CN110927386B - C-反应蛋白胶体金检测试剂卡及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医学检测领域，具体涉及C‑反应蛋白胶体金检测试剂卡及其制备方法和应用。本发明的胶体金检测试剂卡具有成本低廉、检测样品无需处理、检测时间短、准确率高等特点，可以实现免除常规抽血取样、无痛检测的目的。

Description

C-反应蛋白胶体金检测试剂卡及其制备方法
技术领域
本发明属于医学检测领域，具体涉及C-反应蛋白胶体金检测试剂卡及其制备方法。
背景技术
目前，利用核磁共振光谱、气相色谱、质谱和液相色谱分析等技术可在人类尿液中检测到3000多种化学物质或“代谢产物”，因此，尿液可用于无创诊断，从而提示人体的健康情况。例如，当尿液中检出蛋白时，说明身体中蛋白增多，蛋白会跨过肾脏进入尿液中。因此通过分析尿液中的特定物质，判断身体是否处于健康状态，甚至可对疫病进行初步诊断。
一方面，胶体金免疫层析法具有检测成本低、检测速度快的特点，但是相对于化学发光法和荧光放射检测法等检测平台，胶体金免疫层析法的灵敏度较低，同时由于尿液中蛋白(多由单体和聚合体蛋白组成)含量也较低，因此，不易检出。另一方面，在提高胶体金免疫层析法对蛋白的检测灵敏度后，其系统稳定性和假阳性问题会随之产生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种C-反应蛋白胶体金检测试剂卡。
本发明的再一目的在于提供上述胶体金检测试剂卡的制备方法。
根据本发明具体实施方式的C-反应蛋白胶体金检测试剂卡，其由包括以下步骤的方法制备得到：
(1)纯化C反应蛋白单克隆抗体；
(2)将纯化的C单克隆抗体、兔抗鼠IgG分别加入到划膜缓冲液中，混匀，得到浓度为按350ul/mL的C抗体划膜缓冲体系、浓度为500ul/mL的兔抗鼠IgG划膜缓冲体系，并分别包被到硝酸纤维素膜的检测线和质控线上，其中，划膜缓冲液为浓度0.05M、pH7.0的磷酸缓冲液，所述划膜缓冲液中还包含95％乙醇溶液和叠氮钠，磷酸缓冲液、95％乙醇溶液、叠氮钠的体积比为94.9：5：0.1；
(3)将纯化的C反应蛋白单克隆抗体加入到标记缓冲液中，混匀后，加入牛血清白蛋白，混匀，静置，得到沉淀，即为金标抗体；
(4)将步骤(3)所得金标抗体用金悬浮液进行复溶后，负载于基质上，干燥，得到胶体金垫；
(5)将步骤(4)得到的胶体金垫与步骤(2)包被后的硝酸纤维素膜进行组装，得到C-反应蛋白胶体金检测试剂卡。
根据本发明具体实施方式的C-反应蛋白胶体金检测试剂卡，步骤(4)中，所述金悬浮液为浓度0.02M、pH 8.5的Tris-NaCl缓冲液，所述金悬浮液中还包含5％牛血清白蛋白、5％蔗糖、2％明胶和0.1％叠氮钠。
根据本发明具体实施方式的C-反应蛋白胶体金检测试剂卡，步骤(4)中，量取的金悬浮液与胶体金溶液体积相等，其中，胶体金溶液中金颗粒为40nm。
根据本发明具体实施方式的C-反应蛋白胶体金检测试剂卡，步骤(3)中，用0.2M碳酸钾溶液将40nm胶体金溶液调整为pH 8.0，得到所述标记缓冲液。
根据本发明具体实施方式的C-反应蛋白胶体金检测试剂卡，步骤(1)中，利用金黄色葡萄球菌蛋白A亲和层析纯化法纯化所述C反应蛋白。
根据本发明具体实施方式的C-反应蛋白胶体金检测试剂卡的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)纯化C反应蛋白单克隆抗体；
(2)将纯化的C单克隆抗体、兔抗鼠IgG分别加入到划膜缓冲液中，混匀，得到浓度为按350ul/mL的C抗体划膜缓冲体系、浓度为500ul/mL的兔抗鼠IgG划膜缓冲体系，并分别包被到硝酸纤维素膜的检测线和质控线上，其中，划膜缓冲液为浓度0.05M、pH7.0的磷酸缓冲液，所述划膜缓冲液中还包含95％乙醇溶液和叠氮钠，磷酸缓冲液、95％乙醇溶液、叠氮钠的体积比为94.9：5：0.1；
(3)将纯化的C反应蛋白单克隆抗体加入到标记缓冲液中，混匀后，加入牛血清白蛋白，混匀，静置，得到沉淀，即为金标抗体；
(4)将步骤(3)所得金标抗体用金悬浮液进行复溶后，负载于基质上，干燥，得到胶体金垫；
(5)将步骤(4)得到的胶体金垫与步骤(2)包被后的硝酸纤维素膜进行组装，得到C-反应蛋白胶体金检测试剂卡。
根据本发明具体实施方式的C-反应蛋白胶体金检测试剂卡的制备方法，其特征在在于，步骤(4)中，所述金悬浮液为浓度0.02M、pH 8.5的Tris-NaCl缓冲液，所述金悬浮液中还包含5％牛血清白蛋白、5％蔗糖、2％明胶和0.1％叠氮钠。
根据本发明具体实施方式的C-反应蛋白胶体金检测试剂卡的制备方法，步骤(4)中，量取的金悬浮液与胶体金溶液体积相等，其中，胶体金溶液中金颗粒为40nm。
根据本发明具体实施方式的C-反应蛋白胶体金检测试剂卡的制备方法，步骤(3)中，用0.2M碳酸钾溶液将40nm胶体金溶液调整为pH 8.0，得到所述标记缓冲液。
根据本发明具体实施方式的C-反应蛋白胶体金检测试剂卡的制备方法，步骤(1)中，利用金黄色葡萄球菌蛋白A亲和层析纯化法纯化所述C反应蛋白。
本发明胶体金检测试剂卡的组装过程，主要包括以下步骤：将固定有抗体的金标垫盖在NC膜的上方，其前沿搭在NC膜的底部1mm-2mm处；玻璃纤维膜大小为4mm×15mm，盖在金标试纸条的上方1mm-1.5mm处，其前沿搭在金标垫的下部；吸收垫位于试纸条的最上部，其下部盖在NC膜的上方；在上层的塑料板有两个的孔，分别为加样孔和结果观察孔。
本发明的胶体金检测试剂卡可对感染性疾病、抗生素疗效，及心脑血管疾病进行预测评估，特别有助于在基层医院及诊所的广泛推广，并有望进入家庭。
根据本发明的技术方案，提高了划膜时的投料量并降低金悬浮液的复溶比例，进而提高了系统的检测灵敏度；在缓冲体系中加入的乙醇可以提高原料与NC膜的结合率，而且可以有效减少疏水斑及断点的产生。在金悬浮液中加入了明胶，可以有效减少复溶时的溶解难度，提高金液与载体的结合率，从而提升了系统的灵敏度，而且明胶的加入也延长了试纸的观测时间。
根据本发明的技术方案，添加助跑剂不但能够解决假阳性问题，而且解决了尿液释放不完全以及拖带的问题，同时，助跑剂不削弱系统灵敏度；使用Proclin-300作为辅助保存剂，可以有效解决系统稳定性差问题。严格管控保存条件，于4℃长期保存1个月，对检测效果没有影响。
附图说明
图1显示本发明检测试剂卡结构示意图，其中，1-PVC衬板，2-样品垫，3-胶体金垫，4-检测线T，5-质控线C，6-NC硝酸纤维素膜，7-吸水纸；
图2显示本发明的检测试剂卡与现有的检测试剂卡的对比；
图3显示灵敏度检测结果；
图4显示划膜使用浓度对检测结果的影响情况；
图5显示对检测结果的影响情况；
图6显示共沉淀剂对检测结果的影响情况；
图7显示金悬浮液复溶比例对检测结果的影响情况；
图8显示助跑液对检测结果的影响情况；
图9显示尿液与助跑剂的添加比例对检测结果的影响情况；
图10显示本发明的检测试剂卡的保存条件的考察结果；
图11显示本发明的检测试剂卡的长期保存稳定性情况。
具体实施方式
实施例1金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A)亲和层析纯化CRP单克隆抗体
试剂准备：
平衡/结合缓冲液：0.01M pH 8.3Tris-Nacl(0.2M NaCl)；
解离缓冲液：0.1M pH 4.0柠檬酸；
再生缓冲液：0.1M pH 2.7甘氨酸；
透析缓冲液：0.02M pH 7.4PBS；
pH中和液：2M Tris。
设备准备：Protein A柱、低温高速离心机、天平、蠕动泵。
1.1操作步骤：
①样品准备：冷冻的腹水在4℃融化，用浸湿滤纸过滤去除油脂，然后经0.45um滤膜过滤收集上清；
②柱准备：填装适量ProteinA填料，用纯水淋洗5-10倍柱体积，淋洗去除乙醇；
③平衡：ProteinA柱用平衡缓冲液平衡5倍柱体积；
④上样：腹水用两倍体积的结合缓冲液稀释作为样品上样，使用蠕动泵在恒温条件下缓慢上样；
⑤平衡：上样完成后，再用平衡缓冲液淋洗5-10倍柱体积，平衡至无蛋白流出；
⑥解离：平衡完成后，使用0.1M pH 4.0柠檬酸进行解离，使用蛋白紫外检测仪；
⑦再生：解离完成后，用0.1M pH 2.7甘氨酸缓冲液进行再生约2倍柱体积；
⑧平衡：再生完成后用，平衡缓冲液平衡柱约5-10倍柱体积(pH试纸检测约pH8.3)；
⑨透析：合并含蛋白组分使用透析缓冲液0.02M pH 7.4PBS进行透析，透析比例1:50，换液3次，透析完成后添加0.09％NaN3保存蛋白；
ProteinA柱保存：ProteinA柱长期不使用则柱内填充20％乙醇，4-8℃保存。
实施例2
2.1制备划线NC膜
划膜缓冲液包括以下组分：0.05M磷酸缓冲液(pH7.0)、95％乙醇溶液和0.1％叠氮钠(Proclin-300)，其中，磷酸缓冲液、95％乙醇溶液、叠氮钠的体积比为94.9：5：0.1。
CRP单克隆抗体按350ul/mL加入到划膜缓冲液的离心管中，混匀，得到CRP划膜缓冲体系，并将其包被到被到预处理好的NC膜检测线上，划膜线段长度与出液量比值1uL/cm；
将兔抗鼠IgG按500ul/mL加入到划膜缓冲液的离心管中，混匀，得到兔抗鼠IgG划膜缓冲体系，并将其包被到预处理好的NC膜质控线上，划膜线段长度与出液量比值1uL/cm。
37℃包被2-4h，取出放到干燥间干燥，干燥时间不少于1h。
2.2制备胶体金垫
(1)标记缓冲液：pH为8.0的金标记原液
取0.01％氯金酸(HAuCl4)水溶液100mL，加热煮沸；根据需要迅速加入1％柠檬酸钠水溶液0.9ml，继续煮沸约5min，出现酒红色，制成金颗粒40nm的胶体金溶液。
标记缓冲液：用0.2M碳酸钾溶液将金标记原液pH调整到8.0，得到标记缓冲液。
(2)金悬浮液包括：0.02M Tris-Nacl、5％牛血清白蛋白、5％蔗糖、2％明胶、0.1％叠氮钠(Proclin-300)，pH为8.5。
将CRP单克隆抗体按2.5ul/mL加入到标记缓冲液中，吹打或用磁力搅拌器混匀，室温静置20min后，将100ul/ml的10％牛血清白蛋白(BSA)加入到投完CRP单克隆抗体的标记缓冲液中，混匀，室温静置15min，于10℃下12000r离心30min，去上清，得到沉淀，即为金标抗体。
将得到的沉淀用金悬浮液进行复溶，12000r/min、10℃、30min的条件进行多次离心，去除上清液，最后量取与胶体金溶液相等体积的金悬浮液，对所得沉淀进行复溶。按每条铺金载体500ul的量，干燥间干燥(不少于2h)，4℃干燥保存。
2.3制备助跑液
助跑液包括：pH7.4磷酸缓冲盐溶液(PBS)、2％吐温20(Tween-20)、4％海藻糖和10％甘油。
2.4组装检测试剂卡
将试剂卡竖直放置，以加样孔作为试纸条的下方。
最底部为PVC衬板1，将胶体金垫3盖在NC硝酸纤维素膜6的上方，使胶体金垫4的上部与NC硝酸纤维素膜6的底部重合，重合部分的宽度为1mm-2mm；样品垫2(玻璃纤维膜)盖在胶体金垫的上方，使样品垫2的上部与胶体金垫4的底部重合，重合部分的宽度为1mm-1.5mm；吸水纸7位于试纸条的最上部，吸水纸7的下部盖在NC硝酸纤维素膜6的上方，组装后结构如图1所示。
实施例3
未加入质控线
3.1本发明检测试剂卡与现有技术试剂卡的对比
实验过程：
①校准品基质：现有技术为0.02MPBS+1％Tween-20；本发明为助跑液；
②阳性对照：将CRP抗原按500ng/ml用样品稀释液(尿素1.8g、尿酸0.05g、NACL0.4g、KH2PO4 0.06g、Na2HPO4 0.02g、BSA 0.01g、葡萄糖0.01g，加水定容至100ml，pH为6.5)配制而成，得到阳性对照溶液；现有技术直接采用阳性对照液；本发明阳性对照为将阳性对照液与助跑液按9：1混合；
阴性对照：旧检测系统为样品稀释液；本发明为样品稀释液与助跑液按9：1混合；
阳性样本原液：发烧、感冒以及炎症感染病人中取样尿液；现有系统为阳性样本原液；本发明系统为阳性样本原液与助跑液按9：1混合；
③将上述各溶液分别按65uL体积加入到本发明试剂卡、现有技术试剂卡的样本垫上。
结果如图2所示，当加入500ng/ml浓度的阳性对照样本时，本发明表现为明显的强阳性反应，而现有技术CRP检测系统对阳性对照样本反应不明显，甚至出现释放不完全的现象。因此，本发明的检测试剂卡对阳性尿液样本检测灵敏度有明显提高。
3.2系统灵敏度检测结果
实验步骤：
①校准品基质：助跑液；
②标准品质控：将CRP抗原按2ug/mL加入到校准品基质中；
③灵敏度检测溶液：将标准品质控溶液逐渐稀释，得到1280ng/mL、640ng/mL、320ng/mL、160ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL的灵敏度检测溶液；
将上述各溶液以65ul分别加入本发明的试纸条样本垫上。
结果如3所示，本发明的灵敏度良好，将标准品质控溶液按梯度稀释之后，最低检测限可以达到10ng/ml。
3.3考察划膜原料浓度的提高对检测结果的影响
实验步骤：
①将划膜原料配制成需要的浓度(3.5mg/ml、3mg/ml、2.5mg/ml、2mg/ml、1.5mg/ml)，包被到NC膜上；
②校准品基质：助跑液；
③阳性对照：取CRP抗原，以样品稀释液配制为浓度为500ng/ml溶液；
加样时将阳性对照液与助跑液按9:1混合；
④质控溶液：将CRP按500ng/ml加入到校准品基质中作为质控品母液，之后按需求稀释为使用浓度(200ng、100ng、50ng、20ng)；
⑤将每个组分65uL分别加入到对应试纸条样本垫上。
结果如图4所示，当划膜浓度为3mg/mL时，检测灵敏度基本趋于稳定，当浓度再提高时，检测灵敏度变化不明显，因此，最佳划膜浓度为3mg/mL。
3.4考察加入明胶对系统的影响
实验步骤：
①校准品基质：助跑液；
②阴性样本：样品稀释液与助跑液按9：1混合；
③样品溶液：将浓度2mg/ml的CRP抗体用助跑液依次稀释，得到20ug/mL、2ug/mL、20ng/mL、2ng/mL样品溶液；
④将每个组分65ul分别加入到对应试纸条样本垫上。
结果如图5所示，明胶对胶体的分散相容有很好的辅助效果，加入明胶后可以有效的降低复溶难度，并且加入明胶后检测线上的断点明显减少，且检测灵敏度也有一定的提高。
3.5考察划膜缓冲液加入共沉淀剂对检测性能的影响
实验步骤：
①校准品基质：助跑液；
②阳性对照：取CRP抗原，以样品稀释液配制为浓度为500ng/ml溶液；
加样时按阳性对照液与助跑液按9：1混合；
③阴性对照：样品稀释液与助跑液按9：1混合；
④质控：将CRP按2mg/ml加入到校准品基质中作为质控品母液，之后按需求稀释为使用浓度(2ug/ml、200ng/ml、20ng/ml)；
⑤将每个组分65ul分别加入到对应试纸条样本垫上。
结果如6所示，缓冲液中加入硫酸铵反而会抑制检测效果，当加入乙醇和甲醇的时候，检测效果有明显提升，而且醇类物质的加入，有利于减少疏水斑。由于甲醇较乙醇毒性高，且两者检测效果基本一致，故选择乙醇作为组分添加剂使用。
3.6考察复溶比例对实验结果的影响
实验步骤：
①校准品基质：助跑液
②阴性对照：样品稀释液与助跑液按9：1混合；
③质控：将CRP按2mg/ml加入到校准品基质中作为质控品母液，之后按需求稀释为使用浓度(20ng/ml、10ng/ml、2ng/ml)；
④将每个组分65ul分别加入到对应试纸条样本垫上。
结果如图7所示，显示复溶比例不断缩小，低值质控的增色效果较为明显，且没有假阳性检测结果出现，复溶比例为1：1时，检测效果最好。
3.7考察助跑液对检测结果的影响
实验步骤：
①校准品基质：助跑液；
②校准品基质：不加助跑液(0.02M PH7.4磷酸盐缓冲液+1％Tween-20)；
③阴性对照：样品稀释液与助跑液按9：1混合；
④阳性对照：将CRP按500ng/ml用样品稀释液配制，得到阳性对照液，加样时按阳性对照液9:助跑液1混合后使用；
⑤将每个组分65ul分别加入到对应试纸条样本垫上。
结果如8所示，助跑液的加入不但解决了金释放不完全、聚集在样品垫前的问题，还解决了背景不干净、拖带导致出现假阳性检测效果的问题。
3.8考察尿液与助跑剂的添加比例对病人样本结果的影响
实验步骤：
①发烧、感冒以及炎症感染病人尿液两例，记为样本原液1#、2#；
②助跑液与两例样本分别以1:9、9:1的比例配制；
③将每个组分65ul分别加入到对应试纸条样本垫上。
结果如9所示，当样本与助跑液稀释比例为9:1时，不会出现漏检结果，且不会有金标记物在样品垫前残留显现，检测效果最佳。
3.9检测试纸条保存条件
实验步骤：
①校准品基质：助跑液；
②阴性对照：样品稀释液与助跑液按9：1混合；
③质控：将质控按2mg/ml加入到校准品基质中作为质控品母液，之后按需求稀释为使用浓度；
④将每个组分65ul分别加入到对应试纸条样本垫上
⑤将试纸条避光，分别放在室温、4℃、37℃下保存7天后检测。
结果见图10所示，4℃稳定性最好。
3.10检测试纸卡长期4℃保存稳定性
实验步骤：
①校准品基质：助跑液与随机阴性样本按1：9比例配制；更改为助跑液
②阴性对照：混合阴性样本按4倍稀释比例加入到校准品基质中；样品稀释液；
加样时按阴性对照液9:助跑液1混合后使用
③质控：将质控按2mg/ml加入到校准品基质中作为质控品母液，之后按需求稀释为使用浓度(2ug/ml、200ng/ml、20ng/ml、2ng/ml)；
④将每个组分65ul分别加入到对应试纸条样本垫上。
⑤将试纸条避光，分别放在4℃保存。
结果如图11所示，本发明试纸卡在4℃条件下保存效果良好，在划膜缓冲液以及金悬浮缓冲液中加入0.1％Proclin-300对蛋白稳定性有很好的帮助。

Claims (6)

1.C-反应蛋白胶体金检测试剂卡，其特征在于，所述C-反应蛋白胶体金检测试剂卡由包括以下步骤的方法制备得到：
（1）纯化C反应蛋白单克隆抗体；
（2）将纯化的C反应蛋白单克隆抗体、兔抗鼠IgG分别加入到划膜缓冲液中，混匀，得到浓度为350ul/mL的C反应蛋白单克隆抗体划膜缓冲体系、浓度为500ul/mL的兔抗鼠IgG划膜缓冲体系，将所述C反应蛋白单克隆抗体划膜缓冲体系、兔抗鼠IgG划膜缓冲体系分别包被到硝酸纤维素膜的检测线和质控线上，其中，划膜缓冲液为浓度0.05 M、pH7.0的磷酸缓冲液，所述划膜缓冲液中还包含95%乙醇溶液和叠氮钠，磷酸缓冲液、95%乙醇溶液、叠氮钠的体积比为94.9：5：0.1；
（3）将纯化的C反应蛋白单克隆抗体加入到标记缓冲液中，混匀后，加入牛血清白蛋白，混匀，静置，得到沉淀，即为金标抗体；
（4）将步骤（3）所得金标抗体以金悬浮液进行复溶后，负载于基质上，干燥，得到胶体金垫，其中，量取的金悬浮液的体积与胶体金溶液的体积相等，胶体金溶液中金颗粒为40 nm，所述金悬浮液为浓度0.02 M、pH 8.5的Tris-NaCl缓冲液，所述金悬浮液中还包含5%牛血清白蛋白、5%蔗糖、2% 明胶和0.1%叠氮钠；
（5）制备助跑液，所述助跑液用于稀释待检测样本，所述待检测样本与所述助跑液按9:1混合，所述助跑液包括：pH7.4 磷酸缓冲盐溶液、2% 吐温20、4%海藻糖和10% 甘油；
（6）将步骤（4）得到的胶体金垫与步骤（2）包被后的硝酸纤维素膜进行组装，得到C-反应蛋白胶体金检测试剂卡。
2.根据权利要求1所述的C-反应蛋白胶体金检测试剂卡，其特征在于，步骤（3）中，用0.2 M碳酸钾溶液将40 nm胶体金溶液调整为pH 8.0，得到所述标记缓冲液。
3.根据权利要求1所述的C-反应蛋白胶体金检测试剂卡，其特征在于，步骤（1）中，利用金黄色葡萄球菌蛋白A亲和层析纯化法纯化所述C反应蛋白。
4.C-反应蛋白胶体金检测试剂卡的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）纯化C反应蛋白单克隆抗体；
（2）将纯化的C反应蛋白单克隆抗体、兔抗鼠IgG分别加入到划膜缓冲液中，混匀，得到浓度为350ul/mL的C反应蛋白单克隆抗体划膜缓冲体系、浓度为500ul/mL的兔抗鼠IgG划膜缓冲体系，将所述C反应蛋白单克隆抗体划膜缓冲体系、兔抗鼠IgG划膜缓冲体系分别包被到硝酸纤维素膜的检测线和质控线上，其中，划膜缓冲液为浓度0.05 M、pH7.0的磷酸缓冲液，所述划膜缓冲液中还包含95%乙醇溶液和叠氮钠，磷酸缓冲液、95%乙醇溶液、叠氮钠的体积比为94.9：5：0.1；
（3）将纯化的C反应蛋白单克隆抗体加入到标记缓冲液中，混匀后，加入牛血清白蛋白，混匀，静置，得到沉淀，即为金标抗体；
（4）将步骤（3）所得金标抗体以金悬浮液进行复溶后，负载于基质上，干燥，得到胶体金垫，其中，量取的金悬浮液的体积与胶体金溶液的体积相等，胶体金溶液中金颗粒为40 nm，所述金悬浮液为浓度0.02 M、pH 8.5的Tris-NaCl缓冲液，所述金悬浮液中还包含5%牛血清白蛋白、5%蔗糖、2% 明胶和0.1%叠氮钠；
（5）制备助跑液，所述助跑液用于稀释待检测样本，所述待检测样本与所述助跑液按9:1混合，所述助跑液包括：pH7.4 磷酸缓冲盐溶液、2% 吐温20、4%海藻糖和10% 甘油；
（6）将步骤（4）得到的胶体金垫与步骤（2）包被后的硝酸纤维素膜进行组装，得到C-反应蛋白胶体金检测试剂卡。
5.根据权利要求4所述的C-反应蛋白胶体金检测试剂卡的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，用0.2 M碳酸钾溶液40 nm胶体金溶液调整为pH 8.0，得到所述标记缓冲液。
6.根据权利要求4所述的C-反应蛋白胶体金检测试剂卡的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，利用金黄色葡萄球菌蛋白A亲和层析纯化法纯化所述C反应蛋白。
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