CN112798791A - 一种血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备与应用 - Google Patents

一种血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112798791A
CN112798791A CN202011554341.5A CN202011554341A CN112798791A CN 112798791 A CN112798791 A CN 112798791A CN 202011554341 A CN202011554341 A CN 202011554341A CN 112798791 A CN112798791 A CN 112798791A
Authority
CN
China
Prior art keywords
reagent
temperature
antibody
kit
serum amyloid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011554341.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112798791B (zh
Inventor
王兴红
邹海涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Comen Medical Instruments Co Ltd
Original Assignee
Shenzhen Comen Medical Instruments Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Comen Medical Instruments Co Ltd filed Critical Shenzhen Comen Medical Instruments Co Ltd
Priority to CN202011554341.5A priority Critical patent/CN112798791B/zh
Priority to PCT/CN2021/092458 priority patent/WO2022134430A1/zh
Publication of CN112798791A publication Critical patent/CN112798791A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112798791B publication Critical patent/CN112798791B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

一种血清淀粉样蛋白A检测试剂盒及其制备与应用，所述试剂盒包括R1试剂、R2试剂中的至少一种，所述R2试剂含有胶乳抗体复合物，所述抗体选自可特异性结合至血清淀粉样蛋白A的抗体，所述制备方法包括对R1试剂、R2试剂中的至少一种进行冻干。冻干处理后的试剂稳定性高，便于在寒冷地区运输，环境温度的升降对检测试剂的检测性能无显著影响。

Description

一种血清淀粉样蛋白A检测试剂盒及其制备与应用
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种血清淀粉样蛋白A检测试剂盒及其制备与应用。
背景技术
血清淀粉样蛋白A(serumamyloidAprotein，SAA)是一类多基因编码的多形态蛋白家族，是组织淀粉样蛋白A的前体物质，属于急性时相反应蛋白，其相对分子量约12000。在急性时相反应中，如炎症或感染急性期，经IL-1、IL-6和TNF刺激，SAA在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成，在48～72小时内浓度迅速升高，可升高到最初浓度的100～1000倍，但其半衰期短，只有50分钟左右，并在疾病恢复期迅速下降。某些疾病，如病毒感染、移植排斥反应、冠心病等，SAA的敏感性高，可为临床提供更好的参考价值，作为一个新的检测指标，SAA受到人们越来越多的关注。
通常血清淀粉样蛋白A试剂盒由两部分组成，试剂R1与试剂R2，R1试剂和R2试剂通常均为为液态状态。
现有的血清淀粉样蛋白A试剂盒的缺陷包括：R1试剂与R2试剂在液态状态下在寒冷地区运输容易被冻成固态，温度恢复后又变为液态，这样反复冻融容易导致试剂的检测稳定性差，使得对运输温度的要求过高，如果采用恒温运输，则需要在运输工具内安装温控装置，增加了运输的难度。
发明内容
根据第一方面，一种实施例中提供一种试剂盒的制备方法，所述试剂盒包括R1试剂、R2试剂中的至少一种，所述R2试剂含有胶乳抗体复合物，所述抗体选自可特异性结合至血清淀粉样蛋白A的抗体，所述制备方法包括对R1试剂、R2试剂中的至少一种进行冻干，冻干方法包括：
第一干燥段：在低气压条件下，将存放有预冻至第一温度的试剂的冷冻腔室升温至第二温度，在第二温度下的保持时间为4-5h；
第二干燥段：第一干燥段结束后，在低气压条件下，将存放有试剂的冷冻腔室从第二温度升温至第三温度，在第三温度下的保持时间为5-10h；
第三干燥段：第二干燥段结束后，在低气压条件下，将存放有试剂的冷冻腔室从第三温度升温至第四温度，在第四温度下的保持时间为5-10h。
根据第二方面，一种实施例中提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括R1试剂、R2试剂中的至少一种，所述R2试剂含有胶乳抗体复合物，所述抗体选自可特异性结合至血清淀粉样蛋白A的抗体，所述R1试剂、R2试剂各自独立地含有稳定剂、赋形剂中的至少一种。
