JPH07301634A - 組換え抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 遺伝子組換え法により得られたリコビナント
抗原を用い、その検出感度、さらにはその特異性におい
て優れ、そのうえ非特異的な反応がない、より感度、特
異性に優れた抗体測定法の開発をなす。特に、融合蛋白
質としてリコビナント抗原を製造し、それを用いた測定
系で非特異的反応抑制し、偽陽性を生ずるという問題の
ない方法及び試薬の開発を行う。 【構成】 遺伝子組換え法で産生された抗原、特に融合
蛋白質として製造されたリコビナント抗原を用いた、試
料中の該抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法におい
て、蛋白質発現用プラスミドで形質転換された細胞の遺
伝子産物又はそれと実質的に同等の作用を有するもの、
例えば、抗原をコードするＤＮＡ配列の組込まれていな
いＣＫＳ融合蛋白質発現系プラスミドやＳＯＤ融合蛋白
質発現系プラスミドで形質転換された細胞のライゼート
を用いることにより、非特異的反応の発生を効果的に中
和でき、より特異性に優れた測定法及びそれに用いる試
薬が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子組換え法で産生
された抗原を用いたところの試料中の該抗原と免疫学的
に反応性の抗体の測定法において用いられる試薬で、偽
陽性を抑制するため、該蛋白質発現用プラスミド（ベク
ター）で形質転換された細胞の遺伝子産物又はそれと実
質的に同等の作用を有するものを含有することを特徴と
する抗体の測定用試薬及びそれを用いた測定法に関す
る。この試薬は特に抗原が融合蛋白質として遺伝子組換
え法で産生される場合に用いられて、優れた効果が得ら
れる。例えば、ＣＫＳキメラ融合蛋白質発現系プラスミ
ドで形質転換された細胞あるいはＳＯＤキメラ融合蛋白
質発現系プラスミドで形質転換された細胞の細胞水抽出
液を用いると優れた効果が得られる。特に、抗原をコー
ドするＤＮＡ配列の組込まれていないキメラ融合蛋白質
発現用プラスミドで形質転換された細胞の水抽出液が有
利に用いられ、優れた非特異的反応中和効果が得られ
る。

【０００２】

【従来技術及び解決すべき課題】免疫学的測定法は、人
の臨床における検査や病気の診断に広く利用される他、
動物においてもその臨床検査や病気の診断、さらにはそ
の他の広い範囲の測定対象物の分析、測定、定量、検出
などの分野において応用されている。この免疫学的測定
法は、抗原とその抗原に対する抗体との間の抗原抗体反
応を利用するものであるが、通常この抗原抗体反応の生
起していることの検出は可視的に判別したり、あるいは
検知することは困難であるので、その検知、検出を容易
にするため様々な手法が開発されてきている。こうして
免疫学的測定法として、例えば、ラジオイムノアッセ
イ、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法、凝集反応免疫測
定法などが開発されてきて、現在広く利用されている。

【０００３】また、この抗原抗体反応にあずかる抗体あ
るいは抗原は、必要に応じて、例えば、寒天、アガロー
ス、セルロース、紙、ニトロセルロース、デキストラ
ン、ゼラチン、キチン、コラーゲン、綿などの生体由来
高分子あるいは天然物由来高分子、ポリスチレン、ポリ
エチレン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド
などのアクリル樹脂、イオン交換樹脂、光架橋樹脂、テ
フロン、ポリアセタールなどの合成高分子、ガラスビー
ズ、シリカゲル、アルミナ、セラミック、カーボン、硫
酸マグネシウムなどの無機質材料などからなる、微粒
子、ビーズ、マイクロプレート、マイクロタイターウェ
ル、マイクロチューブ、ストリップ、メンブレン、ゲル
など、さらには赤血球、ラテックス粒子、乳剤などの固
定担体に固定しておき、この固定担体を、分析対象とし
ての抗体、抗原等を含有する試料と接触させ、こうして
固定担体に固定された抗原または抗体と、分析試料中の
抗体、抗原等とを特異的に結合反応せしめ、この特異的
に結合した分析対象物を検知することがなされる。

【０００４】ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法、
発光又は螢光免疫測定法などでは、¹²⁵Ｉ、 ³Ｈなどの
放射性物質、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵
素、フルオレッセインなどの螢光色素、金コロイド、セ
レンコロイドなどの発光又は発色物質などで標識された
抗原あるいは抗体が試薬として用いられ、分析試料中の
抗体、抗原等と特異的に結合反応させて、その放射活
性、酵素活性あるいは螢光などを測定して、試料中の抗
体、抗原等が存在していたか否かを判別している。

【０００５】凝集反応を利用した抗原あるいは抗体の測
定法は、一般には赤血球や細菌などの粒子状抗原と、そ
れに対する抗体とが特異的に結合反応して観察できるよ
うな凝集塊をつくる反応を利用するもので、この反応を
凝集反応といっている。例えば、試料中の抗体を検知す
るためには、上記したような粒子状抗原を試料と混合し
て反応させたとき、例えば、水性媒質の中で抗原抗体反
応により生じた凝集反応が観察されるか否かにより、試
料中に測定対象の抗体が存在しているか否かが判別され
る。この凝集反応を用いた測定法にあっては、一定量の
抗原に対し、一定の希釈列にあるところの既知濃度ある
いは既知量の抗体を加え、反応の結果得られる溶液の凝
集反応の程度を希釈倍数の逆数で表して評価されること
もなされる。逆に一定量の抗体に対し、一定の希釈列に
あるところの既知濃度あるいは既知量の抗原を加え、反
応の結果得られる溶液の凝集反応の程度を希釈倍数の逆
数で表して評価されることもなされるし、更に抗体に対
する抗体、すなわち二次抗体を用いて間接的な凝集反応
を観察することもなされる。

【０００６】凝集反応を用いた測定法にあっては、抗原
粒子そのものでなく、可溶性抗原を粒子状担体、例え
ば、赤血球、ポリスチレン粒子、ラテックス粒子などに
結合させたいわゆる感作粒子抗原を用いることがなされ
る。このような感作粒子抗原を用いる凝集反応を用いた
測定法は、受身凝集反応免疫測定法とよばれる。

【０００７】特に最近では、社会的にその臨床的測定が
課題となっているものに、Ｃ型肝炎ウイルスと名付けら
れた非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの測定やＡＩＤＳ関連ウイ
ルス、例えばＨＩＶ−１やＨＩＶ−２などのＨＩＶの測
定などが挙げられる。１９７０年代初めにはＢ型肝炎ウ
イルス（ＨＢＶ）の試験法の開発が成されたが、そのよ
うな試験法によってもなお、感染性の肝炎の発生が抑止
できないことから、そのＢ型肝炎ウイルス以外の肝炎ウ
イルスの存在が検討された。このような肝炎は、輸血に
より伝播することからその後広範な研究が成され、問題
となる血液を判別することが、大きな課題となった。

【０００８】ところで研究の過程で、Ａ型肝炎ウイルス
（ＨＡＶ）、ＨＢＶ、サイトメガロウイルス、エプスタ
イン−バール ウイルスに対する抗体が検出されないに
もかかわらず、他の潜在的な肝炎を誘発するような病歴
もない患者がみつかることから、このような患者を、非
Ａ非Ｂ型肝炎という総称で呼んだ。ＨＢＶに対しては優
れた試験法の開発が成功していることから、現在では輸
血後肝炎の大部分が非Ａ非Ｂ型肝炎であるという状況に
なっており、この意味でも非Ａ非Ｂ型肝炎の有効な試験
法の開発が求められた。このような中にあって、慢性非
Ａ非Ｂ型肝炎感染チンパンジーの血液から遺伝子組換え
法によりクローニングされた非Ａ非Ｂ型肝炎の因子はＣ
型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と名付けられた。

【０００９】こうしてこのＨＣＶに対する抗体を検出す
るための試験方法の開発が進められ、現在供血者のスク
リーニングやＣ型肝炎の診断の補助となる試験法が提供
されるに至っている。しかしながら、これまでの方法
は、依然として急性期の診断においてとか、その検出感
度、さらにはその特異性が必ずしも充分なものでなく、
そのうえ非特異的な反応が観察されるなどの問題を有し
ており、より感度、特異性に優れた測定法の開発が求め
られている。より早い時期でのＨＣＶ関連抗体の検出
は、有効な治療を進める上でも、医療の現場での安全性
を確保する上でも重要であり、また非Ａ非Ｂ型肝疾患に
おける検出率を高めたり、供血者のスクリーニングを確
実に行ないうるようにすることが強く求められている。

【００１０】後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因
ウイルスＨＩＶ−ＩやＨＩＶ−ＩＩなどのＨＩＶ（ｈｕ
ｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕ
ｓ）は、１９８１年米国カルフォルニア州で報告されて
以来、その感染者の世界的でかつ急激な増加と、さらに
感染後発症すると致命的な経過をたどることから、その
対策が大きな社会問題となっている。ＨＩＶは、血液、
粘液などの接触により感染伝播することから、その感染
の有無を確実に診断・検出することが求められている。
ＨＩＶは、ＡＩＤＳ原因ウイルスとしてＳｃｉｅｎｃ
ｅ，２２０：８６８，１９８３，同２２４：４９７，１
９８４及び同２２５：８４０，１９８４などで同定さ
れ、まもなくウイルスＤＮＡがクローニングされ、その
全遺伝子構造が明らかにされ（Ｃｅｌｌ，４０：９，１
９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：２７７，１９８５，同
３１３：４５０，１９８５，及びＳｃｉｅｎｃｅ，２２
７：４８４，１９８５）、さらに感染性を持ったウイル
スＤＮＡクローンが得られている（Ｎａｔｕｒｅ，３１
６：２６２，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：９９
８，１９８６，及びＪ．Ｖｉｒｏｌ．５９：２８４，１
９８６）。またＨＩＶには、Ｎａｔｕｒｅ，３１３：２
７７，１９８５に示されているように種々の分離株の存
在が報告されている。こうして解明されたＨＩＶ遺伝子
情報を利用して、ＡＩＤＳ感染を診断することが、大き
な課題となっている。ＨＩＶ感染についても、医療の現
場での安全性を確保したり、早期の有効な治療を進めた
り、二次感染を防ぐため、確実な測定法の開発が急務と
なっている。

【００１１】こうした目的のため、ＨＣＶやＨＩＶなど
に対する抗体を検出するための試験方法において用いら
れる抗原を、遺伝子組換え法によってより効率よく製造
するための方法が開発されてきた。そして最近では、さ
らに遺伝子組換え法により産生された複数のリコビナン
ト抗原が用いられてくるようになると共に、その遺伝子
組換え法でのリコビナント抗原の製造に、特定の制御領
域、例えば、ｌａｃオペロンのようなプロモーターを使
用して製造する試みがなされているが、多くは特に宿主
細胞と導入遺伝子とがその種において異なるような外来
性の遺伝子を導入していることから必ずしもその製造は
容易ではない。このような問題を解決するため、融合蛋
白質としてリコビナント抗原を製造することが一般的に
行なわれるようになってきている。

【００１２】従来、固体担体の表面上に存在する遊離結
合部位と試料中の分析対象物とが非特異的に結合し、こ
れが測定誤差の原因となるため、種々の対策が試みられ
てきた。このようなものの一つに、遊離結合部位をブロ
ックするようなブロッキング剤を使うことが提案されて
いる。また、上記のように遺伝子組換え法で得られたリ
コビナント抗原を用いてＨＣＶやＨＩＶなどに対する抗
体などを検出する免疫学的測定法を行なう場合、非特異
的反応を示すことが見出され、偽陽性を生ずるという問
題が指摘されている。その対策の一つとして、例えば、
ＨＢｃ抗原を用いた測定系では遺伝子組換え操作の施さ
れていない細菌の口径０．８ミクロンのフィルターを通
過せしめて得られた細菌成分抽出物を使用することも提
案されている（特公平３─５９３８２号公報）。

【００１３】しかしながら、遺伝子組換え法で得られた
リコビナント抗原を用いてＨＣＶやＨＩＶなどに対する
抗体、すなわちＨＣＶ関連抗体やＨＩＶ関連抗体などを
検出する免疫学的測定法においては、依然として非特異
的反応を防ぐことが出来ないという問題がある。上記し
たようにより早い時期でＨＣＶ関連抗体を検出したり、
非Ａ非Ｂ型肝疾患における検出率を高めたり、さらに確
実にＨＩＶ感染などを診断・検出したり、供血者のスク
リーニングを確実に行なうためにはこの非特異的反応に
起因する偽陽性を無くすことが緊急的かつ強く求められ
ている。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＨＣＶ抗
原やＨＩＶ抗原などと免疫学的に反応性の抗体（ＨＣＶ
関連抗体、ＨＩＶ関連抗体など）を遺伝子組換え法で得
られたリコビナント抗原を用いて正確に測定する方法を
見いだすべく、鋭意研究を行った結果、簡単な方法によ
り、再現性のあるかつより感度が高く、そして非特異的
反応を抑えて、その非特異的反応に起因する偽陽性を無
くすことのできる方法及び試薬の開発に成功した。

【００１５】本発明者らは、遺伝子組換え法で産生され
た抗原を用いて、試料中の該抗原と免疫学的に反応性の
抗体を測定する場合、該抗原をコードするＤＮＡ配列の
組込まれていないキメラ融合蛋白質発現用プラスミドで
形質転換された細胞の遺伝子産物又はそれと実質的に同
等の作用を有するもの、例えばＣＫＳ（ＣＴＰ：ＣＭＰ
−３−デオキシ−マンノオクチュロソネート・シチジル
・トランスフェラーゼ又はＣＭＰ−ＫＤＯシンセター
ゼ）を用いたキメラ融合蛋白質発現用プラスミドでかつ
該遺伝子組換え法で産生される抗原をコードするＤＮＡ
配列の組込んでないプラスミドで形質転換された形質転
換体細胞の水抽出液を測定系に加えることにより、非特
異的な反応が著しく抑制でき、偽陽性の問題がなくなる
こと、及び検出感度が高まることを見出し、本発明を完
成した。

【００１６】こうした遺伝子組換え法で抗原を産生する
にあたっては、抗原は融合蛋白質として効率よく得られ
るものであり、通常産生された融合蛋白質抗原は開裂な
どにより遊離抗原の形態にされていることができるが、
融合蛋白質部分、例えばＣＫＳ融合蛋白質部分（ＣＫＳ
の全２４８個のアミノ酸配列のうち最初の２３９個のア
ミノ酸配列をもつもの）は、その全部または一部が抗原
に結合したままであることもできる。

【００１７】こうして本発明によれば、遺伝子組換え法
で産生された抗原を用いたところの試料中の該抗原と免
疫学的に反応性の抗体の測定試薬において、偽陽性を抑
制するため、蛋白質発現用プラスミドで形質転換された
細胞の遺伝子産物又はそれと実質的に同等の作用を有す
るものを配合してあることを特徴とする抗体の測定試薬
及びそれを用いた試料中の抗体の測定法が提供される。
特に、偽陽性を抑制するため、該抗原をコードするＤＮ
Ａ配列の組込まれていないキメラ融合蛋白質発現用プラ
スミド（ベクター）で形質転換された細胞水抽出液を用
いることができる。

【００１８】より具体的な態様においては、本発明は、
ＨＣＶ ｃ１００−３リコビナント抗原，ｐＨＣＶ−３
１リコビナント抗原（ＨＣＶの非構造蛋白質部分の抗
原：２６６個のアミノ酸部分を含有）及びｐＨＣＶ−３
４リコビナント抗原（ＨＣＶの構造蛋白質部分のコア領
域の抗原：１５０個のアミノ酸部分を含有）を用いた試
料中のＨＣＶ関連抗体の免疫測定法において、偽陽性を
抑制するため、ＣＫＳキメラ融合蛋白質発現用プラスミ
ドでかつＨＣＶ関連ペプチドをコードするＤＮＡ配列の
組込まれていないプラスミドで形質転換された細胞から
得られる細胞成分及びＳＯＤキメラ融合蛋白質発現用プ
ラスミドでかつＨＣＶ関連ペプチドをコードするＤＮＡ
配列の組み込まれていないプラスミドで形質転換された
細胞から得られる細胞成分又はそれと実質的に同等の作
用を有するものからなる群から選ばれたものを配合して
あることを特徴とする抗体の測定試薬及びそれを用いた
試料中の抗体の測定法を提供する。

【００１９】さらに、本発明は、ＨＩＶ−Ｉ ｅｎｖ．
ｇｐ４１，ＨＩＶ−Ｉ ｇａｇ．ｐ２４リコビナント抗
原，及びＨＩＶ−ＩＩ ｅｎｖ．ｐ３６リコビナント抗
原からなる群から選ばれたものを用いた試料中のＨＩＶ
関連抗体の免疫測定法において、偽陽性を抑制するた
め、ＣＫＳキメラ融合蛋白質発現用プラスミドでかつＨ
ＩＶ関連ペプチドをコードするＤＮＡ配列の組込まれて
いないプラスミドで形質転換された細胞から得られる細
胞成分又はそれと実質的に同等の作用を有するものから
なる群から選ばれたものを配合してあることを特徴とす
る抗体の測定試薬及びそれを用いた試料中の抗体の測定
法を提供する。

【００２０】本発明で用いられる抗原をキメラ融合蛋白
質として発現するために用いられるプラスミド（ベクタ
ー）としては、例えば大腸菌ではβ−ガラクトシダー
ゼ、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテイ
ンＡのＩｇＧ結合領域、マルトース結合蛋白質、ＣＫ
Ｓ、例えばＣＫＳの全２４８個のアミノ酸配列のうち最
初の２３９個のアミノ酸配列をもつものと、外来遺伝子
である抗原とを融合蛋白質として発現できるプラスミド
が挙げられ、例えばそれらはｐＥＸ系プラスミド（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ社）、ｐＵＥＸ系プラスミド（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ社）、ｐＧＥＸ系プラスミド（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ社）、ｐＲＩＴ系プラスミド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
社）、ｐＭＡＬ系プラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ｐＴＢ系プラスミド（Ａｂｂｏ
ｔｔ社）など、また例えば酵母ではＳＯＤとの融合蛋白
質として抗原を発現できるプラスミド、例えばＳＯＤ８
−３などが挙げられる。当該分野で知られた融合蛋白質
として発現できるプラスミド（ベクター）及びそれらか
ら外来遺伝子の発現に適するように、制限酵素、合成オ
リゴヌクレオチドリンカー、リガーゼなどを用いて誘導
された融合蛋白質発現系プラスミド（ベクター）を作製
することが可能であり、そのプラスミドも使用できる。

【００２１】融合部位は、例えば臭化シアン、ヒドロキ
シルアミン、ギ酸、酢酸−ピリジン溶液、２−（２−ニ
トロフェニルスルフェニル）−３−ブロモインドール−
スカトールなどの化学的な処理で切断しうるようなもの
か、トリプシン、リシルエンドプロテアーゼ、Ｘａ因
子、トロンビン、ヒト血漿カリクレインなどの酵素で切
断しうるようなものとされていることができる。

【００２２】本発明で用いられる抗原をキメラ融合蛋白
質として発現するために用いられる代表的ＣＫＳキメラ
融合蛋白質発現系プラスミドは、例えば次のようにして
得られる。大腸菌ｌａｃプロモーター部位を修飾した配
列とＣＫＳをコードしているｋｄｓＢ遺伝子とを含有す
るプラスミドｐＴＢ２０１を構築する。先ず、プラスミ
ドｐＷＭ111 からプラスミドｐＷＭ145 を構築する。

【００２３】例えば、マンデッキ等（Mandecki et al.
Gene 43: 131, 1986) により開示されたようにプラスミ
ドｐＷＭ111 を大腸菌ＪＭ８３（ａｒａ，（ｌａｃ−，
ｐｒｏＡＢ），ｒｐｓｌ，ｏ８Ｏ，ｌａｃｚＭ１５）か
ら標準アルカリ抽出法、次にセシウムクロライド濃度勾
配法による精製そして約７０％のエタノールによる沈殿
処理後、遠心処理して単離する。単離されたプラスミド
ｐＷＭ111 を次に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで
開裂せしめ、単離して得たＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩベク
ター断片と、単離して得たＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩプロ
モーター断片に代えて図１の配列のオリゴヌクレオチド
とをＴ４リガーゼによりライゲーション処理し、ついで
大腸菌ＪＭ１０３（ｓｕｐＥ，ｔｈｉ，（ｌａｃ−，ｐ
ｒｏＡＢ），ｅｎｄａ，ｒｐｓｌ，ｓｂｃＢ１５，[F',
ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ，ｌａｃｉｑＺＭ１５）のコ
ンペテント細胞を形質転換せしめ、形質転換大腸菌から
プラスミドｐＷＭ145 が得られる。

【００２４】一方、大腸菌Ｋ−１２からプラスミドｐＲ
Ｇ１を単離し、それから大腸菌酵素ＣＫＳ（ＣＴＰ：Ｃ
ＭＰ−３−デオキシ−マンノオクチュロソネート・シチ
ジル・トランスフェラーゼ又はＣＭＰ−ＫＤＯシンセタ
ーゼ）をコードしているｋｄｓＢ遺伝子を分離し、プラ
スミドｐＴＢ２０１を構築する。例えば、プラスミドｐ
ＲＧ１をＨｐａＩＩで消化処理し、次にバクテリアル・
アルカリフォスファターゼ（ＢＲＬ）でもって脱燐酸化
処理し、約１．７ｋｂのｋｄｓＢ遺伝子断片を得る。次
に図２の合成オリゴヌクレオチドをＢＲＬ Ｔ４キナー
ゼを用い標識し、ＨｐａＩＩｋｄｓＢ遺伝子断片とライ
ゲーション処理し、ＢＲＬ Ｔ４キナーゼを用い燐酸化
処理する。ついでＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩでもっ
て同時に消化処理し、約１ｋｂの断片を得る。

【００２５】こうして得られたｋｄｓＢ遺伝子を、プラ
スミドｐＷＭ145 をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩでも
って同時に消化処理し、ついで脱燐酸化処理して得られ
た断片と、ライゲーション処理する。大腸菌ＪＭ１０３
のコンペテント細胞を形質転換せしめ、形質転換大腸菌
からプラスミドｐＴＢ２０１を得る。次にこのプラスミ
ドｐＴＢ２０１で形質転換された大腸菌は、例えばアン
ピシリンを含有するＬＢ培地中で培養され、ＩＰＴＧ
（イソプロピル−β−D −チオガラクトシド）で誘導処
理できる。

【００２６】上記プラスミドｐＴＢ２０１は、ＢｑｌＩ
Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩでもって消化処理し、約３．６ｋ
ｂのベクター断片を与える。この約３．６ｋｂのベクタ
ー断片を図３の二つの合成オリゴヌクレオチドから成る
リンカーとライゲーション処理する。大腸菌ＪＭ１０９
（ｒｅｃＡ１，ｅｎｄＡ９６，ｔｈｉ，ｈｓｄＲ１７，
ｓｕｐＥ４４，ｒｅｌＡ１，−，（ｌａｃ−，ｐｒｏＡ
Ｂ），[F',ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ，ｌａｃｉｑＺＭ
１５）のコンペテント細胞を形質転換せしめ、形質転換
大腸菌からプラスミドｐＴＢ２１０を得る。このプラス
ミドｐＴＢ２１０で形質転換された大腸菌は、例えばア
ンピシリンを含有するＬＢ培地中で培養され、ＩＰＴＧ
（イソプロピル−チオ−β−ガラクトシド）で誘導処理
できる。

【００２７】このプラスミドｐＴＢ２１０は、大腸菌Ｘ
Ｌ−１ Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社：Stratagene）の
コンペテント細胞中に導入され形質転換せしめ、形質転
換された細胞を培養して大量に得ることができる。同様
にプラスミドｐＴＢ２０１及びプラスミドｐＴＢ２１０
から外来遺伝子の発現に適するように、制限酵素、合成
オリゴヌクレオチドリンカー、リガーゼなどを用いて誘
導されたＣＫＳ融合蛋白質発現系プラスミドを作製する
ことが可能であり、そのプラスミドを用いて各種形質転
換体を作製することができる。

【００２８】本発明で用いられる抗原をキメラ融合蛋白
質として発現するために用いられる代表的ＳＯＤキメラ
融合蛋白質発現系プラスミドは、例えば次のようにして
得られる。 ＰＮＡＳ，８０：５４６５−５４６９及びＮｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１２：９３４９−９３６３に
開示のＤＮＡ配列を、Ｇｅｎｅ（１９８８）６８：１０
１−１０７に開示の方法で修飾し、こうして得られたＳ
ＯＤアミノ酸配列をコードする遺伝子を酵母のソルビト
ール・デヒドロゲナーゼ遺伝子の制御遺伝子に結合し、
酵母プラスミドに組み込む。得られたＳＯＤをコードす
る遺伝子を持つプラスミド、例えばＳＯＤ８−３を炭素
源としてソルビトールを用いて生育する酵母変異株に導
入して、形質転換体を得る。この形質転換体酵母は、培
地中で培養することができる。

【００２９】また、ＥＰ−Ａ１−３１８，２１６号に記
載のＳＯＤ融合蛋白質発現系プラスミドを用いて酵母を
形質転換せしめ、得られた形質転換体酵母を培地中で培
養し、形質転換体菌体を得ることができる。同様にＥＰ
−Ａ１−３１８，２１６号に記載のＳＯＤ融合蛋白質発
現系プラスミドから外来遺伝子の発現に適するように、
制限酵素、合成オリゴヌクレオチドリンカー、リガーゼ
などを用いて誘導されたＳＯＤ融合蛋白質発現系プラス
ミドを作製することが可能であり、そのプラスミドを用
いて遺伝子組換え法により形質転換体酵母を得ることが
できる。

【００３０】こうして得られた形質転換体は、その大腸
菌、酵母などの細胞を、ガラスビーズ、アルミナビーズ
などを備えていてもよいホモジュナイザー、ワーリング
ブレンダー、フレンチプレス、超音波破砕機などの機械
的方法、リゾチームなどの酵素による方法、凍結融解や
浸透圧による物理的方法あるいはドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）、トウィーン（Ｔｗｅｅｎ：商品名）、ト
ライトンＸ（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ：商品名）などの界面活
性剤、アセトン、ブタノールなどの有機溶媒、ＥＤＴＡ
などのキレート化剤などを用いる化学的方法などにより
破砕することができる。細胞を破砕する際、懸濁液中に
プロテアーゼ阻害剤などを添加しておくこともできる。

【００３１】超音波処理は、例えば、懸濁溶液試料を１
０〜６０ｋＨｚの音波（超音波）を出すことのできる超
音波振動子に適用することにより細胞を破壊することの
できる装置にかけて行うことができ、そのような装置と
しては棒状の超音波振動子を試料に浸す型のものや、超
音波振動子を取り付けたカップ状の容器に試料をいれ処
理する型のものや、連続処理が可能なように循環式にさ
れた型のもの、さらにはビーズなどと共に試料を処理で
きるようにしたもの等が挙げられる。こういった超音波
破砕装置は、大岳製作所（株）、セントラル科学貿易
（株）、セイコー電子工業（株）などから市販されてい
る。超音波処理は、細胞を破砕するに十分な時間処理す
ることにより行われ、使用試料の量や使用出力に応じて
適宜適当に選ぶことができ、通常約１分間から約２時間
の範囲で選ぶことができる。

【００３２】得られた形質転換体細胞液は、例えば硫酸
アンモニウムなどの蛋白質沈殿剤などを用いての塩析、
エタノールなどの有機溶媒による沈殿法、界面活性剤な
どを用いての抽出、透析、密度勾配遠心などの遠心分離
法、限外濾過法、イオン交換樹脂、イオン交換セルロー
ス、イオン交換セファデックス、アルミナ、ハイドロキ
シアパタイトなどによる吸着、カラムクロマトグラフィ
ー、電気泳動法、デキストランゲル、ポリアクリルアミ
ドゲル、ポリエチレングリコールジメタクリル酸ゲル、
アガロースゲル、多孔質シリカガラス、分子ふるい法、
モノクローナル抗体などを利用したアフィニティクロマ
トグラフィーによりさらに分離、精製されることがで
き、使用に適したものに加工できる。これらの処理は、
任意に適した方法を選び組み合わせてよく、さらに測定
時の非特異的反応を抑制して、偽陽性を排除しうるよう
に選ぶことができる。

【００３３】本発明で用いられる形質転換された細胞の
遺伝子産物又はそれと実質的に同等の作用を有するもの
は、代表的には、上記したような形質転換体細胞水抽出
液で、例えばリコビナント抗原をコードするＤＮＡを発
現しうるようには組み換えてないベクターによって形質
転換された細胞を、プロテアーゼ阻害剤存在下破砕し、
ついで遠心分離処理して得られた水抽出液で、約０．２
ミクロン又はそれ以下のフィルターを通過しうる細胞水
抽出液であることができる。さらには、該形質転換体細
胞水抽出液は、該形質転換体細胞をプロテアーゼ阻害剤
存在下破砕し、ついで遠心分離処理して得られた水抽出
液を蛋白質に関して分画濃縮し、得られた蛋白質濃縮物
を透析した水抽出液で、約０．２ミクロン又はそれ以下
のフィルターを通過しうる細胞水抽出液であることもで
きよう。

【００３４】好ましくは、大腸菌を用いた場合、該形質
転換された細胞の遺伝子産物又はそれと実質的に同等の
作用を有するものは、リコビナントＣＫＳタンパク質の
発現系ベクターであるプラスミドを大腸菌に導入して形
質転換処理し、こうして形質転換された大腸菌を培養
し、この培養液より形質転換体菌体を遠心分離により集
め、集めた菌体を緩衝液に懸濁後破砕し、この菌体破砕
液より、遠心分離及び０．２μｍのフィルターを用いた
濾過により不溶物を除いて得られた水抽出液である。さ
らに、酵母を用いた場合、該形質転換された細胞の遺伝
子産物又はそれと実質的に同等の作用を有するものは、
リコビナントＳＯＤタンパク質の発現系ベクターである
プラスミドを酵母に導入して形質転換処理し、この形質
転換酵母を培養し、この培養液より形質転換体菌体を遠
心分離により集め、集めた菌体を緩衝液に懸濁後破砕
し、この菌体破砕液より、遠心分離により不溶物を除い
た上清液を、攪拌しながら、例えば約８５〜９５℃で、
例えば約５分間熱処理し、例えば約４５〜６５℃まで冷
やした後、遠心分離及び０．２μｍのフィルターを用い
た濾過により不溶物を除いて得られたものである。

【００３５】本発明で用いられる形質転換された細胞の
遺伝子産物又はそれと実質的に同等の作用を有するもの
は、代表的な具体例では次のようにして得られる。例え
ば、リコビナントＣＫＳタンパク質の発現系ベクターで
あるプラスミドｐＴＢ２１０などを、大腸菌ＸＬ−１
Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社：Stratagene）などの宿主
細胞に導入し、形質転換処理し、こうして形質転換され
た大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１などを適切な培地中で
培養し、この培養液より形質転換体菌体を遠心分離によ
り集め、集められた菌体をＥＤＴＡ、トライトンＸ−１
００及びプロテアーゼ阻害剤を含むトリス緩衝液などの
緩衝液に懸濁し、機械的に破砕する。この菌体破砕液よ
り、遠心分離及び０．２μｍのフィルターを用いた濾過
により不溶物を除き、リコビナントＣＫＳ融合タンパク
質発現系ベクターｐＴＢ２１０形質転換大腸菌ｐＴＢ２
１０／ＸＬ−１水抽出液などの形質転換体水抽出液を得
ることができる。

【００３６】上記で得られた、リコビナントＣＫＳタン
パク質を含む大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１などの水抽
出液から、約４．８Ｍ又はそれ以上の濃度の硫酸アンモ
ニアなどの沈殿剤により、リコビナントＣＫＳタンパク
質を含むタンパク質画分を沈殿させた。この沈殿させた
タンパク質画分を、０．５ｍＭジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）水溶液などの媒質に懸濁し、この懸濁液を０．１
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．６）などの緩衝液中で透析
し、粗精製リコビナントＣＫＳタンパク質含有の形質転
換体大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１水抽出液などの形質
転換体水抽出液を得ることができる。

【００３７】別の代表的な具体例では、本発明で用いら
れる形質転換された細胞の遺伝子産物又はそれと実質的
に同等の作用を有するものが次のようにして得られる。
リコビナントＳＯＤタンパク質の発現系ベクターである
プラスミドＳＯＤ８−３などのベクターを、ソルビトー
ル要求性の酵母変異株などの宿主細胞に導入し、形質転
換処理する。この形質転換酵母などを培養し、この培養
液より形質転換体菌体を遠心分離により集め、集めた菌
体をＥＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤を含むトリス緩衝
液などの緩衝液に懸濁し、機械的に破砕する。この菌体
破砕液より、遠心分離により不溶物を除いた上清液を、
攪拌しながら、例えば約８５〜９５℃で５分間熱処理
し、ついで例えば約４５〜６５℃まで冷やした後、遠心
分離及び０．２μｍのフィルターを用いた濾過により不
溶物を除き、リコビナントＳＯＤ融合タンパク質発現系
ベクターＳＯＤ８−３形質転換酵母水抽出液などの形質
転換体水抽出液を得ることができる。

【００３８】本発明においては、形質転換体水抽出液
は、単独でも複数種を組み合わせても使用でき、希釈剤
に添加されて用いることもでき、その場合の使用量は約
０．０００１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは
約０．００１ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌ、さらに
好ましくは約０．００５ｍｇ／ｍｌ〜約０．１ｍｇ／ｍ
ｌ、最も好ましくは約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．１ｍ
ｇ／ｍｌの濃度となるようにして用いることができる。
複数種を組み合わせた場合、偽陽性を抑制する上でより
好ましい。

【００３９】本発明においては、形質転換体水抽出液
は、単に形質転換体の細胞破砕物で口径約０．１〜２．
０ミクロンのフィルターを通過させるだけで調製した形
質転換体細胞成分水抽出物の形態で用いるのでなく、よ
り精製処理して夾雜物を除いた形態のものが好ましく用
いることもできるし、非特異的反応を抑制するために、
例えば、単に細菌などの細胞を水（たとえば、生理食塩
水など）に加え、これを超音波処理（例えば、３〜２０
ＫＣ、１０分〜２時間の処理）に付すことによつて得ら
れ、かくして得られたものを遠心分離（たとえば、３０
００〜２００００ｒ．ｐ．ｍ．１０分〜６０分）に付し
た上澄を、さらに最大口径０．１〜２．０ミクロンのフ
ィルターを通過させることなどによって分離されたよう
な細胞成分水抽出物であることもできる。

【００４０】本発明で用いられる遺伝子組換え法で産生
された抗原は、例えば遺伝子組換え技術を適用し、天然
ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＢＶなどのウイルスなどから分子ク
ローニングにより得られたＤＮＡ配列あるいは既に知ら
れたＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＢＶなどのゲノム配列から、酵
素などを用いたり、化学合成により得られたＤＮＡ配列
を、微生物あるいは動物、植物、昆虫などで発現させて
得られたリコビナント抗原である。このリコビナント抗
原としては、例えば、ＨＣＶやＨＩＶなどのゲノムの別
々の抗原領域を発現させた組換え蛋白質（リコビナント
蛋白質）の少なくとも１種であることができる。本発明
で用いられる遺伝子組換え法で産生された抗原として
は、好ましくは融合蛋白質として得られるものである。
ＨＴＬＶ、ＨＳＶＩＩ（ヘルペス・シムプレックス・ウ
イルスＩＩ）又はその関連抗原、ｔＰＡ（ヒト・ティシ
ュ・プラスミノーゲン）又はその関連抗原、ＳＰＬ（ヒ
ト肺サーファクタント）又はその関連抗原なども挙げら
れる。

【００４１】さらに好ましくはこのリコビナント抗原は
ＣＫＳ、ＳＯＤ、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡのＩｇＧ結合
領域、マルトース結合蛋白質、あるいはそれらの関連蛋
白質の融合蛋白質として得られるものである。例えば、
宿主細胞として大腸菌を用いてＣＫＳ融合蛋白質発現系
の遺伝子産物として得られるもの、特にはＣＫＳの全２
４８個のアミノ酸配列のうち最初の２３９個のアミノ酸
配列をもつものとの融合蛋白質、及び宿主細胞として酵
母を用いてＳＯＤ融合蛋白質発現系の遺伝子産物として
得られるものが挙げられる。

【００４２】ＣＫＳ融合蛋白質発現系によるものとして
は、例えば、特開平４─２５３９９８公報や特開平４─
２８１７９２公報に記載のものが挙げられ、さらには例
えばｐＨＣＶ−２３リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−２９
リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−３１リコビナント抗原、
ｐＨＣＶ−３４リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−４５リコ
ビナント抗原、ｐＨＣＶ−４８リコビナント抗原、ｐＨ
ＣＶ−４９リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−５０リコビナ
ント抗原、ｐＨＣＶ−５１リコビナント抗原、ｐＨＣＶ
−５７リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−５８リコビナント
抗原、ｐＨＣＶ−１０１リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−
１０２リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−１０３リコビナン
ト抗原、ｐＨＣＶ−１０４リコビナント抗原、ｐＨＣＶ
−１０５リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−１０７リコビナ
ント抗原、あるいはそれらをペプチダーゼや化学的開裂
試薬で処理などし、プロセッシングして得られたペプチ
ド、例えばＣＫＳ遺伝子由来ペプチド部分の切断してあ
るものなどが挙げられる。

【００４３】また、ｐＴＢ２１１リコビナント抗原、ｐ
ＴＢ３１０Ａリコビナント抗原、ｐＴＢ３１０Ｂリコビ
ナント抗原、ｐＴＢ３１９リコビナント抗原、ｐＪＣ２
２リコビナント抗原、及びｐＪＣ１００リコビナント抗
原、あるいはそれらをペプチダーゼや化学的開裂試薬な
どでで処理し、プロセッシングなどして得られたペプチ
ドからなる群から選ばれたもの、例えばＨＩＶ−Ｉ ｅ
ｎｖ．ｇｐ４１リコビナント抗原，ＨＩＶ−Ｉ ｅｎ
ｖ．ｇｐ１１０リコビナント抗原，ＨＩＶ−Ｉｇａｇ．
ｐ２４リコビナント抗原，ＨＩＶ−ＩＩ ｅｎｖ．ｐ３
６リコビナント抗原などが挙げられる。

【００４４】ＳＯＤ融合蛋白質発現系の遺伝子産物抗原
としては、ＥＰ−Ａ１−３１８，２１６号に記載のＨＣ
Ｖ ｃ１００−３、あるいはそれらをペプチダーゼや化
学的開裂試薬で処理などし、プロセッシングして得られ
たペプチド、例えばＳＯＤ遺伝子由来ペプチド部分の切
断してあるものなどが挙げられる。また、本発明では好
適に複数のリコビナント抗原を混合して用いることがで
きる。好ましくは、本発明で用いられる抗原は、ＨＣＶ
ｃ１００−３リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−３１リコ
ビナント抗原及びｐＨＣＶ−３４リコビナント抗原から
なるものが使用できる。また、本発明で用いられる抗原
は、ＨＩＶ−Ｉ ｅｎｖ．ｇｐ４１，ＨＩＶ−Ｉ ｇａ
ｇ．ｐ２４リコビナント抗原，及びＨＩＶ−ＩＩ ｅｎ
ｖ．ＣＫＳ−ｐ３６リコビナント抗原からなるものが使
用できる。本発明では遺伝子組換え法で産生された抗原
だけでなく、例えばウイルス、微生物細胞、生体組織な
どから単離精製された抗原又はそれらと同等な作用を有
するものをさらに配合して用いることもできる。このよ
うなものとしては、ＨＢｓ、ＨＩＶより精製されたＨＩ
Ｖ−Ｉ ｅｎｖ．ｇｐ４１などが挙げられる。

【００４５】本発明において試料中の抗原と免疫学的に
反応性の抗体を測定するにあたっては、ラジオイムノア
ッセイ、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法、化学又は生
物発光免疫測定法、及び凝集反応免疫測定法などの方法
によることができる。特に凝集反応免疫測定法、例えば
受身凝集反応免疫測定法は好ましい方法である。

【００４６】本発明において試料中の抗原と免疫学的に
反応性の抗体を測定するにあたっては、抗原抗体反応に
あずかる抗原は、必要に応じて、例えば、寒天、アガロ
ース、セルロース、紙、ニトロセルロース、デキストラ
ン、ゼラチン、キチン、コラーゲン、綿などの生体由来
高分子あるいは天然物由来高分子、ポリスチレン、ポリ
エチレン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド
などのアクリル樹脂、イオン交換樹脂、光架橋樹脂、テ
フロン、ポリアセタールなどの合成高分子、ガラスビー
ズ、シリカゲル、アルミナ、セラミック、カーボン、硫
酸マグネシウムなどの無機質材料などからなる、微粒
子、ビーズ、マイクロプレート、マイクロタイターウェ
ル、マイクロチューブ、ストリップ、メンブレン、トレ
イ、ゲルなど、さらには赤血球、ラテックス粒子、乳剤
などの固定担体に固定しておき、この固定担体を、分析
対象としての抗体等を含有する試料と接触させ、こうし
て固定担体に固定された抗原と、分析試料中の抗体等と
を特異的に結合反応せしめ、この特異的に結合した分析
対象物を検知することによりおこなうことができる。

【００４７】ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法、
化学又は生物発光免疫測定法、螢光免疫測定法などで
は、 ¹²⁵Ｉ、 ³Ｈなどの放射性物質、西洋わさびペルオ
キシダーゼ、β−D −ガラクトシダーゼ、アルカリフォ
スファターゼなどの酵素、フルオレッセインなどの螢光
色素、金コロイド、セレンコロイドなどの発光又は発色
物質などで標識された抗原あるいは二次抗体が試薬とし
て用いられ、分析試料中の抗体、複合体等と特異的に結
合反応せしめられ、その放射活性、酵素活性あるいは螢
光などを測定して、試料中の抗体等が存在していたか否
かを判別することができる。

【００４８】凝集反応を利用した測定法では、一般には
可溶性抗原を粒子状担体、例えば、赤血球、ポリスチレ
ン粒子、ラテックス粒子などに結合させたいわゆる感作
粒子抗原などの粒子状抗原と、それに対する抗体とが特
異的に結合反応して観察できるような凝集塊をつくる反
応を利用する。例えば、試料中の抗体を検知するため、
上記したような粒子状抗原を試料と混合して反応させ、
例えば、水性媒質の中で抗原抗体反応により生じた凝集
反応が観察されるか否かにより、試料中に測定対象の抗
体が存在しているか否かが判別される。この凝集反応を
用いた測定法にあっては、一定量の抗原に対し、一定の
希釈列にある既知濃度あるいは量の抗体を加え、反応の
結果得られる溶液の凝集反応の程度を希釈倍数の逆数で
表して評価されることがなされる。逆に一定量の抗体に
対し、一定の希釈列にある既知濃度あるいは量の抗原を
加え、反応の結果得られる溶液の凝集反応の程度を希釈
倍数の逆数で表して評価されることもなされるし、更に
抗体に対する抗体、すなわち二次抗体を用いて間接的な
凝集反応を観察することもなされる。受身凝集反応免疫
測定法は、本発明に従い、例えば、ＨＩＶに対する抗
体、ＨＣＶに対する抗体などの測定に用いられ、優れた
作用効果が得られる。

【００４９】固体担体、粒子状担体あるいは標識などと
抗原とを結合あるいは吸着させるには、当該分野で汎用
されている方法を用いることができ、例えばイオン相互
作用、疎水相互作用、共有結合などの物理的吸着や化学
的結合により行うことができる。例えば、架橋剤として
は、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミジ
ル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、スク
シンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘ
キサン−１−カルボキシレート、スクシンイミジル
（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、スクシン
イミジル ４−（１−マレイミドフェニル）ブチレート
などが挙げられる。

【００５０】固体担体、粒子状担体などの例としては、
上記したようなものが挙げられ、例えば寒天、アガロー
ス、架橋アガロース、架橋アルギン酸、架橋グアガム、
ニトロセルロースやカルボキシルセルロースなどのセル
ロースエステルあるいは混合セルロースエステル、ゼラ
チン、架橋ゼラチン、ラテックス、ゴム、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジ
エン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリ
アクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタ
クリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、
アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共
重合体などのポリエステル、ポリアミド、ポリウレタ
ン、ポリエポキシ樹脂などの天然あるいは合成の修飾あ
るいは非修飾の重合炭水化物、重合炭化水素など、それ
らの架橋誘導体など、ガラス、例えば活性化ガラス、シ
リカゲル、カオリン、タルク、シリカ−アルミナ、アル
ミナ、硫酸バリウムなどの無機材料などからなる群から
選ばれたものを、多孔性のゲル、微粒子などにしたもの
が挙げられる。

【００５１】本発明においては、測定は競合アッセイ、
中和アッセイ、固相アッセイ、クロマトグラムアッセ
イ、サンドイッチアッセイなどに適したようにしておこ
なうこともできる。本発明で用いられる測定対象試料と
しては、全血、血清、血漿、脳脊髄液、リンパ液、リン
パ球、唾液、尿、汗、涙、糞便、生体粘液、生検組織、
細胞培養上清液などの生物由来材料をあげることができ
る。これら測定対象試料は、必要に応じ濃縮したり、希
釈して用いられるが、普通希釈剤などで希釈して用いる
ことが好ましい。

【００５２】本発明においては、検知用試薬として、４
−ヒドロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレンジアミ
ン、テトラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ・ペルオ
キシダーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフ
ェニルガラクトシドなどとβ−D −ガラクトシダーゼ、
ウンベリフェリルホスフェート、ニトロフェニルホスフ
ェート、ＮＡＤＰなどとアルカリフォスファターゼ、グ
ルコース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼなどの酵素試
薬、放射性物質試薬、フルオレッセインイソチオシアネ
ート、テトラメチルローダミンイソチオシアネートなど
を用いている螢光試薬、発光試薬、化学発光試薬、金コ
ロイド、銀コロイド、セレンコロイドなどのコロイド標
識試薬、磁性体試薬、ビオチン標識抗ビオチン抗体など
のハプテン標識抗ハプテン抗体検出系試薬などを用いる
ことができる。

【００５３】本発明の測定系においては、界面活性剤、
緩衝剤、希釈液又は希釈剤、ブロッキング剤、キレート
化剤、保存剤などを用いることができる。界面活性剤と
しては、陰イオン型界面活性剤、陽イオン型界面活性
剤、両性界面活性剤、非イオン型界面活性剤のうちから
選んで用いることが出来る。陰イオン型界面活性剤とし
ては、炭素数１２〜１８の高級脂肪酸のアルカリ金属
塩、炭素数１２〜１８の高級脂肪酸のトリエタノールア
ミンなどの有機塩基塩、炭素数１２〜１８の高級脂肪酸
又は高級アルコールの硫酸エステル、アルキルスルホン
酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩などが挙げられ
る。陽イオン型界面活性剤としては、アルキル基、アリ
ール基、複素環基などを有する第四級アンモニウム化合
物などが挙げられる。

【００５４】両性界面活性剤としては、ポリアミノモノ
カルボン酸、炭素数１２〜１８の高級アルキルアミノ
酸、ラウリルジメチルベタインなどのアミノ酸のＮ−ト
リアルキル置換体などが挙げられる。非イオン型界面活
性剤としては、モノステアリン酸グリセリンなどの炭素
数１２〜１８の高級脂肪酸の多価アルコールエステル、
高級脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、高級脂肪酸
のソルビタンエステル、高級脂肪酸とポリオキシエチレ
ン及びソルビタンエーテルとのエステル、ポリオキシエ
チレンラウリルアルコールなどの高級アルコールとポリ
オキシエチレンとのエーテル、ポリオキシエチレンとポ
リオキシプロピレンとのエーテルなどが挙げられる。

【００５５】好ましい界面活性剤としては、ポリオキシ
エチレンソルビタン（代表的なものは、Ｔｗｅｅｎ ２
０などの商品名で入手しうる）、ポリオキシエチレンエ
ーテル（代表的なものは、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００な
どの商品名で入手しうる）、オクチルフェノール・エチ
レンオキサイド縮合物（代表的なものは、Ｎｏｎｉｄｅ
ｔ Ｐ−４０などの商品名で入手しうる）、ドデシル硫
酸ナトリウム、Ｎ−ラウリルザルコシンなどが挙げられ
る。これら界面活性剤は、約０．００１％ｖ／ｖ〜約１
０％ｖ／ｖの範囲で用いることができる。

【００５６】緩衝剤、希釈液又は希釈剤としては、水、
リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、例えば生理食塩水などの塩化ナ
トリウム液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン
−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）液、ピペラジン−
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）液、３−（シ
アノヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸）液、
３−（モルホリノ）プロパンスルホン酸液、アミノ酸液
などが挙げられる。これらは単独でも、任意に配合して
も用いることができる。キレート化剤としては、エチレ
ンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコー
ル−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）などが挙げられ
る。これらキレート化剤は、約０．０１ｍＭ〜約２０ｍ
Ｍの範囲で用いることができる。

【００５７】保存剤としては、例えばナトリウムアジ
ド、エチルパラベンなどが挙げられる。その他、本発明
の測定系には、各種動物の血清、例えば牛血清、牛血清
アルブンミン（ＢＳＡ）、牛胎児血清（ＦＣＳ）、ヤギ
血清、卵白アルブンミン、ゼラチン、各種乳蛋白質、例
えばスキムミルク、カゼイン、カゼイン分解物、ホエー
蛋白質など、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリ
ドンなどからなる群から選ばれたものを添加することが
できる。これらは、約０．０１％ｖ／ｖ〜約５０％ｖ／
ｖの範囲で添加することができる。

【００５８】本発明においては、測定は好ましくは水性
媒体中で行うことができるが、場合によっては免疫学的
反応を一時的に水性媒体中で行うようにされていてもよ
い。水性媒体は、好ましくは約５．０〜９．０のｐＨに
調整されて行うことができ、より好ましくは緩衝液中で
行うこともできる。水性媒体の塩濃度は、比較的低いほ
うが好ましく、例えば生理的に等張化されているものが
好ましい。本発明においては、もちろんリンパ球破砕
物、例えばヒトＴ−リンパ球抽出液、大腸菌抽出液、酵
母抽出液、マウス細胞培養液抽出液などの細胞抽出物を
添加することもできる。これらのものは、約０．００１
％ｖ／ｖ〜約２０％ｖ／ｖの範囲で添加することもでき
る。

【００５９】本発明においては、偽陽性を抑制するた
め、さらにＳＯＤ又はそれと実質的に同等の作用を有す
るものを添加することもできる。これに用いられるもの
は、ＳＯＤの全アミノ酸配列からなるもの、ＳＯＤのア
ミノ酸配列の一部からなるものであることができ、ヒト
胎盤由来のＳＯＤタンパク質及びウシ赤血球由来のＳＯ
Ｄタンパク質など市販のもの、さらには遺伝子組換え法
で産生されたものであることができ、遺伝子組換え法で
融合蛋白質の産生に用いられるプラスミドにより産生さ
れるＳＯＤ相当蛋白質と実質的に同等の作用を有するも
のが挙げられる。本発明で用いられるＳＯＤと実質的に
同等の作用を有するものは、例えばＳＯＤの全アミノ酸
配列のうちの一部のアミノ酸配列をもつものあるいはそ
の蛋白質を酵母などの菌体から分離精製処理する際生ず
る断片蛋白質、遺伝子組換え法で融合蛋白質の産生に用
いられるＳＯＤ遺伝子によりコードされたＳＯＤ由来ペ
プチド断片などが挙げられる。

【００６０】本発明で用いられるＳＯＤ又はそれと実質
的に同等の作用を有するものは、例えば次のようにして
得られる。上記したようなＳＯＤをコードする遺伝子を
持つプラスミド、例えばＳＯＤ８−３を炭素源としてソ
ルビトールを用いて生育する酵母変異株に導入して、形
質転換体を得る。この形質転換体酵母を培地中で培養
し、得られた菌体から産生ＳＯＤを、精製処理して得ら
れる。精製には当該分野で知られた方法を適宜選んで使
用できる。

【００６１】また、上記したようにＥＰ−Ａ１−３１
８，２１６号に記載のＳＯＤ融合蛋白質発現系プラスミ
ドを用いて酵母を形質転換せしめ、得られた形質転換体
酵母を培地中で培養し、得られた菌体から産生ＳＯＤ断
片蛋白質を、精製処理して得られる。同様にＥＰ−Ａ１
−３１８，２１６号に記載のＳＯＤ融合蛋白質発現系プ
ラスミドから外来遺伝子の発現に適するように、制限酵
素、合成オリゴヌクレオチドリンカー、リガーゼなどを
用いて誘導されたＳＯＤ融合蛋白質発現系プラスミドを
作製することが可能であり、そのプラスミドを用いて遺
伝子組換え法によりＳＯＤ又はそれと実質的に同等の作
用を有するものが得られる。また、精製ＣＫＳ又はそれ
と実質的に同等の作用を有するものをさらに添加するこ
ともできる。本発明においては、試薬は単一の容器ある
いは複数の容器に入れてあり、使用にあたり配合されて
用いるようになっていてもよい。

【００６２】

【実施例】次に実施例を示して、本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこの具体例により限定されるもの
でなく、その思想に従うかぎり各種の形態で実施できる
ことは理解されるべきである。

【００６３】実施例１ （１）酵母水抽出物 ディフコ ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，米国）社から酵母水抽出物を入手した。 （２）大腸菌水抽出液の調製 リコンビナントタンパク質を発現するための、遺伝子組
換え操作が行われていない大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ
（ストラタジーン社：Stratagene）を培養し、培養液よ
り菌体を遠心分離により集め、こうして得られた菌体を
ＥＤＴＡ、トライトンＸ−１００及びプロテアーゼ阻害
剤を含むトリス緩衝液に懸濁し、機械的に破砕した。こ
の菌体破砕液より、遠心分離及び０．２μｍのフィルタ
ーを用いた濾過により不溶物を除き、大腸菌ＸＬ−１水
抽出物を得た。また、リコンビナントタンパク質を発現
するための、遺伝子組換え操作が行われていない大腸菌
ＪＭ１０３を培養し、上記の大腸菌ＸＬ−１水抽出物の
場合と同様な抽出操作により、大腸菌ＪＭ１０３水抽出
物を得た。このようにして得られる大腸菌ＸＬ−１水抽
出物及び大腸菌ＪＭ１０３水抽出物は、米国アボット社
より入手しうる。

【００６４】（３）リコビナントＣＫＳ融合タンパク質
発現系ベクターｐＴＢ２１０により形質転換された大腸
菌の水抽出液の調製 リコビナントＣＫＳタンパク質の発現系ベクターである
プラスミドｐＴＢ２１０を、大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ
（ストラタジーン社：Stratagene）に導入し、形質転換
処理され、こうして形質転換された大腸菌ｐＴＢ２１０
／ＸＬ−１を得、この大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１を
培養した。この培養液より、形質転換体菌体を遠心分離
により集め、集めた菌体をＥＤＴＡ、トライトンＸ−１
００及びプロテアーゼ阻害剤を含むトリス緩衝液に懸濁
し、機械的に破砕した。この菌体破砕液より、遠心分離
及び０．２μｍのフィルターを用いた濾過により不溶物
を除き、リコビナントＣＫＳ融合タンパク質発現系ベク
ターｐＴＢ２１０形質転換大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−
１水抽出液を得た。このようにして得られるリコビナン
トＣＫＳタンパク質発現系ベクター形質転換大腸菌ｐＴ
Ｂ２１０／ＸＬ−１水抽出液は、米国アボット社より入
手しうる。

【００６５】（４）粗精製リコビナントＣＫＳタンパク
質含有の形質転換大腸菌水抽出液の調製 上記（３）で得られた、リコビナントＣＫＳタンパク質
を含む大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１水抽出液から、
４．８Ｍ以上の濃度の硫酸アンモニアにより、リコビナ
ントＣＫＳタンパク質を含むタンパク質を沈殿させた。
この沈殿させたタンパク質を、０．５ｍＭジチオスレイ
トール（ＤＴＴ）水溶液に懸濁し、この懸濁液を０．１
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．６）中で透析し、粗精製リコ
ビナントＣＫＳタンパク質含有の形質転換体大腸菌ｐＴ
Ｂ２１０／ＸＬ−１水抽出液を得た。このようにして得
られる粗精製リコビナントＣＫＳタンパク質含有の形質
転換体大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１水抽出液は、米国
アボット社より入手しうる。

【００６６】（５）リコビナントＳＯＤ融合タンパク質
発現系ベクターＳＯＤ８−３により形質転換された酵母
水抽出液の調製 リコビナントＳＯＤタンパク質の発現系ベクターである
プラスミドＳＯＤ８−３を、ソルビトール要求性の酵母
変異株に導入し、形質転換処理した。この形質転換酵母
を培養し、この培養液より、形質転換体菌体を遠心分離
により集め、集めた菌体をＥＤＴＡ及びプロテアーゼ阻
害剤を含むトリス緩衝液に懸濁し、機械的に破砕した。
この菌体破砕液より、遠心分離により不溶物を除いた上
清液を、攪拌しながら８５〜９５℃で５分間熱処理し、
４５〜６５℃まで冷やした後、遠心分離及び０．２μｍ
のフィルターを用いた濾過により不溶物を除き、リコビ
ナントＳＯＤ融合タンパク質発現系ベクターＳＯＤ８−
３形質転換酵母水抽出液を得た。

【００６７】この抽出液を６０ｍＭ塩化ナトリウムを含
む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈した後、
陰イオン交換カラム（Ｑ セファロース（Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ）、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社）に
かけた。このカラムを６０ｍＭ塩化ナトリウム液で洗浄
し、酵母菌体由来の不純物を除いた後、３５０ｍＭ塩化
ナトリウムによりリコビナントＳＯＤタンパク質画分を
溶出した。この溶出液を、限外濾過により濃縮し、０．
２μｍのフィルターを用いて濾過して、粗精製リコビナ
ントＳＯＤタンパク質含有の形質転換体酵母水抽出液を
得た。このようにして得られる粗精製リコビナントＳＯ
Ｄタンパク質含有の形質転換体酵母水抽出液は、米国ア
ボット社より入手しうる。

【００６８】実施例２ ＨＣＶ関連抗原を感作した赤血球の調製 ＨＣＶ関連抗原と免疫学的に反応性の抗体を、受身赤血
球凝集反応（ＰＨＡ）を用いて測定するため、ＨＣＶ関
連抗原を感作した赤血球を次のようにして調製した。Ｈ
ＣＶ関連抗原として、ＨＣＶ ｃ１００−３ リコビナ
ント抗原、ｐＨＣＶ−３１ リコビナント抗原及びｐＨ
ＣＶ−３４ リコビナント抗原の混合物をヒト赤血球に
感作し、感作血球濃度が１．０（ｖ／ｖ）％になるよう
に生理食塩水（ｐＨ７．０）に溶解した。

【００６９】また、この感作血球溶解液に、非特異反応
の吸収剤として、実施例１の（１）〜（５）で得た酵母
水抽出物、大腸菌ＸＬ−１水抽出物、大腸菌ＪＭ１０３
水抽出物、発現系ベクター形質転換大腸菌ｐＴＢ２１０
／ＸＬ−１水抽出液、タンパク質発現系ベクターＳＯＤ
８−３形質転換酵母水抽出液、粗精製リコビナントＳＯ
Ｄタンパク質含有の形質転換体酵母水抽出液、又は粗精
製リコビナントＣＫＳタンパク質含有の形質転換体大腸
菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１水抽出液をそれぞれ添加し
た。添加した濃度は、酵母水抽出物は０．１（ｗ／ｖ）
％、大腸菌水抽出物、発現系ベクター形質転換大腸菌ｐ
ＴＢ２１０／ＸＬ−１水抽出液、及び発現系ベクターＳ
ＯＤ８−３形質転換酵母水抽出液は０．１（ｖ／ｖ）
％、粗精製リコビナントＳＯＤタンパク質含有の形質転
換体酵母水抽出液、及び粗精製リコビナントＣＫＳタン
パク質含有の形質転換体大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１
水抽出液は、それぞれ２０μｇ／ｍｌになるようにし
た。

【００７０】実施例３ ＨＣＶ関連抗原を感作した赤血球の調製 実施例２と同様にして、ＨＣＶ関連抗原と免疫学的に反
応性の抗体を、受身赤血球凝集反応（ＰＨＡ）を用いて
測定するため、ＨＣＶ関連抗原を感作した赤血球を調製
した。ＨＣＶ関連抗原として、ＨＣＶ ｃ１００−３
リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−３１ リコビナント抗原
又はｐＨＣＶ−３４ リコビナント抗原を用いた。これ
らのＨＣＶ関連抗原をそれぞれ単独でヒト赤血球に感作
し、感作血球濃度が１．０（ｖ／ｖ）％になるように生
理食塩水（ｐＨ７．０）に溶解した。また、この感作血
球溶解液に、非特異反応の吸収剤として、実施例１の
（１）〜（５）で得た酵母水抽出物、大腸菌ＸＬ−１水
抽出物、大腸菌ＪＭ１０３水抽出物、発現系ベクター形
質転換大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１水抽出液、発現系
ベクターＳＯＤ８−３形質転換酵母水抽出液、粗精製リ
コビナントＳＯＤタンパク質含有の形質転換体酵母水抽
出液、又は粗精製リコビナントＣＫＳタンパク質含有の
形質転換体大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１水抽出液をそ
れぞれ添加した。添加した濃度は、実施例２の場合と同
様にした。

【００７１】実施例４ ＣＫＳ及びＳＯＤの非特異的反応の抑制効果の測定 ＨＣＶ関連抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法にお
ける、ＣＫＳ及びＳＯＤの非特異的反応の抑制効果を、
受身赤血球凝集反応（ＰＨＡ、１５〜３０℃で２時間イ
ンキュベーション）を用いて測定した。 （１）先ず、実施例２で得られた、何も非特異反応の吸
収剤の添加してない感作血球を用いて、健常人の血清検
体５０００例についてＰＨＡアッセイをおこなった。こ
のＰＨＡアッセイで凝集反応が観察された偽陽性検体と
して２０例を得た。次にこの偽陽性検体２０例につい
て、実施例２で得られた、各種（酵母水抽出物、大腸菌
ＸＬ−１水抽出物、大腸菌ＪＭ１０３水抽出物、発現系
ベクター形質転換大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１水抽出
液、リコビナントＳＯＤ融合タンパク質発現系ベクター
ＳＯＤ８−３形質転換酵母水抽出液、粗精製リコビナン
トＳＯＤタンパク質含有の形質転換体酵母水抽出液、又
は粗精製リコビナントＣＫＳタンパク質含有の形質転換
体大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１水抽出液）の非特異反
応の吸収剤を添加した感作血球を用いて、ＰＨＡアッセ
イを行った。得られた結果を表１に示す。

【００７２】

【表１】

【００７３】（２）次に、実施例３で得られた、何も非
特異反応の吸収剤の添加してない感作血球、及び実施例
３で得られた、各種（酵母水抽出物、大腸菌ＸＬ−１水
抽出物、大腸菌ＪＭ１０３水抽出物、発現系ベクター形
質転換大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１水抽出液、リコビ
ナントＳＯＤ融合タンパク質発現系ベクターＳＯＤ８−
３形質転換酵母水抽出液、粗精製リコビナントＳＯＤタ
ンパク質含有の形質転換体酵母水抽出液、又は粗精製リ
コビナントＣＫＳタンパク質含有の形質転換体大腸菌ｐ
ＴＢ２１０／ＸＬ−１水抽出液）の非特異反応の吸収剤
を添加した感作血球を用いて、上記の偽陽性検体２０例
について、ＰＨＡアッセイを行った。得られた結果を表
２に示す。

【００７４】

【表２】

【００７５】表１及び表２に示したように、ＣＫＳタン
パク質発現系ベクター又はＳＯＤタンパク質発現系ベク
ターで形質転換された宿主細胞の水抽出液を含む吸収剤
を添加することにより、偽陽性検体が吸収され陰性化し
た。また、ＣＫＳタンパク質発現系ベクターで形質転換
された宿主細胞の水抽出液及びＳＯＤタンパク質発現系
ベクターで形質転換された宿主細胞の水抽出液の両者を
含む吸収剤を同時に添加することにより、全ての偽陽性
検体が吸収され陰性化した。一方、酵母水抽出物、やリ
コンビナントタンパク質を発現するための、遺伝子組換
え操作が行われていない大腸菌の水抽出液の添加によっ
ては、偽陽性検体は全く陰性化しなかった。

【００７６】このようにＣＫＳタンパク質発現系ベクタ
ー又はＳＯＤタンパク質発現系ベクターで形質転換され
た宿主細胞の水抽出液を含む感作血球溶解液を用いるこ
とにより、非特異的反応を吸収して、顕著に偽陽性を抑
制できることが明らかとなった。また、上記実施例とは
別の実験において、上記実施例で使用した各種の非特異
反応の吸収剤を、上記実施例で使用した各種の感作血球
溶解液に添加しても、ＨＣＶ関連抗体の測定には影響し
なかった。従って、ＣＫＳタンパク質発現系ベクター又
はＳＯＤタンパク質発現系ベクターで形質転換された宿
主細胞の水抽出液を含有する感作血球溶解液を用いるこ
とにより、ＨＣＶ関連抗体の測定を損なうこと無く、非
特異的反応のみを吸収して、偽陽性を抑制し、ＨＣＶ関
連抗体に対するより特異性の高いアッセイ試薬となるこ
とが明らかとなった。

【００７７】実施例５ ＨＩＶ関連抗原を感作した赤血球の調製 ＨＩＶ関連抗原と免疫学的に反応性の抗体を、受身赤血
球凝集反応（ＰＨＡ）を用いて測定するため、ＨＩＶ関
連抗原を感作した赤血球を次のようにして調製した。Ｈ
ＩＶ関連抗原として、ＨＩＶ−Ｉ ｇａｇ．ｐ２４リコ
ビナント抗原、又はＨＩＶ−ＩＩ ｅｎｖ．ＣＫＳ−ｐ
３６リコビナント抗原を用い、これらのＨＩＶ関連抗原
をそれぞれ単独でヒト赤血球に感作し、さらにＨＩＶ−
Ｉ ｇａｇ．ｐ２４リコビナント抗原及びＨＩＶ−ＩＩ
ｅｎｖ．ＣＫＳ−ｐ３６リコビナント抗原（ＨＩＶ
ｐ３６リコビナント抗原）の混合物をヒト赤血球に感作
し、得られた感作血球濃度が１．０（ｖ／ｖ）％になる
ように生理食塩水（ｐＨ７．０）に溶解した。

【００７８】実施例６ ＨＩＶ関連抗原を感作した赤血球の調製 実施例５と同様にして、ＨＩＶ関連抗原と免疫学的に反
応性の抗体を、受身赤血球凝集反応（ＰＨＡ）を用いて
測定するため、ＨＩＶ関連抗原を感作した赤血球を調製
した。ＨＣＶ関連抗原として、ＨＩＶ ｐ３６リコビナ
ント抗原を用いた。このＨＩＶ関連抗原をヒト赤血球に
感作し、感作血球濃度が１．０（ｖ／ｖ）％になるよう
に生理食塩水（ｐＨ７．０）に溶解した。また、この感
作血球溶解液に、非特異反応の吸収剤として、実施例１
の（２）〜（４）で得た大腸菌ＸＬ−１水抽出物、大腸
菌ＪＭ１０３水抽出物、発現系ベクター形質転換大腸菌
ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１水抽出液、又は粗精製リコビナ
ントＣＫＳタンパク質含有の形質転換体大腸菌ｐＴＢ２
１０／ＸＬ−１水抽出液をそれぞれ添加した。添加した
濃度は、大腸菌水抽出物、及び発現系ベクター形質転換
大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１水抽出液はそれぞれ０．
１（ｖ／ｖ）％、粗精製リコビナントＣＫＳタンパク質
含有の形質転換体大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１水抽出
液は、２０μｇ／ｍｌになるようにした。

【００７９】実施例７ ＣＫＳの非特異的反応の抑制効果の測定 ＨＩＶ関連抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法にお
ける、ＣＫＳの非特異的反応の抑制効果を、受身赤血球
凝集反応（ＰＨＡ、１５〜３０℃で２時間インキュベー
ション）を用いて測定した。 （１）先ず、実施例２で得られた、何も非特異反応の吸
収剤の添加してない感作血球を用いて、健常人の血清検
体９００例についてＰＨＡアッセイをおこなった。得ら
れた結果を表３に示す。

【００８０】

【表３】

【００８１】（２）次に、実施例６で得られた、何も非
特異反応の吸収剤の添加してない感作血球、及び実施例
６で得られた、各種（大腸菌ＸＬ−１水抽出物、大腸菌
ＪＭ１０３水抽出物、発現系ベクター形質転換大腸菌ｐ
ＴＢ２１０／ＸＬ−１水抽出液、又は粗精製リコビナン
トＣＫＳタンパク質含有の形質転換体大腸菌ｐＴＢ２１
０／ＸＬ−１水抽出液）の非特異反応の吸収剤を添加し
た感作血球を用いて、上記の偽陽性検体３５例につい
て、ＰＨＡアッセイを行った。得られた結果を表４に示
す。

【００８２】

【表４】

【００８３】表３及び表４に示したように、ＣＫＳタン
パク質発現系ベクターで形質転換された宿主細胞の水抽
出液を含む吸収剤を添加することにより、偽陽性検体が
吸収され陰性化した。一方、リコンビナントタンパク質
を発現するための、遺伝子組換え操作が行われていない
大腸菌の水抽出液の添加によっては、偽陽性検体は全く
陰性化しなかった。このようにＣＫＳタンパク質発現系
ベクターで形質転換された宿主細胞の水抽出液を含む感
作血球溶解液を用いることにより、非特異的反応を吸収
して、顕著に偽陽性を抑制できることが明らかとなっ
た。また、上記実施例とは別の実験において、上記実施
例で使用した各種の非特異反応の吸収剤を、上記実施例
で使用した各種の感作血球溶解液に添加しても、ＨＩＶ
関連抗体の測定には影響しなかった。従って、ＣＫＳタ
ンパク質発現系ベクターで形質転換された宿主細胞の水
抽出液を含有する感作血球溶解液を用いることにより、
ＨＩＶ関連抗体の測定を損なうこと無く、非特異的反応
のみを吸収して、偽陽性を抑制し、ＨＩＶ関連抗体に対
するより特異性の高いアッセイ試薬となることが明らか
となった。

【００８４】なお、ＣＫＳタンパク質発現系ベクターで
形質転換された宿主細胞の水抽出液を含有する感作血球
溶解液を用いるもので偽陽性が現れたもののうち、３例
は×１６及び×３２では非特異的な反応を完全に抑制し
ており、×８においての判定困難な微かな反応であり、
これは非特異的な反応とはみなされず、ＣＫＳタンパク
質添加量を増加することにより偽陽性を抑制できると評
価できるものである。大腸菌の菌体成分は、ＨＩＶの測
定系において非特異的反応を中和するのに、効果が劣
り、特異性的なＨＩＶ抗体の測定に用いても依然問題で
あることが判明した。一方、リコビナントＣＫＳタンパ
ク質含有の形質転換体大腸菌水抽出液を添加することに
より、非特異的反応が顕著に中和されて偽陽性が抑えら
れることが明らかとなった。

【００８５】

【発明の効果】抗原をコードするＤＮＡ配列の組込まれ
ていないキメラ融合蛋白質発現用プラスミドで形質転換
された細胞の遺伝子産物又はそれと実質的に同等の作用
を有するもの、例えば、ＣＫＳ融合蛋白質発現系プラス
ミドやＳＯＤ融合蛋白質発現系プラスミドで形質転換さ
れた細胞の水抽出液を用いることにより、遺伝子組換え
法で産生された抗原を用いた、試料中の該抗原と免疫学
的に反応性の抗体の測定において、非特異的反応の発生
を効果的に中和でき、より特異性に優れた測定ができ
る。また、複数の融合蛋白質発現系プラスミド形質転換
細胞の水抽出液を一緒に用いることにより、より優れた
リコビナント抗原と免疫学的に反応性の抗体測定系が提
供でき、臨床検査においての有用性が高いし、検出率を
高めたり、供血者のスクリーニングを確実に行なうこと
ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ｐＴＢ２０１作製に用いた修飾用の合成ｌａ
ｃＰプロモーター領域のＤＮＡ配列を示す。

【図２】 ｐＴＢ２０１作製に用いたｋｄｓＢ遺伝子の
５’端の合成領域のＤＮＡ配列を示す。

【図３】 ｐＴＢ２１０作製に用いたリンカーのＤＮＡ
配列を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 井上 裕三 千葉県松戸市岩瀬618 エステートピアＯ ＮＥ 201号 (72)発明者 松村 多恵 千葉県千葉市美浜区磯辺１−40−１ (72)発明者 小林 利章 千葉県松戸市稔台60 アーネス敏201号 (72)発明者 城村 哲 千葉県野田市谷津626−１ 707号 (72)発明者 駒越 好之 埼玉県八潮市南後谷780−８ (72)発明者 伊吹 純 千葉県松戸市金ヶ作298−22 サニーハイ ツ 101号

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 遺伝子組換え法で産生された抗原を用い
   た、試料中の該抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法
   において、該蛋白質発現用プラスミドで形質転換された
   細胞の遺伝子産物又はそれと実質的に同等の作用を有す
   るものを用いて、偽陽性を抑制することを特徴とする遺
   伝子組換え抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法。
2. 【請求項２】 蛋白質発現用プラスミドが、該抗原をコ
   ードするＤＮＡ配列の組込まれていないキメラ融合蛋白
   質発現用プラスミドである請求項１記載の遺伝子組換え
   抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法。
3. 【請求項３】 蛋白質発現用プラスミドで形質転換され
   た細胞が、大腸菌である請求項１又は２記載の遺伝子組
   換え抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法。
4. 【請求項４】 蛋白質発現用プラスミドで形質転換され
   た細胞が、酵母である請求項１〜３のいずれか一記載の
   遺伝子組換え抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法。
5. 【請求項５】 蛋白質発現用プラスミドが、ＣＫＳキメ
   ラ融合蛋白質発現用プラスミド又はＳＯＤキメラ融合蛋
   白質発現用プラスミドである請求項１〜３のいずれか一
   記載の遺伝子組換え抗原と免疫学的に反応性の抗体の測
   定法。
6. 【請求項６】 蛋白質発現用プラスミドが、ｐＴＢ２０
   １，ｐＴＢ２１０、ｐＴＢ２６０，ｐＴＢ２７０又はそ
   れから制限酵素及び／又は合成オリゴヌクレオチドを用
   いて遺伝子組換え法で修飾されて誘導されたプラスミド
   である請求項１〜３及び５のいずれか一記載の遺伝子組
   換え抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法。
7. 【請求項７】 蛋白質発現用プラスミドが、ＳＯＤ８−
   ３又はそれから制限酵素及び／又は合成オリゴヌクレオ
   チドを用いて遺伝子組換え法で修飾されて誘導されたプ
   ラスミドである請求項１〜２及び４のいずれか一記載の
   遺伝子組換え抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法。
8. 【請求項８】 形質転換された細胞の遺伝子産物又はそ
   れと実質的に同等の作用を有するものが、細胞水抽出液
   である請求項１〜７のいずれか一記載の抗体の測定法。
9. 【請求項９】 形質転換された細胞の遺伝子産物又はそ
   れと実質的に同等の作用を有するものが、形質転換体細
   胞をプロテアーゼ阻害剤存在下破砕し、ついで遠心分離
   処理して得られた水抽出液で、約０．２ミクロン以下の
   フィルターを通過しうる細胞水抽出液である請求項１〜
   ８のいずれか一記載の遺伝子組換え抗原と免疫学的に反
   応性の抗体の測定法。
10. 【請求項１０】 形質転換された細胞の遺伝子産物又は
    それと実質的に同等の作用を有するものが、形質転換体
    細胞をプロテアーゼ阻害剤存在下破砕し、ついで遠心分
    離処理して得られた水抽出液を分画濃縮し、得られた蛋
    白質濃縮物を透析した水抽出液で、約０．２ミクロン以
    下のフィルターを通過しうる細胞水抽出液である請求項
    １〜９のいずれか一記載の遺伝子組換え抗原と免疫学的
    に反応性の抗体の測定法。
11. 【請求項１１】 形質転換された細胞の遺伝子産物又は
    それと実質的に同等の作用を有するものが、リコビナン
    トＣＫＳタンパク質の発現系ベクターであるプラスミド
    を、大腸菌に導入して形質転換処理し、こうして形質転
    換された大腸菌を培養し、この培養液より形質転換体菌
    体を遠心分離により集め、集めた菌体を緩衝液に懸濁後
    破砕し、この菌体破砕液より遠心分離して得られた形質
    転換大腸菌水抽出液で、約０．２μｍ又はそれ以下のフ
    ィルターを通過しうる形質転換大腸菌水抽出液である請
    求項１〜３、５〜６、及び８〜１０のいずれか一記載の
    遺伝子組換え抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法。
12. 【請求項１２】 形質転換された細胞の遺伝子産物又は
    それと実質的に同等の作用を有するものが、リコビナン
    トＳＯＤタンパク質の発現系ベクターであるプラスミド
    を、酵母に導入して形質転換処理し、この形質転換酵母
    を培養し、この培養液より形質転換体菌体を遠心分離に
    より集め、集めた菌体を緩衝液に懸濁後破砕し、この菌
    体破砕液より遠心分離により不溶物を除いた上清液を、
    攪拌しながら熱処理してから冷やした後、遠心分離して
    得られた形質転換酵母水抽出液で、約０．２μｍ又はそ
    れ以下のフィルターを通過しうる形質転換酵母水抽出液
    である請求項１〜２、４、７、及び８〜１０のいずれか
    一記載の遺伝子組換え抗原と免疫学的に反応性の抗体の
    測定法。
13. 【請求項１３】 遺伝子組換え法で産生された抗原の少
    なくとも一つが、融合蛋白質として得られるものである
    請求項１〜１２のいずれか一記載の遺伝子組換え抗原と
    免疫学的に反応性の抗体の測定法。
14. 【請求項１４】 遺伝子組換え法で産生された抗原の少
    なくとも一つが、遺伝子組換え法でＣＫＳキメラ融合蛋
    白質発現系又はＳＯＤキメラ融合蛋白質発現系により融
    合蛋白質として得られるものである請求項１〜１３のい
    ずれか一記載の遺伝子組換え抗原と免疫学的に反応性の
    抗体の測定法。
15. 【請求項１５】 該抗体が、ＨＣＶ抗体、ＨＩＶ−Ｉ抗
    体及びＨＩＶ−ＩＩ抗体からなる群から選ばれたもので
    ある請求項１〜１４のいずれか一記載の遺伝子組換え抗
    原と免疫学的に反応性の抗体の測定法。
16. 【請求項１６】 遺伝子組換え法で産生された抗原が、
    宿主細胞として少なくとも一つは大腸菌を用いて得られ
    るものである請求項１〜１５のいずれか一記載の遺伝子
    組換え抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法。
17. 【請求項１７】 遺伝子組換え法で産生された抗原が、
    ＨＣＶ抗原又はその関連抗原、ＨＩＶ抗原又はその関連
    抗原、ＨＴＬＶ−Ｉ抗原又はその関連抗原、ＨＴＬＶ−
    ＩＩ抗原又はその関連抗原、ＨＳＶＩＩ抗原又はその関
    連抗原、ｔＰＡ抗原又はその関連抗原、及びＳＰＬ抗原
    又はその関連抗原からなる群から選ばれたものであるこ
    とを特徴とする請求項１〜１６のいずれか一記載の遺伝
    子組換え抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法。
18. 【請求項１８】 遺伝子組換え法で産生された抗原が、
    ｐＨＣＶ−２３リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−２９リコ
    ビナント抗原、ｐＨＣＶ−３１リコビナント抗原、ｐＨ
    ＣＶ−３４リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−４５リコビナ
    ント抗原、ｐＨＣＶ−４８リコビナント抗原、ｐＨＣＶ
    −４９リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−５０リコビナント
    抗原、ｐＨＣＶ−５１リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−５
    ７リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−５８リコビナント抗
    原、ｐＨＣＶ−１０１リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−１
    ０２リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−１０３リコビナント
    抗原、ｐＨＣＶ−１０４リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−
    １０５リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−１０７リコビナン
    ト抗原、あるいはそれらをペプチダーゼ又は化学的開裂
    試薬で処理し、プロセッシングして得られたペプチドか
    らなる群から選ばれたものであることを特徴とする請求
    項１〜１７のいずれか一記載の遺伝子組換え抗原と免疫
    学的に反応性の抗体の測定法。
19. 【請求項１９】 遺伝子組換え法で産生された抗原が、
    ｐＴＢ２１１リコビナント抗原、ｐＴＢ３１０Ａリコビ
    ナント抗原、ｐＴＢ３１０Ｂリコビナント抗原、ｐＴＢ
    ３１９リコビナント抗原、ｐＴＢ３２０リコビナント抗
    原、ｐＴＢ３２１リコビナント抗原、ｐＴＢ３２２リコ
    ビナント抗原、ｐＪＣ２２リコビナント抗原、ｐＪＣ１
    ００リコビナント抗原、あるいはそれらをペプチダーゼ
    又は化学的開裂試薬で処理し、プロセッシングして得ら
    れたペプチドからなる群から選ばれたものであることを
    特徴とする請求項１〜１８のいずれか一記載の遺伝子組
    換え抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法。
20. 【請求項２０】 遺伝子組換え法で産生された抗原が、
    ＨＩＶ−Ｉ−０４１ＨａｅＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩリコ
    ビナント抗原、ＨＩＶ−Ｉ−ｐ４１ｄリコビナント抗原
    及びＨＩＶ−ＩＩ ＴＭＰリコビナント抗原からなる群
    から選ばれたものであることを特徴とする請求項１〜１
    ７及び１９のいずれか一記載の遺伝子組換え抗原と免疫
    学的に反応性の抗体の測定法。
21. 【請求項２１】 遺伝子組換え法で産生された抗原が、
    宿主細胞として少なくとも一つは酵母を用いて得られる
    ものである請求項１〜１７のいずれか一記載の遺伝子組
    換え抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法。
22. 【請求項２２】 遺伝子組換え法で産生された抗原が、
    ＨＣＶ抗原又はその関連抗原、及びＨＢＶ抗原又はその
    関連抗原からなる群から選ばれたものであることを特徴
    とする請求項２１記載の抗体の測定法。
23. 【請求項２３】 遺伝子組換え法で産生された抗原が、
    ＨＣＶｃ１００−３抗原又はそれらをペプチダーゼ又は
    化学的開裂試薬で処理し、プロセッシングして得られた
    ペプチド関連抗原からなる群から選ばれたものであるこ
    とを特徴とする請求項２２記載の遺伝子組換え抗原と免
    疫学的に反応性の抗体の測定法。
24. 【請求項２４】 遺伝子組換え法で産生された抗原が、
    遺伝子組換え法で融合蛋白質として得られる複数の抗原
    からなる請求項１〜２３のいずれか一記載の遺伝子組換
    え抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法。
25. 【請求項２５】 遺伝子組換え法で産生された抗原が、
    ＨＣＶ ｃ１００−３リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−３
    １リコビナント抗原及びｐＨＣＶ−３４リコビナント抗
    原のＨＣＶ関連抗原からなる請求項１〜１４、１６、２
    １及び２４のいずれか一記載の遺伝子組換え抗原と免疫
    学的に反応性の抗体の測定法。
26. 【請求項２６】 偽陽性を抑制するため、さらにＳＯＤ
    又はそれと実質的に同等の作用を有するものを用いるこ
    とを特徴とする請求項１〜２５のいずれか一記載の遺伝
    子組換え抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法。
27. 【請求項２７】 抗原が、ＨＩＶ−Ｉ ｅｎｖ．ｇｐ４
    １，ＨＩＶ−Ｉ ｇａｇ．ｐ２４リコビナント抗原，及
    びＨＩＶ−ＩＩ ｅｎｖ．ｐ３６リコビナント抗原から
    なる請求項１〜６、８〜１１、１３〜１７、１９〜２
    ０、及び２４のいずれか一記載の遺伝子組換え抗原と免
    疫学的に反応性の抗体の測定法。
28. 【請求項２８】 遺伝子組換え法で産生された抗原を用
    いた試料中の該抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定試
    薬において、偽陽性を抑制するため、蛋白質発現用プラ
    スミドで形質転換された細胞の遺伝子産物又はそれと実
    質的に同等の作用を有するものを配合してあることを特
    徴とする遺伝子組換え抗原と免疫学的に反応性の抗体の
    測定試薬。
29. 【請求項２９】 蛋白質発現用プラスミドが、該抗原を
    コードするＤＮＡ配列の組込まれていないキメラ融合蛋
    白質発現用プラスミドである請求項２８記載の遺伝子組
    換え抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定試薬。
30. 【請求項３０】 測定試薬が、ラジオイムノアッセイ、
    酵素免疫測定法、螢光免疫測定法、化学又は生物発光免
    疫測定法、及び凝集反応免疫測定法からなる群から選ば
    れたものにおいて用いられるものであることを特徴とす
    る請求項２８又は２９記載の遺伝子組換え抗原と免疫学
    的に反応性の抗体の測定試薬。
31. 【請求項３１】 測定試薬が、競合アッセイ、中和アッ
    セイ、固相アッセイ、クロマトグラムアッセイ、及びサ
    ンドイッチアッセイからなる群から選ばれたものにおい
    て用いられるものであることを特徴とする請求項２８〜
    ３０のいずれか一記載の遺伝子組換え抗原と免疫学的に
    反応性の抗体の測定試薬。
32. 【請求項３２】 試料が、全血、血清、血漿、脳脊髄
    液、リンパ液、リンパ球、唾液、尿、汗、涙、糞便、生
    体粘液、生検組織、及び細胞培養上清液からなる群から
    選ばれたものであることを特徴とする請求項２８〜３１
    のいずれか一記載の遺伝子組換え抗原と免疫学的に反応
    性の抗体の測定試薬。
33. 【請求項３３】 検知用試薬として、酵素試薬、放射性
    物質試薬、螢光試薬、発光試薬、化学発光試薬、コロイ
    ド標識試薬、磁性体試薬、及びハプテン標識抗ハプテン
    抗体検出系試薬からなる群から選ばれたものを用いるも
    のであることを特徴とする請求項２８〜３２のいずれか
    一記載の遺伝子組換え抗原と免疫学的に反応性の抗体の
    測定試薬。
34. 【請求項３４】 請求項１〜２７のいずれか一記載の遺
    伝子組換え抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法に用
    いるものである請求項２８〜３３のいずれか一記載の遺
    伝子組換え抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定試薬。