CN104483484A - 一种用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒 - Google Patents

一种用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，包含GP73捕获抗体溶液、生物素标记的AAL、用于形成GP73抗体-抗原-生物素标记AAL复合物并进行ELISA检测的AAL-ELISA检测板和用于形成GP73抗体-抗原-生物素标抗体复合物并进行ELISA检测的Protein-ELISA检测板。本发明所述的方法及试剂盒具有高通量性，较高特异性，检测快速准确等突出优点，对肝癌的诊断具有重要的临床价值。

Description

一种用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学领域，与应用性基础医学研究和临床研究相联系；涵盖肿瘤学、诊断学，糖生物学。
背景技术
肝细胞性肝癌(HCC)是一种多基因、多因素、病理机制复杂的常见恶性肿瘤。在我国，乙肝病毒携带者占人口的7.18％，是全世界乙肝携带者的2/3，肝病发病率仍居全球之首，全球50％以上的年新增肝癌病例发生在我国。绝大多数患者发病隐匿，出现临床症状后就医时已属晚期，丧失了治疗的良机，因此早期诊断对于提高患者的生存率至关重要。理想的肝癌标志物需要有较高的特异性，能够将肝癌与肝硬化、肝炎、肝脏再生结节等疾病区分开来；同时还需较高的敏感性，能够在肝癌早期即提示诊断，同时应具有易检测、可重复、可经非侵入性操作测定等特点。
在蛋白质不同的翻译后修饰中，糖基化最为常见，几乎50％的蛋白质都被认为具有糖基化修饰。糖蛋白聚糖存在着宏观和微观的不均一性，其结构功能变化和与疾病发生发展有着密切的联系。聚糖在很多关键的生物学过程中起到重要作用，比如细胞黏附、分子运输和清除、受体激活、信号转导以及内吞作用等。在生物体发育过程中，聚糖结构也在变化，在不同的分化阶段，聚糖有不同的表达。在癌症的发生过程中，糖基化的改变是普遍存在的，如能关注糖基化的变化，可以提升诊断的特异性和敏感性。因此，利用检测糖蛋白聚糖结构的异常来诊断恶性肿瘤已引起相当重视，如AFP-L3的变化已成为检测肝癌的重要聚糖标志等。目前检测糖蛋白聚糖结构变化的技术方法有生物质谱、液相色谱和植物凝集素亲和印迹等，其中植物凝集素是一类存在于多数植物中的糖蛋白，其最大特点是能够识别糖蛋白和糖脂中的聚糖，特别是细胞膜中复杂结构的聚糖即细胞膜表面决定簇，它们与聚糖的结合是非共价且可逆的。AAL(杨树茹凝集素)是一种亲和α连接岩藻糖(TerminalαFuc和±Sia-Lex)的植物凝集素，岩藻糖修饰能赋予聚糖很多独特的功能特性，其在输血反应、凝集素介导的白细胞和内皮的粘附、宿主和微生物相互作用和个体发育等方面发挥重要作用。此外，岩藻糖还参与构成某些重要粘附分子的聚糖结构，与肿瘤转移关系密切。在癌症中发现sialyl Lewisx和sialyl Lewisa含量增多，许多肿瘤中A和B型血型抗原丢失伴随着H血型抗原和Lewisy表达升高。
高尔基体蛋白73(GP73)是一种高尔基体II型膜蛋白，表达于上皮细胞，是一种糖蛋白，包含3个潜在N-糖基化位点：Asn109，Asn144和Asn398。随着糖生物学技术的发展，已有研究证实将GP73的岩藻糖基化异质体在某些肝癌患者中作为标志物进行检测会优于GP73。在前期工作中，发现相比于肝硬化患者，肝癌患者血清单位GP73亲和AAL能力显著降低，说明肝癌患者的单位GP73岩藻糖基化聚糖含量降低。本发明应用AAL对岩藻糖化聚糖的高亲和性，通过AAL-ELISA和Protein-ELISA的制备与检测，分别形成GP73抗体-抗原-生物素标AAL复合物和GP73抗体-抗原-生物素标抗体复合物，获得GP73结合AAL的吸光度与GP73蛋白的吸光度比值Fuc-GP73，通过对临床资料进行回顾性研究，建立肿瘤判别诊断函数，获得ROC曲线和Cut off值，同时比较AFP-L3和Fuc-GP73对肝癌诊断的准确率差异。本发明适用于肝癌高发现场或者肝病人群大规模筛查，对于提高肝癌的诊断率，实现早期干预治疗，降低肝癌病死率具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有较高准确率的用于诊断肝细胞性肝癌(HCC)的试剂盒。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，包含GP73捕获抗体溶液、生物素标记的AAL、用于形成GP73抗体-抗原-生物素标记AAL复合物并进行ELISA检测的AAL-ELISA检测板和用于形成GP73抗体-抗原-生物素标抗体复合物并进行ELISA检测的Protein-ELISA检测板。
优选地，所述的AAL-ELISA检测板的预处理方法为：在AAL-ELISA检测板中加入GP73捕获抗体，AAL-ELISA中GP73捕获抗体浓度为1μg/mL，用量为100μL/well，室温孵育过夜；采用PBST缓冲液洗板；采用含有3％BSA(质量-体积浓度)的PBS溶液进行封闭，用量为200μL/well采用PBST缓冲液洗板；采用pH 4.0的含有100mM NaIO4和50mM柠檬酸的溶液进行氧化，用量为200μL/well，4℃避光反应1h；采用PBST缓冲液洗板，得到预处理后的AAL-ELISA检测板。
优选地，所述的Protein-ELISA检测板的预处理方法为：在Protein-ELISA检测板中加入GP73捕获抗体，Protein-ELISA中GP73捕获抗体浓度为2μg/mL，用量为100μL/well，室温孵育过夜；采用PBST缓冲液洗板；采用含有1％BSA(质量-体积浓度)和0.05％NaN3(质量-体积浓度)的PBS溶液进行封闭，用量为200μL/well；采用PBST缓冲液洗板；采用含有1％BSA(质量-体积浓度)和0.05％NaN3(质量-体积浓度)的PBS溶液进行氧化，用量为200μL/well，4℃避光反应1h；采用PBST缓冲液洗板，得到预处理后的Protein-ELISA检测板。
优选地，所述的GP73捕获抗体溶液共有两种，浓度分别为1μg/mL和2μg/mL。
优选地，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包括生物素标记的GP73抗体。
优选地，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包含含有3％BSA的PBS溶液，含有1％BSA和0.05％NaN3的PBS溶液，pH 4.0的含有100mMNaIO4和50mM柠檬酸的溶液。
优选地，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包括PBST缓冲液。
优选地，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(HRP-Streptavidin)。
优选地，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包括底物溶液和终止液。
优选地，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包含采集血样装置及操作说明书。
本发明中提及的GP73蛋白由前期糖蛋白质组学工作确定单位GP73亲和AAL能力显著降低，说明肝癌患者的单位GP73岩藻糖基化聚糖含量减少。
本发明主要是建立并优化AAL-ELISA和Protein-ELISA方法，确定最优的捕获抗体浓度、血清样品的上样量、凝集素浓度和检测抗体浓度；并选择合适的AAL-ELISA封闭剂和氧化剂。排除GP73抗体与其它抗原的交叉反应，确立AAL-ELISA和Protein-ELISA对GP73的检测范围和重复性，构建可用于临床血清样品筛查的Fuc-GP73半定量检测系统。
如图1所示，本发明通过AAL-ELISA和Protein-ELISA的制备，联合并行分析血清中GP73的岩藻糖(Fuc)和蛋白的表达水平，用于肝癌和肝硬化病人血清中单位GP73蛋白中结合岩藻糖的含量(Fuc-GP73)的定量检测。并根据Fuc-GP73的检测数据和临床资料的回顾性研究，建立肿瘤判别诊断函数可用于原发性肝细胞肝癌的早期诊断。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过AAL(杨树茹凝集素)-ELISA和Protein-ELISA的制备与检测，分别形成抗体-抗原-生物素标AAL复合物和抗体-抗原-生物素标抗体复合物，以GP73结合AAL的吸光度(OD值)与GP73蛋白的吸光度比值作为衡量单位GP73蛋白中结合岩藻糖的含量(Fuc-GP73)，通过对临床资料进行回顾性研究，建立肿瘤判别诊断函数，获得受试者工作曲线(ROC)以及判别(Cut off)值，该函数对于HCC的诊断灵敏度和特异度分别为73.9％和65.4％，AUC为0.801，优于甲胎蛋白N-聚糖核心岩藻糖(AFP-L3)。本发明所述的方法及试剂盒具有高通量性，较高特异性，检测快速准确等突出优点，对肝癌的诊断具有重要的临床价值。
附图说明
图1为高通量Fuc-GP73检测系统原理示意图；
图2为Protein-ELISA线性检测范围图；
图3为Fuc-GP73和AFP-L3检测系统分别构建ROC曲线图；
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例
一种用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其组成为：
1、Fuc-GP73半定量检测ELISA板，所述的Fuc-GP73半定量检测ELISA板由用于形成GP73抗体-抗原-生物素标记AAL复合物并进行ELISA检测的AAL-ELISA检测板和用于形成GP73抗体-抗原-生物素标抗体复合物并进行ELISA检测的Protein-ELISA检测板组成。
2、GP73捕获抗体溶液，其浓度分别为1μg/mL和2μg/mL(由Abmart公司制备，PBS溶液稀释)。
4、含有3％BSA的PBS溶液(3％BSA in PBS，pH7.2-7.4)。
5、含有1％BSA和0.05％NaN3的PBS溶液(1％BSA，0.05％NaN3in PBS，pH7.2-7.4)。
6、含有100mM NaIO4和50mM柠檬酸的溶液(100mM NaIO4，50mMCitric acid，pH 4.0)。
7、生物素标记的AAL溶液，浓度为1μg/mL(Vector公司，Product#B-1395，PBST缓冲液稀释)。
8、生物素标记的GP73抗体溶液，浓度为2μg/mL(由广州生物医药与健康研究院提供)。
9、HRP-streptavidin(Thermo Scientific，Product#N 100)。
10、采集血样装置及操作说明书。
11、PBST缓冲液(0.05％Tween20in PBS，pH7.2-7.4)。
12、底物溶液：3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液，双氧水溶液(KOMABiotech Inc.Product#K0331002)。
13、终止液；2M H2SO4
上述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒的使用方法为：
(一)AAL-ELISA板和Protein-ELISA板的预处理：
1、取两块ELISA板，分别用作AAL-ELISA板和Protein-ELISA板；
2、捕获抗体：在AAL-ELISA板和Protein-ELISA板中分别加入GP73捕获抗体，AAL-ELISA中GP73捕获抗体浓度为1μg/mL，100μL/well；Protein-ELISA中GP73捕获抗体浓度为2μg/mL，100μL/well。室温孵育过夜。
3、洗板：采用PBST缓冲液(0.05％Tween20in PBS，pH7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL/well，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
4、封闭：AAL-ELISA板采用含有3％BSA的PBS溶液(3％BSA in PBS，pH7.2-7.4)进行封闭，室温封闭1h，用量为200μL/well；Protein-ELISA采用含有1％BSA和0.05％NaN3的PBS溶液(1％BSA，0.05％NaN3in PBS，pH7.2-7.4)进行封闭，室温封闭1h，用量为200μL/well。
5、洗板：采用PBST缓冲液(0.05％Tween20in PBS，pH7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL/well，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
6、氧化：AAL-ELISA板采用pH 4.0的含有100mM NaIO4和50mM柠檬酸的溶液(100mM NaIO4，50mM Citric acid，pH 4.0)进行氧化，用量为200μL/well，4℃避光反应1h；Protein-ELISA采用含有1％BSA和0.05％NaN3的PBS溶液(1％BSA，0.05％NaN3in PBS，pH7.2-7.4)进行氧化，4℃避光反应1h，200μL/well。
7、洗板：采用PBST(0.05％Tween20in PBS，pH7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL/well，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干，分别得到处理后的AAL-ELISA板和Protein-ELISA板，用于下述步骤。
(二)Fuc-GP73半定量检测ELISA检测方法：
1、采样：通过采集血样装置采集血样，抽取静脉血5ml，每份标本均无溶血、脂血。37℃静置一小时，3000rpm离心30min后上清即为所需血清，-70℃分装冻存(100μl/tube)。
2、加样：AAL-ELISA板加入血清样品100μL/well；Protein-ELISA板加入稀释后血清样品100上L/well(采用PBS，pH7.2-7.41.4倍稀释至100pL)，室温2h。
3、洗板：采用PBST(0.05％Tween20in PBS，pH7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL/well，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
4、检测试剂：AAL-ELISA板中加入1μg/mL生物素标记的AAL(PBST稀释)；Protein-ELISA板中加入生物素标记的抗体2μg/mL(PBS稀释)，100μL/well，室温2h。
5、洗板：采用PBST(0.05％Tween20in PBS，pH7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL/well，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
6、酶结合物工作液：AAL-ELISA板中加入HRP-streptavidin(采用3％BSA inPBS，pH7.2-7.4，1∶12500稀释)；Protein-ELISA板中加入HRP-streptavidin(采用1％BSA in PBS，pH7.2-7.4，1∶12500稀释)，100μL/well，室温30min。
7、洗板：采用PBST(0.05％Tween20in PBS，pH7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL/well，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
8、加底物溶液，所述的底物溶液由3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液和的双氧水溶液按照体积比为1∶2混合而成，100μL/well，室温20min。
9、加终止液：100μLStop Solution/well，终止液的加入顺序与底物溶液的加入顺序相同。
10、检测：立即用NanoQuant infinite M200(TECAN)酶标仪在450nm波长测量各孔的OD值。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
(三)Fuc-GP73半定量检测ELISA分析方法：
1、数据：每个血清样品的OD值应减去空白孔的OD值为实际OD值。每个血清样品GP73结合AAL的实际OD值(AAL-ELISA)与此相同血清样品GP73蛋白的实际OD值(Protein-ELISA)比值即为Fuc-GP73值。
采用SPSS软件logistic回归分析建立的上述HCC预测模型进行检测区分肝癌和肝硬化的Cut off值为3.9433。按照上述HCC预测模型计算P值，将P值与Cut off值比较，＞3.9433为肝硬化，＜3.9433为肝癌。
采用实施例中的试剂盒和检测方法，分析49例肝病血清样品(肝硬化26例和肝癌患者23例，均经临床确诊)中GP73的岩藻糖和蛋白的表达水平，计算得到Fuc-GP73含量。同时使用AFP-L3检测试剂盒(AFP-L3检测试剂盒购自Abnova公司(Catalog#KA1187)和其操作说明中的检测方法，检测上述49例肝病血清样品中AFP-L3含量，采用SPSS软件获得ROC曲线。比较本发明试剂盒和AFP-L3对肝癌诊断的灵敏性和特异性，结果如图3所示，本发明试剂盒的灵敏度为73.9％，特异度65.4％，AUC为0.801，而AFP-L3对HCC的诊断灵敏度为69.6％，特异度为69.2％，AUC为0.701。因此，本发明具有较高敏感性，对肝癌的预测具有重要临床价值。
采用recombinant GP73标准品进行倍比稀释，确定Protein-ELISA线性检测范围。结果如图2所示，Protein-ELISA的定量线性检测范围为0～500000pg/mL。

Claims (10)

1.一种用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，包含GP73捕获抗体溶液、生物素标记的AAL、用于形成GP73抗体-抗原-生物素标记AAL复合物并进行ELISA检测的AAL-ELISA检测板和用于形成GP73抗体-抗原-生物素标抗体复合物并进行ELISA检测的Protein-ELISA检测板。
2.如权利要求1所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，所述的AAL-ELISA检测板的预处理方法为：在AAL-ELISA检测板中加入GP73捕获抗体，AAL-ELISA中GP73捕获抗体浓度为1μg/mL，用量为100μL/well，室温孵育过夜；采用PBST缓冲液洗板；采用含有3％BSA的PBS溶液进行封闭，用量为200μL/well；采用PBST缓冲液洗板；采用pH 4.0的含有100mM NaIO4和50mM柠檬酸的溶液进行氧化，用量为200μL/well，4℃避光反应1h；采用PBST缓冲液洗板，得到预处理后的AAL-ELISA检测板。
3.如权利要求1所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，所述的Protein-ELISA检测板的预处理方法为：在Protein-ELISA检测板中加入GP73捕获抗体，Protein-ELISA中GP73捕获抗体浓度为2μg/mL，用量为100μL/well，室温孵育过夜；采用PBST缓冲液洗板；采用含有1％BSA和0.05％NaN3的PBS溶液进行封闭，用量为200μL/well；采用PBST缓冲液洗板；采用含有1％BSA和0.05％NaN3的PBS溶液进行氧化，用量为200μL/well，4℃避光反应1h；采用PBST缓冲液洗板，得到预处理后的Protein-ELISA检测板。
4.如权利要求1所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，所述的GP73捕获抗体溶液共有两种，浓度分别为1μg/mL和2μg/mL。
5.如权利要求1所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包括生物素标记的GP73抗体。
6.如权利要求1所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包含含有3％BSA的PBS溶液，含有1％BSA和0.05％NaN3的PBS溶液，pH 4.0的含有100mMNaIO4和50mM柠檬酸的溶液。
7.如权利要求1所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包括PBST缓冲液。
8.如权利要求1所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记链霉亲和素。
9.如权利要求1所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包括底物溶液和终止液。
10.如权利要求1所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包含采集血样装置及操作说明书。
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