JPH01280253A - 免疫学的多層分析素子及び分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、流体試料中の特定成分を分析するだめの分析
素子に係り、特に生物学的流体試料中の特定成分を、こ
れと特異的に結合しうる物質と標識体との均一系競合反
応により測定する分析方法及び分析素子に関する。

〔従来の技術〕

生物学的流体試料中に含まれる極＠量含有される物質を
検出する方法として、各種分析法の開発がなされてきた
。その分析法は、主として免疫反応をその原理とするも
のである。上記原理を用いる測定法として、種々のもの
が開発されてきたが、最も精度の高いものとして、免疫
測定法が知られている。

免疫測定法は、１９５８年、ベルソン（Ｂ　ｅｒｓｏｎ
）とイアロウ（Ｙａｌｌｏｖ）が、放射性ヨードで標識
した、ウシインシュリンと糖尿病患者血清中の抗インシ
ュリン抗体を用いて、血清中のインシュリンを測定する
ことに成功して以来、放射免疫測定法が広く用いられて
いる。

これ以後標識物質として、放射性同位元素以外のものが
種々開発されてきた。他の標識物質としては例えば、酵
素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテリオファ
ージ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、有機補欠
分子族、化学発光性反応体及び蛍光性分子等が挙げられ
る。

上記免疫測定法に関する技術上の重要な問題の１つとし
て、結合を起した物質（以下、Ｂと略記する）と起さな
かった物質（以下、Ｆと略記する）の分離（以下、Ｂ／
Ｆ分離と略記する）がある。

従来、免疫測定法におけるＢ／Ｆ分離の問題点を解決す
るために、種々の測定法が開発されてきた。

例えば、特開昭５１−１４６２９５号、同５５−２９９
７号、同５８−２１１６６２号、同５４−２０１３４号
、同５５−１０４８９６号、同５７−１５０６８１号等
に記載されている均一系免疫測定法がある。すなわち、
流体試料中の特定成分を、該特定成分と特異的に結合す
る物質と標識体を用いる均一系競合反応により測定する
方法であり、該標識体が特定成分と特異的に結合する物
質と結合すると、結合しなかった場合に対して検出可能
な変調応答を示すものであり、このような標識体を利用
することによりＢ／Ｆ分離の工程を省略することができ
る。

臨床検査の分野では、これら均一系免疫測定法による湿
式分析が行われている。しかし、比較的多量の水溶液中
で、試料溶液及び各試薬を混合して反応させるため、測
定結果の信頼性を得るためには、高度の熟練と経験が必
要であり、再現性も十分とはいえない。このような操作
上の問題点を解決すべく、また測定結果の精度、再現性
を高めるべく、各操作を自動化した測定装置も開発され
ているが、送液機構や試料の混入防止等の複雑な機構が
必要であり、非常に高価な装置となる。また、試薬の調
製や装置の調節、測定後の試薬、試料溶液の廃棄等に問
題があり、また試料溶液も多量に必要とし、採取、操作
上も熟練を要するものである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

一方、前記のような湿式分析に代り、簡単な操作で迅速
に測定できる乾式分析法が考案されている。例えば、特
開昭５７−１０３０５５号には、濾紙やガラス繊維布に
免疫反応試薬や発色試薬を順次含浸。

乾燥させた単層の分析要素が記載されている。これを用
いることにより安価な測定装置で迅速に、流体試料中の
特定成分を分析できるが、濾紙のような粗な表面からの
測定では多量の迷光やノイズの影響が避けられず、測定
精度及び再現性が十分とはいえない。

また、特開昭５８−１８１６７号には、均一系免疫測定
法を用いた多層分析素子が記載されている。この分析素
子では、多孔性媒体からなる反応層に特定成分と特異的
に結合する物質（例えば、抗体）や標識体を含有してい
る。一般にハプテンとよばれる低分子化合物は、それ自
身免疫原性をもたないため、アルブミン等のキャリア蛋
白質と共有結合させて、免疫原として用い、その抗体を
得ている。

そのため得られた抗体は、ハプテンそれ自身よりも寧ろ
、標識物質の結合した標識体により強い親和性を示すこ
とが常である。従って、流体試料中のハプテンを測定す
るためには、競合反応時に、標識体と抗体との反応より
も寧ろハプテンと抗体との反応を先に行わせる方が高感
度に測定することができる。しかしながら多孔性媒体か
らなる反応層に、抗体や標識体を含有させたのでは、標
識体と抗体との反応を遅延させるには不十分である。

さらに、特開昭５８−１８１６７号に記載された分析多
層素子では、試料溶液として２５μｌから２００μｌと
いう多量の溶液を必要としている。このような多量の試
料溶液を分析素子に滴下して測定するためには、その量
に応じて多量の免疫反応試薬を分析素子に含有させなけ
ばならず、分析素子が高価なものとならざるを得ない。

また、例えば試料溶液が血清や血漿である場合には多量
の採血が必要となり、採血時間、被採血者の対応事態等
に望ましくないものがある。

〔発明の目的〕

本発明は、前述の従来技術の欠点に省み本発明の目的は
、簡便な操作でしかも少量の試料溶液で、感度、精度お
よび再現性に優れ、流体試料中の特定成分を定量する多
層分析素子を提供することにある。

〔問題点を解決するだめの手段〕

流体試料中の特定成分を、該特定成分または該特定成分
の類縁体のいづれかと標識物質が結合した標識体と該特
定成分および該標識体の双方に特異的に結合しうる物質
を用いる均一系競合反応により分析する免疫学的分析素
子において、該分析素子が少なくとも、 ａ）　繊維質多孔性展開層、 ｂ）　該特定成分および該標識体の双方に特異的に結合
しうる物質を含有する非繊維質多孔性反応層及び Ｃ）　該特定成分および該標識体の双方に特異的に結合
しうる物質との結合により、該標識物質に起因する信号
が変調される標識体を含有する高分子物質からなる非多
孔性層を有する多層からなることを特徴とする免疫学的
多層分析素子及び該多層分析素子を用いて流体試料液を
５μαから２０μｌの範囲の量適用する免疫学的分析方
法によって達成される。

