CN110684188A - 壬基酚聚氧乙烯醚半抗原和全抗原及其制备方法与应用 - Google Patents

壬基酚聚氧乙烯醚半抗原和全抗原及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及壬基酚聚氧乙烯醚半抗原和全抗原及其制备方法与应用。利用本发明的全抗原免疫动物可以产生针对壬基酚聚氧乙烯醚的特异性抗体，可用于建立壬基酚聚氧乙烯醚的胶体金试纸条快速检测法，能用于对多种不同结构壬基酚聚氧乙烯醚的检测；所制备的胶体金检测试纸条操作简便，检测所需时间短，灵敏度高，稳定性好，成本低。

Description

壬基酚聚氧乙烯醚半抗原和全抗原及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，尤其是涉及壬基酚聚氧乙烯醚半抗原和全抗原及其制备方法与应用。
背景技术
壬基酚聚氧乙烯醚(NonypHenol ethoxylate，NPE)是一种烷基酚聚氧乙烯醚类化合物，是以壬基酚和环氧乙烷在催化剂作用下缩合反应生成的，其结构式如下：
Figure BDA0002255505240000011
(n＝6～15)，当n＜15时为无色或微黄色透明液体，当n≥15时为白色膏体或固体。
壬基酚聚氧乙烯醚作为非离子表面活性剂，可以促进碘的溶解，经常被用于奶牛乳头消毒剂助溶，处理不慎便会残留在牛乳中，由于其属于环境激素，对生物体繁殖系统具有危害，近年来已被欧美等国家禁止使用。2011年初，中国环保部口和海关总署发布的《中国严格限制进出口的有毒化学品目录》中已首次将壬基酚、对壬基酚和支链-4-壬基酚列为禁止进出口物质。
常规对壬基酚聚氧乙烯醚的监测方法为仪器方法，如液相色谱和质谱联用法，但需要昂贵的仪器设备，操作需要专业技术人员，目前市场上无相应快速检测产品。
专利申请号201310186034.X的中国发明专利，公开了壬基酚聚氧乙烯醚检测ELISA试剂盒的制备和使用方法，相比液相色谱和质谱联用法更便捷，但存在检测时间长，成本较高的缺点。而且由于壬基酚聚氧乙烯醚中乙氧基聚合数量的不同，导致NPE有不同的结构，常见的为NPE-6，NPE-7、NPE-8、NPE-9、NPE-10、NPE-12，具有相近的理化性质且都具有毒性，国内外市场未见有商品化广谱检测NPE的试纸条和试剂盒的检测产品。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种壬基酚聚氧乙烯醚半抗原和全抗原及其制备方法，还提供一种用于对多种不同结构壬基酚聚氧乙烯醚检测的胶体金检测试纸条。
NPE中由于随着乙氧基聚合数量的不同有不同的结构，发明人通过化学方法对NPE的结构进行改造，使其能更好的与载体蛋白偶联。用偶联得到的抗原免疫小鼠，得到的单克隆抗体分别与不同结构NPE做交叉反应，筛选得到能与NPE-6，NPE-7、NPE-8、NPE-9、NPE-10、NPE-12均能交叉反应的广谱的单克隆抗体。本发明将偶联抗原与单克隆抗体应用到免疫层析试纸条中，制作出胶体金检测试纸条，经验证具有较高的灵敏度、准确率和稳定性。
本发明的目的在于提供一种壬基酚聚氧乙烯醚半抗原，其结构式如下所示：
Figure BDA0002255505240000021
n＝6～15。
本发明还提供一种壬基酚聚氧乙烯醚全抗原，由上述壬基酚聚氧乙烯醚半抗原与载体蛋白偶联后得到。
其中，所述载体蛋白选自牛血清蛋白、钥孔嘁血蓝蛋白或卵清蛋白，γ-球蛋白；优选地，为牛血清蛋白和卵清蛋白。
本发明还提供由上述壬基酚聚氧乙烯醚全抗原制备的特异性抗体，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
本发明还提供由上述壬基酚聚氧乙烯醚半抗原，或上述壬基酚聚氧乙烯醚全抗原，或上述特异性抗体制备的壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂或试剂盒。
本发明还提供由上述壬基酚聚氧乙烯醚半抗原，或上述壬基酚聚氧乙烯醚全抗原，或上述特异性抗体，或上述检测试剂在制备壬基酚聚氧乙烯醚的胶体金检测试纸条中的应用。
上述壬基酚聚氧乙烯醚半抗原的制备方法，具体包括：
分别取NPE-7、NPE-9、NPE-10标准品，用二氯甲烷溶解，加入Dess-Martin氧化剂，冰水浴反应后滴加超纯水，淬灭、离心取上清，将上清液用二氯甲烷溶解，加入6-氨基乙酸，磁力搅拌下室温反应，加入NaBH(OAc)3，继续反应后加入饱和NaCl水溶液淬灭，用HCl调节pH，加入二氯甲烷萃取，饱和NaCl水溶液洗后，用无水Na2SO4干燥，旋干，即得壬基酚聚氧乙烯醚半抗原。
上述壬基酚聚氧乙烯醚全抗原的制备方法，具体包括：
用二甲基甲酰胺溶解壬基酚聚氧乙烯醚半抗原，加入N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺活化，得到壬基酚聚氧乙烯醚半抗原活化液；将载体蛋白溶解于磷酸盐缓冲溶液，得到载体蛋白溶液；将壬基酚聚氧乙烯醚半抗原活化液缓慢滴加到载体蛋白溶液中，室温搅拌，用磷酸盐缓冲溶液透析，换液后收取，即得壬基酚聚氧乙烯醚全抗原。
上述本发明的制备方法各合成步骤中所述的固定值仅是优化后数值，但是本发明的保护范围不限于此，只要能够合成相应的壬基酚聚氧乙烯醚半抗原和全抗原化合物，应均属于本发明的保护范围。
本发明所合成的壬基酚聚氧乙烯醚半抗原端基为羧基,可以在有机溶剂中先行与N-羟基琥珀酰亚胺反应转化成活性酯,更高效的与各种载体蛋白上的氨基反应。
上述壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体的制备：用所得壬基酚聚氧乙烯醚全抗原为免疫原交叉免疫小鼠，取免疫小鼠的血清，分别检测抗血清对壬基酚聚氧乙烯醚的效价和抑制价，选取效价和抑制价较高的免疫小鼠，取所得免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株，并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，腹水纯化，得到纯化的壬基酚聚氧乙烯醚抗单克隆抗体。所述具体效价及抑制反应检测使用ELISA方法。
上述单克隆抗体制备过程还包括筛选步骤，即将所得纯化的单克隆抗体分别与常见的NPE-6，NPE-7、NPE-8、NPE-9、NPE-10、NPE-12以及壬基酚、辛基酚、聚氧乙烯醚标准品进行交叉反应，能与NPE-6，NPE-7、NPE-8、NPE-9、NPE-10、NPE-12均发生交叉抑制反应，且不与壬基酚、辛基酚、聚氧乙烯醚发生抑制反应或抑制反应较小，即为所需要筛选的广谱的NPE单克隆抗体。
一种胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括PVC背衬、样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述PVC背衬一端依次粘贴样品垫、硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫，所述硝酸纤维素膜上包被了壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原作为检测线，和兔抗鼠二抗作为质控线，配套使用的微孔板上包被了壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体-胶体金标记物。
上述壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体-胶体金标记物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备胶体金颗粒：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成胶体金颗粒；取氯金酸水溶液500～1000ml加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热至溶液呈透亮的红色，室温冷却，用去离子水恢复到原体积，4℃保存；
(2)壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体-胶体金标记物的制备：取上步制备的胶体金加入K2CO3溶液调节pH值，再加入筛选纯化后的单克隆抗体，混匀后静置，加入聚乙二醇20000溶液后离心，弃上清，加入复溶液，混合均匀，即得壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体-胶体金标记物，所述复溶液为0.05M三羟甲基氨基甲烷配合5％蔗糖。将胶体金标记好的壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体按每孔3～10μL用冻金稀释液(0.05M三羟甲基氨基甲烷+5％蔗糖)稀释混匀后分装于96孔板，放置在冻干机内冻干。
上述胶体金检测试纸条中所述硝酸纤维素膜所做处理如下：将壬基酚聚氧乙烯醚特异性抗原，均匀喷涂在硝酸纤维素膜检测线的位置，并同时喷涂兔抗鼠二抗质控线，烘干后拿出，干燥放置备用。
所述免疫层析试纸条是将样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫由一端依次黏附在PVC背衬上，用切条机切割成4～4.5mm的细条，即得到免疫层析试纸条。
上述胶体金检测试纸条的检测方法：将待测样品加入到包被了壬基酚聚氧乙烯醚单克隆抗体-胶体金标记物的微孔中，移液器反复吹混匀，将试纸条插入微孔中，室温反应，并开始计时，5min后读取判定结果；
判定标准：根据显色判定样本结果：质控线显色，检测线显色且显色强度比质控线强，则试纸条正常，结果为阴性；质控线显色，检测线不显色或显色强度比质控线弱，则试纸条正常，结果为阳性；质控线不显色则试纸条失效，结果判定无效；查看显色反应30min后结果无效。
所述待测样品为牛乳或乳制品。
与现有方法相比，本发明具有如下有益效果：
本发明所述方法制备得到的壬基酚聚氧乙烯醚全抗原免疫动物可以产生针对壬基酚聚氧乙烯醚的特异性抗体，能实现对多种不同结构壬基酚聚氧乙烯醚的检测，可检测样本中是否含有任一结构的壬基酚聚氧乙烯醚；所制备的胶体金检测试纸条操作简便，时间短：操作仅需5min，与酶联免疫反应(ELISA)和高效液相色谱技术(HPLC)，更省时，且不需要专业技术人员；灵敏度高，稳定性好：总的检出限可达5ppb，稳定性可达到37℃15天以上；成本低：单个试纸条的制造成本与检测成本相比酶联免疫反应(ELISA)和高效液相色谱技术(HPLC)均降低70％以上。
附图说明
图1NPE半抗原合成路线结构图。
图2组装完成的免疫层析试纸条结构。其中1、PVC背衬，2、样品垫，3、硝酸纤维素膜，4、吸水垫，5、检测线，6、质控线。
图3该试纸条对不同浓度NPE-6、NPE-7、NPE-8、NPE-9、NPE-10、NPE-12及NPE混合物的检测结果。
图4该试纸条稳定性检测结果。
具体实施方式
下面对本发明的实施例进行详细说明，但不对本发明的内容造成任何限制。
实施例1：NPE半抗原合成及抗原偶联
1.NPE半抗原的制备：
分别取64mg NPE-7、NPE-9、NPE-10标准品，用4mL二氯甲烷溶解，加入88mg Dess-Martin氧化剂，冰水浴反应2h后滴加2滴超纯水，淬灭、离心(12000r/min，10min)取上清，将上清液用4mL二氯甲烷溶解，加入13mg 6-氨基乙酸，磁力搅拌下室温反应1h，加入63mgNaBH(OAc)3，继续反应3h后加入饱和NaCl水溶液淬灭，用0.1M HCl调节pH至6.0，加入二氯甲烷萃取3次，饱和NaCl水溶液洗2次后，用无水Na2SO4干燥，旋干。得到物质用二甲基甲酰胺溶解，加入21.7mg N-羟基琥珀酰亚胺和43mg碳二亚胺活化15h，合成路线见图1(以NPE-7为例)。
2.NPE半抗原与载体蛋白的偶联
分别取50mg牛血清白蛋白和卵清蛋白，先用磷酸盐缓冲溶液(0.1M PBS，pH7.4)溶解，将上步得到的半抗原活化液缓慢滴加至牛血清白蛋白和卵清蛋白溶液中，室温搅拌2小时后PBS(0.1M，pH7.4)透析，换液三次后收取，测浓度分装(2mg/ml)，-20℃保存。
3.NPE-7、NPE-9、NPE-10抗原鉴定
将得到的浓度为2mg/ml的NPE-7-BSA、NPE-9-BSA、NPE-10-BSA偶联抗原分别作为免疫原免疫小鼠，30μg/只，皮下多点免疫，初次免疫后14天再次免疫，共免疫三次。三次免疫后尾部采血，血液经4000r/min离心5min，取上清，测试抗血清对NPE-7-OVA、NPE-9-OVA、NPE-10-OVA效价及抑制反应，若有效价及抑制反应，则说明抗原偶联成功。
具体效价及抑制反应检测使用ELISA方法，具体操作步骤如下：
(1)包被抗原：先在微孔板中分别包被NPE-7-OVA、NPE-9-OVA、NPE-10-OVA抗原，包被缓冲液为碳酸盐缓冲液(pH9.0，0.1M碳酸盐缓冲液)，包被浓度为1μg/mL；
(2)将得到的免疫小鼠抗血清用0.01M PBS缓冲液(pH7.4)按1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800的梯度进行稀释，一组稀释液不添加标准品，另一组稀释液添加3ppb的NPE-7-OVA、NPE-9-OVA、NPE-10-OVA，加入50μL到已包被抗原的微孔板中，37℃反应30min。
(3)甩出孔中液体，用250μL/孔的PBST洗液(浓度为0.1％)洗板4次，拍干后加入HRP酶标兔抗鼠二抗(以PBS按照1:5000稀释)50μL/孔，37℃反应30min，再次洗板4次，拍干后加入TMB显色液(商品化，北京梅科万德生物科技有限公司、20190506)100μL/孔室温显色10min，最后加入0.5M硫酸，50μL/孔，终止反应，用酶标仪测定OD450nm值，以免疫前的小鼠血清为阴性对照。
抑制率计算公式如下：
Figure BDA0002255505240000091
其中：I－抑制率
B0－0ppb标准品抗血清的平均吸光度值
B－不同标准品样本溶液的平均吸光度值实施例2：NPE特异性单克隆抗体的制备、筛选
NPE偶联抗原免疫小鼠：
将合成得到的NPE-7-BSA、NPE-9-BSA、NPE-10-BSA的特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫，分为四个小组，第一组为NPE-7-BSA、NPE-9-BSA、NPE-10-BSA为免疫原交叉免疫，第二组以NPE-7-BSA为免疫原，第三组以NPE-9-BSA为免疫原，第四组以NPE-10-BSA为免疫原。
免疫步骤：首次免疫使用完全弗氏佐剂与NPE特异性抗原的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液乳化，抗原浓度为0.25mg/mL，计量为125μg/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与NPE特异性抗原的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液乳化，剂量同初次免疫。初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫5-8次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐剂直接用NPE特异性抗原0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液腹腔注射，剂量同初次免疫。
分别用NPE-7-OVA、NPE-9-OVA、NPE-10-OVA抗原包被微孔板对4个免疫组小鼠尾部取血同时检测血清对NPE-7、NPE-9、NPE-10的效价和抑制价，第一组结果如表1～3所示；第二组结果如表4～6所示；第三组结果如表7～9所示；第四组结果如表10～12所示。结果显示第一组即NPE-7-BSA、NPE-9-BSA、NPE-10-BSA交叉免疫组抑制反应效果最好，抗血清与包被板抗原有抑制反应，且效价高于1:3200。分别向抗血清中加入10ppb NPE-7、NPE-9、NPE-10标准品，测定抗血清对其的抑制反应，结果显示抗血清对3种NPE标准品有抑制反应，且抑制率均超过50％，说明抗血清中含有抗NPE抗体，且抑制反应效果良好。
表1包被NPE-7-OVA抗原测定抗血清效价及抑制反应结果
Figure BDA0002255505240000101
表2包被NPE-9-OVA抗原测定抗血清效价及抑制反应结果
Figure BDA0002255505240000102
Figure BDA0002255505240000111
表3包被NPE-10-OVA抗原测定抗血清效价及抑制反应结果
Figure BDA0002255505240000112
表4包被NPE-7-OVA抗原测定抗血清效价及抑制反应结果
Figure BDA0002255505240000113
表5包被NPE-9-OVA抗原测定抗血清效价及抑制反应结果
Figure BDA0002255505240000114
表6包被NPE-10-OVA抗原测定抗血清效价及抑制反应结果
Figure BDA0002255505240000115
Figure BDA0002255505240000121
表7包被NPE-7-OVA抗原测定抗血清效价及抑制反应结果
Figure BDA0002255505240000122
表8包被NPE-9-OVA抗原测定抗血清效价及抑制反应结果
表9包被NPE-10-OVA抗原测定抗血清效价及抑制反应结果
Figure BDA0002255505240000124
Figure BDA0002255505240000131
表10包被NPE-7-OVA抗原测定抗血清效价及抑制反应结果
Figure BDA0002255505240000132
表11包被NPE-9-OVA抗原测定抗血清效价及抑制反应结果
表12包被NPE-10-OVA抗原测定抗血清效价及抑制反应结果
NPE单克隆抗体的筛选：
从NPE-7-BSA、NPE-9-BSA、NPE-10-BSA交叉免疫组取血清对NPE-7、NPE-9、NPE-10效价和抑制价最高的小鼠，分别在无菌条件下，取其脾细胞按10:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。
采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株共5株，添加NPE-7、NPE-9、NPE-10标准品的浓度为3ppb，交叉反应结果如表13所示。
表13 5株杂交瘤细胞株对NPE-7、NPE-9、NPE-10交叉筛选结果
克隆号 原液 NPE-7 NPE-9 NPE-10
10E11-2A3 0.748 0.211 0.257 0.232
3G5-2G3 0.63 0.331 0.388 0.318
9A8-1G8 0.685 0.144 0.146 0.146
11C3-1B1 0.864 0.243 0.145 0.146
9F3-1C10 1.622 0.814 0.724 0.707
由表13可知：筛选得到的5株单克隆杂交瘤细胞株对NPE-7、NPE-9、NPE-10均有抑制反应，且抑制率最高可达80％以上。
NPE单克隆抗体的制备：
Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0.5mL/只。将细胞浓度为1.2万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0.5mL/只。接种杂交瘤细胞7-10天后，收集腹水，反复收集数次。存于4℃冰箱保存。
实施例3：特异性单克隆抗体的纯化及测定
采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化NPE单克隆腹水抗体。具体方法：每1份腹水加入3份乙酸钠缓冲液(浓度0.06mol/L，pH 4.0)，用浓度0.1mmol/L NaOH调整pH 4.5，在4℃下搅拌30min，期间缓慢加入辛酸，按稀释前腹水体积计算40μL/mL；在4℃静置3h，离心(12000r/min，30min)，取上清液，保持在4℃环境中，30min内加入(NH4)2SO4使其终浓度为0.277g/mL，静置1h，4℃离心(12000r/min，30min)，弃上清液，得到单克隆抗体沉淀，并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为1μg/mL。
NPE单克隆抗体的测定
取纯化后的5株NPE单克隆抗体分别对3ppb的NPE-6、NPE-7、NPE-8、NPE-9、NPE-10、NPE-12、以及壬基酚、辛基酚、聚氧乙烯醚标准品做交叉反应，测定OD450nm值，计算抑制率。具体抑制反应检测方法如实施例1，抑制反应测定结果如表14所示。
表14纯化后单克隆抗体对交叉反应物抑制反应测定结果
Figure BDA0002255505240000151
由表14可知：通过原液及添加NPE标准品溶液的OD450nm值计算10株NPE单克隆抗体对不同NPE及壬基酚、辛基酚、聚氧乙烯醚的抑制率，结果表明5株单克隆抗体对NPE-6、NPE-7、NPE-8、NPE-9、NPE-10、NPE-12标准品均有较高的抑制率，且对壬基酚、辛基酚、聚氧乙烯醚标准品有较低的抑制率，故5株单克隆抗体可用于后续试验及胶体金产品的研发。
单克隆抗体灵敏度测定
分别将0.5ppb、1.5ppb、3ppb的NPE-6、NPE-7、NPE-8、NPE-9、NPE-10、NPE-12标准品加入缓冲液及奶粉样本中，用5株单克隆抗体分别测定抑制率，结果如表15所示：
表15-1单克隆抗体10E11-2A3灵敏度测定结果
Figure BDA0002255505240000152
Figure BDA0002255505240000161
表15-2单克隆抗体3G5-2G3灵敏度测定结果
Figure BDA0002255505240000162
表15-3单克隆抗体9A8-1G8灵敏度测定结果
Figure BDA0002255505240000163
表15-4单克隆抗体11C3-1B1灵敏度测定结果
表15-5单克隆抗体9F3-1C10灵敏度测定结果
Figure BDA0002255505240000171
由表15-1～表15-5可知：5株单克隆抗体对于3ppb的NPE-6、NPE-7、NPE-8、NPE-9、NPE-10、NPE-12标准品均有抑制反应，且在缓冲液及奶粉中结果无显著差异，表明此5株单克隆抗体可用于胶体金产品的研发。
实施例4：NPE胶体金免疫层析检测试纸条的制备
如图2所示，PVC背衬1一端依次粘贴样品垫2、硝酸纤维素膜3，另一端粘附吸水垫4，硝酸纤维素膜3上包被了NPE-BSA作为检测线5，和兔抗鼠二抗作为质控线6，配套使用的微孔板上包被了抗NPE的单克隆抗体-胶体金标记物。
1.制备胶体金颗粒：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成40nm胶体金颗粒，取0.01％氯金酸水溶液800ml用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入16％柠檬酸三钠水溶液1ml，继续搅拌加热7min，溶液呈透亮的红色，室温冷却，用去离子水恢复到原体积，4℃保存。
2.NPE单克隆抗体-胶体金标记物的制备：取上步制备的1mL胶体金加入3μL浓度为0.1mol/L的K2CO3溶液调节pH值，再分别加入1mg筛选纯化后的5株单克隆抗体，混匀后静置5min，加入10μL10％聚乙二醇20000(PEG，沃凯，20170615)溶液后12000rpm离心7min，弃上清，加入100μL复溶液(0.05M三羟甲基氨基甲烷+5％蔗糖)，混合均匀。
3.冻干微孔板的制备：将胶体金标记好的NPE单克隆抗体按每孔5μL用冻金稀释液(0.05M三羟甲基氨基甲烷+5％蔗糖)稀释混匀后分装于96孔板(60μL/孔)，放置在冻干机内按设定冻干程序冻干，冻干程序如下表16所示：
表16微孔板冻干程序表
区段 运行时间 结束温度(℃)
1 4时5分 -50
2 1时45分 -25
3 1时0分 -10
4 2时0分 0
5 1时0分 8
6 1时0分 15
7 2时0分 20
8 12时0分 28
4.硝酸纤维素膜的处理：将NPE-7-BSA、NPE-9-BSA、NPE-10-BSA用PBS稀释至1mg/ml，混匀后分别均匀喷涂硝酸纤维素膜检测线的位置，并同时喷涂兔抗鼠二抗于质控线。37℃烘干5小时后拿出，干燥放置备用。
5.试纸条的组装：将样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫由一端依次黏附在PVC背衬上，用切条机切割成4.05mm的细条，即得到用于检测的免疫层析试纸条，2℃～8℃保存。
实施例5：NPE胶体金检测试纸条的使用操作
将样品牛奶200μL加入含有的胶体金标记NPE单克隆抗体的微孔中，移液器反复吹混匀，将试纸条插入微孔中，室温反应，并开始计时，5min后读取判定结果。
结果判定：计时5min后取出试纸条，根据显色判定样本结果：质控线显色，检测线显色且显色强度比质控线强，则试纸条正常，结果为阴性；质控线显色，检测线不显色或显色强度比质控线弱，则试纸条正常，结果为阳性；质控线不显色则试纸条失效，结果判定无效；查看显色反应30min后结果无效。
实施例6：NPE胶体金检测试纸条的灵敏度检测
分别取NPE阴性的纯牛奶与添加终浓度分别为0ppb、2.5ppb、5ppb、10ppb的NPE-6，NPE-7、NPE-8、NPE-9、NPE-10、NPE-12及6种结构NPE混合物的阳性纯牛奶200μL加入含有的胶体金标记NPE单克隆抗体的微孔中，移液器反复吹混匀，将试纸条插入微孔中，室温反应，并开始计时，5min后读取判定结果，样品编号及对应物质含量见表17。
表17试纸条灵敏度检测样品编号及对应物质含量
编号 物质及含量 编号 物质及含量 编号 物质及含量 编号 物质及含量
1 0ppbNPE-6 9 0ppbNPE-8 17 0ppbNPE-10 25 2.5ppb混合
2 2.5ppbNPE-6 10 2.5ppbNPE-8 18 2.5ppbNPE-10 26 5ppb混合
3 5ppbNPE-6 11 5ppbNPE-8 19 5ppbNPE-10 27 10pb混合
4 10ppbNPE-6 12 10ppbNPE-8 20 10ppbNPE-10
5 0ppbNPE-7 13 0ppbNPE-9 21 0ppbNPE-12
6 2.5ppbNPE-7 14 2.5ppbNPE-9 22 2.5ppbNPE-12
7 5ppbNPE-7 15 5ppbNPE-9 23 5ppbNPE-12
8 10ppbNPE-7 16 10ppbNPE-9 24 10ppbNPE-12
结果记录：将终浓度分别为0ppb、2.5ppb、5ppb、10ppb的NPE-6，NPE-7、NPE-8、NPE-9、NPE-10、NPE-12及6种结构NPE混合物的阳性纯牛奶的检测结果记录下来。
结果显示，用单克隆抗体9F3-1C10标记金颗粒、用NPE-7-BSA喷涂硝酸纤维素膜检测线的位置时试纸条检测结果最佳，NPE检测试纸条对6种标品和NPE混合物在终浓度为5ppb时显阳性，终浓度为0、2.5ppb时显阴性，所以，本试纸条可测定多种常见结构NPE，且灵敏度可达5ppb，检测结果见图3。
实施例7：NPE检测试纸条稳定性检测
将所述试纸条放在37℃环境下分别放置0天、4天、6天、13天、15天、18天，取出后分别对终浓度为5ppb的NPE-6，NPE-7、NPE-8、NPE-9、NPE-10、NPE-12及6种结构NPE混合物的阳性纯牛奶进行检测，检测结果见图4，结果显示所述NPE胶体金检测试纸条在37℃环境下保存15天，其外观、检测结果、显色强度均与保存0天一致，所以所述NPE胶体金检测试纸条稳定性为37℃15天以上。
实施例8：NPE试纸条检测盲样的检测实验
从市场随机购买纯牛奶20份，用本申请试纸条检测，结果均为阴性，再添加5ppb的NPE后，用本申请试纸条检测，结果为阳性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变性和改进，这些都是本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种壬基酚聚氧乙烯醚半抗原，其特征在于，其结构式如下所示：
Figure FDA0002255505230000011
n＝6～15。
2.一种壬基酚聚氧乙烯醚全抗原，其特征在于，由权利要求1所述壬基酚聚氧乙烯醚半抗原与载体蛋白偶联后得到。
3.由权利要求2所述壬基酚聚氧乙烯醚全抗原制备的特异性抗体。
4.由权利要求1所述壬基酚聚氧乙烯醚半抗原，或权利要求2所述壬基酚聚氧乙烯醚全抗原，或权利要求3所述特异性抗体制备的壬基酚聚氧乙烯醚检测试剂或试剂盒。
5.权利要求1所述壬基酚聚氧乙烯醚半抗原，或权利要求2所述壬基酚聚氧乙烯醚全抗原，或权利要求3所述特异性抗体，或权利要求4所述所述检测试剂在制备壬基酚聚氧乙烯醚的胶体金检测试纸条中的应用。
6.权利要求1所述壬基酚聚氧乙烯醚半抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
分别取NPE-7、NPE-9、NPE-10标准品，用二氯甲烷溶解，加入Dess-Martin氧化剂，冰水浴反应后滴加超纯水，淬灭、离心取上清，将上清液用二氯甲烷溶解，加入6-氨基乙酸，磁力搅拌下室温反应，加入NaBH(OAc)3，继续反应后加入饱和NaCl水溶液淬灭，用HCl调节pH，加入二氯甲烷萃取，饱和NaCl水溶液洗，用无水Na2SO4干燥，旋干，即得壬基酚聚氧乙烯醚半抗原。
7.权利要求2所述壬基酚聚氧乙烯醚全抗原的制备方法，其特征在于，用二甲基甲酰胺溶解壬基酚聚氧乙烯醚半抗原，加入N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺活化，得到壬基酚聚氧乙烯醚半抗原活化液；将载体蛋白溶解于磷酸盐缓冲溶液，得到载体蛋白溶液；将壬基酚聚氧乙烯醚半抗原活化液缓慢滴加到载体蛋白溶液中，室温搅拌，用磷酸盐缓冲溶液透析，换液后收取，即得壬基酚聚氧乙烯醚全抗原。
8.一种胶体金检测试纸条，其特征在于，所述胶体金检测试纸条包括PVC背衬、样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述PVC背衬一端依次粘贴样品垫、硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫，所述硝酸纤维素膜上包被了权利要求2所述壬基酚聚氧乙烯醚全抗原作为检测线，和兔抗鼠二抗作为质控线，配套使用的微孔板上包被了抗壬基酚聚氧乙烯醚的单克隆抗体-胶体金标记物；
所述胶体金检测试纸条中所述硝酸纤维素膜所做处理如下：将权利要求2所述壬基酚聚氧乙烯醚全抗原用PBS稀释至1mg/ml，混匀后均匀喷涂在硝酸纤维素膜检测线的位置，并同时喷涂兔抗鼠二抗质控线，烘干后拿出，干燥放置备用；
所述胶体金检测试纸条是将样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫由一端依次黏附在PVC背衬上，用切条机切割成4～4.5mm的细条，即得到免疫层析试纸条。
9.如权利要求8所述胶体金检测试纸条，其特征在于，所述胶体金检测试纸条的检测方法为：将待测样品加入到包被了抗壬基酚聚氧乙烯醚的单克隆抗体-胶体金标记物的微孔中，移液器反复吹混匀，将试纸条插入微孔中，室温反应，并开始计时，5min后读取判定结果；
判定标准：质控线显色，检测线显色且显色强度比质控线强，则试纸条正常，结果为阴性；质控线显色，检测线不显色或显色强度比质控线弱，则试纸条正常，结果为阳性；质控线不显色则试纸条失效，结果判定无效；查看显色反应30min后结果无效；
所述待测样品为牛乳或乳制品。
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