过ROC曲线(图2)对AFP-IgM诊断肝癌的敏感度、特异度及准确度进行分析；不同cutoff值对应不同的敏感度、特异度(表4)；根据不同的诊断目的并结合诊断效率确定参考值；确定25ug/L作为参考值是考虑了用该参考值诊断效率接近最高，并且敏感度较高，能与AFP形成互补。表4中约登指数＝敏感度+特异度-1，25ug/L对应的cutoff值约登指数最大。
表4
实施例5 AFP-IgM、AFP试剂盒检测试验
AFP-IgM、AFP分别检测肝癌，AFP-IgM按照实施例1的方法，AFP采用化学发光法进行检测(北京源德生物医学工程有限公司是AFP单克隆抗体的提供厂家)，仪器为
Ianalyzer(Beckman Coulter，CA，USA)。两种试剂盒对肝细胞癌的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、诊断效率结果见表5.
表5
试验结果表明本发明的AFP-IgM试剂盒对肝癌的诊断较AFP试剂盒具有更高的敏感度，对于早期肝癌及小肝癌(直径＜3cm)诊断效率更高；而AFP对肝炎、肝硬化具有更高的特异度，对一些假阳性的标本具有更好的鉴别力；因此AFP-IgM更适合人群中肝癌的筛检实验，同时联合AFP-IgM试剂盒、AFP试剂盒对肝癌进行诊断将会提高对肝癌诊断准确度，两者具有很好的互补性。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (10)
1.一种检测患者体内AFP-IgM含量的试剂盒，包括下列试剂：作为标准品的人免疫球蛋白IgM、作为标准品包被抗体的抗IgM抗体、作为检测样品包被抗体的抗AFP抗体、作为酶标记检测抗体的抗IgM辣根过氧化物酶标记物、作为显色剂的四甲基联苯胺溶液、作为终止液的2M H2SO4溶液、包被缓冲液、洗涤缓冲液、稀释缓冲液。
2.权利要求1所述的试剂盒，特征在于标准品包被抗体IgM抗体为羊抗人IgM多克隆抗体，0.2μg/ml，0.3ml。
3.权利要求1所述的试剂盒，特征在于检测样品包被抗体抗AFP抗体为鼠抗人AFP单克隆抗体，0.2μg/ml，0.3ml。
4.权利要求1所述的试剂盒，特征在于抗IgM辣根过氧化物酶标记物为兔抗人辣根过氧化物酶标记物，0.5mg/L，0.1ml。
5.权利要求1所述的试剂盒，特征在于包被缓冲液为PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液。
6.权利要求1所述的试剂盒，特征在于洗涤缓冲液为PH7.4 0.15M磷酸盐缓冲溶液。
7.权利要求1所述的试剂盒，特征在于稀释缓冲液为牛血清白蛋白与洗涤缓冲液配成质量分数0.1％使用或以羊血清、兔血清与洗涤缓冲溶液配成质量分数5～10％使用。
8.权利要求1所述的试剂盒，特征在于四甲基联苯胺溶液由2mg/ml四甲基联苯胺无水乙醇溶液0.5ml、PH5.0底物缓冲液10ml、0.75％H2O2 32μl制得，其中PH5.0底物缓冲液由0.2M Na2HPO4 25.7ml、0.1M柠檬酸24.3ml，加蒸馏水50ml制得。
9.权利要求1-8任一项试剂盒检测患者体内体内AFP-IgM含量的方法，包括下列步骤：
第一步：包被
(1)标准品孔用IgM抗体包被于酶标板孔内；
(2)检测孔用AFP抗体包被于酶标板孔内；
第二步：洗涤酶标板孔，移去包被液；
第三步：通过倍比稀释建立标准品浓度梯度，标准品孔分别加入各个浓度的人免疫球蛋白IgM标准品；样品孔加入稀释的血清或血浆被检标本；并建立阴性、阳性对照，阴性对照为稀释缓冲液，阳性对照为阳性血清；37℃作用2小时，IgM标准品与包被的IgM抗体结合，被检标本中AFP及AFP-IgM与包被的AFP抗体结合；
第四步：洗涤酶标板孔，将未结合的多余样品去除；
第五步：每个凹孔加入兔抗人IgM辣根过氧化物酶标记物溶液，与复合物的IgM端结合；
第六步：洗涤酶标板孔，去除多余的抗IgM-HRP；
第七步：加入底物四甲基联苯胺溶液于每个凹孔，显色。
第八步：每个凹孔加终止剂H2SO4；
第九步：观察记录结果，在450nm波长下用酶标仪测定OD值。
第十步：计算检测样品中AFP-IgM浓度，通过倍比稀释建立标准品浓度拟合曲线：y＝ax+b，x为标准品OD值，y为标准品浓度，获得a、b值；测得待测样品OD值为x1，则可计算待测样品浓度y1＝ax1+b。
10.权利要求9所述的AFP-IgM含量的检测方法，其特征是包括下列步骤：
第一步：包被
(1)标准品孔包被：用包被缓冲液稀释羊抗人IgM多克隆抗体至0.2μg/ml，96孔酶标板的凹孔加0.3ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱；
(2)检测孔包被：用包被缓冲液稀释鼠抗人AFP单克隆抗体至0.2μg/ml，96孔酶标板的凹孔加0.3ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱；
第二步：每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，移去包被液；
第三步：通过倍比稀释建立标准品浓度梯度，为0μg/L、2μg/L、4μg/L、8μg/L、16μg/L、32μg/L，标准品孔包括6孔，分别加入0.1ml各浓度的人免疫球蛋白IgM标准品，于第五、第六孔各加浓度为32μg/L的标准品0.1ml；样品孔加入0.1ml 5倍稀释血清或血浆被检标本；并建立阴性、阳性对照，阴性对照为稀释缓冲液，阳性对照为阳性血清；37℃作用2小时；
第四步：每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，将未结合的多余样品去除；
第五步：加入酶标抗体，每凹孔加入0.1ml用稀释缓冲液稀释的兔抗人IgM辣根过氧化物酶标记物溶液，浓度为0.5mg/L，37℃作用1小时；
第六步：每凹孔用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟，去除多余的抗IgM-HRP；
第七步：加入0.1ml底物四甲基联苯胺溶液于每个凹孔，室温作用30分钟；
第八步：加终止剂，每凹孔加2M H2SO4 0.05ml；
第九步：观察记录结果，在450nm波长下用酶标仪测定OD值；
第十步：计算检测样品中AFP-IgM浓度，通过倍比稀释建立标准品浓度拟合曲线：y＝ax+b，x为标准品OD值，y为标准品浓度，获得a、b值；测得待测样品OD值为x1，则可计算待测样品浓度y1＝ax1+b。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110231053.0A CN102435733B (zh) | 2011-08-12 | 2011-08-12 | 一种AFP-IgM检测试剂盒及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110231053.0A CN102435733B (zh) | 2011-08-12 | 2011-08-12 | 一种AFP-IgM检测试剂盒及检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102435733A true CN102435733A (zh) | 2012-05-02 |
