CN113466456A - 用于肝癌早期诊断的检测甲胎蛋白异质体afp-l3的elisa试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于肝癌早期诊断的检测AFP‑L3的ELISA试剂盒及检测方法，该试剂盒包括AFP‑L3标准品、AFP单克隆抗体包被的酶标板、生物素标记的橙黄网孢盘菌凝集素、链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶(SA‑HRP)、稀释液、洗涤液、封闭液、TMB显色液、终止液。采用该试剂盒进行检测的方法为：在AFP单克隆抗体包被的酶标板中加待测样品，然后加生物素标记的橙黄网孢盘菌凝集素，随后加链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶；再加入显色液，最后加入终止液终止反应，并采用酶联检测仪测定吸光度值。本发明的试剂盒直接通过凝集素代替二抗对AFP‑L3进行检测，使AFP‑L3的检测更加简便、快捷。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于肝癌早期诊断的检测甲胎蛋白异质体(AFP-L3)的ELISA试剂盒及检测方法。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界第六大常见的恶性肿瘤，在肿瘤中的致死率位居第三。2012年全球登记在册的肝癌的新增病例有782500人，死亡人数约745500人，其中在中国新增病例和死亡人数占半数。HCC患者早期常无明显的临床症状，致使大多数患者直到疾病的中晚期才被发现，从而往往错过最佳的治疗时间。HCC的早期诊断不仅可以提高疗效，还可以极大程度的提高患者五年生存率，并改善其生存质量。
一直以来，我国利用甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)和超声检查对易发生HCC的高危人群进行初步筛查。AFP的灵敏度和特异度不足，在慢性肝炎、肝硬化等肝脏慢性疾病中也会有不同程度的升高，且并非所有HCC患者中均有升高。
AFP分子量约为70KD，在胎儿时期高表达，出生后血清AFP降至健康成人水平，浓度小于20μɡ/L的一种单链糖蛋白。AFP作为一个糖蛋白分子，具有一个公认的N糖位点，其糖链部分约占其总量的4％。由于糖链存在微不均一性，已发现AFP有16种糖肽，在不同疾病状态有不同的糖型组合。其中甲胎蛋白异质体(AFP-L3)是指AFP的氨基酸序列相同而糖链结构不同的一个亚型，利用扁豆凝集素将AFP分为三个亚种，其中AFP-L1不与LCA结合，在肝硬化、乙肝病毒感染时升高；AFP-L2与LCA具有中度结合力，在孕妇或者妇科肿瘤中会有升高；AFP-L3与LCA具有高结合力，是由癌变的肝脏细胞产生。美国食品药品监督管理局于2005年批准将AFP-L3用于HCC的临床诊断。AFP-L3不仅可以用于HCC的早期诊断和鉴别诊断，还可以用于疗效评估及复发监测。
目前AFP-L3的检测方法有亲和免疫交叉电泳技术、亲和印迹技术、亲和层析、微量离心柱亲和吸附法以及微全检测技术等。这些方法有的已经应用于临床，有的还停留在科研阶段，但是它们检测的根本原理都是需先将AFP-L3从总AFP中分开后再进行测定，因此操作十分繁琐，导致无法高通量应用，同时检测成本较高，不适合市场大规模运用。基于临床研究和市场应用的需求，迫切需要开发一种可作为AFP-L3定量检测的简便、快速、有效、低成本的检测手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于肝癌早期诊断的AFP-L3的ELISA检测试剂盒及其检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒，所述的ELISA试剂盒包括：(A)AFP-L3标准品；(B)AFP单克隆抗体包被的酶标板；(C)生物素标记的橙黄网孢盘菌凝集素(AAL)、链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶(SA-HRP)、稀释液、洗涤液、封闭液、TMB显色液以及终止液。
采用该试剂盒进行检测的方法包括以下步骤：在AFP单克隆抗体包被的酶标板中加待测样品，然后加生物素标记的橙黄网孢盘菌凝集素,随后加链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶；再加入显色液，最后加入终止液终止反应，并采用酶联检测仪测定吸光度值。
