CN116046937A - 一种游离睾酮的高效液相色谱串联质谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种游离睾酮的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：S100，建立游离睾酮的标准曲线；S200，在待测的生物样品中加入PBS，形成第一混合物；S300，对第一混合物进行超滤分离；S400，加入内标和盐酸羟胺进行衍生，形成第二混合物；S500，对第二混合物进行液液萃取，取上清，氮气吹干后复融；S600，对游离睾酮进行高效液相色谱串联质谱检测，采集信号，计算浓度。本发明以超滤加衍生后液液萃取作为前处理，利用高效液相色谱串联质谱进行检测，单样本检测时间为4.5min，采用超滤法，实现游离睾酮和蛋白结合型睾酮的完全分离，加上衍生和液液萃取的前处理可提升整体方法的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及激素检测技术领域，具体为一种游离睾酮的高效液相色谱串联质谱检测方法。
背景技术
睾酮是雄激素的主要成分，主要与性激素结合蛋白和清蛋白结合，在外周血循环中，只有小部分(2％～3％)未与蛋白质结合，称为游离睾酮，只有游离部分才能进入细胞并发挥雄激素活性，已有研究表明，游离睾酮的测定，对于许多疾病的诊断特别是对于男性的雄激素缺乏症以及女性雄激素过多症有指导意义，但在常规的临床实践中基于技术上的困难，加上游离睾酮在体内水平很低，特别是女性人群，正常游离睾酮水平为＜10.9pg/mL，对现有检测技术挑战非常大。
针对游离睾酮的测定，目前尚无统一的标准，平衡透析法成本高、方法复杂，耗时长，另外，平衡透析过程容易发生体积迁移效应，影响结果的准确性，目前已较少使用；而由于放射免疫法和酶联免疫法中同一抗体会与多种抗原发生反应，灵敏度、准确度和特异性较差，不能准确反映机体外周血液中游离睾酮的真实水平，目前有用Vermeulen公式来计算游离睾酮水平，但是，该计算公式需先通过免疫分析法测得总睾酮和性激素结合球蛋白值，相对于单纯检测游离睾酮，价格相对昂贵、计算繁琐且耗时，在一定程度上限制了该方法的推广应用。
游离睾酮测定的技术难点在于如何将游离型和蛋白结合型睾酮分开，并对痕量的游离睾酮进行准确定量，已有文献报道使用超滤法来分离游离睾酮，该法能快速有效分离出游离睾酮，而高效液相色谱串联质谱法是检测类固醇激素的金标准，高效液相色谱串联质谱法结合了高效液相色谱的分离能力以及质谱的高特异性，既可准确检测游离睾酮，更解决了既往类固醇激素检测方法阈值高、灵敏度低的问题，大大提高了精准性。
综上，现有的游离睾酮检测方法大多不同程度上存在着复杂性、准确性、灵敏度较差等缺陷，不能准确反映机体外周血液中游离睾酮的真实水平，本发明提出一种游离睾酮的高效液相色谱串联质谱检测方法。
发明内容
本发明目的是提供一种游离睾酮的高效液相色谱串联质谱检测方法，以解决现有技术中，游离睾酮检测方法大多不同程度上存在着复杂性、准确性、灵敏度较差等缺陷，不能准确反映机体外周血液中游离睾酮的真实水平的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种游离睾酮的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：
S100，建立游离睾酮的标准曲线；
S200，在待测的生物样品中加入PBS，形成第一混合物：
在待测的生物样品中加入PBS，振荡混匀2min，充分混合，形成第一混合物；
S300，对第一混合物进行超滤分离：
将第一混合物转移到超滤管，在37℃恒温孵育30min，孵育完成后，然后进行超滤分离；
S400，加入内标和盐酸羟胺进行衍生，形成第二混合物：
向待测样本中分别加入内标溶液，充分混合，然后加入20uL 15％的盐酸羟胺溶液，充分混合后，在70℃下衍生15min，形成第二混合物；
S500，对第二混合物进行液液萃取，取上清，氮气吹干后复融：
向待测样本加入1200uL的萃取溶剂，充分混合后，在12000rpm的转速下，离心10min，取1000uL上清液，50℃下氮吹30min，加入60uL20％甲醇水溶液，充分混合；
S600，对游离睾酮进行高效液相色谱串联质谱检测，采集信号，计算浓度：
对所述目标组分进行高效液相色谱串联质谱检测，采集质谱信号；分析质谱信号，建立已知浓度分析物与内标物响应值之间的函数关系；根据所述函数关系，计算出目标组分在所述待检测的生物样品中的浓度。
优选的，所述S200中PBS为磷酸盐缓冲溶液，pH为7.2-7.4，浓度为0.01M。
优选的，所述S300中超滤分离的操作步骤为：
孵育完成后，在10000rpm转速下，离心30min，然后将超滤液转移至2mL的离心管中，将超滤芯倒扣在废液管中，在4000rpm转速下，离心10min，将滤芯内剩余的样本甩出，再向清除样本的超滤管芯中加入500uL的50％甲醇水溶液，10000rpm转速下，离心15min；将得到的超滤液全部混合，待用。
优选的，所述S400中内标溶液是由激素同位素内标物配置成的一定浓度的储备液稀释所得。
优选的，所述S500中萃取溶剂为正己烷和乙酸乙酯的混合试剂，所述萃取溶剂中正己烷和乙酸乙酯的体积比为9:1。
优选的，所述S600中高效液相色谱分离所用的流动相选自乙腈、水或甲醇中的一种或多种，并加入流动相添加剂；所述高效液相色谱串联质谱检测采集时间4.5min。
优选的，所述S100建立游离睾酮的标准曲线，具体步骤如下：
S110，配置不同浓度的游离睾酮标准溶液；
S120，向各浓度标准溶液中加入PBS溶液；
S130，向各浓度标准溶液中加入50％甲醇水，充分混合；
S140，加入盐酸羟胺衍生；
S150，衍生后进行液液萃取，取上清氮气吹干后复融；
S160，对标准溶液进行高效液相色谱串联质谱检测，采集信号，拟合曲线。
优选的，所述S110中标准溶液的游离睾酮浓度梯度如下：
1pg/mL，4pg/mL，12pg/mL，48pg/mL，96pg/mL，120pg/mL。
本发明至少具备以下有益效果：
(1)本发明提供的一种游离睾酮的高效液相色谱串联质谱检测方法，以超滤加衍生后液液萃取作为前处理，利用高效液相色谱串联质谱进行检测，单样本检测时间为4.5min，便于临床检测和应用，样本前处理方式简单易操作，采用超滤法，实现游离睾酮和蛋白结合型睾酮的完全分离，加上衍生和液液萃取的前处理可提升整体方法的灵敏度；
(2)本发明提供的一种游离睾酮的高效液相色谱串联质谱检测方法，采用类固醇激素检测的金标准方法：高效液相色谱串联质谱法，可大大提升检测的准确性、特异性、灵敏度和效率。
附图说明
图1为本发明中游离睾酮检测方法的流程图；
图2为本发明中样品在上机前的操作步骤示意图；
图3为本发明中高效液相色谱串联质谱检测谱图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供了一种游离睾酮的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：
S100，建立游离睾酮的标准曲线：
建立游离睾酮的标准曲线的具体步骤如下：
S110，配置不同浓度的游离睾酮标准溶液，游离睾酮浓度梯度如下：
1pg/mL，4pg/mL，12pg/mL，48pg/mL，96pg/mL，120pg/mL；
S120，向各浓度标准溶液中加入PBS溶液；
S130，向各浓度标准溶液中加入50％甲醇水，充分混合；
S140，加入盐酸羟胺衍生；
S150，衍生后进行液液萃取，取上清氮气吹干后复融；
S160，对标准溶液进行高效液相色谱串联质谱检测，采集信号，拟合曲线；
S200，在待测的生物样品中加入PBS，形成第一混合物：
在待测的生物样品中加入PBS，PBS为磷酸盐缓冲溶液，pH为7.2-7.4，浓度为0.01M，加入PBS后需震荡混匀2min，充分混合，形成第一混合物；
S300，对第一混合物进行超滤分离：
将第一混合物转移到超滤管，在37℃恒温孵育30min，孵育完成后，在10000rpm转速下，离心30min，然后将超滤液转移至2mL的离心管中，将超滤芯倒扣在废液管中，在4000rpm转速下，离心10min，将滤芯内剩余的样本甩出，再向清除样本的超滤管芯中加入500uL的50％甲醇水溶液，10000rpm转速下，离心15min；将得到的超滤液全部混合，待用；
S400，加入内标和盐酸羟胺进行衍生，形成第二混合物：
向待测样本中分别加入内标溶液，充分混合，然后加入20uL 15％的盐酸羟胺溶液，充分混合后，在70℃下衍生15min，形成第二混合物；
其中，内标溶液是由激素同位素内标物配置成的一定浓度的储备液稀释所得；
S500，对第二混合物进行液液萃取，取上清，氮气吹干后复融：
向待测样本加入1200uL的萃取溶剂，充分混合后，在12000rpm的转速下，离心10min，取1000uL上清液，50℃下氮吹30min，加入60uL20％甲醇水溶液，充分混合；
其中，萃取溶剂为正己烷和乙酸乙酯的混合试剂，萃取溶剂中正己烷和乙酸乙酯的体积比为9:1；
S600，对游离睾酮进行高效液相色谱串联质谱检测，采集信号，计算浓度：
将目标组分转移上机，进行高效液相色谱串联质谱检测，高效液相色谱进行分离洗脱，质谱进行信号采集，高效液相色谱分离所用的流动相选自乙腈、水或者甲醇中的一种或者多种，并加入流动相添加剂，高效液相色谱串联质谱检测采集时间4.5min；
分析质谱信号，建立已知浓度分析物与内标物响应值之间的函数关系；
根据所述函数关系，计算出目标组分在所述待检测的生物样品中的浓度。
本发明实施例提供了一种游离睾酮的高效液相色谱串联质谱检测方法，图1为本发明提供的游离睾酮检测方法的方法流程图，具体的方案如下：
仪器：AB SCIEX Triple QuadTM 4500高效液相色谱质谱联用仪；多管涡旋振荡器；离心机。
试剂：超纯水、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、甲酸、氟化铵、盐酸羟胺；所用试剂均为质谱级或色谱级别。
试剂制备：
100mM氟化铵溶液：
用电子分析天平准确称取0.185g氟化铵固体，加入到50mL水中，混匀。
流动相A(0.3mM氟化氨水溶液)：
用量筒量取500mL超纯水，倒入准备好的玻璃瓶里，移取1.5mL100mM的氟化铵溶液加入其中，超声15min后方可使用。
流动相B：
用量筒量取500mL甲醇，倒入准备好的玻璃瓶里，超声15min后方可使用。
衍生试剂：
15％盐酸羟胺水溶液：用电子分析天平称取1.5g盐酸羟胺固体，加入10mL水中，充分振荡混匀溶解。
PBS缓冲溶液：
将PBS磷酸盐粉剂(0.01M，PH 7.2-7.4)溶解于1L去离子水中，配制成0.01M的PBS缓冲液(此溶液于2-8℃温度下保存)。
萃取液：
用移液枪分别移取45mL的正己烷加5mL乙酸乙酯，混合均匀即可用。
复溶液：
用移液枪分别移取8mL甲醇加2mL超纯水，混合均匀即可使用。
实验前处理操作：
1、实验前准备：
准备相应数量的2mL塑料带盖离心管及0.5mL的超滤管，编号，备用。
2、标准品及质控品配制：
取15uL的标准品工作液、质控品工作液加入285uL的空白基质中(PBS溶液)，混合均匀待用。
3、样本预处理：
①取300uL标准品、质控品、血清样本，加入100uL PBS溶液调节pH，2500r/min，震荡2min；
②标准品和质控品分别加入500uL 50％的甲醇水，2500r/min，震荡2min，待用；
4、血清游离睾酮分离：
①超滤管心预清洗：用移液枪吸取超纯水水轻轻吹打清洗超滤管的内外壁后，在滤芯内加入500uL 50％的甲醇水，12000rpm离心20min，用废液收集管收集，将滤芯倒扣在废液收集管内，4000rpm离心5min，将滤芯内剩余的溶液甩出。
②将步骤3中得到的400uL血清样本转移到0.5mL的干净超滤管心中，用干净的收集管收集超滤后的溶液，在37℃恒温孵育30min,孵育完成后10000rpm离心30min(注标准品、质控品不需要孵育、超滤)；
③将步骤②中超滤液转移至2mL的离心管中，将超滤心倒扣在废液管中，，4000rpm离心10min，将滤芯内剩余的样本甩出；
④向清除样本的超滤管心中加入500uL的50％甲醇水溶液，10000rpm离心15min；
⑤将②和④中得到的超滤液全部混合待用；
5、衍生化：
①分别取3-②和4-⑤中的标准品、质控品、血清样本700uL加入5uL内标，2000r/min，震荡2min；
②加入20uL 15％盐酸羟胺衍生试剂，2000r/min，震荡2min；
③放置于70℃烘箱，衍生反应15min；
④衍生结束后，取出至于室温下10min，使其温度恢复至室温；(注:若衍生结束后发现管内有沉淀则为超滤时蛋白泄露，影响定量结果，应按步骤重新制备)
6、萃取：
向衍生化完成的标准品、质控品、样本中加入1200uL正己烷/乙酸乙酯混合溶剂(正己烷：乙酸乙酯9:1)，2500r/min，震荡10min，12000rpm离心10min；
7、氮吹：
取1000uL的上清液，50℃下氮吹约30min，至溶液全部被吹干；
9、复溶：
加入60uL 20％甲醇水溶液，2500r/min，震荡5min，震荡完成后用离心机瞬离。
10、转移上机：
将步骤③所得溶液转移至96孔V型微孔板，盖上铝箔封套，进行液相色谱串联质谱分析。
液相条件：流动相A相为0.3mM氟化氨水溶液；流动相B相为纯乙腈；流速：0.5mL/min；色谱柱：C18；柱温：45℃；进样量：20uL；梯度洗脱条件见表1。
表1梯度洗脱条件
质谱MRM参数见表2，源气参数见表3：
表2MRM参数
| ID | Q1 | Q3 | Dwell Time | DP | EP | CE | CXP |
| 游离睾酮离子对1 | 289.4 | 97.1 | 70 | 76 | 10 | 33 | 16 |
| 游离睾酮离子对2 | 289.4 | 109.00 | 70 | 81 | 10 | 41 | 6 |
| 游离睾酮内标 | 292.3 | 97.00 | 70 | 81 | 10 | 37 | 6 |
表3源气参数
| CUR | 35 |
| CAD | 9 |
| IS | 5500 |
| TEM | 600 |
| GS1 | 40 |
| GS2 | 60 |
以标准品浓度值为横坐标，以标准品化合物与内标的面积比为纵坐标绘制标准曲线，进行回归计算，得回归方程如下：
| 化合物名称 | 回归方程 | 相关系数 |
| 游离睾酮 | y＝0.00324x+0.00634 | r＝0.99585 |
表明游离睾酮在范围内线性关系良好，游离睾酮的实验结果见下表：
表4游离睾酮的线性关系考察结果
准确度实验：取空白基质中添加已知浓度的低、中、高标准品，前处理后检测，每个浓度至少检测5次；
结果：低浓度检测值和理论值的偏差在±20％以内，其余浓度的偏差在±15％以内，表明该方法准确度较高。结果详见下表：
表5游离睾酮准确度试验结果
基质效应：取5份患者样本基质、1份替代基质和纯溶剂(流动相)，前处理后加入相同的内标，比较两者的内标信号值。
结果：5种患者样本基质和替代基质的基质效应CV均小于15％，说明了本方法基质效应偏差较小。
表6游离睾酮基质效应试验结果
结论：由上表可知，5种患者样本基质和替代基质的基质效应CV均小于15％，说明了本方法基质效应偏差较小。
精密度：三个不同浓度的样本LQC(测量区间下限)，HQC(测量区间上限)，MQC((LQC+HQC)/2)，每个分6份，分3批检测。
结果要求：分析物的批内、批间精密度均满足。测量区间下限附近CV＜20％，其他浓度CV＜15％。结果详见下表7-9：
表7游离睾酮LQC精密度试验结果
表8游离睾酮MQC精密度试验结果
表9游离睾酮HQC精密度试验结果
实施例2
本实施例采集临床多囊卵巢综合征患者血清样本进行游离睾酮检测，采用如实施例1提供的检测方法，图2为本发明提供的样品在上机前的操作步骤示意图，图3为本发明提供的样本高效液相色谱串联质谱检测谱图；检测结果如表10所示，临床参考范围为＜10.9pg/mL，结果完全满足临床对血清样本中游离睾酮检测的需求。
表10多囊卵巢综合征患者血清游离睾酮检测
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种游离睾酮的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S100，建立游离睾酮的标准曲线；
S200，在待测的生物样品中加入PBS，形成第一混合物：
在待测的生物样品中加入PBS，振荡混匀2min，充分混合，形成第一混合物；
S300，对第一混合物进行超滤分离：
将第一混合物转移到超滤管，在37℃恒温孵育30min，孵育完成后，然后进行超滤分离；
S400，加入内标和盐酸羟胺进行衍生，形成第二混合物：
向待测样本中分别加入内标溶液，充分混合，然后加入20uL 15％的盐酸羟胺溶液，充分混合后，在70℃下衍生15min，形成第二混合物；
S500，对第二混合物进行液液萃取，取上清，氮气吹干后复融：
向待测样本加入1200uL的萃取溶剂，充分混合后，在12000rpm的转速下，离心10min，取1000uL上清液，50℃下氮吹30min，加入60uL
20％甲醇水溶液，充分混合；
S600，对游离睾酮进行高效液相色谱串联质谱检测，采集信号，计算浓度：
对所述目标组分进行高效液相色谱串联质谱检测，采集质谱信号；分析质谱信号，建立已知浓度分析物与内标物响应值之间的函数关系；根据所述函数关系，计算出目标组分在所述待检测的生物样品中的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种游离睾酮的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述S200中PBS为磷酸盐缓冲溶液，pH为7.2-7.4，浓度为0.01M。
3.根据权利要求1所述的一种游离睾酮的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于：所述S300中超滤分离的操作步骤为：
孵育完成后，在10000rpm转速下，离心30min，然后将超滤液转移至2mL的离心管中，将超滤芯倒扣在废液管中，在4000rpm转速下，离心10min，将滤芯内剩余的样本甩出，再向清除样本的超滤管芯中加入500uL的50％甲醇水溶液，10000rpm转速下，离心15min；将得到的超滤液全部混合，待用。
4.根据权利要求1所述的一种游离睾酮的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于：所述S400中内标溶液是由激素同位素内标物配置成的一定浓度的储备液稀释所得。
5.根据权利要求1所述的一种游离睾酮的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述S500中萃取溶剂为正己烷和乙酸乙酯的混合试剂，所述萃取溶剂中正己烷和乙酸乙酯的体积比为9:1。
6.根据权利要求1所述的一种游离睾酮的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述S600中高效液相色谱分离所用的流动相选自乙腈、水或甲醇中的一种或多种，并加入流动相添加剂；所述高效液相色谱串联质谱检测采集时间4.5min。
7.根据权利要求1所述的一种游离睾酮的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述S100建立游离睾酮的标准曲线，具体步骤如下：
S110，配置不同浓度的游离睾酮标准溶液；
S120，向各浓度标准溶液中加入PBS溶液；
S130，向各浓度标准溶液中加入50％甲醇水，充分混合；
S140，加入盐酸羟胺衍生；
S150，衍生后进行液液萃取，取上清氮气吹干后复融；
S160，对标准溶液进行高效液相色谱串联质谱检测，采集信号，拟合曲线。
8.根据权利要求1所述的一种游离睾酮的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述S110中标准溶液的游离睾酮浓度梯度如下：
1pg/mL，4pg/mL，12pg/mL，48pg/mL，96pg/mL，120pg/mL。
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| CN202211681997.2A CN116046937A (zh) | 2022-12-23 | 2022-12-23 | 一种游离睾酮的高效液相色谱串联质谱检测方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117147740A (zh) * | 2023-10-31 | 2023-12-01 | 合肥歆智医疗器械有限公司 | 测定血中游离孕激素的超滤-质谱法及试剂盒 |
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2022
- 2022-12-23 CN CN202211681997.2A patent/CN116046937A/zh active Pending
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