本発明の多層分析素子に用いる均一系競合反応による測
定法自体は、溶液系（湿式）では従来公知の技術であり
、例えば特開昭５５−２９９７号に記載されている測定
法が有利に利用できる。

本発明の多層分析素子において、非繊維質多孔性反応層
は、上記均一系競合反応を行わせる層であり、繊維質多
孔性展開層と分離して設けることにより均一系競合反応
を効率よく局在的に行わしめることができる。従って、
少量の試料溶液で、十分に反応でき、しかも高精度に測
定できることが可能となった。また、標識体を高分子物
質からなる非多孔性層に含有させることにより、標識体
と特定成分および標識体の双方に特異的に結合しうる物
質との反応を、任意に遅延させることが可能となり特定
成分を高感度に測定することができる。

本発明において、流体試料としては、あらゆる形態の溶
液、コロイド溶液が使用しうるが、好ましくは生物由来
の流体試料例えば、血液、血漿、血清、５クキを髄液、
唾液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる。

本発明により測定しうる流体試料中での特定成分とは、
その存在の有無又は、゛その流体試料中で１′７）量が
検出され、その特定成分に特異的に結合する物質が存在
しうる物質又は物質群である。すなわち、ポリペプチド
、蛋白質、複合蛋白質、多糖類、脂質、複合脂質、核酸
、ホルモン類、ビタミン類、薬剤、抗生物質、農薬等が
挙げられる。好ましくは、分子量６，０００以下の低分
子化合物である。

具体的には、下記の物質、または物質群を挙げることが
できるが、これらに限定されるものではない。

くホルモン及びホルモン様物質〉 卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体刺激ホルモン（ＬＨ
）、成長ホルモン（ＧＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳ
Ｈ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡｃＴＨ）、メラニン刺
激ホルモン（Ｍ　Ｓ　Ｈ）、バソプレッシン、オキシト
シン、インシュリン、グルカゴン、アンギオテンシンＩ
及び汀、プロラクチン、セクレチン、トーハミン、セロ
トニン、ソマトスタチン、サイロキシン（Ｔ４）、トリ
ヨードサイロニン（Ｔ、）、ガストリン、コルチゾール
、アルドステロン、カテコラミン、エストロゲン、プロ
ゲステロン、テストステロン、胎盤性ゴナドトロピン、
胎盤性ラクトーゲン、下垂体ホルモン放出因子（Ｔ　Ｒ
ＨｌＦＳＨ−ＲＨ％　ＣＲＨ，ＬＨ−ＲＨ等）等〈ビタ
ミン類〉 ヒオチン、チアミン、ビタミンＡ１　ビタミンＢ２、ビ
タミンＢ６、ビタミンＢ１□、ビタミンＣ１ビタミンＤ
１　ビタミンＥ１　ビタミンに１葉酸等。

〈各種の薬剤及び代謝産物〉 ペンゾイルエクゴニン、コカイン、コデイン、デ千スト
ロメトロファン、ヘロイン、リセルレグ酸、モルヒネ、
キニジン、キニーネ、アミカシン、ゲンタマイシン、カ
ナマイシ乙ネオマイシン、トブラマイシン、アクチノマ
イセチン、力ロマイシン、クロラムフェニコール、クロ
ロマイセチン、クロルテトラサイクリン、エリトロマイ
シン、オキシテトラサイクリン、ペニシリン、セファロ
スポリン、ポリミキシン８１テラマイシン、テトラサイ
クリン、ストレプトマイシン、ジフェニルヒダントイン
、エトスクシミド、フエノバルビタール、ブリミドン、
セコバルビタール、アセタミノフェン、アミトリブチリ
ン、カルバマゼピン、ジゴキシン、ジンピラミド、リド
カイン、メントレキセート、Ｎ−アセチルプロカイナミ
ド、フェニトイン、プロカイナミド、プログラ１０−ル
、テオフィリン、カナピノール、テトラヒドロカナピノ
ール、コリン抑制薬剤、抗ヒスタミン剤、アトロピン、
ブチロフェノン、カフェイン、クロロプロマシン、パル
ピッレート、アンフェタミン、カテコールアミン、エピ
ネフリン、グリセオフルビン、イミプラミン、Ｌ−ドー
パ、メペリジン、メプロバメート、メタトン、ナルセイ
ン、ノルトリブチリン、オキサゼパン、パバベリン、グ
ロスタグランジン、バルプロン酸等及びこれらの代謝産
物。

く農薬〉 ハロゲン化ビフェニル、燐酸エステル類、チオホスフェ
ート類、及びこれらの代謝産物。

尚、特定成分の類縁体とは、特定成分のエピトープをも
ち、かつ特定成分の一部を有している物質のことである
。

本発明に使用しうる流体試料中の特定成分と特異的に結
合する物質としては、測定対象番こより抗体、抗原、レ
クチン、プロティンＡなどが挙げられるが、該特定成分
と該結合物質の結合反応が抗原−抗体反応である場合が
特に好ましい。本発明で使用する抗体は、その由来を特
に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原を投与、
免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるい
は従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈殿法、硫酸ア
ンモニウム沈殿法、セファデックスゲルによるゲル濾過
法、イオン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳
動法等（右田俊介編「免疫化学」中肉書店ｐｐ７４〜８
８参照）で精製して用いることができる。

