JPH0862219A - 還元型抗原に対する抗体アッセイ試薬及びそれを使用した測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原と
免疫学的に反応性の抗体の存在を同定するためのアッセ
イ方法において、抗還元型ＨＣＶ抗体特に、３３Ｃ抗原
に対する抗体を高い感度で正確に測定する。 【構成】 抗原としてＨＣＶゲノム上のＮＳ３領域にコ
ードされているタンパク質抗原またはそれと実質的に同
等の作用を有するペプチドを少なくとも用い、該抗原が
還元型ＮＳ３関連抗原の形態を実質上保有するように変
換または保持されていることにより、抗還元型ＨＣＶ抗
体を高い感度で測定できる。その変換保存処理は、還元
型ＮＳ３関連抗原を乾燥状態、不活性ガス中あるいは脱
酸素剤存在下で保持するとか、チオール基を、チオール
基保護または修飾試薬で修飾するとか、システイン残基
を、遺伝子組換え技術、例えば特定部位変異誘発法など
により修飾し、変異体リコビナントＮＳ３関連抗原とし
て製造するとか、などである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、試料中のＣ型肝炎ウイ
ルス（ＨＣＶ）抗原と免疫学的に反応性の抗体の存在を
同定するためのアッセイ、特に該抗原中に存在するシス
テイン残基を還元型あるいは還元型誘導体に変換あるい
は保持し、特異的に該還元型抗原またはその還元型抗原
誘導体と特異的に反応性の抗体を検出することに関す
る。ＨＣＶゲノムのＮＳ３領域、特に３３Ｃ抗原のシス
テイン残基が還元型あるいは還元型誘導体に変換されて
いるかあるいはその還元型に保持されているものは、Ｃ
型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に曝された個体の体液中の抗
体検出試薬として有用である。特に、本発明はＣ型肝炎
ウイルス（ＨＣＶ）に対する抗体を高い感度で測定する
と共により正確に測定するための測定用試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】急性ウイルス肝炎は、これまでＡ型肝炎
ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）など
のウイルスにより引き起こされていることが見出されて
きているが、これらＨＡＶやＨＢＶ、サイトメガロウイ
ルス、エプスタイン−バールウイルスに対する抗体が検
出されない急性肝炎が臨床的に見出され、これを非Ａ非
Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）と呼ぶことが提案された。ＨＢ
Ｖに対しては優れた試験法の開発が成功していることか
ら、現在では輸血後肝炎の大部分が非Ａ非Ｂ型肝炎であ
るという状況になっており、この意味でも非Ａ非Ｂ型肝
炎の有効な試験法の開発が求められた。

【０００３】このような中にあって、慢性非Ａ非Ｂ型肝
炎感染チンパンジーの血液から遺伝子組換え法によりク
ローニングされた非Ａ非Ｂ型肝炎の因子はＣ型肝炎ウイ
ルス（ＨＣＶ）と名付けられた（欧州特許公開第３１８
２１６号〔ＥＰ−Ａ−０３１８２１６〕、同第３８８２
３２号〔ＥＰ−Ａ−０３８８２３２〕）。こうしてＣ型
肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染を診断する方法とし
ては、１９８８年に米国カイロン社よりＣ１００−３抗
原を使用したＨＣＶ抗体測定系が開発された。このＣ１
００−３と呼ばれる抗原は、そのアミノ末端にヒトスー
パーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）に由来する１
５４個のアミノ酸残基、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含む
合成ＤＮＡアダプターの発現で導かれる５個のアミノ酸
残基、クローン化されたＨＣＶゲノム由来のｃＤＮＡフ
ラグメントの発現で導かれる３６３個のアミノ酸残基及
びＭＳ２クローニングベクターＤＮＡから導かれる５個
のカルボキシ末端にある５個のアミノ酸残基を含むもの
であると報告されている。

【０００４】１９９１年には、ＨＣＶゲノム上の構造領
域であるコア領域およびＣ１００−３抗原とは重複しな
いＮＳ３領域にコードされる３３Ｃ抗原の使用により更
に感度および検出率の優れたＨＣＶ抗体測定系が開発さ
れた。さらにＮＳ４領域にコードされる抗原の使用も図
られている。これらＨＣＶ抗体の測定法としては、赤血
球やラテックス粒子を抗原担持担体として用いる凝集
法、ビーズ、チューブ、あるいはプレートを抗原固相化
担体として用いるイムノメトリック法等が用いられてい
る。

【０００５】しかし、抗原を担体上へ固相化する工程中
あるいは調製された試薬の保存中に抗原の活性が反応溶
液中で急激に低下し、抗原抗体反応が十分に進行できな
いために測定感度が十分に上がらない、更には抗原の活
性が経時的に変化するために感度の再現性が悪化する等
の問題があった。本発明者等は先にこのＨＣＶ抗体測定
系における感度不良の問題は、ＨＣＶ抗原、特にＨＣＶ
ゲノム上のＮＳ３領域にコードされているタンパク質に
含まれているシステインが自然酸化を受け、ジスルフィ
ド結合等になることに起因するとの知見に基づきＨＣＶ
測定系に還元剤、特にチオール保護剤を添加することに
より、そのＨＣＶ抗体測定系の感度の低下の問題を防止
でき、さらにその還元剤処理は該測定系に悪影響を与え
ないものであることを確かめた。こうして検体中のＨＣ
Ｖ抗体を免疫学的方法により測定するための試薬におい
て、該ＨＣＶ抗原またはそれと実質的に同等の作用を有
するペプチド含有試薬に還元剤を含有せしめること、あ
るいは担体に固相化したＨＣＶ抗原またはそれと実質的
に同等の作用を有するペプチドを還元剤で処理した試薬
を提供した。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】こうした試薬を用いて
さらに研究を進めるなかで、ＨＣＶ陽性検体中にはＨＣ
Ｖゲノム上のＮＳ３領域にコードされているタンパク質
に含まれているシステインの酸化型に対する抗体よりも
その還元型に対する抗体の方がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣ
Ｖ）に曝された個体の体液中でははるかに高い力価で存
在を示すことを見出した。したがって、ＨＣＶ陽性検体
を検出するには安定してＨＣＶゲノム上のＮＳ３領域に
コードされているタンパク質のうち還元型システイン残
基を含有するタンパク質部分に対する抗体（以下、単に
「抗還元型ＨＣＶ抗体」という。）を検知する系を利用
するのが有用である。しかしながら、これまでは上記し
たようにペプチド含有試薬に還元剤を含有せしめると
か、担体に固相化したＨＣＶ抗原を一旦還元剤で処理す
るなどのことしかなされておらず、確実に抗還元型ＨＣ
Ｖ抗体のみを検知する系は他には知られていなかった。
また、一旦還元型のシステイン残基を含有するタンパク
質部分が測定の途中などで酸化型に変化してしまうとい
う問題を解決できなかった。

【０００７】

【課題を解決する手段】本発明者等は、より確実にＨＣ
Ｖ陽性検体を検出するためには、安定して少なくとも該
抗還元型ＨＣＶ抗体を検出できる測定系であれば、非常
に有用との考えのもと鋭意研究した結果、ＨＣＶゲノム
上のＮＳ３領域にコードされているタンパク質，特に３
３Ｃ抗原のうちのシステイン残基を該抗還元型ＨＣＶ抗
体とのみ反応できるようにすればよいことを見出し、本
発明を完成したものである。

【０００８】即ち、本発明は、検体中のＨＣＶ抗体を免
疫学的方法により測定するための抗原またはそれと実質
的に同等の作用を有するペプチド含有試薬において、該
ＨＣＶゲノム上のＮＳ３領域にコードされているタンパ
ク質抗原（以下、単に「ＮＳ３抗原」という。）または
それと実質的に同等の作用を有するペプチド（以下、単
に「ＮＳ３抗原関連ペプチド」という。）中に存在する
システイン残基を、該ＮＳ３抗原またはＮＳ３抗原関連
ペプチドに存在する還元型システイン残基を含有するタ
ンパク質抗原部分に免疫学的かつ特異的に反応性の抗体
（以下、単に「抗還元型ＨＣＶ抗体」という。）と免疫
学的かつ特異的に反応性の残基に変換または保持されて
いることを特徴とする試薬及びその製造法に関する。な
お、ＮＳ３抗原及びＮＳ３抗原関連ペプチドを含めて、
ＮＳ３関連抗原と略称する。該抗還元型ＨＣＶ抗体は、
ＨＣＶ陽性検体において抗酸化型ＨＣＶ抗体よりもはる
かに高い力価で存在することが見出され、この抗還元型
ＨＣＶ抗体に特異的に反応する抗原を試薬として用いる
ことにより、測定系の感度を高めたり、測定結果の信頼
性を高めることができる。ここで抗酸化型ＨＣＶ抗体と
はＮＳ３抗原に対して酸化状態においても反応性の抗体
を指す。

【０００９】ＮＳ３関連抗原中に存在するシステイン残
基は、以下（１）〜（５）からなる群から選ばれた処理
を施すことにより、該抗還元型ＨＣＶ抗体と免疫学的か
つ特異的に反応性の残基に変換するかまたはそのような
残基を保持しているようにされることができると考えら
れるが、要は該ＮＳ３関連抗原が該抗還元型ＨＣＶ抗体
と免疫学的かつ特異的に反応性のものに変換されるか、
あるいは該抗還元型ＨＣＶ抗体と免疫学的かつ特異的な
反応性の保持されているものであればよい。 （１）ＮＳ３関連抗原をその中に存在するシステイン残
基が還元型となるよう還元剤で処理し、得られた還元型
ＮＳ３関連抗原を乾燥状態、不活性ガス中あるいは脱酸
素剤存在下で保持する、（２）ＮＳ３関連抗原中に存在
するシステイン残基のチオール基を、チオール基保護ま
たは修飾試薬、例えばヨードアセトアミド、ヨード酢
酸、ｐ−クロロマーキュリ安息香酸、ヨウ化メチル、あ
るいは水銀、鉄、鉛などの金属などで修飾する、（３）
ＮＳ３関連抗原中に存在するシステイン残基を、遺伝子
組換え技術、例えば特定部位変異誘発法などにより修飾
し、変異体リコビナントＮＳ３抗原またはＮＳ３抗原関
連ペプチドを製造する、（４）ＮＳ３関連抗原をその中
に存在するシステイン残基が還元型となるよう還元剤で
処理し、次に還元剤除去後得られた還元型の該ＮＳ３関
連抗原を酸化防止剤の存在下使用直前まで保持する、
（５）ＮＳ３関連抗原の中に存在するジスルフィド結合
（−Ｓ−Ｓ−）を開裂させて、チオール基を形成できる
酵素、例えばジスルフィド・レダクターゼなどで処理す
る、及び（６）ＮＳ３関連抗原の中に存在するシステイ
ン残基に基質親和性をもつものでＮＳ３抗原またはＮＳ
３抗原関連ペプチドを処理する。

【００１０】本発明で用いる抗原としては、システイン
残基を有するものであり、特には還元型システイン残基
を有するものである。特表平２−５００８８０号公報、
欧州特許公開第３１８２１６号〔ＥＰ−Ａ−０３１８２
１６〕、同第３８８２３２号〔ＥＰ−Ａ−０３８８２３
２〕には、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のゲノムのクロ
ーニングにより得られたＤＮＡ配列をもつクローンが開
示されており、その開示された配列を利用して得られ、
システイン残基を有するものは、本発明で用いる抗原の
一つとして考えられる。上記文献には、Ｃ１００−３ク
ローンにより発現されるＣ１００−３抗原の記載があ
り、このＣ１００−３と呼ばれる抗原は、そのアミノ末
端にヒトスーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）
に由来する１５４個のアミノ酸残基、ＥｃｏＲＩ制限酵
素部位を含む合成ＤＮＡアダプターの発現で導かれる５
個のアミノ酸残基、クローン化されたＨＣＶゲノム由来
のｃＤＮＡフラグメントの発現で導かれる３６３個のア
ミノ酸残基及びＭＳ２クローニングベクターＤＮＡから
導かれる５個のカルボキシ末端にある５個のアミノ酸残
基を含むと報告されている。ＨＣＶ配列の第１番目〜第
１５０番目のアミノ酸残基を含むものはＨＣＶ−コア
（Ｃｏｒｅ）抗原として知られている。ＨＣＶ配列の第
１１９２番目〜第１４５７番目のアミノ酸残基を含むも
のは、ＮＳ３領域からのポリペプチドでクローン３３に
より発現され、３３Ｃ抗原として知られている。ＨＣＶ
配列の第１６７６番目〜第１９３１番目のアミノ酸残基
（２５６個のアミノ酸残基からなる）を含むものは、Ｎ
Ｓ４領域からのポリペプチドである。本発明で用いる抗
原としては、ＮＳ３領域からのポリペプチドが挙げら
れ、特に、３３Ｃ抗原またはそれと実質的に同様な活性
を持つものが挙げられる。

【００１１】ここで抗原の活性とは、特異的な抗原抗体
反応をなすことができるものをいい、特に検体中の特異
抗体と免疫学的方法で反応する特異抗原の活性を指すも
ので、抗還元型ＨＣＶ抗体と反応しうるものである。本
発明で用いる抗原は、このような性状を持つものであれ
ば、遺伝子工学的手法によって作製された発現産物たる
組換え抗原、あるいは合成ペプチドであるものも格別の
制限無く用いることが出来る。本発明で用いられる遺伝
子工学的手法によって作製された発現産物たる組換え抗
原、すなわち遺伝子組換え法で産生された抗原は、例え
ば遺伝子組換え技術を適用し、天然ＨＣＶなどのウイル
スなどからクローニングにより得られたＤＮＡ配列ある
いは既に知られたＨＣＶなどのゲノム配列から、酵素な
どを用いたり、化学合成により得られたＤＮＡ配列を、
微生物あるいは動物、植物、昆虫及びそれらの培養細胞
などで発現させて得られたリコビナント抗原である。こ
のリコビナント抗原としては、例えば、ＨＣＶなどのゲ
ノムの別々の抗原領域を発現させた組換え蛋白質（リコ
ビナント蛋白質）の少なくとも１種であることができ
る。本発明で用いられる遺伝子組換え法で産生された抗
原としては、好ましくは融合蛋白質として得られるもの
である。特に、本発明の上記（３）の処理方法では、変
異体リコビナントＮＳ３抗原またはＮＳ３抗原関連ペプ
チド（変異体リコビナントＮＳ３関連抗原）を合成する
には、例えば、特定部位変異誘発法（アル、ウー（Ｒ．
Ｗｕ）及びエル、グロスマン（Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ）
編、メソーズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ．１５４、
アカデミック・プレス、ニュー・ヨーク（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ）、１９８７年、セクション
ＩＶ、第３２９１頁以降、例えば、第３２９頁、第３５
０頁、第３６７頁、第３８２頁など）などの方法に従っ
て行うことができる。該システイン残基は、例えば、欠
失などの除去を施したり、あるいは他のアミノ酸で置換
したり、さらには近傍配列を除去したり、他の配列で置
換するなどの処理ができる。これらの決定は実験により
なすことができる。該システイン残基は、中性のアミノ
酸、例えば、グリシン、バリン、アラニン、ロイシン、
イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジ
ン、トリプトファン、セリン、スレオニン、メチオニン
などに置き換えることが挙げられる。

【００１２】さらに好ましくはこのリコビナント抗原は
ＣＫＳ、ＳＯＤ、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡのＩｇＧ結合
領域、マルトース結合蛋白質、あるいはそれらの関連蛋
白質の融合蛋白質として得られるものであることができ
る。例えば、宿主細胞として大腸菌を用いてＣＫＳ融合
蛋白質発現系の遺伝子産物として得られるもの、特には
ＣＫＳの全２４８個のアミノ酸配列のうち最初の２３９
個のアミノ酸配列をもつものとの融合蛋白質、及び宿主
細胞として酵母を用いてＳＯＤ融合蛋白質発現系の遺伝
子産物として得られるものが挙げられる。

【００１３】ＣＫＳ融合蛋白質発現系によるものとして
は、例えば、特開平４─２５３９９８公報や特開平４─
２８１７９２公報に記載のものが挙げられ、さらには例
えばｐＨＣＶ−２３リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−２９
リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−３１リコビナント抗原、
ｐＨＣＶ−３４リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−４５リコ
ビナント抗原、ｐＨＣＶ−４８リコビナント抗原、ｐＨ
ＣＶ−４９リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−５０リコビナ
ント抗原、ｐＨＣＶ−５１リコビナント抗原、ｐＨＣＶ
−５７リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−５８リコビナント
抗原、ｐＨＣＶ−１０１リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−
１０２リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−１０３リコビナン
ト抗原、ｐＨＣＶ−１０４リコビナント抗原、ｐＨＣＶ
−１０５リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−１０７リコビナ
ント抗原、あるいはそれらをペプチダーゼや化学的開裂
試薬で処理などし、プロセッシングして得られたペプチ
ド、例えばＣＫＳ遺伝子由来ペプチド部分の切断してあ
るものなどが挙げられる。融合部位は、例えば臭化シア
ン、ヒドロキシルアミン、ギ酸、酢酸−ピリジン溶液、
２−（２−ニトロフェニルスルフェニル）−３−ブロモ
インドール−スカトールなどの化学的な処理で切断しう
るようなものか、トリプシン、リシルエンドプロテアー
ゼ、Ｘａ因子、トロンビン、ヒト血漿カリクレインなど
の酵素で切断しうるようなものとされていることができ
る。こうして得られた形質転換体は、その大腸菌、酵母
などの細胞を、ガラスビーズ、アルミナビーズなどを備
えていてもよいホモジュナイザー、ワーリングブレンダ
ー、フレンチプレス、超音波破砕機などの機械的方法、
リゾチームなどの酵素による方法、凍結融解や浸透圧に
よる物理的方法あるいはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）、トウィーン（Ｔｗｅｅｎ：商品名）、トライトン
Ｘ（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ：商品名）などの界面活性剤、ア
セトン、ブタノールなどの有機溶媒、ＥＤＴＡなどのキ
レート化剤などを用いる化学的方法などにより破砕する
ことができる。細胞を破砕する際、懸濁液中にプロテア
ーゼ阻害剤などを添加しておくこともできる。

【００１４】超音波処理は、例えば、懸濁溶液試料を１
０〜６０ｋＨｚの音波（超音波）を出すことのできる超
音波振動子に適用することにより細胞を破壊することの
できる装置にかけて行うことができ、そのような装置と
しては棒状の超音波振動子を試料に浸す型のものや、超
音波振動子を取り付けたカップ状の容器に試料をいれ処
理する型のものや、連続処理が可能なように循環式にさ
れた型のもの、さらにはビーズなどと共に試料を処理で
きるようにしたもの等が挙げられる。こういった超音波
破砕装置は、大岳製作所（株）、セントラル科学貿易
（株）、セイコー電子工業（株）などから市販されてい
る。超音波処理は、細胞を破砕するに十分な時間処理す
ることにより行われ、使用試料の量や使用出力に応じて
適宜適当に選ぶことができ、通常約１分間から約２時間
の範囲で選ぶことができる。

【００１５】得られた抗原含有形質転換体細胞液は、例
えば硫酸アンモニウムなどの蛋白質沈殿剤などを用いて
の塩析、エタノールなどの有機溶媒による沈殿法、界面
活性剤などを用いての抽出、透析、密度勾配遠心などの
遠心分離法、限外濾過法、イオン交換樹脂、イオン交換
セルロース、イオン交換セファデックス、アルミナ、ハ
イドロキシアパタイトなどによる吸着、カラムクロマト
グラフィー、電気泳動法、デキストランゲル、ポリアク
リルアミドゲル、ポリエチレングリコールジメタクリル
酸ゲル、アガロースゲル、多孔質シリカガラス、分子ふ
るい法、モノクローナル抗体などを利用したアフィニテ
ィクロマトグラフィーによりさらに分離、精製されるこ
とができ、使用に適したものに加工できる。これらの処
理は、任意に適した方法を選び組み合わせてよい。これ
らの処理にあたっては、還元状態でその処理を行うこと
ができ、例えば還元剤を含有する媒質を使用したり、酸
素との接触を排除し得るように不活性ガス雰囲気中で処
理をしたり、脱酸素剤共存下あるいは脱酸素剤のある雰
囲気中で処理を行うことができる。還元剤としては、例
えばジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、チオ
グリコール酸、システイン、グルタチオン、２−メルカ
プトエタノール、２−メルカプトエチルアミンおよびこ
れらの混合物から成る群より選ばれた少なくとも一つで
あるものにより処理されていることができる。この処理
においては、特に、ジチオスレイトール、グルタチオ
ン、２−メルカプトエタノール等が好ましい。

【００１６】本発明で用いる抗原は、上記抗還元型ＨＣ
Ｖ抗体と実質的に免疫学的に特異的に反応しうる性状を
持つものであれば、遺伝子工学的手法によって作製され
た発現産物たる組換え抗原、あるいは合成ペプチドであ
るものも格別の制限無く用いることが出来る。本発明に
おいては、たとえ分子中にシステインのチオール基また
はそれに由来するジスルフィド結合を有していてもそれ
らが該抗原の活性に影響を与えうる基でない場合は、本
発明での処理をなす対象抗原としてそれを意図はしな
い。本発明で用いられる測定対象試料検体としては、全
血、血清、血漿、などの生物由来材料をあげることがで
きるが、これらに限定されるものではない。

【００１７】本発明では、不溶性担体などの担体に、上
記の（１）〜（６）からなる群から選ばれた処理を施し
て得られたＮＳ３関連抗原を感作し、こうして得られた
感作担体を用いて、検体中の特異抗体を免疫学的に測定
するために使用する試薬が製造される。上記（１）の方
法に従えば、例えば担体にその還元型の抗原を感作した
後、凍結乾燥させるか、又は得られた感作担体を実質的
に還元剤非存在のもとで不活性ガス雰囲気の下、適当な
緩衝液に分散させることにより達成することが出来る。
こうして得られた試薬は不活性ガス雰囲気下その使用直
前まで保存される。このようにして得られた試薬は、測
定時においても還元剤非存在のもとでその測定を行うこ
とが出来る。不活性ガスとしては、窒素ガス、アルゴン
ガス、ヘリウムガス、炭酸ガス、それらの任意の混合ガ
スなどが挙げられる。担体にその還元型の抗原を感作す
る前に、必要に応じ、抗原は例えばジチオスレイトー
ル、ジチオエリスリトール、チオグリコール酸、システ
イン、グルタチオン、２−メルカプトエタノール、２−
メルカプトエチルアミンおよびこれらの混合物から成る
群より選ばれた少なくとも一つであるものにより処理さ
れていることができる。この処理においては、特に、ジ
チオスレイトール、グルタチオン、２−メルカプトエタ
ノール等が好ましい。本発明においては、上記感作処
理、凍結乾燥処理、保存及び測定操作のいずれかあるい
はそのすべての処理にわたって脱酸素剤共存下または脱
酸素剤のある雰囲気中で行うことができる。脱酸素剤と
しては、無機系の鉄粉末、アルカリ金属あるいはアルカ
リ土金属の亜硫酸水素塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、ピロ
亜硫酸塩など、有機系のアスコルビン酸、ハイドロキノ
ン、カテコールなどが挙げられる。脱酸素剤としては、
市販のエージレス（商品名）として入手できるものが挙
げられる。ここで脱酸素剤としては、上記還元剤、さら
にはチオール保護剤とは異なる。

【００１８】ここで用いることが出来る不溶性担体とし
ては、不溶性担体として広く知られたものが挙げられ、
例えば合成樹脂、ニトロセルロース等の天然あるいは合
成の高分子等から作られたものの他、ラテックス粒子等
あるいは赤血球等が挙げられる。上記（２）の方法に従
えば、例えば抗原をチオール基修飾試薬で処理し、次に
修飾抗原を感作した後、適当な緩衝液に分散させること
により達成することが出来る。チオール基修飾試薬とし
ては、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、ブロモ酢酸な
どのハロゲノ酢酸またはそのアミド、２−ブロモプロピ
オン酸など、Ｎ−エチルマレイミド、ｐ−クロロマーキ
ュリ安息香酸、ヨウ化メチル、あるいは水銀、鉄、鉛な
どの金属、テトラチオン酸カリウム、テトラチオン酸ナ
トリウム、メチルメタンスルホネート、２−ヒドロキシ
エチルジスルフィド、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸
無水物、Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド、グル
タチオン、ジチオピリジンまたはそのＮ−オキサイド体
などが挙げられる。上記（４）の方法に従えば、例えば
担体にその抗原を感作した後、得られた感作担体を酸化
防止剤（還元剤やチオール保護剤を除く）を含有する雰
囲気下、適当な緩衝液に分散させることにより達成する
ことが出来る。また、本発明は、上記（１）〜（６）か
らなる群から選ばれた処理を施して得られたＮＳ３関連
抗原を不溶性担体に固相化することによって得られた固
相化抗原を用いて、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩ
Ａ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、あるいはフル
オロイムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法により検体中の
特異抗体を免疫学的に測定するために使用する試薬が製
造される。不溶性担体にＨＣＶ抗原を固相化した後、得
られた抗原結合固相を前記の（１）〜（６）からなる群
から選ばれた処理を施し、次に緩衝液に浸漬し、達成す
ることが出来る。本発明において試料中の抗原と免疫学
的に反応性の抗体を測定するにあたっては、抗原抗体反
応にあずかる抗原は、必要に応じて、固定担体に固定し
ておき、この固定担体を、分析対象としての抗体等を含
有する試料と接触させ、こうして固定担体に固定された
抗原と、分析試料中の抗体等とを特異的に結合反応せし
め、この特異的に結合した分析対象物を検知することに
よりおこなうことができる。

【００１９】ここで用いることが出来る不溶性又は固体
の担体としては、固相化用担体として広く知られたもの
が挙げられ、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポ
リスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化
ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、テフ
ロン、ポリアセタール、ポリアクリルアミド、ポリメタ
クリレート、ポリアクリレート、スチレン−メタクリレ
ート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロ
レイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体
等のポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエ
ポキシ樹脂など合成樹脂、寒天、アガロース、架橋アガ
ロース、架橋アルギン酸、架橋グアガム、紙、セルロー
ス、ニトロセルロース、カルボキシルセルロースなどの
セルロースエステルあるいは混合セルロースエステル、
デキストラン、ゼラチン、キチン、コラーゲン、綿な
ど、重合アミノ酸、多糖等の天然あるいは合成の修飾あ
るいは非修飾の重合炭水化物、重合炭化水素などの高分
子、それらの架橋誘導体など、ガラス、例えば活性化ガ
ラス、シリカゲル、アルミナ、カオリン、タルク、シリ
カ−アルミナ、セラミック、カーボン、硫酸バリウム、
硫酸マグネシウムなどから選ばれたものであり、粒子、
微粒子、膜、ビーズ、チューブ、プレート、マイクロプ
レート、マイクロタイター・ウェル、マイクロチュー
ブ、ストリップ等の形状のものがある。さらには赤血
球、ラテックス粒子、乳剤などが挙げられる。

【００２０】本発明において試料中の抗原と免疫学的に
反応性の抗体を測定するにあたっては、ラジオイムノア
ッセイ、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法、化学又は生
物発光免疫測定法、及び凝集反応免疫測定法などの方法
によることができる。また化学発光免疫測定法は自動化
された測定ができ好ましい方法でもある。ラジオイムノ
アッセイ、酵素免疫測定法、化学又は生物発光あるいは
螢光免疫測定法などでは、 ¹²⁵Ｉ、 ³Ｈなどの放射性物
質、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素、フルオ
レッセインなどの螢光色素、アクリジニウムエステル類
などの化学発光色素、金コロイド、セレンコロイドある
いは有色ラテックス粒子などの有色物質、発光又は発色
物質などで標識された抗原などが試薬として用いられ、
分析試料中の抗体、複合体等と特異的に結合反応せしめ
られ、その放射活性、酵素活性、化学発光あるいは色の
有無などを測定して、試料中の抗体等が存在していたか
否かを判別することができる。

【００２１】本発明においては、例えば、検知用試薬と
して、４−ヒドロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレ
ンジアミン、テトラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ
・ペルオキシダーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、
ニトロフェニルガラクトシドなどとβ−D −ガラクトシ
ダーゼ、ウンベリフェリルホスフェート、ニトロフェニ
ルホスフェート、ＮＡＤＰなどとアルカリフォスファタ
ーゼ、グルコース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼなど
の酵素試薬、放射性物質試薬、フルオレッセインイソチ
オシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネ
ート、アクリジニウムエステル類、発光ランタニドなど
を用いている螢光試薬、発光試薬、化学発光試薬、金コ
ロイド、銀コロイド、セレンコロイドなどのコロイド標
識試薬、磁性体試薬、ビオチン標識抗ビオチン抗体など
のハプテン標識抗ハプテン抗体検出系試薬などを用いる
ことができる。

【００２２】本発明においては、特に化学発光標識法、
例えばアクリジニウムエステル類あるいは螢光標識法、
例えば発光ランタニドなどで標識された試薬を用いる螢
光あるいは化学発光免疫測定法は自動化された測定がで
き好ましい方法である。特にアクリジニウムエステル類
で標識された試薬を用いる化学発光免疫測定法は自動化
された測定ができ好ましい。

【００２３】アクリジニウムエステル類としては、例え
ば特開昭６２−３９５９８号公報、特開昭６２−６１９
６９号公報、特開昭６３−５７５７２号公報、特開昭６
３−１０１３６８号公報、特開昭６３−１１２５６４号
公報、特開平１−２６１４６１号公報、英国特許明細書
第１，４６１，８７７号、米国特許明細書第３，５３
９，５７４号などに記載のＮ−アルキル又はアリールア
クリジニウム−９−カルボン酸エステルなどが挙げられ
る。特に、特開昭６３−１１２５６４号公報、米国特許
明細書第３，５３９，５７４号などに記載の１０−アル
キル・Ｎ−アルキル又はアリール−スルホニル−Ｎ−ア
ルキル又はアリールスルホニルアクリジニウム−９−カ
ルボキサミド、Ｎ−メチルアクリジニウム−９−カルボ
ン酸エステルなどは代表的な化学発光標識として挙げら
れる。アクリジニウム標識の場合、測定前に発光開始試
薬処理、例えば過酸化水素、例えば約０．０１％〜約
０．１％の過酸化水素水溶液、及び水酸化ナトリウム、
例えば約０．０５Ｎ〜約０．５Ｎの水酸化ナトリウム水
溶液で処理しながら、ルミノメーターなどを用いて測定
を行うことができる。

【００２４】発光ランタニドとしては、例えば欧州特許
公開出願第００６８８７５号、米国特許明細書第４，３
７４，１２０号、米国特許明細書第４，２８３，３８２
号、米国特許明細書第４，２５９，３１３号、米国特許
明細書第４，３５２，７５１号、米国特許明細書第４，
４３２，９０７号、欧州特許公開出願第０１０３５５８
号などに記載のアミノカルボン酸基を持つ発光ランタニ
ドをキレート化できるものなどが挙げられる。また測定
前にレーザー光などによる励起処理をして測定を容易に
することもできる。勿論、標識剤は上記のものに限定さ
れること無く、測定に使用される機器、場所などを考慮
し、適宜当該分野で使用することが知られているものの
中から目的に応じ選択して用いることができる。

【００２５】凝集反応を利用した測定法では、抗原を粒
子状担体、例えば、赤血球、ポリスチレン粒子、ラテッ
クス粒子などに結合させたいわゆる感作粒子抗原などの
粒子状抗原と、それに対する抗体とが特異的に結合反応
して観察できるような凝集塊をつくる反応を利用する。
例えば、試料中の抗体を検知するため、上記したような
粒子状抗原を試料と混合して反応させ、例えば、水性媒
質の中で抗原抗体反応により生じた凝集反応が観察され
るか否かにより、試料中に測定対象の抗体が存在してい
るか否かが判別される。この凝集反応を用いた測定法に
あっては、一定量の抗原に対し、一定の希釈列にある既
知濃度あるいは量の抗体を加え、反応の結果得られる溶
液の凝集反応の程度を希釈倍数の逆数で表して評価され
ることがなされる。逆に一定量の抗体に対し、一定の希
釈列にある既知濃度あるいは量の抗原を加え、反応の結
果得られる溶液の凝集反応の程度を希釈倍数の逆数で表
して評価されることもなされるし、更に抗体に対する抗
体、すなわち二次抗体を用いて間接的な凝集反応を観察
することもなされる。受身凝集反応免疫測定法は、本発
明に従い、例えば、ＨＣＶに対する抗体などの測定に用
いられ、優れた作用効果が得られる。

【００２６】固体担体、粒子状担体あるいは標識などと
抗原とを結合あるいは吸着させるには、当該分野で汎用
されている方法を用いることができ、例えばイオン相互
作用、疎水相互作用、共有結合などの物理的吸着や化学
的結合により行うことができる。化学的な結合剤として
は、通常の当業者に知られたものの中から選択すること
ができるが、例えば、グルタルアルデヒド、１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド、Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−スク
シンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ
ート、Ｎ−スクシンイミジル Ｓ−アセチルメルカプト
アセテート、Ｎ−スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイ
ミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、
Ｎ−スクシンイミジル ６−マレイミドヘキサノエー
ト、Ｎ−スクシンイミジル ４−ヨードアセチルアミノ
ベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル ３−（ｐ−ヒド
ロキシフェニル）プロピオンネート、Ｎ−スクシンイミ
ジル ｍ−マレイミドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミ
ジル ４−マレイミドブチレート、Ｎ−スクシンイミジ
ル （ｐ−マレイミドフェニル）アセテート、Ｎ−スク
シンイミジル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレ
ートなどが挙げられ、さらに６−マレイミドカプロン
酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、コハク酸等の活
性エステル、トリアジンの活性エステル、スルホン酸エ
ステル誘導体等が挙げられるが、これらに限定されるも
のではない。

【００２７】本発明の測定系においては、界面活性剤、
緩衝剤、希釈液又は希釈剤、ブロッキング剤、キレート
化剤、保存剤などを用いることができる。界面活性剤と
しては、陰イオン型界面活性剤、陽イオン型界面活性
剤、両性界面活性剤、非イオン型界面活性剤のうちから
選んで用いることが出来る。陰イオン型界面活性剤とし
ては、炭素数１２〜１８の高級脂肪酸のアルカリ金属塩
あるいはアルカリ土類金属塩、炭素数１２〜１８の高級
脂肪酸のトリエタノールアミンなどの有機塩基塩、炭素
数１２〜１８の高級脂肪酸又は高級アルコールの硫酸エ
ステル、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスル
ホン酸塩などが挙げられる。陽イオン型界面活性剤とし
ては、アルキル基、アリール基、複素環基などを有する
第四級アンモニウム化合物などが挙げられる。アルカリ
金属としては、ナトリウム、カリウム、リチウムなど、
アルカリ土類金属としては、カルシウム、マグネシウム
などが挙げられる。

【００２８】両性界面活性剤としては、ポリアミノモノ
カルボン酸、炭素数１２〜１８の高級アルキルアミノ
酸、ラウリルジメチルベタインなどのアミノ酸のＮ−ト
リアルキル置換体などが挙げられる。非イオン型界面活
性剤としては、モノステアリン酸グリセリンなどの炭素
数１２〜１８の高級脂肪酸の多価アルコールエステル、
高級脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、高級脂肪酸
のソルビタンエステル、高級脂肪酸とポリオキシエチレ
ン及びソルビタンエーテルとのエステル、ポリオキシエ
チレンラウリルアルコールなどの高級アルコールとポリ
オキシエチレンとのエーテル、ポリオキシエチレンとポ
リオキシプロピレンとのエーテルなどが挙げられる。

【００２９】緩衝剤、希釈液又は希釈剤としては、水、
リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、例えば生理食塩水などの塩化ナ
トリウム液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン
−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）液、
ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）
（ＰＩＢＥＳ）液、３−（シアノヘキシルアミノ）−１
−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）液、３−（モルホリ
ノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）液、Ｎ，Ｎ’−ビ
ス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホ
ン酸（ＢＥＳ）液、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メ
チル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）液、Ｎ−
（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸
（ＡＣＥＳ）液、アミノ酸液などが挙げられる。これら
は単独で用いることができるし、任意に二種以上を配合
しても用いることができる。キレート化剤としては、エ
チレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリ
コール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）などが挙げられ
る。これらキレート化剤は、約０．０１ｍＭ〜約２０ｍ
Ｍの範囲で用いることができる。

【００３０】保存剤としては、例えばナトリウムアジ
ド、エチルパラベンなどが挙げられる。その他、本発明
の測定系には、各種動物の血清、例えば牛血清、牛血清
アルブンミン（ＢＳＡ）、牛胎児血清（ＦＣＳ）、ヤギ
血清、卵白アルブンミン、ゼラチン、各種乳蛋白質、例
えばスキムミルク、カゼイン、カゼイン分解物、ホエー
蛋白質など、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリ
ドンなどからなる群から選ばれたものを添加することが
できる。これらは、約０．０１％ｖ／ｖ〜約５０％ｖ／
ｖの範囲で添加することができる。

【００３１】本発明においては、リンパ球破砕物、例え
ばヒトＴ−リンパ球抽出液、大腸菌抽出液、酵母抽出
液、マウス細胞培養液抽出液などの細胞抽出物を添加す
ることもできる これらのものは、約０．００１％ｖ／
ｖ〜約２０％ｖ／ｖの範囲で添加することもできる。

【００３２】

【実施例】次に実施例を示して、本発明を更に具体的に
説明する。 実施例１ 固定化用ヒト赤血球をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３
回洗浄後、ｐＨ５．７の酢酸緩衝液に１容量％となるよ
うに懸濁し、遺伝子組換え技術により産生された精製Ｈ
ＣＶ ３３Ｃ抗原を最終濃度が、６μｇ／ｍｌとなるよ
うに添加し、室温で１時間攪拌した後に、リン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、７．５％のサッカロース
及び３０ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）を含有するリン
酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で凍結乾燥して、３３Ｃ抗原
感作赤血球を調製した。

【００３３】得られた３３Ｃ抗原感作赤血球をトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．８）の入ったボトルに、１容量％と
なるように注入し、懸濁させた。３３Ｃ抗原感作赤血球
懸濁液が入った該ボトルを酸素濃度の約２倍量及び２０
倍量の脱酸素剤エージレス（商品名、三菱ガス化学社
製）と共に非開放空間に保存した。対照として３３Ｃ抗
原感作赤血球懸濁液の入ったボトルを脱酸素剤不存在下
開放空間に放置したものを用いた。こうして調製された
３３Ｃ抗原感作赤血球懸濁液を用い、０〜９日間その液
を２５℃に静置した後、感度比較を行った。感度の比較
は、３３Ｃ抗体陽性ヒト血清を、同抗体陰性である血清
により予め段階希釈したものを感度管理用血清として使
用した。マイクロタイター・プレートの各ウエルに、リ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２５μｌ、及び各濃度の感度
管理用血清２５μｌを分注し、さらに感作赤血球を２５
μｌ分注し、ミキサーで３０秒間攪拌し、室温で１時間
放置した後、結果を目視により判定した。結果は表１に
示す。対照３３Ｃ抗原感作赤血球液を用いた場合、５日
目にはＡパネル及びＢパネル血清検体で感度の消失が認
められたが，脱酸素剤付加群ではいずれのパネル血清検
体でも感度に変化は認められ無かった。

【００３４】

【表１】

【００３５】実施例２ ３３Ｃ抗原感作赤血球保存用ボトル内にヘリウムガスを
封入しておき、さらにトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）
を入れておく。実施例１と同様にして得られた凍結乾燥
３３Ｃ抗原感作赤血球を用い、該ボトルに、１容量％と
なるように該ＨＣＶ抗原感作赤血球をシリンジを使用し
て注入し、３３Ｃ抗原感作赤血球を懸濁した。対照とし
て何らヘリウムガスなどの不活性ガスの加えてないボト
ル中のトリス塩酸緩衝液に懸濁した３３Ｃ抗原感作赤血
球液を用いた。こうして調製された３３Ｃ抗原感作赤血
球懸濁液を用い、０〜９日間その液を２５℃に静置した
後、実施例１と同様にして感度比較を行った。結果は図
１に示す。ヘリウムガス封入ボトルでの３３Ｃ抗原感作
赤血球液の場合には、１６日後でも十分に感度を保持で
きていたが、空気中で保存された３３Ｃ抗原感作血球液
の場合５日目で感度がなくなり、２日目で実質上その使
用に問題なものとなっていた。

【００３６】実施例３ 実施例１と同様にして調製された凍結乾燥３３Ｃ抗原感
作赤血球を用い、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を含
有するボトル中で４容量％となるようにその３３Ｃ抗原
感作赤血球を懸濁した後、凍結乾燥した。こうして調製
された３３Ｃ抗原感作赤血球を（１）１％牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）、６％牛胎児血清（ＦＣＳ）含有１１０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に再懸濁した後、
室温で１時間置いたもの、（２）（１）と同様に再懸濁
後、室温で空気雰囲気に曝したまま４日間置いたもの及
び（３）（２）と同様４日間空気雰囲気中に放置した
後、３０ｍＭグルタチオン含有１１０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．８）で処理した３３Ｃ抗原感作赤血球を
室温で１時間置いたものそれぞれを用い試験した。検体
としては、５’ＮＣ−ｒｅｇｉｏｎ−ＲＴ−ＰＣＲ法Ｈ
ＣＶ ＲＮＡ陽性を示した血清及び陰性を示した血清を
用いた。血清は実施例１に準じてＨＣＶ抗体陰性である
血清により予め段階希釈し、感度管理用血清として使用
し、測定を行った。結果は表２に示す。ＰＣＲ法陽性及
び陰性血清検体共に、（１）再懸濁後１時間血球で測定
されうる還元型抗原に対する抗体のタイター（ｔｉｔｅ
ｒ）のほうが、（２）再懸濁後４日間置かれた血球で測
定されうる酸化型抗原に対する抗体のタイターより高か
った。さらに、酸化型抗原をグルタチオン溶液で還元処
理すると（１）と同様の抗原の反応性が再現されること
が観察された。

【００３７】

【表２】

【００３８】実施例４ ＨＣＶ抗原のコア抗原、Ｃ１００抗原及び３３Ｃ抗原を
実施例１と同様にして感作して各ＨＣＶ抗原感作赤血球
を調製した。同様にＨＣＶ抗原としてコア抗原、Ｃ１０
０抗原及び３３Ｃ抗原の混合物を用いＨＣＶ ＰＨＡ抗
原感作赤血球を調製した。ＨＣＶ ３３Ｃ抗原感作赤血
球中のシステイン残基は十分に還元型であることが認め
られていた。この各ＨＣＶ抗原感作赤血球を用い、実施
例１に準じて感度比較を行った。結果は図２及び図３に
示す。図２（ａ）は、ＨＣＶ ＰＨＡ抗原感作赤血球で
の結果を示し、図２（ｂ）は、ＨＣＶ ３３Ｃ抗原感作
赤血球での結果を示し、図３（ｃ）は、ＨＣＶ コア抗
原抗原感作赤血球での結果を示し、図３（ｄ）は、ＨＣ
Ｖ Ｃ１００抗原感作赤血球での結果を示す。ＨＣＶ
ＰＨＡ抗原感作赤血球での結果とＨＣＶ ３３Ｃ抗原感
作赤血球での結果とはその分布がよく一致し、還元型３
３Ｃ抗原がＨＣＶ抗体測定試薬として非常に有用である
ことが証明された。

【００３９】実施例５ 実施例１と同様にして得られた３３Ｃ抗原感作赤血球を
７．５％のサッカロース及び１０ｍＭのジチオスレイト
ール（ＤＤＴ）を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
中で凍結乾燥して、３３Ｃ抗原感作赤血球を調製した。
得られた３３Ｃ抗原感作赤血球を用い、実施例１に準じ
て感度比較を行った。実施例１と同様な結果が得られ
る。

【００４０】実施例６ １／４インチのポリスチレン・ビーズを７．５％のサッ
カロースを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に入
れ、実施例１で使用した遺伝子組換え技術により産生さ
れた精製ＨＣＶ ３３Ｃ抗原を最終濃度が、１０μｇ／
ｍｌとなるように添加し、３７℃で１時間静置した。次
にリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄後、７．５％
のサッカロース及び２０ｍＭの２−メルカプトエタノー
ル（２−ＭＥ）を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
中に浸漬し、ついで乾燥処理し、３３Ｃ抗原固相化ビー
ズを得た。対照固相化ビーズとして、２−ＭＥを含まな
い７．５％のサッカロース含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）中に浸漬し、ついで乾燥処理して得られた３３Ｃ抗
原固相化ビーズを用いた。

【００４１】保存３３Ｃ抗原固相化ビーズ１個を、反応
用緩衝液としてトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）２００
μｌを入れた反応試験管に入れ、各濃度の感度管理用血
清１０μｌを添加し、３７℃で１時間反応させた。反応
終了後、生理食塩水で３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標
識抗ヒトイムノグロブリンＧ抗体２００μｌを添加し、
３７℃で３０分間反応させた。反応終了後、生理食塩水
で３回洗浄し、オルトエチレンジアミン及び過酸化水素
を含む基質溶液を１ｍｌ加え、室温で３０分間反応させ
た後、１Ｎ硫酸溶液１ｍｌを添加し、反応停止後４９０
ｎｍの吸光度を測定することにより判定した。２−ＭＥ
処理ビーズは、感度が優れていた。

【００４２】実施例７ ７．５％のサッカロース及び４０ｍＭのグルタチオン
（ＧＳＨ）を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に
浸漬し、ついで乾燥処理する以外は、実施例６と同様に
処理し、３３Ｃ抗原固相化ビーズを調製した。得られた
３３Ｃ抗原固相化ビーズを用い、実施例６と同様にして
感度比較を行った。実施例６と同様な結果が得られる。

【００４３】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ボトル中の不活性ガスの影響を示す。Ｈｅは
ヘリウム含有の場合、Ｃｏｎｔ．は対照試験を示す。

【図２】 各ＨＣＶ抗原感作赤血球とＨＣＶ抗体陽性血
清における検出感度との関係を示す。縦軸はＮｕｍｂｅ
ｒを示す。

【図３】 各ＨＣＶ抗原感作赤血球とＨＣＶ抗体陽性血
清における検出感度との関係を示す。縦軸はＮｕｍｂｅ
ｒを示す。

【図４】 図２及び図３の結果の相関関係を示す。

【図５】 図２及び図３の結果の相関関係を示す。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 検体中のＨＣＶ抗体を免疫学的方法によ
   り測定するための抗原またはそれと実質的に同等の作用
   を有するペプチド含有試薬において、抗原としてＨＣＶ
   ゲノム上のＮＳ３領域にコードされているタンパク質抗
   原またはそれと実質的に同等の作用を有するペプチドを
   少なくとも用い、該抗原が還元型ＮＳ３関連抗原の形態
   を実質上保有するように変換または保持されていること
   を特徴とする試薬。
2. 【請求項２】 該抗原中にはシステイン残基が存在し、
   該システイン残基は、以下（１）還元型ＮＳ３関連抗原
   を乾燥状態、不活性ガス中あるいは脱酸素剤存在下で保
   持する、（２）還元型ＮＳ３関連抗原中に存在するシス
   テイン残基のチオール基を、チオール基保護または修飾
   試薬、例えばヨードアセトアミド、ヨード酢酸、ｐ−ク
   ロロマーキュリ安息香酸、ヨウ化メチル、あるいは水
   銀、鉄、鉛などの金属などで修飾する、（３）還元型Ｎ
   Ｓ３関連抗原中に存在するシステイン残基を、遺伝子組
   換え技術、例えば特定部位変異誘発法などにより修飾
   し、変異体リコビナントＮＳ３関連抗原として製造す
   る、（４）還元型ＮＳ３関連抗原を酸化防止剤の存在下
   使用直前まで保持する、（５）ジスルフィド結合（−Ｓ
   −Ｓ−）を開裂させて、チオール基を形成できる酵素、
   例えばジスルフィド・レダクターゼなどでＮＳ３関連抗
   原を処理する、または（６）ＮＳ３関連抗原を存在する
   システイン残基に基質親和性をもつもので処理するのい
   ずれかの処理をなすことにより、該抗還元型ＨＣＶ抗体
   と免疫学的かつ特異的に反応性の残基に変換するかまた
   はそのような残基を保持しているようにされることを特
   徴とする請求項１記載の試薬。
3. 【請求項３】 抗原はその製造、分離及び／又は精製処
   理において実質的に還元状態あるいは酸素非存在下にそ
   れらの処理がなされたものである請求項１又は２記載の
   試薬。
4. 【請求項４】 ＮＳ３領域にコードされているタンパク
   質抗原が３３Ｃである請求項１〜３のいずれか一記載の
   試薬。
5. 【請求項５】 抗原またはそれと実質的に同等の作用を
   有するペプチドを用いた検体中のＨＣＶ抗体の免疫学的
   測定方法において、抗原としてＨＣＶゲノム上のＮＳ３
   領域にコードされているタンパク質抗原またはそれと実
   質的に同等の作用を有するペプチドを少なくとも使用
   し、該抗原中に存在するシステイン残基を、抗還元型Ｈ
   ＣＶ抗体と免疫学的かつ特異的に反応性である残基に変
   換または保持しておくことを特徴とする検体中のＨＣＶ
   抗体の測定方法。
6. 【請求項６】 該抗原中に存在するシステイン残基を、
   以下（１）還元型ＮＳ３関連抗原を乾燥状態、不活性ガ
   ス中あるいは脱酸素剤存在下で保持する、（２）還元型
   ＮＳ３関連抗原中に存在するシステイン残基のチオール
   基を、チオール基保護または修飾試薬、例えばヨードア
   セトアミド、ヨード酢酸、ｐ−クロロマーキュリ安息香
   酸、ヨウ化メチル、あるいは水銀、鉄、鉛などの金属な
   どで修飾する、（３）還元型ＮＳ３関連抗原中に存在す
   るシステイン残基を、遺伝子組換え技術、例えば特定部
   位変異誘発法などにより修飾し、変異体リコビナントＮ
   Ｓ３関連抗原として製造する、（４）還元型ＮＳ３関連
   抗原を酸化防止剤の存在下使用直前まで保持する、
   （５）ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を開裂させて、
   チオール基を形成できる酵素、例えばジスルフィド・レ
   ダクターゼなどでＮＳ３関連抗原を処理する、または
   （６）ＮＳ３関連抗原を存在するシステイン残基に基質
   親和性をもつもので処理するのいずれかをなすことによ
   り、該抗還元型ＨＣＶ抗体と免疫学的かつ特異的に反応
   性の残基に変換するかまたはそのような残基を保持して
   いるようにすることを特徴とする請求項５記載の検体中
   のＨＣＶ抗体の測定方法。
7. 【請求項７】 抗原はその製造、分離及び／又は精製処
   理において実質的に還元状態あるいは酸素非存在下にそ
   れらの処理がなされたものである請求項５又は６記載の
   検体中のＨＣＶ抗体の測定方法。
8. 【請求項８】 ＮＳ３領域にコードされているタンパク
   質抗原が３３Ｃである請求項５〜７のいずれか一記載の
   検体中のＨＣＶ抗体の測定方法。
9. 【請求項９】 該抗原試薬を乾燥状態、脱酸素剤又は不
   活性ガス中で保存、又は測定のため使用するものである
   請求項５記載の検体中のＨＣＶ抗体の測定方法。