根据第三方面，一种实施例中提供第二方面所述试剂盒在检测血清淀粉样蛋白A中的应用。
依据上述实施例的一种血清淀粉样蛋白A检测试剂盒及其制备与应用，冻干处理后的试剂稳定性高，便于在寒冷地区运输，环境温度的升降对检测试剂的检测性能无显著影响。
附图说明
图1为实施例1的冻干试剂与液态试剂检测结果图；
图2为实施例1制得的冻干试剂与该冻干试剂再冻干复溶1次、2次、3次后的检测结果图；
图3为普通液态试剂与分别冻干复溶1次、2次、3次的普通液态试剂的检测结果图；
图4为实施例2的冻干试剂检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”，如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。
根据第一方面，在一些实施例中，提供一种试剂盒的制备方法，所述试剂盒包括R1试剂、R2试剂中的至少一种，所述R2试剂含有胶乳抗体复合物，所述抗体选自可特异性结合至血清淀粉样蛋白A的抗体，所述制备方法包括对R1试剂、R2试剂中的至少一种进行冻干，冻干方法包括：
第一干燥段：在低气压条件下，将存放有预冻至第一温度的试剂的冷冻腔室升温至第二温度，在第二温度下的保持时间为4-5h；
第二干燥段：第一干燥段结束后，在低气压条件下，将存放有试剂的冷冻腔室从第二温度升温至第三温度，在第三温度下的保持时间为5-10h；
第三干燥段：第二干燥段结束后，在低气压条件下，将存放有试剂的冷冻腔室从第三温度升温至第四温度，在第四温度下的保持时间为5-10h。
在一些实施例中，所述第一温度为-40℃。
在一些实施例中，所述第二温度为-30℃。
在一些实施例中，所述第三温度为5℃。
在一些实施例中，所述第四温度为20℃。
在一些实施例中，所述低气压为10±10Pa。
在一些实施例中，第一干燥段的保温期间对存放有试剂的冷冻腔室进行通气。通气的方式可以是间断性通气，也可以是连续通气，通气的目的是使得冷冻腔室内的水分子外排，促进试剂的干燥。第二干燥段、第三干燥段几乎没有水分子产生，因此无需通气。
第一干燥段、第二干燥段、第三干燥段的升温速率为本领域的常规技术手段，本领域技术人员可以根据需要选择合适的升温速率，对存放有试剂的冷冻强室内的温度进行逐步升温。
在一些实施例中，所述R1试剂、R2试剂各自独立地含有稳定剂、赋形剂中的至少一种。
在一些实施例中，所述R1试剂、R2试剂各自独立地含有如下终浓度的组分中的至少一种：1-10g/L稳定剂、1-10g/L赋形剂。
在一些实施例中，所述R1试剂、R2试剂独立地含有如下终浓度的组分：1-10g/L稳定剂、1-10g/L赋形剂。
在一些实施例中，稳定剂的浓度包括但不限于1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L等等。
在一些实施例中，赋形剂的浓度包括但不限于1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L等等。
在一些实施例中，所述稳定剂包括但不限于蔗糖、海藻糖、果糖、牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶中的至少一种。
在一些实施例中，所述赋形剂包括但不限于甘露醇、聚乙二醇(亦称PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(亦称PVP，CAS登录号：9003-39-8)、丙三醇、乙二醇中的至少一种。
在一些实施例中，所述聚乙二醇包括但不限于PEG6000、PEG8000、PEG10000、PEG20000中的至少一种。
在一些实施例中，所述R1试剂、R2试剂各自独立地还含有缓冲剂、防腐剂中的至少一种。
在一些实施例中，所述R1试剂、R2试剂各自独立地还含有如下终浓度的组分中的至少一种：5-50mmol/L缓冲剂、0.5-5g/L防腐剂。
在一些实施例中，所述R1试剂、R2试剂各自独立地还含有如下终浓度的组分：5-50mmol/L缓冲剂、0.5-5g/L防腐剂。
在一些实施例中，缓冲剂的浓度包括但不限于5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L、50mmol/L等等。
在一些实施例中，防腐剂的浓度包括但不限于0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L等等。
在一些实施例中，所述缓冲剂包括但不限于磷酸缓冲盐溶液(PBS)、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris盐酸盐)溶液、甘氨酸、硼酸盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、吗啉乙磺酸(MES，亦称2-吗啉乙磺酸，CAS号：4432-31-9)中的至少一种。
在一些实施例中，所述防腐剂包括但不限于叠氮化钠、ProClin-950、ProClin-300、KroVin100、KroVin300、KroVin500、KroVin750、硫柳汞中的至少一种。
在一些实施例中，所述胶乳抗体复合物为偶联有抗体的胶乳微球。
在一些实施例中，所述胶乳微球的粒径为50-300nm。
在一些实施例中，所述胶乳微球包括但不限于聚苯乙烯。
在一些实施例中，所述胶乳抗体复合物是由胶乳微球与抗体按照(10-50)：1的质量比混合反应得到。
在一些实施例中，胶乳微球与抗体的质量比包括但不限于10：1、20：1、30：1、40：1、50：1等等。
在一些实施例中，所述R2试剂中胶乳微球的浓度为0.05-0.2wt％。胶乳微球的浓度包括但不限于0.05wt％、0.06wt％、0.07wt％、0.08wt％、0.09wt％、0.1wt％、0.11wt％、0.12wt％、0.13wt％、0.14wt％、0.15wt％、0.16wt％、0.17wt％、0.18wt％、0.19wt％、0.2wt％等等。
在一些实施例中，所述R1试剂、R2试剂的pH独立地为6.0-9.0。该pH包括但不限于6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0。
在一些实施例中，所述血清淀粉样蛋白A包括但不限于人源血清淀粉样蛋白A。
在一些实施例中，所述抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体中的至少一种。抗体可以从市场上购买得到。
在一些实施例中，所述抗体包括但不限于羊抗人血清淀粉样蛋白A多克隆抗体、鼠抗人血清淀粉样蛋白A单克隆抗体、兔抗人血清淀粉样蛋白A多克隆抗体中的至少一种。
根据第二方面，在一些实施例中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包括R1试剂、R2试剂中的至少一种，所述R2试剂含有胶乳抗体复合物，所述抗体选自可特异性结合至血清淀粉样蛋白A的抗体，所述R1试剂、R2试剂各自独立地含有稳定剂、赋形剂中的至少一种。
在一些实施例中，所述R1试剂、R2试剂各自独立地含有如下终浓度的组分中的至少一种：1-10g/L稳定剂、1-10g/L赋形剂。
在一些实施例中，所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、果糖、牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶中的至少一种。
在一些实施例中，所述赋形剂选自甘露醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙三醇、乙二醇中的至少一种。
在一些实施例中，所述聚乙二醇选自PEG6000、PEG8000、PEG10000、PEG20000中的至少一种。
在一些实施例中，所述R1试剂、R2试剂各自独立地还含有缓冲剂、防腐剂中的至少一种。
在一些实施例中，所述R1试剂、R2试剂各自独立地还含有如下终浓度的组分中的至少一种：5-50mmol/L缓冲剂、0.5-5g/L防腐剂。
在一些实施例中，缓冲剂的浓度包括但不限于5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L、50mmol/L等等。
在一些实施例中，防腐剂的浓度包括但不限于0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L等等。
在一些实施例中，所述缓冲剂选自磷酸缓冲盐溶液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、甘氨酸、硼酸盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、吗啉乙磺酸中的至少一种。
在一些实施例中，所述防腐剂选自叠氮化钠、ProClin-950、ProClin-300、KroVin100、KroVin300、KroVin500、KroVin750、硫柳汞中的至少一种。
在一些实施例中，所述R1试剂、R2试剂均为冻干所得的固态试剂。
在一些实施例中，所述试剂盒是由第一方面所述方法制得。
在一些实施例中，使用时，试剂盒中的固态R1和R2组分需要加入纯水使其复溶。
在一些实施例中，所述试剂盒还包括用于独立容纳R1试剂、R2试剂的容器。
在一些实施例中，所述试剂盒还包括使用说明书，用于指导用户使用该试剂盒进行样品检测。
根据第三方面，提供第二方面所述试剂盒在检测血清淀粉样蛋白A中的应用。
在一些实施例中，所述应用包括用于检测样本中血清淀粉样蛋白A的浓度。
在一些实施例中，所述样本包括但不限于体液样本。
在一些实施例中，所述体液样本包括但不限于全血、血清、血浆中的至少一种。
在一些实施例中，所述样本来自于人体。
实施例1
本实施例的血清淀粉样蛋白A试剂盒中含有固态的R1和R2两种试剂，所述R1和R2试剂是由含有赋形剂和稳定剂的液态试剂冻干而成，形成固态的R1和R2试剂，可用纯水复溶恢复成液态的R1和R2试剂。
本实施例的试剂盒制备方法如下：
1)R1的制备：
在调配罐中加入适量的水，调节搅拌器至合适转速，依次投入缓冲离子、稳定剂、赋形剂、防腐剂，15分钟至完全溶解，溶液澄清透明无沉淀后，调节pH至8.0，定容至最终体积。R1试剂含有如下终浓度的组分：2g/L第一稳定剂、2g/L第一赋形剂、5mmol/L第一缓冲剂、0.5g/L第一防腐剂。第一稳定剂为海藻糖、牛血清白蛋白，海藻糖、牛血清白蛋白在R1试剂中的终浓度均为1g/L，第一赋形剂为甘露醇、PEG6000，甘露醇、PEG6000在R1试剂中的终浓度均为1g/L，第一缓冲剂为Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，第一防腐剂为ProClin-300。
然后使用冻干装置将液态的R1进行冻干，后分装、标识。
2)R2的制备：
将粒径为100nm的胶乳微球稀释至一定浓度，并进行搅拌，同时边滴加兔抗人SAA抗体，每5秒加入一滴，胶乳微球与兔抗人SAA抗体按照20：1的质量比例进行混合，反应一定时间后加入10％BSA溶液反应一定时间，将混合液离心、超声重悬，将标记好的胶乳微球-SAA抗体复合物中加入适量的水，超声重悬后，依次投入第二稳定剂、第二赋形剂、第二缓冲剂、第二防腐剂，调节pH至8.0，定容至最终体积。
R2试剂含有如下终浓度的组分：胶乳微球0.1wt％、2g/L第二稳定剂、2g/L第二赋形剂、5mmol/L第二缓冲剂、0.5g/L第二防腐剂。第二稳定剂为海藻糖、牛血清白蛋白，海藻糖、牛血清白蛋白在R2试剂中的终浓度均为1g/L，第二赋形剂为甘露醇、丙三醇，甘露醇、丙三醇在R2试剂中的终浓度均为1g/L，第二缓冲剂为Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，第二防腐剂为ProClin-300。
然后使用冻干装置将液态的R2进行冻干，后分装、标识。
R1试剂、R2试剂的冻干方法如下：
A)将R1、R2试剂放入冷冻设备中进行产品预冻，设定冷冻设备内部温度为-40℃，冷冻设备开始降温，经4h后试剂温度稳定后，预冻结束。
B)第一干燥段：抽真空使冷冻设备内气压降至30Pa，并使冷冻设备内温度上升，待冷冻设备内部温度升至-30℃后，开始向冷冻设备内间断地通气，在-30℃下持续运行5h，在此过程中，将冷冻腔室内的气压控制在10±10Pa，直至产品水线消失。
C)第二干燥段：第一干燥段结束后，将冷冻设备内部温度从-30℃逐步升温至5℃，在此过程中，冷冻设备内的气压控制在10±10pa，进行第二干燥段，具体是在5℃下保持10h。
D)第三干燥段：第二干燥段结束后，冷冻设备内部温度从5℃逐步升温至20℃，进行第三干燥段，具体是在20℃下保持5h，在此过程中，冷冻设备内的气压控制在10±10pa，第三干燥段结束后，制得固态的R1试剂、R2试剂，将冷冻设备打开，将冻干后的R1试剂与R2试剂取出，独立包装。得到本实施例的冻干试剂。
用纯水将本实施例冻干的R1、R2试剂复溶，复溶后，R1试剂、R2试剂的体积与冻干前的液态试剂体积一致，检测全血样本中血清样淀粉蛋白A的浓度，作为实验组；采用未冻干的液态R1试剂、R2试剂检测全血样本中血清样淀粉蛋白A的浓度，作为对照组1；将本实施例的冻干试剂冻干复溶1次，使用所得的R1试剂、R2试剂检测全血样本中血清样淀粉蛋白A的浓度，作为对照组2；将本实施例的冻干试剂冻干复溶2次，使用所得的R1试剂、R2试剂检测全血样本中血清样淀粉蛋白A的浓度，作为对照组3；将本实施例的冻干试剂冻干复溶3次，使用所得的R1试剂、R2试剂检测全血样本中血清样淀粉蛋白A的浓度，作为对照组4。每次冻干复溶的冻干程序同本实施例的步骤A)至步骤D)，对于只需冻干复溶1次的试剂，在冻干结束后为固态，在检测样品时，使用纯水复溶至冻干前的体积，用于后续样品检测；对于需要冻干复溶2次、3次的试剂，上一次冻干结束后，用纯水复溶至冻干前的体积，然后按照本实施例的步骤A)至步骤D)进行下一次冻干程序，最后一次冻干结束后，得到固态试剂，在检测样品时，使用纯水复溶至冻干前的体积，用于后续样品检测。
检测实验的具体步骤如下：
对比实验1：使用本实施例的冻干试剂，冻干前液态的R1、R2试剂，冻干试剂再冻干复溶1次的R1、R2试剂，冻干试剂再冻干复溶2次的R1、R2试剂，冻干试剂再冻干复溶3次的R1、R2试剂，独立检测全血样本，在540nm波长下，通过与已知浓度(使用深圳市国赛生物技术有限公司的Aristo全自动特定蛋白分析仪，进行SAA试剂测试赋值得到)的全血样本比较，可定量检测出全血样本中血清样淀粉蛋白A的含量。
血清淀粉样蛋白A试剂盒中的R1和R2复溶后，用于检测时，R1试剂与R2试剂按照1:1的体积比混合。各个对照组用于全血样本检测时，R1试剂与R2试剂均按照1:1的体积比混合。
结果如图1、图2所示。
图1为使用冻干前液态的R1、R2试剂，本实施例冻干后的R1、R2试剂，检测出全血样本中血清样淀粉蛋白A的含量结果图，横坐标为全血中血清样淀粉蛋白A的浓度(mg/L)，纵坐标为反应度。
从图1可见，使用实施例1冻干后的R1、R2试剂复溶，测试一定浓度的全血样本，检测得到的相同浓度的样本的反应度与冻干前的液态R1、R2试剂检测所得的反应度几乎一致，说明冻干复溶后的试剂与未冻干的试剂测试值无显著差别，测试不受冻干的影响，显著提高了试剂的稳定性。
图2为使用本实施例的冻干试剂，冻干试剂再冻干复溶1次的R1、R2试剂，冻干试剂冻干再复溶2次的R1、R2试剂，冻干试剂再冻干复溶3次的R1、R2试剂，检测出全血样本中血清样淀粉蛋白A的含量结果图，横坐标为全血中血清样淀粉蛋白A的浓度(mg/L)，纵坐标为反应度。
使用冻干后的R1、R2试剂冻干复溶1次、2次、3次，每次冻干复溶的程序同本实施例的步骤A)至步骤D)，冻干复溶2次、3次时，上一次冻干复溶结束后，用纯水复溶至冻干前的体积，然后按照本实施例的步骤A)至步骤D)进行冻干。测试全血样本中的血清样淀粉蛋白A的含量，结果如图2所示，从其结果来看，用于检测相同浓度的全血样本时，本实施例的冻干试剂检测出的反应度与使用冻干复溶1次、2次、3次的试剂的检测结果均高度接近，不受冻干复溶次数的影响，说明本实施例冻干的R1、R2试剂更加稳定，即使在寒冷地区运输，也不会因环境温度的变化而影响试剂的检测准确性。
对比例1
本对比例提供普通液态试剂，其中的R1试剂不含第一稳定剂、第一赋形剂，R2试剂不含第二稳定剂、第二赋形剂，其他组分及含量同实施例1，将三等份的普通液态试剂，分别冻干复溶1次、2次、3次，每次冻干复溶的方法同对比实验1，得到相应的试剂后，进行全血检测。
图3为使用未经过冻干处理的普通液态试剂，普通液态试剂冻干复溶1次的R1、R2试剂，普通液态试剂冻干复溶2次的R1、R2试剂，普通液态试剂冻干复溶3次的R1、R2试剂，分别测试全血样本中的血清样淀粉蛋白A的含量的结果图。
从图3可知，用于检测相同浓度的全血样本时，冻干复溶次数越多，反应度越低，冻干复溶1次、2次、3次的R1、R2试剂模拟了试剂在寒冷地区运输时容易被冻成固态的情形，可见，普通液态试剂冻干复溶1次、2次、3次后，稳定性显著下降，说明稳定剂和赋形剂可显著提高R1试剂、R2试剂的稳定性。
实施例2
本实施例的血清淀粉样蛋白A试剂盒中含有固态的R1和R2两种试剂，所述R1和R2试剂是由含有赋形剂和稳定剂的液态试剂冻干而成，形成固态的R1和R2试剂，可用纯水复溶恢复成液态的R1和R2试剂。
本实施例的试剂盒制备方法如下：
1)R1的制备：
在调配罐中加入适量的水，调节搅拌器至合适转速，依次投入缓冲离子、稳定剂、赋形剂、防腐剂，15分钟至完全溶解，溶液澄清透明无沉淀后，调节pH至8.0，定容至最终体积。R1试剂含有如下终浓度的组分：10g/L第一稳定剂、10g/L第一赋形剂、50mmol/L第一缓冲剂、5g/L第一防腐剂。第一稳定剂为海藻糖、牛血清白蛋白，海藻糖、牛血清白蛋白在R1试剂中的终浓度均为5g/L，第一赋形剂为甘露醇、PEG6000，甘露醇、PEG6000在R1试剂中的终浓度均为5g/L，第一缓冲剂为Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，第一防腐剂为ProClin-300。
然后使用冻干装置将液态的R1进行冻干，后分装、标识。
2)R2的制备：
将粒径为100nm的胶乳微球稀释至一定浓度，并进行搅拌，同时边滴加兔抗人SAA抗体，每5秒加入一滴，胶乳微球与兔抗人SAA抗体按照20：1的质量比例进行混合，反应一定时间后，再加入10％BSA溶液反应一定时间，将混合液离心、超声重悬，向标记好的胶乳微球-SAA抗体复合物中加入适量的水，超声重悬后，依次投入第二稳定剂、第二赋形剂、第二缓冲剂、第二防腐剂，调节pH至8.0，定容至最终体积。
R2试剂含有如下终浓度的组分：胶乳微球0.2wt％、10g/L第二稳定剂、10g/L第二赋形剂、50mmol/L第二缓冲剂、5g/L第二防腐剂。第二稳定剂为海藻糖、牛血清白蛋白，海藻糖、牛血清白蛋白在R2试剂中的终浓度均为5g/L，第二赋形剂为甘露醇、丙三醇，甘露醇、丙三醇在R2试剂中的终浓度均为5g/L，第二缓冲剂为Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，第二防腐剂为ProClin-300。
然后使用冻干装置将液态的R2进行冻干，后分装、标识。
R1试剂、R2试剂的冻干方法如下：
A)将R1、R2试剂放入冷冻设备中进行产品预冻，设定冷冻设备内部温度为-40℃，冷冻设备开始降温，经4h后试剂温度稳定后，预冻结束。
B)第一干燥段：抽真空使冷冻设备内气压降至30Pa，并使冷冻设备内温度上升，待冷冻设备内部温度升至-30℃后，开始向冷冻设备内间断地通气，在-30℃下保持运行5h，在此过程中，将冷冻腔室内的气压控制在10±10Pa，直至产品水线消失。
C)第二干燥段：第一干燥段结束后，将冷冻设备内部温度从-30℃逐步升温至5℃，在此过程中，冷冻设备内的气压控制在10±10pa，进行第二干燥段，具体是在5℃保持运行10h。
D)第三干燥段：第二干燥段结束后，冷冻设备内部温度从5℃逐步升温至20℃，进行第三干燥段，具体是在20℃保持运行10h，在此过程中，冷冻设备内的气压控制在10±10pa，第三干燥段结束后，制得固态的R1试剂、R2试剂，将冷冻设备打开，将冻干后的R1试剂与R2试剂取出，独立包装。
用纯水将本实施例冻干的R1、R2试剂复溶，复溶后，R1试剂、R2试剂的体积与冻干前的液态试剂体积一致，检测全血样本中血清样淀粉蛋白A的浓度，作为实验组；采用未冻干的液态R1试剂、R2试剂检测全血样本中血清样淀粉蛋白A的浓度，作为对照组5。
检测步骤如下：
使用冻干前液态的R1、R2试剂，在540nm波长下，通过与已知浓度(使用深圳市国赛生物技术有限公司的Aristo全自动特定蛋白分析仪，进行SAA试剂测试赋值得到)的全血样本比较，可定量检测出全血样本中血清样淀粉蛋白A的含量。使用本实施例的方法制备的R1、R2冻干试剂进行复溶后测试已知浓度的全血样本，使用普通液态的R1、R2试剂测试同样的全血样本，将测试结果进行对比。
本实施例制得的血清淀粉样蛋白A试剂盒中的R1和R2复溶后，用于检测全血样本时，R1试剂与R2试剂按照1:1的体积比混合。冻干前的液态试剂用于检测全血样本时，R1试剂与R2试剂同样按照1:1的体积比混合。
图4为本实施例冻干后复溶的试剂与冻干前的液态试剂的检测结果图。
实验结果如下图4所示，图4的横坐标为全血中血清样淀粉蛋白A的浓度(mg/L)，纵坐标为反应度。
从图4可知，使用本实施例2冻干后的R1、R2试剂复溶，测试一定浓度的全血样本，检测得到的相同浓度的样本的反应度与冻干前的液态R1、R2试剂检测所得的反应度几乎一致，说明冻干复溶后的试剂与未冻干的试剂测试值无显著差别，测试结果不受冻干的影响，显著提高了试剂的稳定性。
在一些实施例中，本发明使用冻干技术将血清淀粉样蛋白A试剂盒的R1和R2试剂进行冻干，可提高试剂在寒冷地区的运输方便性和试剂反复冻融的稳定性。
在一些实施例中，本发明检测时操作方便，运输时为固体状态，不受寒冷地区温度的影响，使用时复溶为液体后不会破坏抗体的活性，检测时为液体状态，性能不受影响。保证了寒冷地区运输方面方便储存、增强了试剂反复冻融的稳定性。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (10)

1.一种试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒包括R1试剂、R2试剂中的至少一种，所述R2试剂含有胶乳抗体复合物，所述抗体选自可特异性结合至血清淀粉样蛋白A的抗体，所述制备方法包括对R1试剂、R2试剂中的至少一种进行冻干，冻干方法包括：
第一干燥段：在低气压条件下，将存放有预冻至第一温度的试剂的冷冻腔室升温至第二温度，在第二温度下的保持时间为4-5h；
第二干燥段：第一干燥段结束后，在低气压条件下，将存放有试剂的冷冻腔室从第二温度升温至第三温度，在第三温度下的保持时间为5-10h；
第三干燥段：第二干燥段结束后，在低气压条件下，将存放有试剂的冷冻腔室从第三温度升温至第四温度，在第四温度下的保持时间为5-10h。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一温度为-40℃；
和/或，所述第二温度为-30℃；
和/或，所述第三温度为5℃；
和/或，所述第四温度为20℃；
和/或，所述低气压为10±10Pa；
和/或，第一干燥段的保温期间对存放有试剂的冷冻腔室进行通气。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述R1试剂、R2试剂各自独立地含有稳定剂、赋形剂中的至少一种；
和/或，所述R1试剂、R2试剂各自独立地含有如下终浓度的组分中的至少一种：1-10g/L稳定剂、1-10g/L赋形剂；
和/或，所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、果糖、牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶中的至少一种；
和/或，所述赋形剂选自甘露醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙三醇、乙二醇中的至少一种；
和/或，所述聚乙二醇选自PEG6000、PEG8000、PEG10000、PEG20000中的至少一种；
和/或，所述R1试剂、R2试剂各自独立地还含有缓冲剂、防腐剂中的至少一种；
和/或，所述R1试剂、R2试剂各自独立地还含有如下终浓度的组分中的至少一种：5-50mmol/L缓冲剂、0.5-5g/L防腐剂；
和/或，所述缓冲剂选自磷酸缓冲盐溶液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、甘氨酸、硼酸盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、吗啉乙磺酸中的至少一种；
和/或，所述防腐剂选自叠氮化钠、ProClin-950、ProClin-300、KroVin100、KroVin300、KroVin500、KroVin750、硫柳汞中的至少一种。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胶乳抗体复合物为偶联有抗体的胶乳微球；
和/或，所述胶乳微球的粒径为50-300nm；
和/或，所述胶乳微球选自聚苯乙烯；
和/或，所述胶乳抗体复合物是由胶乳微球与抗体按照(10-50)：1的质量比混合反应得到；
和/或，所述R2试剂中胶乳微球的浓度为0.05-0.2wt％；
和/或，所述R1试剂、R2试剂的pH独立地为6.0-9.0。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述血清淀粉样蛋白A选自人源血清淀粉样蛋白A；
和/或，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体中的至少一种；
和/或，所述抗体选自羊抗人血清淀粉样蛋白A多克隆抗体、鼠抗人血清淀粉样蛋白A单克隆抗体、兔抗人血清淀粉样蛋白A多克隆抗体中的至少一种。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括R1试剂、R2试剂中的至少一种，所述R2试剂含有胶乳抗体复合物，所述抗体选自可特异性结合至血清淀粉样蛋白A的抗体，所述R1试剂、R2试剂各自独立地含有稳定剂、赋形剂中的至少一种。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂、R2试剂各自独立地含有如下终浓度的组分中的至少一种：1-10g/L稳定剂、1-10g/L赋形剂；
和/或，所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、果糖、牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶中的至少一种；
和/或，所述赋形剂选自甘露醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙三醇、乙二醇中的至少一种；
和/或，所述聚乙二醇选自PEG6000、PEG8000、PEG10000、PEG20000中的至少一种。
和/或，所述R1试剂、R2试剂各自独立地还含有缓冲剂、防腐剂中的至少一种；
和/或，所述R1试剂、R2试剂各自独立地还含有如下终浓度的组分中的至少一种：5-50mmol/L缓冲剂、0.5-5g/L防腐剂；
和/或，所述缓冲剂选自磷酸缓冲盐溶液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、甘氨酸、硼酸盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、吗啉乙磺酸中的至少一种；
和/或，所述防腐剂选自叠氮化钠、ProClin-950、ProClin-300、KroVin100、KroVin300、KroVin500、KroVin750、硫柳汞中的至少一种。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂、R2试剂均为冻干所得的固态试剂；
和/或，所述试剂盒是由权利要求1-5任意一项所述制备方法制得；
和/或，所述试剂盒还包括用于独立容纳R1试剂、R2试剂的容器；
和/或，所述试剂盒还包括使用说明书。
9.如权利要求6-8任意一项所述试剂盒在检测血清淀粉样蛋白A中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，所述应用包括用于检测样本中血清淀粉样蛋白A的浓度；
和/或，所述样本选自体液样本；
和/或，所述体液样本选自全血、血清、血浆中的至少一种；
和/或，所述样本来自于人体。
CN202011554341.5A 2020-12-24 2020-12-24 一种血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备与应用 Active CN112798791B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011554341.5A CN112798791B (zh) 2020-12-24 2020-12-24 一种血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备与应用
PCT/CN2021/092458 WO2022134430A1 (zh) 2020-12-24 2021-05-08 一种血清淀粉样蛋白 a 检测试剂盒及其制备与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011554341.5A CN112798791B (zh) 2020-12-24 2020-12-24 一种血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112798791A true CN112798791A (zh) 2021-05-14
CN112798791B CN112798791B (zh) 2023-08-08

Family

ID=75804218

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011554341.5A Active CN112798791B (zh) 2020-12-24 2020-12-24 一种血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备与应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN112798791B (zh)
WO (1) WO2022134430A1 (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101716343A (zh) * 2008-10-09 2010-06-02 哈药集团生物工程有限公司 一种单克隆抗体的冻干制剂
US20100285073A1 (en) * 2007-07-31 2010-11-11 The Board Of Regents, The University Of Texas System a micro-rna family that modulates fibrosis and uses thereof
CN103076455A (zh) * 2012-12-26 2013-05-01 上海奥普生物医药有限公司 快速定量检测血清淀粉样蛋白a试剂盒及其制备和应用
CN103585118A (zh) * 2013-10-29 2014-02-19 王明丽 一种重组猪干扰素α1产品的冻干方法
CN108387748A (zh) * 2018-05-04 2018-08-10 广州敏捷生物技术有限公司 用于检测猫血清淀粉样蛋白a的免疫荧光层析检测卡与制备方法
CN110684188A (zh) * 2019-10-31 2020-01-14 北京纳百生物科技有限公司 壬基酚聚氧乙烯醚半抗原和全抗原及其制备方法与应用
CN110907639A (zh) * 2019-12-05 2020-03-24 四川新健康成生物股份有限公司 血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备方法
CN110940815A (zh) * 2019-12-16 2020-03-31 成都普利泰生物科技有限公司 定量测定猫血清淀粉样蛋白a的乳胶免疫比浊检测试剂盒

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105709235B (zh) * 2016-03-31 2019-02-26 深圳市国赛生物技术有限公司 一种冻干保护剂及乳胶偶联抗体的冻干方法
CN108828225A (zh) * 2018-04-25 2018-11-16 迪瑞医疗科技股份有限公司 血清淀粉样蛋白a含量测定的试剂盒、制备方法及检测方法
CN109633167A (zh) * 2018-12-20 2019-04-16 北京贝尔生物工程股份有限公司 一种高灵敏度、宽检测范围的人血清淀粉样蛋白a测定试剂盒
CN110133282A (zh) * 2019-05-06 2019-08-16 中生北控生物科技股份有限公司 炎症类标志物复合质控品及其制备方法与应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100285073A1 (en) * 2007-07-31 2010-11-11 The Board Of Regents, The University Of Texas System a micro-rna family that modulates fibrosis and uses thereof
CN101716343A (zh) * 2008-10-09 2010-06-02 哈药集团生物工程有限公司 一种单克隆抗体的冻干制剂
CN103076455A (zh) * 2012-12-26 2013-05-01 上海奥普生物医药有限公司 快速定量检测血清淀粉样蛋白a试剂盒及其制备和应用
CN103585118A (zh) * 2013-10-29 2014-02-19 王明丽 一种重组猪干扰素α1产品的冻干方法
CN108387748A (zh) * 2018-05-04 2018-08-10 广州敏捷生物技术有限公司 用于检测猫血清淀粉样蛋白a的免疫荧光层析检测卡与制备方法
CN110684188A (zh) * 2019-10-31 2020-01-14 北京纳百生物科技有限公司 壬基酚聚氧乙烯醚半抗原和全抗原及其制备方法与应用
CN110907639A (zh) * 2019-12-05 2020-03-24 四川新健康成生物股份有限公司 血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备方法
CN110940815A (zh) * 2019-12-16 2020-03-31 成都普利泰生物科技有限公司 定量测定猫血清淀粉样蛋白a的乳胶免疫比浊检测试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
郑铁生: "《临床生物化学检验》", 31 August 2015, 中国医药科技出版社, pages: 52 - 53 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112798791B (zh) 2023-08-08
WO2022134430A1 (zh) 2022-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US3551555A (en) Coated immunochemical reagent particles and process of preparation
Ts'o et al. Studies of ribosomes from reticulocytes
Kass et al. Studies on the purification of antihemophilic factor (factor viii): i. precipitation of antihemophilic factor by concanavalin A
ES2381334T3 (es) Procedimientos de turbidimetria de látex inmunológica y reactivo para el mismo
IE44471B1 (en) Stable preparation of erythrocytes process for preparing it and its use
Linscott et al. Guinea pig β1c-globulin: Its relationship to the third component of complement and its alteration following interaction with immune complexes
US10905113B2 (en) Compositions and method for storing liquid biospecimens
JP4106111B2 (ja) イムノアッセイ用較正／対照用配合物
CN112798791B (zh) 一种血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备与应用
US4100268A (en) Preparation of gentamicin sensitized particles for agglutination tests
Carr Jr et al. Effect of homo poly (L-amino acids) on fibrin assembly: role of charge and molecular weight
CN112904011A (zh) 一种血清C1q补体的检测试剂盒及制备方法
US5837474A (en) Immunological method for the detection of malignant tumors and kit for performing the method
NO160554B (no) Reagens for bestemmelse av ristocetin-kofaktoren (willebrand-faktor).
US11968975B2 (en) Compositions and methods for storing liquid biospecimens
Purves et al. Sites of D-domain interaction in fibrin-derived D dimer
WO2018227359A1 (en) A novel method for blood serum protein activity preservation
JP3274743B2 (ja) 診断用キット
Berman et al. Profiling the activity of G proteins in patient‐derived tissues by rapid affinity‐capture of signal transduction proteins (GRASP)
RU2181893C2 (ru) Способ получения референс-панели для контроля качества тест-систем и вакцин против гепатита в
JPH0674956A (ja) 抗体測定用試薬
CN111393523A (zh) 一种ha阻断剂的制备方法、抗体检测系统
JPS58144748A (ja) 免疫学的反応用ラテツクス試薬
Hong et al. Univalence of half-molecules of rabbit antibody
CN116973569A (zh) 甲胎蛋白异质体3检测试剂盒及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant