JPH0674956A - 抗体測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 感受性チオール基を持つ抗原またはそれと実
質的に同等の作用を有するペプチドを用いる試薬による
免疫学的方法による検体中の抗体測定系で、抗体を試薬
の貯蔵状態などに影響されること無く高い感度で測定す
ると共により正確に測定する。 【構成】 検体中の抗体を免疫学的方法により測定する
ための感受姓チオール基を持つ抗原またはそれと実質的
に同等の作用を有するペプチド含有試薬において、該試
薬に還元剤を含有せしめるか、固相化された該感受性チ
オール基を持つ抗原またはそれと実質的に同等の作用を
有するペプチド含有試薬を還元剤で処理することにより
抗体を試薬の貯蔵状態などに影響されること無く高い感
度で測定すると共により正確に測定できる。 【効果】 検体中の抗体を免疫学的方法により測定する
にさいし、その試薬の感度を高めることが出来る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は抗体を測定するための試
薬、特に免疫学的方法により検体中の抗体を感受性チオ
ール基を持つ抗原またはそれと実質的に同等の作用を有
するペプチドを用いて測定するための試薬において、抗
体を試薬の貯蔵状態などに影響されること無く高い感度
で測定すると共により正確に測定するための測定用試薬
に関する。特に、本発明はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）
に対する抗体を測定するための試薬、特に免疫学的方法
により検体中のＨＣＶ抗体を高い感度で測定すると共に
より正確に測定するための測定用試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染
を診断する方法としては、１９８８年に米国カイロン社
よりＨＣＶゲノム上の非構造領域であるＮＳ３およびＮ
Ｓ４領域にコードされるＣ１００−３抗原を使用したＨ
ＣＶ抗体測定系が開発された。１９９１年には、ＨＣＶ
ゲノム上の構造領域であるコア領域およびＣ１００ー３
抗原とは重複しないＮＳ３領域にコードされるコア抗原
およひ３３Ｃ抗原の使用により更に感度および検出率の
優れたＨＣＶ抗体測定系が開発された。これらＨＣＶ抗
体の測定法としては、赤血球やラテックス粒子を抗原担
持担体として用いる凝集法、ビーズ、チューブ、あるい
はプレートを抗原固相化担体として用いるイムノメトリ
ック法等が用いられている。しかし、抗原を担体上へ固
相化する工程中あるいは調製された試薬の保存中に抗原
の活性が反応溶液中で急激に低下し、抗原抗体反応が十
分に進行できないために測定感度が十分に上がらない、
更には抗原の活性が経時的に変化するために感度の再現
性が悪化する等の問題があった。このようにある種の抗
原を用いた試薬の場合、試薬の保存中に抗原の活性が反
応溶液中で急激に低下し、抗原抗体反応が十分に進行で
きず測定感度が十分に上がらないとか、抗原の活性が経
時的に変化するために感度の再現性が悪化する等の問題
があった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、従来の
ＨＣＶ抗体測定系における感度の問題を解決すべく鋭意
研究した結果、この感度不良の問題は、ＨＣＶ抗原、特
にＨＣＶゲノム上のＮＳ３領域にコードされているタン
パク質に含まれているシステインが自然酸化を受け、ジ
スルフィド結合等になることに起因することを解明し
た。本発明者等は、これらの知見に基づきＨＣＶ測定系
に還元剤、特にチオール保護剤を添加することにより、
そのＨＣＶ抗体測定系の感度の低下の問題を防止でき、
さらにその還元剤処理は該測定系に悪影響を与えないも
のであることを知った。本発明者等は、この知見から感
受性チオール基を持つ抗原またはそれと実質的に同等の
作用を有するペプチドを用いる試薬による免疫学的方法
による検体中の抗体測定系にも還元剤、特にチオール保
護剤を添加したりすることにより感度の低下を防止でき
るだけでなく、該測定系に悪影響を与えないようになし
うるとの応用ができると考え、本発明を完成したもので
ある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は検体中の抗体を
免疫学的方法により測定するための感受性チオール基を
持つ抗原またはそれと実質的に同等の作用を有するペプ
チド含有試薬において、還元剤を含有せしめること、あ
るいは担体に固相化した抗原を還元剤で処理することを
特徴とし、測定系の感度を高めたり、測定結果の信頼性
を高めるにある。特には本発明は検体中のＨＣＶ抗体を
免疫学的方法により測定するための試薬において、該Ｈ
ＣＶ抗原またはそれと実質的に同等の作用を有するペプ
チド含有試薬に還元剤を含有せしめること、あるいは担
体に固相化したＨＣＶ抗原またはそれと実質的に同等の
作用を有するペプチドを還元剤で処理することを特徴と
し、測定系の感度を高めたり、測定結果の信頼性を高め
るにある。本発明において用いられる検体としては、問
題の抗体を含有する生体由来成分であればよく、例え
ば、血液、血清、精液、脊髄液、リンパ液、痰、涙、唾
液、乳汁、白血球、消化器官粘液、尿等の体液あるいは
組織液等が挙げられ、更にインビトロの細胞培養液等が
挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【０００５】本発明は、赤血球やラテックス粒子等の微
粒子担体に感受性チオール基を持つ抗原またはそれと実
質的に同等の作用を有するペプチドを感作した感作担体
を用いて、凝集反応により検体中の特異抗体を免疫学的
に測定するために使用する試薬を製造するに際し、担体
にその抗原を感作した後、得られた感作担体を還元剤を
含有する緩衝液に分散させ、上記感作担体含有緩衝液を
凍結乾燥することにより達成することが出来る。特に本
発明は、赤血球やラテックス粒子等の微粒子担体にＨＣ
Ｖ抗原を感作した感作担体を用いて、凝集反応により検
体中のＨＣＶ抗体を免疫学的に測定するために使用する
試薬を製造するに際し、担体にＨＣＶ抗原を感作した
後、得られた感作担体を還元剤を含有する緩衝液に分散
させ、上記感作担体を含有する緩衝液を凍結乾燥するこ
とからなる。ここで用いることが出来る還元剤として
は、チオール保護剤として知られたものが挙げられる。
また、還元剤としては、チオール基の酸化防止剤である
ものが好ましく、例えばジチオスレイトール、ジチオエ
リスリトール、チオグリコール酸、システイン、グルタ
チオン、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエ
チルアミンおよびこれらの混合物から成る群より選ばれ
た少なくとも一つであるものが挙げられる。特に、ジチ
オスレイトール、グルタチオン、２−メルカプトエタノ
ール等が好ましい。

【０００６】ここで用いることが出来る微粒子担体とし
ては、微粒子用担体として広く知られたものが挙げら
れ、例えば合成樹脂、ニトロセルロース等の天然あるい
は合成の高分子等から作られたものの他、ラテックス粒
子等あるいは赤血球等が挙げられる。本発明に従えば、
凝集反応時に感作担体を懸濁させる際の使用緩衝液中に
上記還元剤を添加してもよい。また、本発明は、感受性
チオール基を持つ抗原またはそれと実質的に同等の作用
を有するペプチドを不溶性担体に固相化することによっ
て得られた固相化抗原を用いて、エンザイムイムノアッ
セイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、あ
るいはフルオロイムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法によ
り検体中の特異抗体を免疫学的に測定するために使用す
る試薬を製造するに際し、不溶性担体に感受性チオール
基を持つ抗原またはそれと実質的に同等の作用を有する
ペプチドを固相化した後、得られた抗原結合固相を前記
の還元剤あるいはこれらの混合物を含有する緩衝液に浸
漬した後、上記固相を乾燥することにより達成すること
が出来る。特に、本発明では、ＨＣＶ抗原を不溶性担体
に固相化することによって得られた固相化抗原を用い
て、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）、あるいはフルオロイムノアッセ
イ（ＦＩＡ）等の方法により検体中のＨＣＶ抗体を免疫
学的に測定するために使用する試薬を製造するに際し、
不溶性担体にＨＣＶ抗原を固相化した後、得られた抗原
結合固相を前記の還元剤あるいはこれらの混合物を含有
する緩衝液に浸漬した後、上記固相を乾燥することによ
り達成することが出来る。

【０００７】ここで用いることが出来る還元剤として
は、上記と同様なチオール保護剤として知られたものが
挙げられる。本発明に従えば、抗原結合固相に検体中の
特異抗体を反応させる際に使用する反応液中に上記の還
元剤あるいはこれらの混合物を添加してもよい。ここで
用いることが出来る不溶性担体としては、固相化用担体
として広く知られたものが挙げられ、例えばポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリレート
等の合成樹脂、ニトロセルロース、重合アミノ酸、多糖
等の天然あるいは合成の高分子、ガラス等から作られ
た、粒子、膜、ビーズ、チューブ、あるいはプレート等
の形状のものがある。また、固相化にあたっては、物理
的吸着法あるいは化学的に結合剤を用いて固相化せしめ
る方法がある。化学的な結合剤としては、通常の当業者
に知られたものの中から選択することができるが、例え
ば、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−
ヨード酢酸、コハク酸等の活性エステル、トリアジンの
活性エステル、スルホン酸エステル誘導体等が挙げられ
るが、これらに限定されるものではない。

【０００８】本発明で用いる抗原としては、感受性チオ
ール基を持つ抗原またはそれと実質的に同等の作用を有
するペプチドが挙げられる。ここで感受性チオール基と
はタンパク質またはペプチドに含まれているシステイン
中のチオール基であって、通常のもとで自然酸化または
人工的酸化に感受性で、該抗原の活性に大きく影響を与
えうる基をいう。ここで抗原の活性とは、特異的な抗原
抗体反応をなすことができるものをいい、特に検体中の
特異抗体と免疫学的方法で反応する特異抗原の活性を指
す。本発明で用いる抗原は、このように感受性チオール
基を持つものであれば、遺伝子工学的手法によって作製
された発現産物たる組換え抗原、あるいは合成ペプチド
であるものも格別の制限無く用いることが出来る。本発
明においては、たとえ分子中にシステインのチオール基
またはそれに由来するジスルフィド結合を有していても
それらが該抗原の活性に影響を与ええる基でない場合
は、本発明で還元剤による処理をなす抗原としてはそれ
を意図しない。特に本発明で用いるＨＣＶ抗原は、遺伝
子工学的手法によって作製された発現産物たる組換えＨ
ＣＶ抗原、あるいは合成ペプチドであるＨＣＶ抗原ペプ
チドが挙げられる。本発明で用いるＨＣＶ抗原として、
好ましいものとしてはＨＣＶゲノム上の非構造領域のＮ
Ｓ３領域に相当するものが挙げられる。

【０００９】

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的
に説明する。 実施例１ ＤＴＴ添加による感作血球への影響 ヒト固定化赤血球をリン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）で３
回洗浄後、ｐＨ５．７の酢酸緩衝液に１容量％となるよ
うに懸濁し、遺伝子組換え技術により産生された精製Ｈ
ＣＶ抗原（コア抗原、３３Ｃ抗原およびＣ１００抗原の
混合物）を最終濃度が６μｇ／ｍｌとなるように添加
し、温室で１時間攪拌した後に、リン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）で３回洗浄し、７．５％のサツカロースを含有
するリン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）中で凍結乾燥して、
ＨＣＶ抗原感作赤血球を調製した。得られたＨＣＶ抗原
感作赤血球を２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を
含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．８）及び対照として
ＤＴＴを含まないトリス塩酸緩衝液に、１容量％となる
ように再懸濁を行い、感度を比較した。感度の比較は、
ＨＣＶ抗体陽性ヒト血清を同抗体が陰性である血清によ
り予め段階希釈したものを感度管理用血清として使用し
た。マイクロタイタープレートの各ウエルに、リン酸緩
衝液（ｐＨ ７．４）２５μｌ，及び各濃度の感度管理
用血清２５μｌを分注し、さらに感作血球を２５μｌ分
注して、ミキサーで３０秒間攪拌し、室温で１時間放置
後、結果を目視により判定した。

【表１】 表１の結果より、ＤＴＴを含有する緩衝液に感作血球を
再懸濁した場合には感度が上昇していることが示され
た。

【００１０】 実施例２ ２−ＭＥ添加による感作血球への影響 実施例１と同様に調製した感作血球を４０ｍＭの２−メ
ルカプトエタノール（２−ＭＥ）を含有するトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ ７．８）に１容量％となるように再懸濁
し、懸濁後の保存安定性について２−ＭＥを含まないト
リス塩酸緩衝液を対照にして比較した。溶解後の保存は
２〜８℃保存とし、感作血球の感度比較は実施例１に準
じて行った。

【表２】 表２の結果より、２−ＭＥの添加により、感作血球の懸
濁後の保存安定性が改善されたことが確認された。

【００１１】 実施例３ グルタチオン添加による感作血球への影響 実施例１に準じてＨＣＶ抗原を感作させた血球を、７．
５％サツカロース含有リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）に
最終濃度が４０ｍＭとなるようにグルタチオン（ＧＳ
Ｈ）を添加した凍結乾燥用の緩衝液中で凍結乾燥し、感
作血球とした。対照としてＧＨＳを含まない緩衝液中で
凍結乾燥し、対照感作血球とした。感作血球及び対照感
作血球をトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．８）に１容量％
となるように懸濁し、室温における懸濁後の安定性につ
いて、感作血球の感度により比較した。感度比較は実施
例１に準じて行った。

【表３】 表３の結果より、ＧＳＨを添加して凍結乾燥を行った感
作血球は、懸濁後の安定性が良いことが確認された。

【００１２】 実施例４ ２−ＭＥ添加による固相化抗原への影響 １／４インチのポリスチレンビーズを７．５％のサツカ
ロースを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）中に入
れ、実施例１で使用したＨＣＶ抗原を最終濃度が１０μ
ｌ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で１時間静置した
後、リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）で３回洗浄し、さら
に７．５％のサツカロースを含有するリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ ７．４）中に浸漬した後、乾燥し、ＨＣＶ抗原固相
化ビーズを得た。上記ＨＣＶ抗原固相化ビーズ１個を、
反応用緩衝液として２０ｍＭの２−ＭＥを含有するトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．８）２００μｌを入れたワイ
ドウエルのトレイにいれ、室温で１時間放置後、感度管
理用血清１０μｌを添加し、３７℃で１時間反応させ
た。反応終了後、生理食塩水で３回洗浄し、ペルオキシ
ダーゼ標識抗ヒトイムノグロブリンＧ抗体２００μｌを
添加し、３７℃で３０分反応させた。反応終了後に生理
食塩水で３回洗浄し、オルトエチレンジアミン及び過酸
化水素を含む基質溶液を１ｍｌ加え、室温で３０分反応
後に４９０ｎｍの吸光度を測定することにより判定し
た。比較対照のために、２−ＭＥを含有しないトリス塩
酸緩衝液を反応用緩衝液として用いて同様の操作を行
い、判定した。

【表４】 表４の結果より、２−ＭＥを反応用緩衝液に添加するこ
とにより、感度の上昇が見られた。

【００１３】実施例５ ２−ＭＥの添加による影響 実施例１に準じて調製したＨＣＶ抗原感作血球をトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に懸濁し、２〜８℃で２週間
放置後、ＨＣＶ抗体陽性検体として抗コア（ＨＣＶのコ
ア領域）、抗３３Ｃ（ＨＣＶのＮＳ３領域）及び抗Ｃ１
００（ＨＣＶのＮＳ３〜ＮＳ４領域）のそれぞれの抗体
を主に含む検体３種に対する感作血球の感度を測定し、
実施例１に準じて検討した。懸濁液に４０ｍＭの２−Ｍ
Ｅを添加し、同様に感度を検討した。

【表５】 その結果より、２週間の放置により感度の低下した感作
血球の感度が、ＨＣＶゲノム上のＮＳ３領域にコードさ
れる３３Ｃ抗原では、２−ＭＥの添加により回復してい
るのが認められた。

【００１４】

【発明の効果】感受性チオール基を持つ抗原またはそれ
と実質的に同等の作用を有するペプチド含有抗体測定用
試薬に還元剤を含有せしめるか、固相化された該試薬を
還元剤で処理して、検体中の抗体を免疫学的方法により
測定するにさいし、その試薬の感度を高めることが出来
る。

フロントページの続き (72)発明者 時田 進 千葉県松戸市稔台344 ダイナボット株式 会社総合研究所内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 検体中の抗体を免疫学的方法により測定
   するための感受性チオール基を持つ抗原またはそれと実
   質的に同等の作用を有するペプチド含有試薬において、
   該試薬に還元剤を含有せしめるか、固相化された該感受
   性チオール基を持つ抗原またはそれと実質的に同等の作
   用を有するペプチド含有試薬を還元剤で処理することを
   特徴とする抗体測定用試薬。
2. 【請求項２】 該抗原がＨＣＶ抗原またはそれと実質的
   に同等の作用を有するペプチドである請求項１記載の抗
   体測定用試薬。
3. 【請求項３】 還元剤が反応用溶媒中に存在する請求項
   １記載の抗体測定用試薬。
4. 【請求項４】 該試薬が、ＨＣＶ抗原またはそれと実質
   的に同等の作用を有するペプチドを担体に固相化した抗
   原であり、該試薬が還元剤で処理されている請求項１記
   載の抗体測定用試薬。
5. 【請求項５】 該抗原がＨＣＶゲノム上の非構造領域の
   ＮＳ３領域である請求項２または４記載の抗体測定用試
   薬。
6. 【請求項６】 該抗原が遺伝子組換え技術による発現産
   物である請求項５記載の抗体測定用試薬。
7. 【請求項７】 該抗原が合成ペプチドである請求項５記
   載の抗体測定用試薬
8. 【請求項８】 該試薬が、担体を含み、該担体がビー
   ズ、チューブ、プレート、赤血球、またはラテックス粒
   子である請求項１記載の抗体測定用試薬。
9. 【請求項９】 還元剤がチオール基の酸化防止剤である
   請求項１〜８記載の抗体測定用試薬。
10. 【請求項１０】 還元剤がジチオスレイトール、ジチオ
    エリスリトール、チオグリコール酸、システイン、グル
    タチオン、２−メルカプトエタノール、２−メルカプト
    エチルアミンおよびこれらの混合物から成る群より選ば
    れた少なくとも一つである請求項１〜８記載の抗体測定
    用試薬。