あるいは抗原で感作した哺乳動物等（例えばマウス）牌
臓細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ）とから雑腫細胞（ハ
イブリドーマ）を得てモノクローナル抗体を作成し、該
特定成分と特異的に結合しうる物質として使用すると特
異性が向上し、好ましい。

また、これらの抗体はＩ　ｇＧ　−１ｇＭ　ＸＩ　ｇＡ
各分画を用いることができ、あるいはこれらの抗体を酵
素処理してＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）、といっ
た活性抗体フラグメントにして使用してもよい。

更にこれらの抗体は単一で使用しても、複数の抗体を組
合せて使用してもよい。

これらの抗体を非繊維質多孔性反応層に含有させるには
、抗体の特定成分と特異的に結合しうる能力を保持した
まま含有させる必要があり、例えば測定すべき特異的反
応に関与しない哺乳動物の正常血清蛋白質、アルブミン
、ゼラチンおよびそれらの分解物等と混合後、凍結乾燥
して、含有させることができる。また後述の多孔性反応
層を形成する素材あるいは千畑等共著「アフイニティク
ロマトグラフイ」　（講談者サイエンティフイク。

１９７６年）記載の水不溶性担体およびラテックス等に
物理的あるいは化学的に結合させて含有させることがで
きる。

本発明に適用しうる標識物質としては、例えば、補欠分
子族、補酵素などが挙げられるが、好ましくはフラビン
アデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌ
レオチド及びその還元体、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド燐酸及びその還元体、アデノシン燐酸、フラ
ビンモノヌクレオチドである。特に好ましくは、フラビ
ンアデニンジヌクレオチド（以後ＦＡＤと略記する）で
ある。

特定成分または特定成分の類縁体と、上記標識物質が結
合した標識体は、Ｄ、Ｌ、１Ｊｏｒｒｉｓ　ｅｔ　ａ（
２，；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　
ｖｏＱ５３．　ｐｐ６５８−６６５　（１９８１）、Ｔ
、Ｊ、　Ｒｉｃｈａｒｄ　ａｔ　ａＱ、：　Ｃ１１ｎｉ
ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

ｖｏＱ、２７．ｐｐ１４９９−１５０４　（１９８１）
および特開昭５５−２９９６号、同５８−４６０７２号
等に記載された方法を用いて作成することができる。

本発明に適用しうる均一系免疫測定法の標識物質に起因
する信号を検出するために、補欠分子族や補酵素を除去
したアポ酵素をか必要である。アポ酵素としては、特開
昭５５−２９９７号、同５７−１０３０５５号等に記載
されたものが使用でき、例えばホロ酵素の形で記載する
と、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンレダクター
ゼ、リポアミドデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−燐
酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、
アルコールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ等
を挙げることができる。好ましくは、グルコースオキシ
ダーゼである。アポグルコースオキシダーゼの使用に際
しては、酵素の安定化のために特開昭５７−１６６９８
０号に記載された抗グルコースオキシダーゼ抗体を使用
することが望ましい。

また、これら酵素の活性は、発色反応により比色定量す
ることが有利であり、例えばグルコースオキシダーゼを
例にして説明すると、グルコースヲ基質として、グルコ
ースオキシダーゼにより生成する過酸化水素をペルオキ
シダーゼを触媒として検出可能な色素を形成させて検出
する方法が広く用いられている。

本発明に使用する流体試料中の特定成分と特異的に結合
する物質や標識体の量は、特定成分の測定領域で識別で
きるように、流体試料中の特定成分と特異的に結合する
物質と特定成分の反応性や標識体の感度などを考慮して
適宜定める。

発色反応試薬としては、例えば特開昭５７−９４６５３
号、同５７−９４６５４号、同５７−９４６５５号、同
５７−９４６５６号に記載されたカップリング反応によ
る発色試薬、さらに下記に示される化合物を用いること
ができる。

０−ジアニシジン ０−およびＩ）−トルイジン等のアニリン誘導体０−フ
二二レンジアミン、Ｎ、Ｎ’−ジメチル−ｐ−７二二レ
ンジアミン、ベンジジン、３．３’、５．５’−テトラ
メチルベンジジン等の芳香族ジアミン類カテコール、グ
アヤコール、オルシノール、ピロガロール等の７工ノー
ル誘導体 サリチル酸、ピロカテキン酸、没食子酸のような芳香族
カルボン酸 ロイコマラカイトグリーン、ロイコフェノールフタレン
のようなロイコ染料 ４−アミノアンチピリンとフェノールまたはナフトール
誘導体との組合せ ３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾンとＮ、Ｎ
’−ジメチルアニリンとの組合せｐ−アニシジンと８−
ヒドロキシキノリンとの組合せ ２．２′−アジノジ（３−エチル−６−スルホベンゾチ
アゾリン） ２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）　−４
，５−ビス（ｐ−ジメトキシアミノフェニル）イミダゾ
ール 等。

これら発色反応試薬は、水あるいは有機溶媒に溶解し容
易に後述の検出層に含有させることができる。また必要
に応じて発色反応試薬および形成された色素の安定化に
特開昭５８−８７４６１号に記載されているようなカル
ボキシル基を有するポリマを含有させてもよい。

標識体に起因した信号は、吸光度法（比色法）、蛍光法
または、発光法で検出することができ、測定法としては
信号の経時的変化を測定するレート測定法または一定時
間後の信号を測定するエンドポイント測定法で測定する
ことができる。好ましくは吸光度法であり、吸光度法（
比色法）では、紫外光、可視光、近赤外光を利用するこ
とができ、例えば流体試料として血清および血漿を用い
る場合には、血清および血漿による吸光の影響を小さく
するために緑色光、赤色光または、近赤外光を利用する
のが好ましい。

本発明により多層分析素子は、光透過性支持体の上に積
層して製造することが好ましく、本発明で使用しうる支
持体としては、例えば酢酸セルロース、ポリエチレンテ
レフタレート、ポリカーボネートおよびポリビニル化合
物（例えばポリスチレン）のような高分子化合物あるい
はガラスのような透明無機化合物等が挙げられる。

本発明の繊維質多孔性展開層は、流体試料溶液を展開し
多孔性反応層に均一に供給するための層であり、その素
材としては、例えば　　バルブ、粉末濾紙、綿、麻、絹
、羊毛、キチン、キトサン、セルロースエステル、ビス
コースレーヨン、銅アンモニアレーヨン、ポリアミド（
６−ナイロン、６ローナイロン、６１Ｏ−ナイロンなど
）、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレートなど）
、ポリオレフィン（ホリプロピレン、ヒニロンなど）、
ガラス。

石綿などの繊維、例えば植物性、動物性、鉱物性或は合
成、半合成、再生の繊維を用いることができ、更にこれ
らを混合して用いても良い。また吸水性の洋紙、和紙、
濾紙、プラッシュポリマ、あるいは前記の繊維類などを
単独あるいは混合して製造した織布、不織布、合成紙な
どを用いることもできる。

本発明において、繊維質多孔性展開層および非繊維質多
孔性反応層の多孔性とは、塗布および／または、製膜後
に形成された、上記各層が、流体試料と自由に接触し得
る相互連絡空隙孔を有する多孔性構造を有していること
を意味し、繊維質多孔性展開層および非繊維質多孔性反
応層の相互連絡空隙孔としては、夫々の空隙孔の短径が
１〜３００μｍおよび１−１００μｍが好ましい。

また、高分子物質からなる非多孔性層の非多孔性とは、
塗布および／または製膜後に形成された層が、上記多孔
性層に比べて、相互連絡空隙孔が実質的に無視できるレ
ベルであり、多孔性構造を有さないことを意味する。

本発明の非繊維質多孔性反応層は、均一系競合反応を行
わせる層であり、特定成分および標識体の双方に特異的
に結合しうる物質や前記アポ酵素等を含有している。尚
ここで非繊維質とは繊維状のものではなく等方的形状の
ものをいい、この反応層は流体試料と自由に接触しうる
相互連絡空隙孔（短径１μｍ−１００μｍが好ましい）
を有する多孔性構造が存在していることが必要であり、
この条件を満たしていれば、その素材は特に限定されな
いが、好ましい例としてはサイズ１〜１００μｍの粒状
体から少なくとも１つの素材により構成される構造体が
挙げられる。該粒状体の材料としては、珪藻土、二酸化
チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セル
ロース、珪砂、ガラス、シリカゲル、架橋デキストラン
、架橋ポリアクリルアミド、アガロース、架橋アガロー
ス、各種合成樹脂（ポリスチレンなど）などの他、特開
昭５７−１０１７６０号および同５７−１０１７６１号
記載の反応基をもつ化合物からなる自己結合型粒子が挙
げられる。さらに、これらの粒状体の数種を混合して用
いることもできる。

このような繊維質多孔性展開層および粒状体からなる非
繊維質多孔性反応層を形成させるには、これら繊維およ
び粒状体を塗布および／または製膜することにより形成
させることができる。

自己結合性を有しない粒状体粒子は適当な接着剤を用い
て粒子同志が点接着する形で製膜することができ、例え
ば特開昭４９−５３８８８号、同５５−９０８５９号、
同５７−６７８６０号等の方法を適用することができる
。自己結合性を有する有機ポリマ粒子は特開昭５７−１
０１７６０号、同５７−１０１７６１号、同５８・７０
１６３号等に記載の方法により同様に製膜できる。繊維
又は繊維−粒子混合物については特開昭５７−１２５８
４７号、同５７−１９７４６６号に記載された繊維分散
液を塗布することにより多孔性層を形成できる。また特
開昭６０−１７３４７１号に記載されている方法のよう
にゼラチンやポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコ
ールのような親水性バインダを使用した繊維及び／また
は粒状体分散液を塗布して形成させることができる。水
溶性バインダは、広範に選択された量が適用できるが、
粒状体及び／または繊維の重量に対して０−１−２５ｗ
ｔ％、好ましくはｌ−０−２０ｗｔ％用いられる。

このような分散液を製造するためには、多くの方法を単
独または組合せて用いることが可能である。例えば有用
な方法の一つとして界面活性剤を液体キャリヤへ添加し
粒状体および／又は繊維の分散液中における分散および
安定化を促進することができる。

使用可能な代表的な界面活性剤の例としては、トライト
ン■Ｘ　−１００（・−ムアンド・・−ス社製８オクチ
ルフェノキシポリエトキシエタノール）、サー、７ケ、
７．、。。■（第１．−ア社製、７ユ２．７、ノキシポ
リグリシドール）等の非イオン性界面活性剤およびイオ
ン性界面活性剤がある。

上記界面活性剤は広範に選択された量を用いることが可
能であるが、粒状体および／又は繊維の重量に対して２
Ｑｖｔ％乃至０．００５ｖｔ％、好ましくは１５ｖｔ％
乃至Ｑ、ｌ１％用いることができる。更に別の方法とし
て該繊維及び粒子単位と液体キャリアの超音波処理、物
理的混合、および物理的攪拌処理、ｐＨ調整がある。こ
れらは前記の方法と組合せることにより、さらに有用で
ある。

また、本発明による展開層や反応層には、必要に応じて
免疫反応における非特異反応を排除する目的で測定すべ
き特異的反応に関与しない蛋白質を含有させることがで
きる。代表的な例としては、哺乳動物の正常血清蛋白質
、アルブミン、ゼラチンおよびそれらの分解物等が挙げ
られる。

本発明の標識体を含有する高分子物質からなる非多孔性
層の素材としては、成膜性を有する少なくとも１種の親
水性コロイドが用いられる。

親水性コロイドとしては、ゼラチン、フタル化ゼラチン
等のゼラチン誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニ
ルピロリドン、ポリビニルイミダゾール、ポリアクリル
アミド、ポリアクリル酸ナトリウム等の合成高分子、ヒ
ドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロー
スナトリウム塩等のセルロース誘導体等或はアルギン酸
ナトリウム等まで含まれる。そして好ましくはゼラチン
、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘導体が挙げられる。

これら親水性コロイドを塗布および／または製膜するこ
とにより、本発明に係る高分子物質からなる非多孔性層
を形成させることができる。標識体を含有させるには、
水、有機溶媒で溶解して容易に含有させることができる
。

本発明の分析素子の各層の膜厚は、必要に応じ任意に選
択することができるが、繊維質多孔性展開層の膜厚は、
好ましくは５０〜５００μｍ、更に好ましくは１００〜
３００μｍである。

非繊維質非多孔性反応層の膜厚は、好ましくは１０〜２
００μｍ、更に好ましくは３０〜１８０μｍである。

高分子物質からなる非多孔性層の膜厚は、好ましくは１
−１００μｍ１更に好ましくは、５〜５０μｍである。

さらに、本発明による多層分析素子では、高分子物質か
らなる非多孔性層が標識体に起因する信号を検出するた
めの検出層として設けられ、また前記発色試薬を含有さ
せた検出層を設けることが好ましい。

更に、標識体を含有する高分子物質からなる非多孔性層
と前記発色試薬を含有させた検出層とを同一層とし、発
色試薬を標識体を含有した非多孔性層に含有させること
ができる。

さらに本発明に係る検出層の高分子物質はその膜物性、
例えば膨潤度や熱による溶解性の改良のために一部を他
の水分散性高分子重合体、すなわち高分子ラテックスと
置換することができる。好ましい高分子ラテックスの例
としては、例えば特開昭５７−１１６２５８号、同５８
−９９７５２号記載のものが有用である。これらの高分
子ラテックスは、親水性コロイドバインダの最大７０％
を置換することが可能であるが、好ましくは約５０％以
下の置換である。

該検出層には他の添加剤、例えば緩衝剤、保恒剤、界面
活性剤、媒染剤等を目的に応じて添加することができる
。また、その膜厚は３〜５０μｍ１好ましくは５〜３０
μｍである。緩衝剤は、特異的結合反応、酵素反応、発
色反応等に適したｐＨするために含有される。用いるこ
とができる緩衝剤としては日本化学金偏「化学便覧基礎
編」（東京、丸首（株）１９６６）ｐｐ１３１２−１３
２０、Ｎ　、　Ｅ　、　Ｇｏｏｄ等；　バイオケミスト
リ（Ｂｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　ｖｏ（２５，ｐ４
６７（１９６６）、今村、斎藤；化学の領域、ｖｏｆｆ
３０（２）、ｐ７９（１９７６）、Ｗ、Ｊファーギュソ
ン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ）等、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　。

ｖｏＱ１０４．ｐ３００（１９８０）等の文献に記載さ
れテいるものをあげることができる。具体的な例として
は、くえん酸塩、硼酸塩、燐酸塩、炭酸塩、トリス、バ
ルビタール、グリシン、グツド緩衝剤等があげられる。

これらの緩衝剤は必要に応じて検出層以外の層に含有さ
せてもよい。

保恒剤は、基質発色試薬の保存安定化のために含有され
、酸化防止剤などがある。また層中に含有させる標識体
の活性保持のために、固定化酵素、アフィニティクロマ
トグラフィの吸着体、固定化抗体、及び蛋白質や酵素等
の保存に用いられる保恒剤を含有される。その物質とし
ては、日本生化学金偏「生化学実験講座ｌ、蛋白質の化
学ＩＪ（東京化学同人（株）　１９７６）ｐｐ６６〜６
７、実験と応用［アフィニティクロマトグラフィＪ　ｐ
ｐ１６〜１０４、特開昭６０−１４９９２７号等に記載
されているものがあげられる。

具体的な例としては、ゼラチン、ゼラチン分解物、アル
ブミン、シクロデキストリン類、非還元ａ［（シュクロ
ース、トレハロース）、ホリエチレングリコール、アミ
ノ酸、各種イオン、アジ化ソーダ等が挙げられる。

ゼラチンやゼラチン誘導体のような親水性コロイドから
なる高分子物質層には硬膜剤を添加することができ、硬
膜剤としては、写真業界で多用されている物質を用いる
ことができ、Ｔ、Ｈ，ジェイムス（Ｔ、Ｈ，Ｊａｍｅｓ
）編「ザ・セオリ・オブ・ザ・フォトグラフィックプロ
セスＪ　（Ｔｈｅ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅＰｈｏ
ｔｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｐｒｏｃｅｓｓ）（４ｔｈ）、ｐ
ｐ７７〜８７に記載されているものをあげることができ
る。具体的な例としては、アルデヒド類、活性オレフィ
ン類、活性エステル類等があげられる。

標識体を含有した高分子物質からなる非多孔性層に硬膜
剤を添加することにより、該標識体の多孔性反応層への
溶出拡散を任意にコントロールすることができ、標識体
と特異的に結合しうる物質との反応を遅延させるのに有
用である。

界面活性剤としては、前述のものがあげられる。

その他の層中に含有される試薬としては、溶解助剤、ブ
ロッカ試薬などがある。これらの添加剤は、必要に応じ
て適当量添加する。媒染剤は、酵素活性測定のだめの検
出物質を、検出層に集中的に集めたり、検出物質が色素
の場合、吸光度係数を高めたり、波長をシフトさせる物
質であり、検出物質と強い相互作用を示めす。カチオン
性ポリマ、アニオン性ポリマ及びこれらのポリマのラテ
ックスが用いられる。

本発明の多層分析素子は、さらに流体試料が血液（全血
）の場合に有用な血球分離層、必要に応じて設ける接着
層、保護層、タイミング層といった補助層を設けること
ができる。これらの層は、その機能に応じて設けられる
べき位置が容易に決定できる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例によって更に具体的に説明するが
、本発明がこれら実施例によって限定されるものではな
い。

ＦＡＤ標識テオフィリンおよびアポグルコースオキシダ
ーゼは、特開昭５８−４６０７２号および米国特許４．
２３８．５６５号に記載された方法に準じて作成した。

実施例１ ｌ−（１）　　モノクローナル抗テオフィリン抗体の作
成 表記抗体は特開昭５８−４６０７２号に準じて作成しｔ
こ　。

無水エタノール２５ＯｍＱ中に、６−クロル−１，３−
ジメチルウラシル５０ｇと６−アミノカプロン酸３７９
を加え、さらにトリエチルアミン２８９を加えて加熱還
流下２００時間反応せ、エタノールを留去後、水から再
結晶して（５−カルボキシペンチル）′イミノ基を導入
したウラシル誘導体を得た。この化合物３６ｇを水１０
０＋＋＋Ｑに加えて懸濁し、これに水５０ｍ１２に溶解
した亜硝酸ナトリウム１４ｇを加え、５０°Ｃで１時間
反応させ、冷却後濾取した。

この濾取物３２９をメタノール４００＋ＩＩＱに溶解し
、酸化白金を触媒として水素で還元した。触媒を濾別し
た後、さらに蟻酸メチルと反応させることによりホルム
アミド化したウラシル誘導体を得た。次に、この１８ｇ
を０−ジクロルベンゼンＩＱ、中に入れ、窒素雰囲気下
４時間加熱還流することにより、９−（５−カルボキシ
ペンチル）−１，３−ジメチルキサンチンを得た。特開
昭５８−４６０７２号記載の方法に準じて、この化合物
をウシ血清アルブミンに結合させ、免疫原として用いた
。

約６週齢のＢａ４ｂ／ｃマウス（雌）を上記免疫原で免
疫した。すなわち２００μｇの上記免疫原を完全フロイ
ンドアジュバントを用いてエマルジョンとし、マウスの
腹腔に注射した。２週間後、１５０Ｕｇの免疫原を不完
全７０インドアジユバントを用いてエマルジョンとしマ
ウス腹腔に注射した。さらに２週間後０．１５Ｍの食塩
水に溶解した１００μりの免疫原をマウスの静脈に注射
した。その３日後牌臓を取り牌細胞を採取した。この牌
細胞Ｃ４Ｘ　１０’個）とアザグアニン耐性マウス骨髄
腫細胞ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３（１，２Ｘ　１０’
個）とを混合し、５０％ポリエチレングリコール４００
０（メルク社製）を用いて細胞融合した。融合細胞を９
６ウエルプレートに撒き１５％ウシ胎児血清、ペニシリ
ン（５０単位／ｍ（１）とストレプトマイシン（５０μ
ｇ／ｍＱ）とを含むＨＡＴ培地（０，４μＭアミノプテ
リン、１６μＭチミジン、１００μＭヒポキサンチンを
含むＲＰＭＩ−１６４０培地）で培養した。２日おきに
培地の半分を新しいＨＡＴ培地と交換し、２週間後各ウ
ェルの培地上清をＥＩ２ｉｓａ法によりアッセイし、ポ
ジティブのものを限界希釈法により、クローニングを行
い、雑種細胞を得た。

次にこの細胞を、マウス腹腔内にて増殖させ、モノクロ
ーナル抗テオフィリン抗体を含むマウス腹水を得た。

このマウス腹水０．８ｍＱに、さらにウシ血清アルブミ
ン２００ｍｇを加えて、凍結乾燥し、多層分析素子に用
いた。

１−（２）　　アポグルコースオキシダーゼの調製凍結
乾燥したアポグルコースオキシダーゼ５０ｒｎｇに、グ
ルコースオキシダーゼをヤギに免疫して得うした抗グル
コースオキシダーゼ抗体５ｍＱおよびウシ血清アルブミ
ン２５０ｍｇを加え、凍結乾燥して、多層分析素子に用
いた。

１−（３）　　テオフィリン測定用分析素子の作成厚さ
１８０μｍの透明な下引き済ポリエチレンテレフタレー
トフィルムの上に、下記の組成の塗布液（１）を塗布、
乾燥させ検出層を形成させた。（乾燥後の膜厚は２２μ
ｍであった。） 塗布液（１） 脱イオン化ゼラチン　　　　　　４．０ｇトライトンＸ
−１００（ロームアレトノ１−ス社Ｍ）０．３ｙ １．７〜ジヒドロキシナフタレン（アルトリ・ソチ社製
）　　　　　　　　　　　　　　１６０ｍｇジメドン（
東京化成社製）　　　　　５０＋１１！９４−アミノア
ンチピリン塩酸塩（東京化成社製）２３０＋１１９ グルコース（東京化成社製）　　　　６００ｍｇペルオ
キシダーゼ（ベーリンガ社製） ５００Ｕ ■、２−ビス（ビニルスルホニル）エタン５ｍｇ 蒸留水　　　　　　　　　　　　　４０．０９次にこの
検出層の上に下記の組成の塗布液（２）を塗布乾燥させ
ＦＡＤ標識テオフィリンを含有するゼラチンバインダか
らなる非多孔性層を形成させた。（乾燥後の膜厚は５μ
ｍであった。）塗布液（２） 脱イオン化ゼラチン　　　　　　　３．０ｇトライトン
Ｘ−１０００，３ｇ ＦＡＤ標識チオ７　イ！Ｊ　７　（１００／ｎ／ｍ４水
溶液）８０μρ １．２−ヒス（ビニルスルホニル）エタン８ｍｇ 蒸留水　　　　　　　　　　　　２７．０９次に、この
層の上に前記１−（１）および１−（２）で調整したウ
シ血清アルブミンを含む抗テオフィリン抗体及びアポグ
ルコースオキシダーゼを均一に分散した下記の組成の塗
布液（３）を塗布、乾燥させ、非繊維質多孔性反応層を
形成させた（乾燥後の膜厚は１５０μｍであった）。

塗布液（３） トライトンＸ−１０００，４ｇ 抗テオフィリン抗体（凍結乾燥品） ００ｍｇ 抗グルコースオキシダーゼ抗体含有アポグルコースオキ
シダーゼ（凍結乾燥品）　　３８０ｍｇポリビニルピロ
リドン（和光紬薬社製）１．８９ アビセル（旭化成社製）　　　　　　　１１．０ｇｎ−
ブタノール　　　　　　　　　　　　　３４．０ｇさら
に、この多孔性反応層の上に下記の組成の塗布液（４）
を塗布、乾燥させ、繊維質多孔性展開層を形成させた。

（乾燥後の膜厚は２００μｍであっｔこ　。　　） 塗布液（４） トライトンＸ−１００１，８ｇ ポリビニルピロリドン　　　　　　　　１．８ｇ粉末濾
紙Ｄ（東洋濾紙社製）　　　　　１８．０ｇｎ−ブタノ
ール　　　　　　　　　　　　　６８．０９このように
して塗布した試料を、１．５ｃｍｘ　１．５ｃｍの大き
さに裁断して本発明による分析素子−１とした。

また、比較としてＦＡＤ標識テオフィリンを塗布液（２
）から除き、塗布液（３）に添加して、上記と同様に塗
布してＦＡＤ標識テオフィリンを非繊維質多孔性反応層
に含有させた比較用の分析素子−２を作成した。

１−（４）　　テオフィリンの測定 ５．３ｗｔ％ウシ血清アルブミンを含有する５０ｍＭ　
＜えん酸−燐酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ５，０）に
溶解した５〜２５μｇ／ｍＱ濃度のテオフィリン（アル
ドリッチ社製）　１０μａを前記１−（３）で作成した
分析素子−１および２に滴下し、３７°Ｃで密閉状態で
インキュベーションしながら３０秒ごとに１５分間支持
体側から５４６ｍｍの反射濃度を測定した。テオフィリ
ン濃度Ｏμｇ／ｍＱを１００として、１５分後の反射濃
度を表−１に示す。

表−１ 表−１に示すように標識体を高分子物質からなる非多孔
性層に含有させた本発明による多層分析素子は、ｌＯμ
αという少量の試料溶液で高感度にテオフィリン濃度を
識別することができることがわかった。

実施例２ ２−　（１）　　テオフィリン測定用分析素子の作成厚
さ１８０μｍの透明な下引き済ポリエチレンテレフタレ
ートフィルムの上に、下記の組成の塗布液（５）を塗布
、乾燥させ標識体および発色試薬を含有する非多孔性層
を形成させた。（乾燥後の膜厚は２５μｍであった。） 塗布液（５） 脱イオン化ゼラチン　　　　　　　　４．５ｇトライト
ンＸ−１００（ロームアンドハース社製）０．５ｇ グルコース（東京化成社製）　　　　　５４０＋ｎｇ３
．３’、　５．５’−テトラメチルベンジジン（同口化
学研究所製）　　　　　　　　９０ｍｇガントレッツＥ
Ｓ−２２５（ＧＡＦ社製）　　　　　１．６ｇペルオキ
シダーゼ（ベーリンガ社製） ０００Ｕ ＦＡＤ標識テオフィリン（１００μｇ／ｍＱ水溶液）１
２０μα １．５Ｍ＜えん酸−燐酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７
，０）　　　　　　　　　　　　　２．０９１．２−ビ
ス（ビニルスルホニル）エタン０ｍ９ 蒸留水　　　　　　　　　　　　　４６．０ｇさらに、
この層の上に１−（３）に記載した抗テオフィリン抗体
及びアポグルコースオキシダーゼを含有する非繊維質多
孔性反応層及び繊維質多孔性展開層を塗布、乾燥により
形成させた後、この塗布した試料を１．５ｃｍＸ　１．
５ｃ＋ｎ”の大きさに裁断して本発明による分析素子−
３とした。

２−（２）　　テオフィリンの測定 １−（４）と同様にしてテオフィリン溶液を調製し、２
−（１）で作成した多層分析多層素子−３に１０μａ滴
下し、３７°Ｃで密閉状態でインキュベーションしなが
ら３０秒ごとに１５分間支持体側から６５０ｎｍの反射
濃度を測定した。テオフィリン濃度０μｇ／ｍＱを１０
０として１５分後の反射濃度を表−２に示す。

表−２ 表−２に示すように、標識体を高分子物質からなる非多
孔性層に含有させた本発明による多層分析素子によって
高感度にテオフィリンを測定することができることがわ
かった。

実施例　３ ３−　（１）テオフィリン測定用分析素子の作成厚さ１
８０μｍの透明な下引き済ポリエチレンテレ７タートフ
イルムの上に、下記の組成の塗布液−（６）を塗布、乾
燥させ、標識体および発色試薬を含有する非多孔性層を
形成させた（乾燥後の膜厚は２０μｍであった）。

塗布液（６） 脱イオン化ゼラチン　　　　　　　　　４．０ｇトライ
トンＸ　−１０００，４ｇ グルコース　　　　　　　　　　　　　　４８０ｍｇ３
．３’　、５．５’−テトラメチルベンジジン　　８０
ｍｇガントレッツＥＳ−２２５（２５％アセトン溶液）
２．７ｇ ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　２６０００ＦＡＤ
標識テオフイリン（１００μｇ／ｍ（２水溶液）２５０
μｌ １．５Ｍ＜えん酸−燐酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ５
，０）　　　　４．０ｇ １１２−ヒス（ヒニルスルホニル）エタン　　２７Ｉｎ
ｇ蒸留水　　　　　　　　　　　　　　３０．０ｇ次に
この層の上に、実施例１−（１）および１−（２）で調
製したウシ血清アルブミンを含む抗テオフィリン抗体お
よびアポグルコースオキシターゼを、均一に分散した下
記の組成の塗布液（７）を塗布、乾燥させ、非繊維質多
孔性反応層を形成させた（乾燥後の膜厚は１００μｍで
あった）。

塗布液（７） トライトンＸ　−１０００，３５ｇ 抗テオフィリン抗体（凍結乾燥品）　　　２５０ｍｇ抗
グルコースオキシダーゼ抗体含有アポグルコースオキシ
ダーゼ（凍結乾燥品）　　　　２００ｍｇポリヒニルビ
ロリドン　　　　　　　　１．１ｇアビセル　　　　　
　　　　　　　　　９．０ｇブタノール　　　　　　　
　　　　　３２．０ｇさらに、この多孔性反応層の上に
、下記の組成の塗布液（８）を塗布、乾燥させ、繊維質
多孔性展開層を形成させた（乾燥後の膜厚は１８０μｍ
であっＩこ　）　　。

塗布液（８） トライトンＸ　−１００１，５ｇ ポリビニルピロリドン　　　　　　　　０．８ｇ粉粉末
紙Ｄ　　　　　　　　　　　　　１１．０ｇブタノール
　　　　　　　　　　　　　５４．０ｇこのようにしし
て塗布した試料を１．５ｃｍＸ　１．５ｃｍの大きさに
裁断して本発明により分析素子−４とした。

また比較として、ＦＡＤ標識テオフィリンを塗布液（６
）から除き、塗布液（８）に添加して上記と同様に塗布
して、ＦＡＤ標識テオフィリンを繊維質多孔性展開層に
含有させた比較用の分析素子−５を作成した。すなわち
、塗布液（８）にかえて、下記の組成の塗布液（９）を
用いて、比較用の分析素子−５を作成した。

塗布液（９） トライトンＸ　−１００１，５ｇ ポリビニルピロリドン　　　　　　　　０．８ｇＦＡＤ
ｇ識テオフィリン（１００μｇ／ｍＱジメチルホルムア
ミド溶液）１７０μｌ 粉末濾紙Ｄ　　　　　　　　　　　　　１１．０ｇブタ
ノール　　　　　　　　　　　　　　５４．０ｇ３−（
２）テオフィリンの測定 健常人から採取したヒト血清にテオフィリンを添加し、
０．　５．１５．２５μｇ／ｍ４濃度とした検体を用意
し、各ｌＯμαを前記３−　（１）で作成した分析素子
−４８よび５に滴下し、３７°Ｃで密閉状態でインキュ
ベーションしながら３０秒ごとに７分間、支持体側から
６５０ｎｍの反射濃度を測定した。この測定を各１０回
繰返して行い、７分後の反射濃度と３．５分後の反射濃
度との差を求め、レート測定とした。この結果を表−３
に示す。

表−３ 表−３に示すように、本発明による多層分析素子は、比
較の分析素子に比べて高感度にテオフィリン濃度を測定
することができ、同時に再現性が優れていることがわか
った。

〔発明の効果〕

本発明により、前述の従来技術の欠点が除去された、簡
便な操作でしかも少量の試料溶液で、感度、精度および
再現性に優れ、流体試料なかの特定成分を定量する多量
分析素子を提供することができるようになった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）流体試料中の特定成分を、該特定成分または該特
   定成分の類縁体のいづれかと標識物質が結合した標識体
   と該特定成分および該標識体の双方に特異的に結合しう
   る物質を用いる均一系競合反応により分析する免疫学的
   分析素子において、該分析素子が少なくとも、 ａ）繊維質多孔性展開層、 ｂ）該特定成分および該標識体の双方に特異的に結合し
   うる物質を含有する非繊維質多孔 性反応層及び ｃ）該特定成分および該標識体の双方に特異的に結合し
   うる物質との結合により、該標識 物質に起因する信号が変調される標識体を 含有する高分子物質からなる非多孔性層 を有する多層からなることを特徴とする免疫学的多層分
   析素子。
2. （２）流体試料中の特定成分の分析に、 ａ）繊維質多孔性展開層、 ｂ）該特定成分および該標識体の双方に特異的に結合し
   うる物質を含有する非繊維質多孔 性反応層及び ｃ）該特定成分および該標識体の双方に特異的に結合し
   うる物質との結合により、該標識 物質に起因する信号が変調される標識体を 含有する高分子物質からなる非多孔性層 を有する多層からなる免疫学的分析素子を用いて流体試
   料溶液を５μｌから２０μｌの範囲の量適用する免疫学
   的分析方法。