CN109374907A - 一种黏菌素胶体金检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黏菌素胶体金检测试剂盒，其主要由黏菌素胶体金检测试纸条、冻干的胶体金标记黏菌素特异性单克隆抗体微孔试剂、微孔板架、定量移液管、样本稀释液组成。其中检测试纸条由PVC背板、吸水垫、样品垫、喷涂有包被有检测抗原的检测线（T线）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（C线）的硝酸纤维素膜（NC膜）构成。试剂盒用于检测鸡蛋或牛奶中黏菌素残留，无需昂贵设备，操作简便，无需特殊培训，检测灵敏度高，非常适合基层实验室、现场检测等领域广泛应用。

Description

一种黏菌素胶体金检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于兽药残留快速检测技术领域，涉及一种黏菌素胶体金检测试剂盒及其应用。

背景技术

硫酸黏菌素是碱性多肽类抗生素，主要用于防治敏感菌的感染和促进畜禽生长。硫酸黏菌素可以与细胞膜脂蛋白游离磷酸盐结合，使得细胞膜表面张力减小、通透性增加，导致胞浆外流，细胞死亡。硫酸黏菌素对革兰氏阴性菌(尤其大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、变形杆菌和嗜血杆菌等)有强抑制作用，对革兰氏阳性菌(除金黄葡萄球菌和溶血性链球菌外)和真菌无作用。硫酸黏菌素口服难以吸收，毒性较低，不易造成药物残留，不易产生耐药性。

2016年7月26日，我国农业部发布第2428号公告：为保障动物产品质量安全和公共卫生安全，根据《兽药管理条例》规定，农业部组织开展了硫酸黏菌素安全性评价工作。根据评价结果，农业部决定自2017年4月30日起，硫酸黏菌素将不再允许作为促生长剂添加到饲料中使用。自此硫酸黏菌素的应用被严格限制。

2017年11月，农业部办公厅关于征求动物性食品中兽药最大残留限量标准意见的函中明确对黏菌素的残留量做出严格规定，其残留以黏菌素A和黏菌素B合计，牛奶残留限量为50μg/kg，鸡蛋为300μg/kg，畜禽组织为150~200μg/kg不等。大型养殖企业如中粮、伊利集团等对黏菌素的内部限量更为严格。

传统的检测黏菌素残留的方法有液相色谱法、液质联用法、酶联免疫法（ELISA）等，其中前两种方法为仪器方法，利用色谱技术对检测样本中的药物残留分离后以紫外分光法或质谱定量检测，其操作繁琐、样本制备要求高、检测成本高、仪器设备价格更是昂贵，基层企业难以承受；酶联免疫法作为基于抗原抗体免疫反应的快速检测方法，具有成本低廉、检测快速等特点，在企业和基层实验室中也有应用，但其本身也有一定缺点，如操作过程需要稳定的温度环境、孵育时间过长、操作精密度要求高等，一般人员不经过训练较难掌握，特别是针对像奶站、奶罐车、鸡蛋收购等场合，较难以胜任。基于以上现有技术的不足和缺陷，有必要开发新的检测方法，满足基层检测实际需求。

发明内容

为了克服现有技术的不足，解决基层单位现场检测黏菌素残留的棘手难题和迫切需求，本发明提供了一种具有高灵敏度和特异性的黏菌素胶体金检测试剂盒，其主要由P黏菌素胶体金检测试纸条、冻干的胶体金标记黏菌素特异性单克隆抗体微孔试剂、微孔板架、定量移液管、样本稀释液组成。本发明提供的检测试剂盒无需昂贵设备，操作简便，无需特殊培训，检测灵敏度高，非常适合基层实验室、现场检测等领域广泛应用。

本发明的另外一个目的是提供上述黏菌素胶体金检测试剂盒的制备方法。该制备方法简便、所需原料简单，易于制备、可以在较短时间内制备成功，产生较大经济效益。

本发明还提供了一种上述黏菌素胶体金检测试剂盒在检测牛奶、奶粉和鸡蛋中黏菌素残留的应用。利用该方法检测时，基层单位如乳品厂、奶站、养殖场等无需恒温箱和酶标仪，无需专门的场地，只要有采集好的样本即可完成检测。整体耗时仅为10min，省时省力。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种具有高灵敏度和特异性的黏菌素胶体金检测试剂盒，其主要由黏菌素胶体金检测试纸条、冻干的胶体金标记黏菌素特异性单克隆抗体微孔试剂、微孔板架、定量移液管、样本稀释液组成。

其中，所述的黏菌素胶体金检测试纸条（图1和图2）由PVC背板（1）、硝酸纤维素膜（NC膜）（2）、样品垫（5）、吸水垫（6）构成；其中硝酸纤维素膜（2）为整个检测反应的载体，粘贴在PVC背板（1）上，其上喷涂有包被有检测抗原的检测线（T线）（3）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（C线）（4）的，其T线端粘贴有样品垫（5），样品垫的上端与T线的距离为4~10mm，并与NC膜重合约1~3mm；其C线端粘贴有吸水垫（6），吸水垫与C线的距离为4~10mm，并与NC膜重合约1~3mm。检测样本时，样品垫部分浸入检测样本，确保样本能在虹吸作用下沿胶体金试纸条由样品垫向吸水垫方向（图1箭头方向）爬行。

所述的包被有检测抗原的检测线（T线）（3），其检测抗原是与载体蛋白偶联的黏菌素B与卵清蛋白的偶联物CL-OVA。

所述的包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（C线）（4），在包被时还可加入染料，标记出C线位置，以方便客户检测时识别试纸条的方向。

所述的样品垫（5）为玻璃纤维或纤维素或者纺织聚合物，其经过缓冲液浸泡后晾干，所述缓冲液为含有5%蔗糖、3%甲醇、0.5%吐温-20的0.01M 磷酸盐缓冲液（pH7.2）。

所述的吸水垫（6）为玻璃纤维。

所述包被有冻干检测抗原（7）的微孔试剂（图3）是将胶体金颗粒标记的黏菌素单克隆抗体稀释至一定浓度，冷冻干燥在酶标微孔（8）中，然后用酶标板孔盖（9）密封，其中制备黏菌素单克隆抗体的半抗原为利用丁二酸酐法合成的黏菌素B半抗原CL-HS，其结构式为

。

所述微孔板架为普通96孔酶标板板架（图4）。

所述定量移液管为普通的0.2ml塑料吸管，实际使用时也可以用微量移液器取代。

所述样本稀释液是25mM HEPES缓冲液，其中含有1%BSA，3%甘露醇，0.5% trixton-100，2%蔗糖。

本发明还提供黏菌素胶体金检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1 黏菌素特异性单克隆抗体的制备：

(1) 偶联抗原的合成：利用丁二酸酐法合成黏菌素B半抗原CL-HS，然后与牛血清白蛋白、卵清蛋白等载体蛋白通过碳化二亚胺(EDC)法偶联，偶联产物经纯化后紫外测定蛋白浓度，透析除盐后备用；利用黏菌素B直接与载体蛋白偶联合成偶联抗原。

(2) 动物免疫及抗体筛选：

分别利用半抗原CL-HS的偶联抗原和黏菌素B直接偶联抗原CL-BSA免疫干只Balb/C小鼠。首次免疫时佐剂为弗氏完全佐剂，后续免疫佐剂为弗氏不完全佐剂佐剂。免疫间隔为2周，3次免疫后以ELISA测定血清效价，同时以竞争ELISA测定血清抑制效价和血清对黏菌素、黏菌素A、黏菌素B的交叉反应。筛选血清效价高、对黏菌素A和B反应良好的小鼠按常规方法细胞融合，筛选分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3) 抗体鉴定：

进一步对筛选的单抗进行鉴定，使用的交叉反应物为黏菌素、黏菌素A、黏菌素B、杆菌肽、庆大霉素、卡那霉素、四环素、头孢噻呋等，通过筛选排除对无关物质有交叉反应的单抗细胞株，保留只与黏菌素及其代谢物反应的细胞株。扩大培养后以体内法诱生腹水，收集后经过饱和硫酸铵沉淀后，以Protein G柱纯化，测定蛋白浓度后冻存。

2 胶体金标记黏菌素特异性单抗微孔试剂的制备

以柠檬酸钠还原法制备粒径为40nm胶体金颗粒备用。取0.01%氯金酸水溶液加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入体积比为1.5%~2.5%的1%柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热，溶液呈透亮的酒红色。室温冷却，用去离子水恢复到原体积，2~8℃保存。

将纯化的黏菌素特异性单克隆抗体至一定浓度用制备好的胶体金颗粒标记后用定量分液器以100~150μl/孔的量包被在酶标板微孔（8）中，然后2~8℃孵育一定时间，洗板后封闭，再次洗板拍干备用；将包被有金标抗原的酶标板使用冻干机冷冻干燥后盖酶标板孔盖（9）密封后作为微孔试剂储存在2~8℃干燥环境中备用。

3划膜及组装

将检测抗原（T线抗原）和质控线抗抗体用0.01M PBS（pH7.2）缓冲液稀释至一定浓度，用划膜仪喷涂在硝酸纤维素膜上作为检测线；然后按照图1和图2将干燥固定后的硝酸纤维素膜（2）贴在PVC背板（1）上，粘贴好样品垫（5）、吸水垫（6），其中硝酸纤维素膜（2）为整个检测反应的载体，粘贴在PVC背板（1）上，其T线端粘贴有样品垫（5），样品垫的上端与T线的距离为4~10mm，并与NC膜重合约1~3mm ；C线端粘贴有吸水垫（6），吸水垫与C线的距离为4~10mm，并与NC膜重合约1~3mm。最后用切条机切成4.5mm的试纸条备用。

挑选裁切整齐无残缺的试纸条（图2）8条和微孔试剂一条（图3，含有8个微孔）盛放于含有干燥剂的塑料瓶中，密封，将12个塑料瓶贴好标签后放置在刻有孔位的试剂盒纸托上，然后继续装入1个微孔板架（图4）、1包塑料吸管（100个每包）、1份样本稀释液、1份说明书，最后装入试剂盒外包装盒，塑封，至此黏菌素胶体金检测试剂盒制备完毕。

此外，本发明还涉及一种使用本试剂盒检测检测牛奶、奶粉和鸡蛋中黏菌素残留的检测方法，包括如下步骤：

第一步，采集样本，采集好之后保存在适当条件（例如2~8℃不超过6小时或冻存于-20℃）或者当场检测；

第二步，将采集的牛奶样本可以直接检测，奶粉样本用水按照1:8的比例（1g奶粉对应8mL水）溶解混匀后检测，鸡蛋样本需要将鸡蛋打开后取蛋清、蛋黄混匀后，取1g蛋液加入10ml样本稀释液混匀后检测；

第三步，用塑料吸管吸取200μl（即0.2ml）准备好的样本，溶解在微孔试剂中，上下吸打若干次，确保充分溶解，然后室温计时5min；

第四步，将试纸条的样品垫段插入有样本的微孔中，计时5min。根据试纸条的显色情况判定结果：当试纸条的C线显色，T线颜色深于C线时，样本检测结果为阴性。当试纸条的C线显色，T线颜色等于或浅于C线时，样本检测结果为阳性，T线颜色越深，阳性越强。当试纸条的C线不显色，样本检测结果为无效。

与传统的病原学分析方法及ELISA分析方法相比，本发明具有以下有益效果：

1）操作简单，无需特殊仪器设备。从试剂、仪器设备来看，本方法无需有机试剂，检测样本经稀释后可以直接检测，降低了操作难度，非常适合于基层检测实验室推广应用。

2）耗时短，检测效率高。整体检测时间10min，检测效率高。

3）检测灵敏度高，成本低。方法利用免疫检测技术优势，具有极高的检测灵敏度，且单次检测成本不超过10元。

4）检测结果可定性定量。在有胶体金读数仪的情况下，可以测定T线和C线的显色并可绘制校准曲线，可以定量及半定量检测抗体滴度。

本发明提供的黏菌素胶体金检测试剂盒与传统技术相比较，优势明显，技术改进明显，特别是针对当前黏菌素被限制使用的情况下，可以有效地在基层检测和政府监管中发挥重要作用。

附图说明

图1 胶体金试纸条组装结构图。

图2 胶体金试纸条的纵剖面图。

图3 胶体金试剂盒微孔试剂结构图。

图4 微孔板架示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式来进一步描述本发明。本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚，但这些实施例仅是范例性质，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或者替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。下述试剂、实验材料，如没有特殊说明，均来源于商品化产品。

实施例1：黏菌素偶联抗原的制备

利用丁二酸酐法合成黏菌素B半抗原CL-HS，然后与牛血清白蛋白、卵清蛋白等载体蛋白通过碳化二亚胺(EDC)法偶联，偶联产物经纯化后紫外测定蛋白浓度，透析除盐后备用，具体如下：

用分析天平准确称量140mg硫酸黏菌素B和20mg丁二酸酐，装入带有磁力搅拌子的10ml棕色小瓶中，加入3ml吡啶溶解，80℃恒温油浴6h；吹干溶剂，用甲醇将残留物充分洗涤3次，静置后有大量沉淀；弃掉甲醇，将沉淀用冻干机冷冻干燥，即为半抗原黏菌素-HS（CL-HS）。

取41.6mg黏菌素-HS，溶于2ml DMF（N-N二甲基甲酰胺），用分析天平准确称量10mgNHS（N-羟基琥珀酰亚胺）和15mg EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）搅拌活化6h；用分析天平准确称量50mg BSA，充分溶解于4ml 0.01M pH7.4的PBS中，将上步中活化液缓慢滴入BSA液中，搅拌过夜；将反应液置于0.01M PBS中透析3d，每8h换一次液。经紫外分光光度计鉴定偶联成功。

利用黏菌素B直接与载体蛋白偶联合成偶联抗原。1. 称量30mg硫酸黏菌素B溶于1ml 0.01M pH7.4的PBS中；称量10mgOVA溶于1ml 0.01M pH7.4的PBS中，与上步混匀；将10mgEDC溶于500ulPBS，缓慢滴入混合液中，反应2h；再次加入溶于250μl PBS的5mgEDC，室温反应24h；将反应液置于0.01M PBS中透析3d，每8h换一次液。经紫外分光光度计鉴定偶联成功。

利用同样的方法合成上述半抗原CL-HS和黏菌素B与卵清蛋白的偶联物CL-HS-OVA和CL-OVA，透析纯化后备用。

实施例2：黏菌素特异性单克隆抗体的制备

分别利用半抗原CL-HS的偶联抗原CL-HS-BSA和黏菌素B直接偶联抗原CL-BSA免疫干只Balb/C小鼠。首次免疫时佐剂为弗氏完全佐剂，后续免疫佐剂为弗氏不完全佐剂佐剂。免疫间隔为2周，3次免疫后以ELISA测定血清效价，同时以竞争ELISA测定血清抑制效价和血清对黏菌素、黏菌素A、黏菌素B的交叉反应。筛选血清效价高、对黏菌素A和B反应良好的小鼠按常规方法细胞融合，筛选分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(1) 血清效价检测：

将偶联抗原CL-BSA、CL-HS-BSA、CL-OVA、CL-HS-OVA等用0.05M碳酸盐缓冲液（pH 9.6）稀释至1μg/mL按照每孔50μL包被酶标板，4℃过夜包被，然后以PBST洗板3次，250μl/孔，每次60s，然后以200μL 1%明胶（1g明胶溶于100mL PBS，pH 7.2~7.4，过滤除菌）封闭酶标板，37℃封闭2小时；继续PBST洗板1次；

小鼠血清按照1:500、1:1000、1:2000、1:4000用PBS稀释后，取50μL加入微孔，并以未免血清作为阴性对照、PBS作为空白对照，37℃孵育30min；

弃去孔中液体，洗板3次；加入HRP酶标二抗50μL每孔，继续37℃孵育30min；弃去孔中液体，洗板3次；加入TMB底物，50μL每孔，37℃孵育10min，再以2M硫酸终止反应；酶标仪读取450nm吸光度值。

(2)血清灵敏度、交叉反应检测：

按照前述方法制备包被酶标板，然后取黏菌素、黏菌素A、黏菌素B，配制浓度成5ng/mL的溶液；

检测时，每孔加入1:1000稀释的抗血清50μl，同时在不同孔中加入50μl的各个标准品溶液，并留2孔加入50μl PBS作为0浓度对照，后续操作与本实施例(1)中相同，根据检测结果判定各个标准品对鼠血清的效价抑制率（标准孔OD值与浓度对照孔OD值均值的百分比）。筛选5ng/ml的标准品抑制率小于40%的血清，取其小鼠脾细胞融合，制备分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3) 高灵敏度、高特异性抗体细胞株的筛选：

按照常规方法筛选单克隆抗体，并使用黏菌素及其代谢物用于特异性抗体的筛选，同时使用杆菌肽、庆大霉素、卡那霉素、四环素、头孢噻呋等无关抗生素和载体蛋白BSA、OVA等做交叉反应，最终筛选到多株特异性单克隆抗体。

挑选其中灵敏度较高的抗体1G2、5F6免疫小鼠制备腹水抗体，收集后经过饱和硫酸铵沉淀后，以Protein G柱纯化，然后利用梯度稀释的黏菌素、黏菌素A、黏菌素B作为标准品，测定不同标准品对于两株抗体的检测灵敏度和交叉反应情况，具体结果如下表：

注：交叉反应率=黏菌素IC50/交叉反应物IC50 x 100%。

由结果可知，两株抗体对黏菌素类药物灵敏度、交叉反应都较好，灵敏度都可以满足国家标准限量要求，均可用于黏菌素残留检测方法研究。为了方便调试，后续选用1G2用于胶体金检测方法调试研究。

实施例3：胶体金颗粒的制备

以柠檬酸钠还原法制备粒径为30-40nm胶体金颗粒，具体操作如下：

(1)取250 ml圆底烧瓶，量取100 ml蒸馏水并加1 ml 1%氯金酸溶液，搅拌加热至煮沸；

(2)加入1.5ml 1%柠檬酸钠水溶液至上述氯金酸水溶液中，搅拌混匀，并保持沸腾10min，此间溶液颜色将由透明变黑，再逐渐变红，最终溶液呈酒红色；

(3)10min后停止加热，待溶液冷却后，补加蒸馏水定容至100ml，此即胶体金溶液；

(4)将制备好的胶体金溶液置于2~8℃保存。

实施例4：胶体金标记抗体的制备

将制备好的黏菌素特异性纯化单克隆抗体1G2用稀释液（pH7.2 PBS）稀释后用胶体金颗粒标记，具体操作如下：

(1)取制备的胶体金溶液10ml至离心管中，加入适量的0.1M K₂CO₃溶液，此时pH值约为7.5。

(2)取制备的黏菌素特异性纯化单克隆抗体1G2溶液（抗体浓度为5μg/ml）140μl加入到胶体金溶液中，室温孵育20分钟。

(3)加入牛血清白蛋白（BSA）0.02g使其终浓度为0.2%，充分混匀。4℃条件下，10000r/min离心40分钟，弃上清。

(4)用2ml 0.02M磷酸盐缓冲液（1%蔗糖、1%海藻糖、2%BSA、0.02%叠氮钠）复溶沉淀，此即标记好的抗体胶体金溶液。

(5)将标记好的胶体金抗体溶液用0.22μm的滤膜过滤除菌，置2~8℃保存备用。

实施例5：微孔试剂的制备

将制备好的胶体金标记的1G2抗体溶液用包被机平均分配至96孔微孔板中，利用冻干机冷冻干燥，具体操作如下：

(1)将制备的胶体金标记抗原用0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液（碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，用灭菌去离子水溶解至1000mL，pH9.6）稀释到5µg/mL，按100µL/孔包被96孔酶标板（Nunc，468667），2~8℃作用14~18小时。

(2)弃去孔中的包被液，每孔加入300µL 1×PBS-Tween洗涤液（终浓度为0.1%的Tween-20溶于PBS中，121℃高压灭菌，pH 7.2）洗板4次，每次3分钟。最后一次拍干。

(3)每孔加入200µL的1%明胶（1g明胶溶于100 mL PBS，pH 7.2~7.4，0.22µm滤膜过滤除菌)，37℃封闭2小时后弃去。

(4)每孔加入250µL PBST(终浓度为0.1%的Tween-20溶于PBS中，121℃高压灭菌，pH 7.2）洗板1次，3分钟/次，拍干。

(5)弃去洗涤液，经0.1mba真空干燥10小时。

(6)冻干完毕，迅速取出含有冻干试剂的酶标板，盖上酶标微孔盖，与干燥剂一起放置于2~8℃保存备用。

实施例6：胶体金试剂盒的组装

(1) 将300mm×25mm的硝酸纤维素膜粘贴在300mm×6cm的PVC背板上，备用。

(2)将制备的黏菌素偶联抗原CL-HS-OVA用缓冲液（含有3%甲醇、1%蔗糖、0.05%叠氮钠的0.02M磷酸盐缓冲液，pH7.4）作1:200稀释，用划膜仪以0.1μl/mm喷涂到粘贴在PVC背板上硝酸纤维素膜的检测线（T线）的位置，待固定。

(3)继续用上述缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至0.5 mg/mL，用划膜仪以0.1μl/mm的体积喷涂到黏附在PVC背板上的硝酸纤维素膜的质控线（C线）上，待干燥备用。

(4)将喷有检测线(T线)和质控线(C线)的硝酸纤维素膜置于37℃恒温干燥箱中，烘干16h，室温干燥贮存。

(5)将聚酯纤维膜样品垫（300mm×17mm）浸泡于样品垫溶液（含3%蔗糖、1%吐温-20、0.05%叠氮钠的0.02M磷酸盐缓冲液）中1小时，然后转移至37℃恒温箱中干燥16小时，备用。

(6)将吸水纸裁切成300mm×17mm，备用。

(7)按照图1及图2所示，先将硝酸纤维素膜（3）粘贴到PVC板（7）的相应位置，然后将样品垫（1），吸水纸（4）依次粘贴到PVC板（7）的相应位置。使样品垫（2）与硝酸纤维素膜（3）部分接触，约1~2mm；使吸水纸（4）与硝酸纤维素膜（3）部分接触，约2~3mm。用切条机将其切成4.5mm宽的小条，备用。

(8)挑选裁切整齐无残缺的试纸条8条和微孔试剂（8）一条（含有8个微孔（8），每个微孔中含有冻干试剂（7）、1条微孔板盖帽（9），如图3所示）盛放于含有干燥剂的塑料瓶中，密封，将12个塑料瓶贴好标签后放置在刻有孔位（12）的试剂盒纸托（11）上，然后继续装入1个酶标板架（图4）、1份说明书，最后装入试剂盒外包装盒，塑封，至此黏菌素胶体金检测试剂盒制备完毕。

实施例7：利用黏菌素胶体金检测试剂盒检测样本

(1) 采集样本，采集好之后保存在适当条件（例如2~8℃不超过6小时或冻存于-20℃）或者当场检测；

(2) 将采集的牛奶样本可以直接检测，奶粉样本用水按照1:8的比例（1g奶粉对应8mL水）溶解混匀后检测，鸡蛋样本需要将鸡蛋打开后取蛋清、蛋黄混匀后，取1g蛋液加入10ml样本稀释液混匀后检测；

注意：所有样本在检测之前必须恢复至室温。

(3)打开试剂盒外包装盒，取出1桶试纸条，然后根据样本数量取出合适的试纸条，将剩余的试纸条盖好。如试纸条在2~8℃保存，应提前至少30分钟取出在室温平衡。

(4)用微量移液器或者其它移液装置吸取准备好的样本200μl至为含有微孔试剂的微孔中，上下吸打3次，使微孔试剂与样本充分混匀，然后室温计时5min；

(5)将试纸条的末端（即样品垫端）插入有样本的微孔中，计时5min，如果试纸条有破损，请更换试纸条；

(6)判定结果：当试纸条的C线显色，T线颜色深于C线时，样本检测结果为阴性。当试纸条的C线显色，T线颜色等于或浅于C线时，样本检测结果为阳性，T线颜色越深，阳性越强。当试纸条的C线不显色，样本检测结果为无效，应更换试纸条重新检测。

实施例8：黏菌素胶体金检测试剂盒的灵敏度测定

利用本发明研制的黏菌素胶体金检测试剂盒检测梯度稀释的黏菌素标准品，浓度为0、1、2.5、5、10μg/L；同时利用黏菌素标准品添加至阴性空白牛奶样本中，添加浓度为0、1、2.5、5、10μg/L；每个样本检测5次，结果如下表：

初步分析可知，本发明的黏菌素胶体金检测试剂盒对黏菌素标准品的检测灵敏度为2.5μg/L，对牛奶样本中黏菌素的检测限至少为5μg/L。

进一步利用黏菌素A和黏菌素B标准品对本发明研制的黏菌素胶体金检测试剂盒进行验证，添加2.5μg/L黏菌素A和3.0μg/L黏菌素B的标准品溶液，本发明试剂盒检测为阳性；添加3μg/L黏菌素A和5.0μg/L黏菌素B的阴性空白牛奶样本，本发明试剂盒检测为阳性。

对比可知本发明的黏菌素胶体金检测试剂盒具有极高的灵敏度，可满足黏菌素残留检测的需求。

实施例9：黏菌素胶体金检测试剂盒的特异性测定

将常见药物如四环素、阿莫西林、链霉素、杆菌肽、卡那霉素、庆大霉素、新霉素、磺胺喹噁啉等配制成100μg/L标准品溶液，利用本发明黏菌素胶体金检测试剂盒进行检测，结果均呈阴性，即本发明的试剂盒特异性良好，可以有效地检测黏菌素药物残留。

实施例10：本发明黏菌素胶体金检测试剂盒与其他同类产品的对比

随着国家对食品安全的重视，药物残留控制越来越严格，本发明的胶体金检测试剂盒具有高灵敏度，可以满足目前国内最严格的检测需求。

Claims (3)

1.一种黏菌素胶体金检测试剂盒，其主要由黏菌素胶体金检测试纸条、冻干的胶体金标记黏菌素特异性单克隆抗体微孔试剂、微孔板架、定量移液管、样本稀释液组成，其中：

所述的黏菌素胶体金检测试纸条（图1和图2）由PVC背板（1）、硝酸纤维素膜（NC膜）（2）、样品垫（5）、吸水垫（6）构成，其中硝酸纤维素膜（2）为整个检测反应的载体，粘贴在PVC背板（1）上，其上喷涂有包被有检测抗原的检测线（T线）（3）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（C线）（4）的，其T线端粘贴有样品垫（5），样品垫的上端与T线的距离为4~10mm，并与NC膜重合约1~3mm；其C线端粘贴有吸水垫（6），吸水垫与C线的距离为4~10mm，并与NC膜重合约1~3mm，检测样本时，样品垫部分浸入检测样本，确保样本能在虹吸作用下沿胶体金试纸条由样品垫向吸水垫方向（图1箭头方向）爬行；

所述的包被有检测抗原的检测线（T线）（3），其检测抗原是将黏菌素B与卵清蛋白的偶联物CL-OVA；

所述的包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（C线）（4），在包被时还可加入染料，标记出C线位置，以方便客户检测时识别试纸条的方向；

所述的样品垫（5）为玻璃纤维或纤维素或者纺织聚合物，其经过缓冲液浸泡后晾干，所述缓冲液为含有5%蔗糖、3%甲醇、0.5%吐温-20的0.01M 磷酸盐缓冲液（pH7.2）；

所述的吸水垫（6）为玻璃纤维；

所述包被有冻干检测抗原（7）的微孔试剂（图3）是将胶体金颗粒标记的黏菌素单克隆抗体稀释至一定浓度，冷冻干燥在酶标微孔（8）中，然后用酶标板孔盖（9）密封，其中制备黏菌素单克隆抗体的半抗原为利用丁二酸酐法合成的黏菌素B半抗原CL-HS，其结构式为：

；

所述微孔板架为普通96孔酶标板板架（图4）；

所述定量移液管为普通的0.2ml塑料吸管，实际使用时也可以用微量移液器取代；

所述样本稀释液是25mM HEPES缓冲液，其中含有1%BSA，3%甘露醇，0.5% trixton-100，2%蔗糖。

2.根据权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述黏菌素B半抗原CL-HS的制备方法为：用分析天平准确称量140mg硫酸黏菌素B和20mg丁二酸酐，装入带有磁力搅拌子的10ml棕色瓶中，加入3ml吡啶溶解，80℃恒温油浴6h；吹干溶剂，用甲醇将残留物充分洗涤3次，静置后有大量沉淀；弃掉甲醇，将沉淀用冻干机冷冻干燥，即为半抗原黏菌素-HS（CL-HS）。

3.根据权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在，所述试剂盒用于检测牛鸡蛋或牛奶中黏菌素残留的步骤为：

(1)采集样本，采集好之后保存在适当条件（例如2~8℃不超过6小时或冻存于-20℃）或者当场检测；

(2)将采集的牛奶样本可以直接检测，奶粉样本用水按照1:8的比例（1g奶粉对应8mL水）溶解混匀后检测，鸡蛋样本需要将鸡蛋打开后取蛋清、蛋黄混匀后，取1g蛋液加入10ml样本稀释液混匀后检测；

(3)用塑料吸管或微量移液器吸取200μl（即0.2ml）准备好的样本，溶解在微孔试剂中，上下吸打若干次，确保充分溶解，然后室温计时5min；

(4)将试纸条的样品垫段插入有样本的微孔中，计时5min；

(5)判定结果：当试纸条的C线显色，T线颜色浅于C线时，样本检测结果为阴性；当试纸条的C线显色，T线颜色等于或深于C线时，样本检测结果为阳性，T线颜色越深，阳性越强；当试纸条的C线不显色，样本检测结果为无效，应更换试纸条重新检测。