其中，所述AFP-L3标准品的制备方法为：称取1000μg AFP标准品，溶于1mL的0.01mol/L PBS(pH 7.4)，吸取600μL加入到小扁豆凝集素亲和吸附离心管中，室温静置10min，吸取1.2mL清洗液加入离心管中，3000r室温下离心20s，弃去离心液体，加入600μL洗脱液到上部离心管，3000r室温下离心收集离心柱外管液体，即所需要的AFP-L3标准品。反复上述操作，收集AFP-L3标准品。利用罗氏化学发光仪E602进行定量测定收集的AFP-L3标准品浓度，并用0.01mol/L PBS(pH 7.4)配制含量成60μg/mL的AFP-L3标准品。
所述AFP单克隆抗体包被的酶标板的制备过程为：取1mg/mL的AFP单克隆抗体用包被液(50mmol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液)以1:800的比例稀释后加入酶标板各孔，每孔100μL，4℃包被过夜。随后甩去酶标板孔内液体，采用洗涤液PBST浸泡3min，反复洗涤3次，拍干酶标板内液体后用封闭液(1×Carbo-free Blocking Solution)，200μL/孔，室温孵育30min，再次洗板3次，甩干后拍干，每孔加入100μL 20mmol/L醋酸钠(PH4.5)，4℃孵育30min后甩干，随后加入新鲜配置的25mmol/L NaIO4溶于醋酸钠(PH4.5)每孔100μL，4℃避光孵育1.5h后20mmol/L醋酸钠洗涤3次，每次5min，拍干后加入1mmol/L MPBH每孔100μL，18-22℃，避光孵育2h后加入1mmol/L Cys-Gly溶液每孔100μL，4℃避光孵育过夜。最后采用洗涤液PBST洗3次板，每次5分钟，甩干后晾干，即获得AFP-L3单克隆抗体包被的酶标板。
稀释液(PBS)：0.2700ɡ KH2PO4，1.4200ɡ Na2HPO4，8.0000ɡ NaCl，0.2000ɡ KCl，加去离子水约800mL，充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调节PH至7.4，并定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存；
洗涤液(PBST)：8.0g NaCl、0.2g KCl、0.26g KH2PO4、2.9g Na2HPO4·12H2O、0.5mLTween-20、0.2g NaN3，加蒸馏水溶解后定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存；
封闭液：含1％BSA的PBST，过滤除菌，4℃保存；
TMB显色液：即磷酸盐-枸橼酸缓冲液。将0.1mol/L的枸橼酸命名为A液，0.2mol/L的Na2HPO4命名为B液。临用前取A液9.7mL、B液10.3mL混匀，每5mL混合液加入2mg邻苯二胺，完全溶解后，加入30％H2O2 7.5μL混匀；
终止液：蒸馏水90mL，逐渐滴加入98％浓硫酸10mL配制而成。
采用上述诊断试剂盒进行检测的检测方法，包括以下步骤：
1)将AFP-L3标准品用稀释液分别按1:2、1:8、1:32、1:128、1:512、1:2048、1:4096、1:8192梯度进行倍比稀释；
2)在AFP单克隆抗体包被的酶标板的微孔中加待测血清样品，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照，还有1)中不同溶度的标准品，均100μL/孔，振荡混匀，37℃孵育30min，PBST洗3次板，每次5min，拍干；
3)生物素标记的AAL孵育：每孔加入50μL经1:8000稀释的生物素标记的AAL，37℃孵育30min，洗板同上；
4)链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶孵育：每孔加入50μL经1:8000稀释的亲和素标记的HRP，37℃孵育30min，洗板同上；
5)显色：加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光孵育20min；
6)终止：各孔加50μL终止液终止反应，混匀后10min内在450nm波长处测定吸光度值；
7)制作标准曲线：分别测定按1:2、1:8、1:32、1:128、1:512、1:2048、1:4096、1:8192梯度进行倍比稀释AFP-L3标准品的OD值作AFP-L3的蛋白标准曲线，其中以标准品稀释倍数相应浓度的对数为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标；
8)根据标准曲线计算待测样品AFP-L3浓度。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：本发明所述的肝癌早期诊断试剂盒摒弃了原有各种检测方法中需将AFP-L3从总AFP中分开后再进行测定这一步骤，直接通过凝集素代替二抗对AFP-L3进行检测，使AFP-L3的检测更加简便、快捷，同时大幅度降低成本。该检测方法最低检测限为18.23ng/ml；批内和批间精密度均小于10％；实验结果几乎不受胆红素C、胆红素F、溶血血红蛋白和乳糜的影响。该方法检测临床样品所得结果与临床检测结果相符。
附图说明
图1为AFP-L3的自然对数浓度曲线。
图2为干扰因素对试验结果的干扰作用结果。
图3为本发明建立的检测方法检测人血清AFP-L3的检测结果
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆实验指南(Sambrook J,et al.2008.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
一种肝癌早期诊断试剂盒，所述的定量检测甲胎蛋白异质体(AFP-L3)的ELISA试剂盒组成如下：
AFP-L3标准品，AFP单克隆抗体包被的酶标板，生物素标记的橙黄网孢盘菌凝集素，链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶(SA-HRP)，稀释液，洗涤液，封闭液，TMB显色液，终止液。
其中，所述AFP-L3标准品的制备方法为：称取1000μg AFP标准品，溶于1mL的0.01mol/L PBS(pH 7.4)，吸取600μL加入到小扁豆凝集素亲和吸附离心管中，室温静置10min，吸取1.2mL清洗液加入离心管中，3000r室温下离心20s，弃去离心液体，加入600μL洗脱液到上部离心管，3000r室温下离心收集离心柱外管液体，即所需要的AFP-L3标准品。反复上述操作，收集AFP-L3标准品。利用罗氏化学发光仪E602进行定量测定收集的AFP-L3标准品浓度，并用0.01mol/L PBS(pH 7.4)配制含量成60μg/mL的AFP-L3标准品。
所述AFP单克隆抗体包被的酶标板的制备过程为：取1mg/mL的AFP单克隆抗体用包被液(50mmol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液)以1:800的比例稀释后加入酶标板各孔，每孔100μL，4℃包被过夜。随后甩去酶标板孔内液体，采用洗涤液PBST浸泡3min，反复洗涤3次，拍干酶标板内液体后用封闭液(1×Carbo-free Blocking Solution)，200μL/孔，室温孵育30min，再次洗板3次，甩干后拍干，每孔加入100μL 20mmol/L醋酸钠(PH4.5)，4℃孵育30min后甩干，随后加入新鲜配置的25mmol/L NaIO4溶于醋酸钠(PH4.5)每孔100μL，4℃避光孵育1.5h后20mmol/L醋酸钠洗涤3次，每次5min，拍干后加入1mmol/L MPBH每孔100μL，18-22℃，避光孵育2h后加入1mmol/L Cys-Gly溶液每孔100μL，4℃避光孵育过夜。最后采用洗涤液PBST洗3次板，每次5分钟，甩干后晾干，即获得AFP-L3单克隆抗体包被的酶标板。
稀释液(PBS)：0.2700ɡ KH2PO4，1.4200ɡ Na2HPO4，8.0000ɡ NaCl，0.2000ɡ KCl，加去离子水约800mL，充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调节PH至7.4，并定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存；
洗涤液(PBST)：8.0g NaCl、0.2g KCl、0.26g KH2PO4、2.9g Na2HPO4·12H2O、0.5mLTween-20、0.2g NaN3，加蒸馏水溶解后定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存；
封闭液：含1％BSA的PBST，过滤除菌，4℃保存；
TMB显色液：即磷酸盐-枸橼酸缓冲液。将0.1mol/L的枸橼酸命名为A液，0.2mol/L的Na2HPO4命名为B液。临用前取A液9.7mL、B液10.3mL混匀，每5mL混合液加入2mg邻苯二胺，完全溶解后，加入30％H2O2 7.5μL混匀；
终止液：蒸馏水90mL，逐渐滴加入98％浓硫酸10mL配制而成。
实施例2
采用上述诊断试剂盒进行检测的检测方法，包括以下步骤:
1)将AFP-L3标准品用稀释液分别按1:2、1:8、1:32、1:128、1:512、1:2048、1:4096、1:8192梯度进行倍比稀释；
2)在AFP单克隆抗体包被的酶标板的微孔中加待测血清样品，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照，还有1)中不同溶度的标准品，均100μL/孔，振荡混匀，37℃孵育30min，PBST洗3次板，每次5min，拍干；
3)生物素标记的AAL孵育：每孔加入50μL经1:8000稀释的生物素标记的AAL，37℃孵育30min，洗板同上；
4)链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶孵育：每孔加入50μL经1:8000稀释的亲和素标记的HRP，37℃孵育30min，洗板同上；
5)显色：加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光孵育20min；
6)终止：各孔加50μL终止液终止反应，混匀后10min内在450nm波长处测定吸光度值；
7)制作标准曲线：分别测定按1:2、1:8、1:32、1:128、1:512、1:2048、1:4096、1:8192梯度进行倍比稀释AFP-L3标准品的OD值作AFP-L3的蛋白标准曲线，其中以标准品稀释倍数相应浓度的对数为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标；
8)根据标准曲线计算待测样品AFP-L3浓度。
实施例3
试剂盒的性能检测
1.建立AFP-L3标准曲线
AFP-L3从60μg/mL的浓度按1:2、1:8、1:32、1:128、1:512、1:2048、1:4096、1:8192梯度进行倍比稀释。采用自建ELISA方法检测OD450值，每个浓度做2个复孔，采用样本稀释液作为零标准。以OD450值为纵坐标，稀释倍数相应蛋白浓度的自然对数为横坐标绘制标准曲线。
2.批内、批间精密度
采用两个不同浓度的血清样品(高值和低值)经过亲和吸附离心法制备两种不同浓度的检测样品。在同一次试验中连续检测10次，利用10个数据求出均值、标准差和变异系数；将同一标本连续测定10个工作日，计算其均值、标准差和变异系数。
3.最低检测限
测得10个空白孔吸光度值。以空白孔均值加3倍空白标准差作为检测低限的估计值，并计算对应的最低检测浓度。
4.干扰实验
(1)将各干扰物(胆红素C、胆红素F、乳糜、溶血血红蛋白)进行溶解，后再将溶解好的试剂1.0mL与预先准备好的标本(具有一定浓度的AFP-L3的标本)9.0mL相混合，调制成样品A。
(2)将各干扰物相应空白液进行溶解，将溶解好的空白液1.0mL和与(1)相同的标本9.0mL相混合，调制成样品B。
(3)将样品A和样品B按如下方法调制，做成不同稀释比例的样品。
(4)测定(3)调制了的样品，判断干扰物对实验方法的影响程度的大小。
5.AFP-L3阳性肝癌组、AFP-L3阴性肝癌组、健康组AFP-L3的测定
将经临床检测后的AFP-L3阳性肝癌组、AFP-L3阴性肝癌组、健康组3组临床样品稀释100倍后使用已建立的ELISA方法进行检测。对检测结果进行统计学分析。
本试剂盒的性能评价结果：
1.本试剂盒检测人AFP-L3的标准曲线见图1；
2.本试剂盒检测人AFP-L3的批内、批间变异均小于10％(结果见表1)；
表1高值和低值阳性血清的批内、批间变异
3.本试剂盒检测人AFP-L3的最低检出限为18.23ng/mL；
4.本试剂盒检测人AFP-L3几乎不受胆红素C、胆红素F、乳糜、溶血血红蛋白这4种干扰物的影响(P<0.05)(图2)；
5.分别检测33例AFP-L3阳性肝癌组、35例AFP-L3阴性肝癌组、30例正常人组血清AFP-L3含量，检测结果与临床结果相符，且具有统计学差异(图3)。
Claims (9)
1.一种用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的ELISA试剂盒包括：
(A)AFP-L3标准品；
(B)AFP单克隆抗体包被的酶标板；
(C)生物素标记的橙黄网孢盘菌凝集素、链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶、稀释液、洗涤液、封闭液、TMB显色液以及终止液。
2.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒，其特征在于：所述AFP-L3标准品的制备方法为：称取1000μg AFP标准品，溶于1mL的浓度为0.01mol/L且pH为7.4的PBS缓冲液，吸取600μL加入到小扁豆凝集素亲和吸附离心管中，室温静置10min，吸取1.2mL清洗液加入离心管中，3000r室温下离心20s，弃去离心液体，加入600μL洗脱液到上部离心管，3000r室温下离心收集离心柱外管液体，即所需要的AFP-L3标准品。
3.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒，其特征在于：所述AFP单克隆抗体包被的酶标板的制备过程为：取1mg/mL的AFP单克隆抗体用包被液以1:800的比例稀释后加入酶标板各孔，每孔100μL，4℃包被过夜；随后甩去酶标板孔内液体，采用洗涤液PBST浸泡3min，反复洗涤3次，拍干酶标板内液体后用封闭液，200μL/孔，室温孵育30min，再次洗板3次，甩干后拍干，每孔加入100μL PH为4.5，浓度为20mmol/L的醋酸钠，4℃孵育30min后甩干，随后加入新鲜配置的25mmol/L NaIO4溶于PH为4.5的醋酸钠中，每孔100μL，4℃避光孵育1.5h后20mmol/L醋酸钠洗涤3次，每次5min，拍干后加入1mmol/L MPBH每孔100μL，18-22℃，避光孵育2h后加入1mmol/L Cys-Gly溶液每孔100μL，4℃避光孵育过夜；最后采用洗涤液PBST洗3次板，每次5分钟，甩干后晾干，即获得AFP-L3单克隆抗体包被的酶标板。
4.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒，其特征在于：所述稀释液为PBS缓冲液；
所述PBS缓冲液的配制方法为：将0.2700ɡ KH2PO4、1.4200ɡ Na2HPO4、8.0000ɡ NaCl、0.2000ɡ KCl、加去离子水约800mL，充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调节PH至7.4，并定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存。
5.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为PBST缓冲液；所述PBST缓冲液的配制方法为：将8.0g NaCl、0.2g KCl、0.26g KH2PO4、2.9g Na2HPO4·12H2O、0.5mL Tween-20、0.2g NaN3，加蒸馏水溶解后定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存。
6.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒，其特征在于：所述封闭液为含1％BSA的PBST缓冲液，配置好的封闭液经过滤除菌后，4℃保存。
7.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒，其特征在于：所述TMB显色液为磷酸盐-枸橼酸缓冲液。
8.根据权利要求1所述的用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒，其特征在于：所述终止液为将90mL蒸馏水，逐渐滴加入10mL 98％浓硫酸中所配制而成的溶液。
9.利用权利要求1-8任意一项所述的ELISA试剂盒定量检测AFP-L3的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将AFP-L3标准品用稀释液分别按1:2、1:8、1:32、1:128、1:512、1:2048、1:4096、1:8192梯度进行倍比稀释；
2)在AFP单克隆抗体包被的酶标板的微孔中加待测血清样品，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照，还有1)中不同溶度的标准品，均100μL/孔，振荡混匀，37℃孵育30min，PBST洗3次板，每次5min，拍干；
3)生物素标记的AAL孵育：每孔加入50μL经1:8000稀释的生物素标记的AAL，37℃孵育30min，洗板同上；
4)链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶孵育：每孔加入50μL经1:8000稀释的亲和素标记的HRP，37℃孵育30min，洗板同上；
5)显色：加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光孵育20min；
6)终止：各孔加50μL终止液终止反应，混匀后10min内在450nm波长处测定吸光度值；
7)制作标准曲线：分别测定按1:2、1:8、1:32、1:128、1:512、1:2048、1:4096、1:8192梯度进行倍比稀释AFP-L3标准品的OD值作AFP-L3的蛋白标准曲线，其中以标准品稀释倍数相应浓度的对数为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标；
8)根据标准曲线计算待测样品AFP-L3浓度。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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