| CN102435733B CN102435733B (zh) | 2014-03-05 |
Family
ID=45983896
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110231053.0A Expired - Fee Related CN102435733B (zh) | 2011-08-12 | 2011-08-12 | 一种AFP-IgM检测试剂盒及检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102435733B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103063841A (zh) * | 2012-12-24 | 2013-04-24 | 潍坊市康华生物技术有限公司 | 一种流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法 |
| CN103969453A (zh) * | 2014-05-30 | 2014-08-06 | 上海度微医学技术有限公司 | 甲胎蛋白自身抗体单独或与甲胎蛋白联合作为肿瘤诊断、疗效评估和复发监控标志物的应用 |
| CN108484762A (zh) * | 2018-03-20 | 2018-09-04 | 南京京达生物技术有限公司 | 一种甲胎蛋白检测用抗体IgM及应用 |
| CN111363037A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-07-03 | 北京瀚梅生物科技有限公司 | 一种包含特异性结合afp蛋白的抗体的疾病检测试剂盒 |
| WO2023087616A1 (zh) * | 2021-11-19 | 2023-05-25 | 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 | 一种原发性胆汁性胆管炎诊断用分子标志物及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101402960A (zh) * | 2008-08-13 | 2009-04-08 | 吴丽霞 | 一种重组风疹病毒e1蛋白及其应用 |
| CN201293787Y (zh) * | 2008-01-29 | 2009-08-19 | 马义才 | 便携式肝炎与肝硬化快速联检装置 |
| CN101750502A (zh) * | 2008-12-19 | 2010-06-23 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | 一种同步检测AFP和AFP-IgM的TRFIA及其试剂盒 |
-
2011
- 2011-08-12 CN CN201110231053.0A patent/CN102435733B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN201293787Y (zh) * | 2008-01-29 | 2009-08-19 | 马义才 | 便携式肝炎与肝硬化快速联检装置 |
| CN101402960A (zh) * | 2008-08-13 | 2009-04-08 | 吴丽霞 | 一种重组风疹病毒e1蛋白及其应用 |
| CN101750502A (zh) * | 2008-12-19 | 2010-06-23 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | 一种同步检测AFP和AFP-IgM的TRFIA及其试剂盒 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 《Journal of Clinical Laboratory Analysis》 20090721 Jiang Jingting et al Clinical Evaluation of Serum Alpha-Fetoprotein-IgM Immune Complexes on the Diagnosis of Primary Hepatocellular Carcinoma 第23卷, 第7期 * |
| JIANG JINGTING ET AL: "Clinical Evaluation of Serum Alpha-Fetoprotein–IgM Immune Complexes on the Diagnosis of Primary Hepatocellular Carcinoma", 《JOURNAL OF CLINICAL LABORATORY ANALYSIS》 * |
| JINGTING JIANG ET AL: "Clinical Application of Determining Serum AFP-IgM Complexes for Diagnosis of Small Hepatocellular Carcinoma", 《ANTICANCER RESEARCH》 * |
| L.BENEDUCE ET AL: "Improvement of liver cancer detection with simultaneous assessment of circulating levels of free alpha-fetoprotein(AFP) and AFP-IgM complexes", 《THE INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MARKERS》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103063841A (zh) * | 2012-12-24 | 2013-04-24 | 潍坊市康华生物技术有限公司 | 一种流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法 |
| CN103969453A (zh) * | 2014-05-30 | 2014-08-06 | 上海度微医学技术有限公司 | 甲胎蛋白自身抗体单独或与甲胎蛋白联合作为肿瘤诊断、疗效评估和复发监控标志物的应用 |
| CN103969453B (zh) * | 2014-05-30 | 2016-07-06 | 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 | 甲胎蛋白自身抗体单独或与甲胎蛋白联合作为肿瘤诊断、疗效评估和复发监控标志物的应用 |
| CN108484762A (zh) * | 2018-03-20 | 2018-09-04 | 南京京达生物技术有限公司 | 一种甲胎蛋白检测用抗体IgM及应用 |
| CN111363037A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-07-03 | 北京瀚梅生物科技有限公司 | 一种包含特异性结合afp蛋白的抗体的疾病检测试剂盒 |
| CN111363037B (zh) * | 2020-05-26 | 2020-11-17 | 深圳迈吉赛尔生物科技有限公司 | 一种包含特异性结合afp蛋白的抗体的疾病检测试剂盒 |
| WO2023087616A1 (zh) * | 2021-11-19 | 2023-05-25 | 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 | 一种原发性胆汁性胆管炎诊断用分子标志物及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102435733B (zh) | 2014-03-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tian et al. | Altered expression of sialylated glycoproteins in breast cancer using hydrazide chemistry and mass spectrometry | |
| CN102435733B (zh) | 一种AFP-IgM检测试剂盒及检测方法 | |
| Park et al. | Lectin-based optical sensing for quantitative analysis of cancer antigen CA15-3 as a breast cancer marker | |
| EP2679997B1 (en) | Method for measuring cardiac troponin | |
| CN103620409A (zh) | 用于减少非特异性结合的免疫检验方法和试剂 | |
| CN101435825A (zh) | 夹心免疫检测法及用该法检测抗原的方法 | |
| JPWO2017170187A1 (ja) | 化学センサ | |
| EP2583101A1 (en) | Multi epitope assay | |
| JP6320651B2 (ja) | 被検物質の検出方法および被検物質の検出用試薬キット | |
| Yazdani et al. | Development of a sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of hepatitis B surface antigen using novel monoclonal antibodies | |
| JP5104622B2 (ja) | 磁性粒子を用いた測定対象物質の濃度測定法 | |
| US20210364515A1 (en) | Optimizing diagnostics for galactofuranose containing antigens | |
| JP6217742B2 (ja) | 糖タンパク質の検出方法 | |
| CN110045130B (zh) | 一种与IgA肾病相关的多肽的免疫分析检测试剂盒 | |
| JP5487393B2 (ja) | ＥＬＩＳＡ法を用いたヒト血清中の抗原特異的なＩｇＧ抗体力価測定の標準化法 | |
| JP6578119B2 (ja) | 前立腺特異抗原の測定方法及び測定キット | |
| CN104483484A (zh) | 一种用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒 | |
| JP5093087B2 (ja) | ポリエチレングリコールおよび尿素による免疫反応増強方法 | |
| KR101613020B1 (ko) | 표적항원 검출용 복합체 및 이의 제조방법 | |
| KR100673835B1 (ko) | Ｓｐｒ을 이용하여 단백질을 정량하는 방법 | |
| CN103575892A (zh) | 用于cea定量检测的试剂盒及其制备、使用方法 | |
| CN102213722B (zh) | 一种检测蛋白表达水平的试剂盒在制备诊断肝细胞癌的试剂盒中的应用 | |
| Shu et al. | Evaluation of the yeast phase-specific monoclonal antibody 4D1 and Galanthus nivalis agglutinin sandwich ELISA to detect Talaromyces marneffei antigen in human urine | |
| CN115023611A (zh) | 免疫学分析方法和免疫学分析试剂盒 | |
| CN106932593B (zh) | 以ncam‑1为检测指标的双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Free format text: FORMER OWNER: JIANG JINGTING WU CHANGPING LU MINGYANG Effective date: 20141204 Owner name: CHANGZHOU NO.1 PEOPLE'S HOSPITAL Free format text: FORMER OWNER: XU BIN Effective date: 20141204 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20141204 Address after: 213003, No. 185, front street, Tianning District, Jiangsu, Changzhou Patentee after: THE FIRST PEOPLE'S HOSPITAL OF CHANGZHOU Address before: 213003 first people's Hospital of Changzhou, 185 west front street, Jiangsu, Changzhou Patentee before: Xu Bin Patentee before: Jiang Jingting Patentee before: Wu Changping Patentee before: Lu Mingyang |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140305 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |