KR0137173B1 - 항 hcv, hiv-1, hiv-2 및 htlv-i 항체 동시진단시약 - Google Patents

Abstract

사람혈액중에 존재하는 항 C형 간염바이러스 및 인간 면역 결핍바이러스 1형, 2형, 인간 T세포 백혈병 바이러스 항체를 동시에 2개이상 측정 검출하는 목적의 면역 측정법으로, 동일 고정고상에 분석 목적의 항체에 대응하는 2개 이상의 바이러스 항원을 다량체로 제조한 후 최적 혼합비율과 흡착순서 및 항원흡착 완충액을 개발하여 흡착시킴으로써 2개 이상의 항체를 진단할 때 단일 진단시약에 비하여 감도 및 특이도가 동일하면서 동시 진단이 가능하게한 발명이다.

Description

항 HCV, HIV-1, HIV-2 및 HTLV-I항체 동시진단시약

제1도는 HCV의 코어부분인 DA 703항원의 염기 및 아미노산 서열이다.

제2도는 HCV의 NS3부분인 DA 168항원의 염기 및 아미노산 서열이다.

제3도는 HCV의 NS4부분인 DA 99항원의 염기 및 아미노산 서열이다.

제4도는 HIV-1/2 항원제조시 PCR에 사용된 프라이머 염기서열이다.

제5도는 HIV-1/2 항원 발현 재조합 플라스미드이다.

제6도는 HIV-1의 p24항원의 염기 및 아미노산 서열이다.

제7도는 HIV-1의 gp41항원의 염기 및 아미노산 서열이다.

제8도는 HIV-2의 gp35항원의 염기 및 아미노산 서열이다.

본 발명은 사람의 혈액속에 존재하는 항 HCV 및 HIV-1, HIV-2, HTLV-I 항체중 하나 또는 둘이상의 존재를 동시에 검출하는 목적의 효소면역 측정법에 관한 것이다. 최근 의학에 연관된 여러 기초학문들이 눈부신 발전을 거듭하면서 인류에게 질병을 일으킬 수 있는 여러 전염성 병원균이 속속 밝혀지고 있다. 인간면역결핍 바이러스 1형 및 2형(HIV-1/2 Human Immundodeficiency Virus-1/2), C형 간염 바이러스(HCV, Hepatitis C Virus) 및 인간 T세포 백혈병 바이러스(HTLV-I, Human T-Cell Leukemia Virus-I)등 역시 최근에 병원균이 분리되어 원인균이 밝혀졌고 앞으로 이러한 새로운 병원균의 수는 점차 늘어날 전망이다. 상기한 바이러스들은 모두 혈액에 의한 감염이 주경로이며 일단 감염되면 적절한 치료약이 없는 치명적인 질병을 초래하므로 그 감염방지에 최선의 노력을 기울여야 한다.

인류의 공포의 질병으로 지대한 관심사가 되고 있는 HCV-HIV-1, HIV-Ⅱ 및 HTLV-Ⅰ바이러스들의 항체 검출을 위한 개개의 단독 진단시약은 여러나라에서 많은 회사들이 제조 판매하고 있다. 그러나 수혈을 위한 혈액 및 혈액제재 등에 이러한 병원균의 검색항목은 더욱 증가되고 있어 각 병원균 진단에 필요한 시약 구입비 및 검색 시험자의 인건비, 기기 및 시설이 설치, 운영비등의 제반경비로 인하여 막대한 부담이 가중되고, 혈액 및 혈액제재의 가격도 현저히 증가할 수밖에 없는 실정이다. 이와 같은 상황에서 본 발명자들은 여러 병원균의 검출 및 진단을 동시에 수행할 수 있는 방법을 고안하여 여러 병원균 검색에 소요되는 막대한 시간과 인력손실 및 경비를 절감하고자 본 동시진단법을 발명하였다.

그러나 이러한 목적의 진단법을 몇 외국 회사들이 국내에 몇건의 유사한 특허를 기출원 하였으나[참조-특허공개 92-4839, 90-702371, 91-14708] 그 방법이 본 발명과는 달리 각각의 분석대상물에 대응하는 항원이나 항체를 Abbott의 경우 제1고상과 제2고상에 별도로 결합하거나, 후지레비오의 경우 자성입자나 라텍스 등의 결합 입자를 사용하고, 비로발 에스·에이의 경우는 검출대상의 다른 두종류에 대항하는 다른 효소가 공급되어 다른 착색효과를 갖는 해당수의 지시제 물질이 공급되는 점이 상이하다. 즉 타특허는 2개 이상의 동시진단을 실시하는데 있어서 고상을 2개 사용하던가 효소표지 접합체를 달리하여 2개 이상의 분석대상물을 구별판정 하는 것이나, 본 발명은 각 항원을 교차 결합체를 사용하여 다량체로 만들어 항체결합력을 증가시켜 동일고상에 흡착하고 각 항원들의 혼합비율과 흡착순서 및 흡착용 완충액의 최적조건을 발명하므로써 기존의 단일 진단시약이 확보하고 있는 감도 및 특이도를 그대로 유지한채 동시에 2개 이상의 진단이 가능하게한 신규방법이다. 항원을 고정고산(plate)에 흡착하는 기술은 흡착된 항원의 항체결합능력 및 안정성을 결정하여 진단시약의 감도 및 특이도 뿐만 아니라 균일성 및 안정성에도 매우 큰 영향을 미치므로 진단시약 제조에서 가장 중요한 기술이다. 본 발명의 동시진단시약 제조에 사용된 흡착기술은 단량체 항원을 흡착시키는 기존기술과는 달리, 항원에 교차결합체인 글루타르 알데히드를 처리하여 다량체 항원을 형성한 후 흡착시킴으로써 흡착항원의 항체결합부위(epitope)의 노출과 구조의 안정화를 극대화시켜 항체에 대한 결합능력을 향상시켰다.

또한 재조합 HIV 및 HCV 각 항원을 동일한 pH의 완충용액에서 혼합하여 동시에 흡착시켰을 경우 항원들의 물리·화학적 성상의 차이에 의해 항원흡착량이 상당히 다르게 나타났다. 따라서 본 발명에서 서로 다른 pH를 갖는 완충용액에서 순서적으로 각 항원을 최적으로 흡착시키는 기술을 개발하였다.

사용된 각 항원도 항원항체 반응에 가장 민감한 부위만을 고순도로 정제사용하여 항원 결합용 고상의 단위면적당 최대한 항체 결합부위를 갖게끔 제조할 수 있었다. 그러므로 자칫 다양한 항원을 혼합사용하므로써 감도저하로 인한 위음성 판정을 배제할 수 있었다. 또한 본 발명에서는 HCV바이러스 항원을 한국형 HCV에서 분리한 유전자를 사용하여 항원단백질을 제조하였기 때문에 한국형 C형 간염 바이러스는 감염진단에 더욱 정확성을 기할 수 있게 되었다. C형 간염 바이러스는 인간면역결핍 바이러스나 인간 T세포 백혈병 바이러스 보다도 더욱 유전적 변이가 심하여 일정지역이나 국가내에서의 보균자나 감염되어 있는 C형 간염 바이러스의 유전정보 또는 이에 코드되는 항원 단백질을 서로 상동성을 나타내지만 다른 지역이나 국가에서 감염된 바이러스와는 상당부분 이질성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 〔참조-Yoshihiro et al., Nucleic Res.17(24), 10367-10372, 1988와 Nobuyuki et al., Proc. Japan Acad. 66, B(9), 219-223, 1989〕C형 간염 바이러스 항체의 진단은 항원-항체간의 반응을 이용하는 것이므로 환자가 현재 감염된 바이러스와 이질성을 나타내는 바이러스 유전자로부터 얻어지는 항원단백질을 그 항체의 진단에 사용할 경우에는 진단의 정확도가 낮아지는 문제점이 발생하므로 진단에 이용되는 C형 감염 항원 단백질은 그 지역이나 국가의 특성에 맞게 상동성을 나타내는 항원단백질을 이용하여야 한다. 실제로 본 발명에 사용된 C형 간염 바이러스〔참조-유럽특허 0318216 A1〕와는 부분과 외막부위에서 20∼28%의 유전자 염기서열간의 이질성 및 15∼10% 이상의 아미노산 서열간의 이질성을 나타내었고 진단 키트제조 후 자체임상시 시판중인 미국의 C형 간염 바이러스 항체 진단시약과 한예에서 차이를 보여주었고 확인시험결과 한국형 바이러스 항원을 사용하여 항체측정이 가능한 것으로 보였다. 이하 본 발명을 상세히 설명하면 항원 고정고상의 제조방법은 다음과 같다. 분석대상물에 대응하는 항원을 교차 결합제를 사용하여 각 항원을 다량체로 형성시킨 뒤 0.1M카보네이트(pH 9.6)완충액 및 0.1M NaHCO3(pH 8.4)완충액에 각각 최적의 농도로 희석 혼합한 후 2회에 걸쳐 흡착반응으로 고상에 결합시킨다. 그 후 항원액을 흡입제거한 다음 추가 흡착용액(인산염 완충액, pH 7.4＋1% 탈지유 ＋0.5% BSA＋1% 트리톤X－100)을 각 구멍에 분주한 후 37℃에서 1시간 반응하여 흡광도값을 안정화시킨다. 그후 추가 흡착용액을 흡입제거한 후 세척액(인산염 완충액, pH 7.4＋0.05% 트윈 20)으로 3회 세척 후 메탄올을 각 구멍당 280㎕ 씩 분주하고 수초후 흡입제거한 다음 150∼200℃에서 30∼50초간 처리하여 항원과 고상간의 결합을 견고히 고정화시킨다. 제조된 플레이트는 건조제를 첨가한 후 알루미늄 팩으로 밀봉포장한 후 냉장실에서 보관한다.

검처내에 존재하는 항체의 측정은 위와 같이 제조한 마이크로 플레이트를 이용하여 공지의 방법인 효소면역 측정법으로 다음과 같이 시행하였다. 트리톤 X－100 0.5%가 첨가되고 소혈청 등으로 제조된 검체용 희석액을 각 구멍당 200㎕씩 분주한 후 각 검체를 10㎕씩 취해 직접 각 구멍에 분주하고 잘 혼합한 후 37℃에서 30분간 반응을 시켜 항원－항체 복합체를 만들었다. 반응후 결합되지 않은 검체여액은 흡입제거하고, 0.05%의 트윈－20이 첨가된 세척액 250㎕로 각 구멍을 5회 세척하였다. 트리톤 X－100 0.5% 첨가되고 소혈청으로 제조된 효소표지 항체용 희석액으로 희석된 염소 항인간 면역글로부린－과산화 효소 접합체(Zymed, U.S.A) 200㎕씩을 각 구멍에 넣고 37℃에서 30분간 반응을 시켜 항원－항체 복합체와 결합시켰다. 반응후 세척액 250㎕로 각 구멍을 5회 세척한 후 OPD(Ortho Phenylene Diamine 2HCI)가 12.8㎎(Sigma, U.S.A) 들어 있는 기질 발포정 1정을 35% 과산화 수소수가 0.02% 들어 있는 기질용 완충액 5㎖에 넣어 녹인 기질용액을 구멍당 200㎕씩 넣어 실온에서 30분간 효소－기질 반응을 시켰다. 4N－황산용액을 각 구멍당 50㎕씩 넣어 반응을 정지시킨 후 흡광도 분석기로 492㎜에서 흡광도를 측정하였다. 상기한 방법으로 동시진단 키트를 제조한 후 외국의 우수한 단일진단 시약과 동시에 비교한 자체 임상결과 민감도나 특이도면에서 전혀 문제가 없어 2개 이상의 바이러스 항체를 정확하고 간편하게 동시에 측정 검출할 수 있었다. 하기의 실시예는 본 발명의 범위를 제한함이 없어 더 상세하게 설명하기 위한 것이다.

[실시예 1 각 항원의 제조]

(1) HCV항원의 제조

본 발명에 사용된 C형 간염바이러스 항원은 기특허출원된(공개특허 93-127) 내용중 바이러스 코어 부분의 항원 단백질인 DA703(참조-제1도) 비구조 단백질인 NS3 부위의 DA168(참조-제2도) NS4 부위의 DA99(참조-제3도)를 사용하였다.

(2) HIV-1/2 항원의 제조

HIV-1/2 항원은 공지의 방법에 따라 제조할 수 있으며 NCI(National Cancer Institute, National Institute of Health, Maryland, U.S.A)로부터 분양받은 유전자 정보를 이용하여 아래의 방법에 따라 각각 제조하였다.

1) p24항원(HIV-1 코아 단백부위)의 제조

① p24발현 플라스미드

제작 HIV-1 gag유전자의 132 아미노산 위치와, 264 아미노산 위치의 DNA 염기서열에 대하여 두 개의 올리고 뉴클레오티드를 만들었다.(참조-제4도). 이 두 개의 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로 하고 Taq 플리머라제와 HIV-1 유전자를 가진 플라스미드를 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 실시하였다. 이때의 PCR 조건은 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 2분간 결합과 72℃에서 고리화 반응을 45회 반복하였으며, 사용된 올리고 뉴클레오티드의 농도는 각각 50 pmole이었다. 증폭된 p24의 cDNA들을 저융점 아가로즈 (Low melting Agarose)젤 전기영동으로 분리하고 제한효소(EcoRI)(SalI)으로 절단후 pMal CRI 발현 플라스미드의 (EcoRI)(SalI)제한효소 자리에서 서브클리닝하여 재조합 발현 플라스미드 pDA24를 제작하였다.(참조-제5도)

② p24 단백질의 발현 및 정제 p24항원

단백질 발현 플라스미드 pDA24를 대장균 DH5 균주에 형질전환(대장균DA24)하였다. 이렇게 형질 전환된 균주를 암피실린 50g/㎖를 함유하는 LB배지(1% 박토트 립톤, 0.5% 효모액기스, 1% NaC1)에서 37℃로 배양하다가 흡광도(A600)가 0.5로 될 때 IPTG(isopropyl-thio-D-galactoside)를 1mM농도로 첨가하고 16시간 배양하였다. 각 시간별로 배양액을 취해 그 세포파쇄액을 SDS폴라이크릴 아미드 젤 전기영동과 웨스턴 블로팅을 실시한 결과 HIV-1 p24항원 단백질이 발현되었음을 확인하였다. DA24 균주를 2L 배양 배지를 사용하여, 37℃의 발효기에서 10시간 정도 배양시킨 후 흡광도가 50(A600)일 때 IPTG를 3mM농도로 첨가하였다. 이렇게 IPTG를 첨가하고 6시간 배양을 계속함으로써 p24와 MBP(Maltose Binding Protein)의 융합단백질 발현을 유도하였으며, 배양이 끝난 후에 배양액을 원심분리하여 균체를 회수한 뒤 인산염 완충액(pH 7.4)으로 2회 세척 후 초음파 분쇄기로 균체를 파쇄하였다. 파쇄된 균체 용액을 10,000g에서 30분간 원심분리 후 상층액의 가용성 단백질 부위만을 분리하였다. 이러한 상층액의 가용성 단백질을 1차로 말토오즈 결합 단백질 아미로즈수지(New England Biolabs, U.S.A)로 융합 단백질만을 흡착시킨 뒤, 10mM 말토오즈로서 흡착된 단백질을 용출시켰다. 1차로 정제되어진 융합단백질을 DEAE 세파로즈 크로마토그래피로서 추가 정제후 정제된 융합단백질을 팩터 Xa(Boehringer Mannheim, Germany)로서 MB와 p24단백질로 절단하였다. 절단된 MBP와 p24단백질로 절단 하였다. 절단된 MBP와 p24 단백질을 분리하기 위해 젤여과 크로마토그라피 방법으로 p24단백질(참조-제6도)을 순수정제하였다.

2) gp41(HIV-1 막투과 단백부위)항원 제조방법

① gp41

플라스미드 제작 HIV-1 유전자가 클로닝된 플라스미드를 제한효소 Hae III 및 Hind III로 절단하여 HIV-1의 투과막(Transmembrne)에 해당되는 단백질인 gp41(HIV-env a, a 540-641)부위의 306bp DNA단편을 얻었다. 분리한 306bp DNA단편을 pATHJ발현 플라스미드등에 접합시킨 후, 이 재조합 플라스미드로부터 하이드록실아민 절단부위와 gp41부분을 함유하는 DNA단편을 Map I과 Cla I자리에 접합시켜 pDA41플라스미드를 만들었으며, 이 재조합 플라스미드는 tac 프로모터를 가지며 lacZ유전자와 융합된 형태로 발현되도록 하였다. 정지코돈은 Cla I 제한효소로 절단 후 채워(filling in reaction) 만들었다(참조-제5도).

② gp41 단백질의 발현 및 정제 pDA41

플라스미드로 형질전환된 JM109대장균을 암피실린 20g/㎖ 농도로 들어있는 37℃ LB배양액에서 12시간 배양시켰다. 위와 같이 배양된 종균을 200㎖ LB배양액에 접종하고 2-3시간 후 새로만든 4리터 LB배양액을 첨가하여 교반하였다. 배양액의 흡광도(A600)가 0.4로 될 때 IPTG를 1mM농도가 되게 배양액에 첨가하였으며, 6-7시간후 원심분리하 여균체를 분리시켰다. SDS-전기영동과 웨스턴 블로팅 방법을 통해 발현된 gp41의 융합단백질은 봉입체(inclusion body)형태로 발현됨을 알 수 있었으며, 초음파 분쇄기로 균체를 파쇄하고 12,000g에서 원심분리하여 봉입체를 쉽게 얻을 수 있었다. 세균단백질을 제거하기 위해 불용성 단백질 봉입체를 50mM 트리스-염산(pH 7.0)이 첨가된 3M 우레아 완충액으로 세척하였다. 그리고, 불용성 단백질 봉입체 70㎖의 완충액 a(5.0M 우레아, 50mM 트리스-염산 pH 7.0, 10mM dithiothreitol, 1.0mM EDTA)에 녹이고, 이 용액에 하이드록실아민을 최종 2.0M농도로 첨가하여, 45℃에서 4시간동안 반응시켜 융합단백질을 절단시켰다. 그리고 농축된 개미산을 pH 4.0되게 첨가하여 반응을 종료시켰다. 이 반응액을 증류수에 투석하였으며, 투석과정에서 gp41단백질은 다시 불용성 봉입체로 되었으며, 원심분리로 봉입체인 gp41을 분리하였다. 분리한 봉입체를 완충액 a에 녹인 후 DEAE-세파로즈 칼럼에 흡착시켜 동일한 완충액으로 용출하여 분획하였다. 각 분획을 SDS- 전기영동 및 웨스턴 블로팅 gp41(참조-제7도)의 정제를 확인하였다.

3) gp35항원(HIV-II 막투과 단백부위)제도

p24 및 gp41 항원 제조방법과 동일하게 제조, 정제하였다.

(3) HTLV-I 항원의 제조

HTLV-I 바이러스는 사람의 T세포에 감염하는 레트로 바이러스의 일종으로 성인 T세포 백혈병 바이러스(Adult T-cell Leukemia Virus)라고도 불려진다. HTLV-I 바이러스는 공지의 방법에 따라서 얻을 수 있다. 예를 들어서 MT-2, Hut-102 등의 세포를 배양하여 배양액에서 세포를 분리하고, 이 세포 또는 배양상등액에서 HTLV-I 바이러스를 분리할 수 있다. 그 방법을 더욱 상세히 설명하면, NCI(National Cancer Institute, U.S.A)로부터 분양받아 냉동보관중인 Hut102/HTLV-I 세포주를 녹인 후, 소의 태아혈청을 10% 함유하는 RPMI-1640 배지 7㎖ 접종하고 T-25Cm 2 플라스크(Falcon, U.S.A)에서 3일간 37℃에서 배양한다. 배양후 배양액을 배지 50㎖가 들어있는 T-175Cm 2플라스크(Falcon, U.S.A)에 접종하고 37℃에서 5일간 배양한다. 이배양액을 2L의 새로운 배지에 접종하고 37℃에서 5일간 Roller bottle 배양을 한다. 이때 배양기내에는 10%의 습윤화된 CO2를 함유하게끔 조절해준다. 배양이 끝난후 배양액을 겔만 필터(Gelman, U.S.A)를 사용하여 여과하여 세포를 제거하고 여과액 1.8L를 얻었다. 이 여과액을 4℃에서 원심분리를 19,000 rpm으로 3시간동안 수행하여 침전물을 회수한 뒤 이것을 슈크로즈 농도가 10 내지 60%의 밀도 구배에 분배시켜 25,000 rpm으로 4℃에서 16시간 초원심분리를 한다. 원심분리 후 수득된 약 8㎖의 바이러스 밴드를 모아 다시 3,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 TNE 완충액(트리스-염산완충액-NaCl-EDTA)으로 세척한 후 비이온 계면 활성제인 NP-40으로 바이러스를 파괴한다. 그리고 10,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 최종 2㎖의 상등액을 바이러스 항원으로 사용하였다.

[실시예 2 동시진단용 항원고정고상의 제조]

(1) 재조합 항원의 다량체 제조

실시예 1에서 기술한 HCV 및 HIV-1, 2 재조합 항원 각각을 0.5∼2.0㎎/㎖ 농도로 하여 pH 9.0의 보레이트 완충액에 투석한 후 글루타르 알데히드(Sigma, U.S.A)를 항원액의 최종 25%(v/v) 농도가 되게끔 첨가하여 25℃에서 15분간 반응을 하여 각 항원을 다량체화 했다.

1M 글리신(Sigma, U.S.A)을 반응액의 10%(v/v)양이 되게 첨가하여 반응을 중지한 뒤 HIV 항원들인 경우는 pH9.6의 0.1M 카보네이트 완충액에 투석하였고 HCV 항원들인 경우 pH 8.4의 0.1M 카보네이트 완충액에 각각 투석하였다.

[표 1] 글루타르 알데히드 처리항원을 사용한 진단시약의 감도 및 특이도

① 감도비교결과

② 특이도 비교결과(정상인 혈액 100개 사용)

[표 1]은 HIV 및 HCV의 각 재조합 다량체 항원을 사용하여 제조한 진단시약 및 단량체 항원을 그대로 사용한 진단시약의 감도 및 특이도 비교결과이다.

다량체 항원을 사용한 진단시약은 단량체 항원들을 상용한 진단시약보다 각기 10개의 HIV 및 HCV 양성검체를 이용한 감도 시험결과 월등한 감도증가를 보였고, 정상인 혈액 100개를 사용한 특이도 시험결과에서도 안정적인 값을 보여주었다.

이는 본 발명에 사용한 각 재조합 항원이 항원, 항체 반응에 가장 민감한 부위만을 선택하여 제조하였기 때문에 각 항원 단량체는 항원고정고상에 최적으로 흡착되기에는 다소 작은 크기이며 항원구조 역시 항원, 항체 결합을 쉽게 이루기에도 불완전한 분자구조를 이루기 때문인 것으로 생각되며 교차결합체를 이용하여 다량체를 제조하여 항원으로 사용할 경우 이러한 문제점이 해결됨을 알 수 있었다.

(2) HIV와 HCV-I형 항체 동시진단용 항원 고정고상의 제조

실시예 2 (1)에서 기술한 HIV와 HCV-I의 다량체 항체를 0.1M 카보네이트 완충액(pH 9.6)으로 희석혼합한 후 ELISA 용 96구멍의 마이크로 플레이트(Nunc, Immunoplate polysorp) 각 구멍에 125㎕씩 분주한 후 28℃에서 18시간 흡착시킨다.

1차 반응후 반응여액을 제거한 다음 HCV 항원을 아래의 표와 같은 최종농도가 되게끔 0.1M NaHCO3(pH8.4) 완충액으로 희석혼합 후 고정고상의 각 구멍에 250㎕씩 분주한후 28℃에서 18시간 동안 2차 흡착반응을 시킨다.

그후 항원액을 흡입제거한 후 세척액(인산염 완충액, pH 7.4＋0.05% 트윈 20)으로 1회 세척한 후 추가 흡착용액(1% 탈지유＋0.5% BSA (소혈청 알부민)＋1.0% 트리톤 X－100/인산완충용액, pH 7.4)을 각 구멍당 250㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간 반응하여 흡광도값을 안정화시킨다. 반응을 끝낸후 용액을 흡입제거한 후 세척액으로 각 구멍을 3회 세척한 다음 메탄올을 각 구멍당 280㎕씩 분주하고 2∼3초 후 흡입제거한 다음 180℃에서 40초간 플레이트를 고열건조하여 항원단백질과 고상간의 결합을 더욱 고정화시켜 오랜기간의 저장에도 안정할 수 있도록 했다. 제조된 플레이트는 실리카겔을 첨가한 후 알루미늄으로 밀봉포장한 후 냉장보관한다.

(3) HCV와 HIV-I형 및 2형 항체 동시진단용 항원 고정고상의 제조

각 항원의 최종농도 및 희석비는 상기 표와 같으며 HIV-1, 2항원을 0.1M 카보네이트 완충액(pH9.6)으로 희석혼합하여 1차 흡착후 0.1M NaHCO3 완충액(pH8.4)에 녹아있는 HCV항원액을 2차로 흡착시킨다. 기타의 항원 고정고상의 제조방법은 (2)와 HCV와 HIV-I방법과 동일하다.

(4) HIV-I, 2와 HTLV-I 항체 동시진단용 항원 고정고상의 제조

각 사용항원의 최종농도가 상기 표와 같으며 HIV-I, 2항원을 0.1M카보네이트 완충액(pH 9.6)으로 희석혼합한 후 0.1M NaHCO3 완충액(pH8.4)에 녹아있는 HTLV-I바이러스 항원액을 2차로 흡착하며 기타의 제조방법은 (2)와 HCV와 HIV-I방법과 동일하다.

(5) HCV, HIV-1, HIV-2, HTLV-I 항체 동시진단용 항원 고정고상의 제조

HTLV-I의 항원을 0.1M NaHCO₃(pH 8.4)용액으로 최종농도가 1.2 g/㎖이 되게끔 희석한다. 희석된 HTLV-I 바이러스 분해물 항원용액을 마이크로 플레이트(Nunc, Immunoplate)각 구멍에 80㎕씩 분주한 후 28℃챔버에서 16시간 반응을 시켰다. 반응 후 각 구멍의 항원액을 흡입제거한 후 세척액으로 1회 세척한다. 세척이 끝난 플레이트에 HCV 및 HIV-1, 2항원이 0.1M카보네이트 완충액에 상기한 표의 최종농도로 희석 혼합되어 있는 항원용액을 250㎕씩 플레이트 각 구멍에 분주한다. 반응은 28℃챔버에서 18시간 수행했으며 이하 추가 흡착 및 메탄올 고정화 작업등은 (1)의 HCV와 HIV-1 동시진단용 항원 고정고상 제조방법과 동일하다.

[실시예 3 HCV, HIV-I 키트의 항 HIV-1항체 양성 패널을 사용한 감도 측정]

실시예 2, (1), (2)의 방법으로 제조한 HCV와 HIV-1동시진단 키트의 항 HIV-1항체 측정감도를 확인하고자 미국 BBI사(Boston Biomedica, Inc)의 항 HIV-1의 퍼포먼스 패널(performance panel)PRB301 및 PRB102를 사용하여 항HIV-1항체 진단시약으로 시판중인 제품과 동시에 시험 비교하였던 결과는 다음과 같다.

[표 2] 항 HIV-1항체 양성 패널을 사용한 HCV, HIV-I 키트의 감도시험

상기한 결과 보면 본발명의 HCV와 HIV-1 동시진단시약은 낮은 항체역가의 검체를 모아 놓은 PRB102 패널에서 오히려 대조키트와 비교하여 높은 흡광도 값을 보여주었고 PRB301의 14번 검체의 경우 BBI 패널 설명서의 내용을 참조하면 웨스턴 불릿 확인결과 HIV의 코아 단백부위와 막투과 단백부위에 항체가 낮은 역가도 좋게 하는 것으로 판정되는데 대조키트는 음성으로 판정한 반면 본 발명의 키트는 양성으로 정확히 판정하여 외국의 우수한 단일진단시약과 비교하여 오히려 그 감도면에서 우수한 점을 보였다.

[실시예 4 HCV, HIV-I 키트의 항 HIV-1항체 양성 패널을 사용한 감도 측정]

실시예 2 (1), (2)의 방법으로 제조한 HCV와 HIV-1 동시진단 키트의 항 HCV항체측정 감도를 확인하고자 미국 BBI사의 항 HIV-1의 퍼포먼스 패널(performance panel) PHV101을 사용하여 항 HCV 항체 진단시약으로 국내에 시판중인 제품과 동시에 시험 비교하였고 그 결과는 다음의 표에 나타내었다.

[표 3] 항 HCV항체 양성 패널을 사용한 HCV, HIV-I 키트의 감도시험

상기한 결과 보면 대조키트와 본 발명 동시진단 키트는 각기 2개의 검체를 음성으로 판정하였고 그 중 하나는 음성대조 검체로 동일하나 14번 검체는 대조키트가 음성으로, 5번 검체는 본 발명 키트가 음성으로 판정하는 차이를 보였으나 BBI의 패널 설명서의 내용을 참고하면 14번 검체는 4-RIBA(Recombinant immunoblot assay)를 사용한 확인시험에서 양성으로 판정된 반면 5번 검체는 확인 검사결과 음성으로 판정되어 본 시험에 사용한 낮은 항체역가를 갖는 검체를 모은 PHV101 패널을 이용한 항-HCV항체 측정감도 역시 시판중인 외국의 단일진단시약과 비교하여 양호함을 보였다.

실시예 5 간질환 환자 혈액을 사용한 HCV, HIV-I 동시진단시약의 항 HCV항체 검출 임상 본 발명의 HCV, HIV-I 동시진단 시약의 정확한 평가를 위하여 서울시내 소재 대학병원에서 간질환 환자 혈액을 156개 구입하여 자체임상을 시판중인 2세대 HCV진단 키트와 비교 시험하였고 상이한 결과를 나타내는 검체인 경우 4-RIBA 및 PCR로서 확인하였다.

[표 4] 간 질환 환자에 있어서의 양성률 비교

[표 5] 두 키트의 항체 측정간의 상이 결과를 보여준 검체의 확인시험 결과

ELISA 판정 4-RIBA

상기한 표 4의 결과에서 보듯이 국내의 간질환 환자의 약 29%가 C형 간염 바이러스 항체를 보유하고 있는 것으로 나타나 각종 간질환에 C형 간염 바이러스가 큰 원인을 제공한다는 것을 알 수 있었고 시판중인 2세대 HCV 진단시약과 본 발명제품인 HCV, HIV-I 동시진단과의 상이한 결과를 보여준 만성간염환자 3개 검체의 경우(표 5) 2개의 검체를 대조키트가 양성으로 판정을 더한 것으로 나타났으며, 본 발명품은 대조키트가 음성으로 판정을 내린 49번 검체를 양성으로 판정하였다. 상기한 3개의 검체를 4-RIBA를 행한 결과 15번과 49번의 검체는 판정 보류의 결과를 보였고 101번의 검체는 4개의 밴드 모두 음성 판정하였다. 그러나 49번 검체는 대조키트가 음성으로 판정한 반면 본 발명 키트에서는 높은 흡광도 값을 보여 양성으로 판정되었고 PCR 결과 바이러스가 존재하는 것으로 판정되었다. 이는 대조키트 및 4-RIBA에 사용된 항원과는 많은 상이점을 갖는 한국형의 바이러스 때문인 것으로 추측되었고 환자의 증상이 명백한 만성간염의 증상이며 A형 및 B형 간염에 음성인 것, 4-RIBA에 사용된 항원과는 많은 상이점을 갖는 한국형 바이러스 때문인 것으로 추측되었고 환자의 증상이 명백한 만성간염의 증상이며 A형 및 B형 간염에 음성인 것, 4-RIBA 결과 코어항원에 미세한 반응을 보인점, 또한 PCR결과가 C형 간염 바이러스 양성으로 판정된 것등을 종합하여 볼 때 이 환자는 C형 간염환자이며 외국 제품의 ELISA와 4-RIBA로서 검출되지 않고 한국형 바이러스 항원물을 사용한 본 발명품에만 강한 시그날을 나타내는 점으로 보아 국내에서의 C형 간염진단에는 한국형 바이러스로부터 제조된 항원을 사용함이 정확한 것을 분명히 알 수 있었다.

[실시예 6 HCV, HIV-I 키트의 정상인 혈액을 사용한 특이도 시험]

HCV, HIV-I 키트의 특이도를 검사하기 위하여 적십자 산하 혈액원으로부터 정상인 혈액 500검체를 구입 시험하였다.

[표 6] HCV, HIV-I 키트의 특이도 결과

※검체의 평균 흡광도()=0.064

건강인 혈청 및 혈장을 550개 사용한 특이도 시험결과 1차 시험시에는 3개의 검체를 양성으로 판정하였으나 3개 검체 모두 흡광도가 1.0미만의 검체였으며 재시험결과 이중 두 개의 검체는 음성으로 판정하였으나 한검체는 1, 2차 모두 양성으로 판정되었고 PCR로 확인한 결과 음성으로 판정되었으며 4-RIBA 확인시험은 판정보류의 결과를 보여 본 키트의 특이도는 약 99.8% 이상인 것으로 나타났다.

[실시예 7 HCV와 HIV-I, 2 동시진단 키트의 양성 Panel을 사용한 감도측정]

실시예 2, (3)에 기술한 방법으로 제조한 HCV, HIV-I, 2 동시진단 키트의 항 HIV-I, 2 및 항 HCV 항체에 대한 감도를 확인하고자 미국 BBI의 퍼포먼스 패널인 PRZ201과 PHV101을 사용하여 시험하였다.

[표 7] HCV, HIV-1, 2 동시진단 키트의 양성 패널 측정 결과

상기한 표 7의 결과에서 보듯이 HCV, HIV-I, 2 동시진단 키트는 항 HIV-I, 2 항체 역가가 다양한 검체를 모아 놓은 PRZ 201 패널을 사용한 결과 음성 대조 검체인 7번과 10번 검체를 제외하고는 모두 높은 흡광도 값을 보였고 PHV 101의 저역가 항체 패널을 사용한 항 HCV항체 측정 시험결과 역시 HCV, HIV-I 동시진단 키트와 동일한 양호한 결과를 얻었다.

[실시예 8. HIV-I, 2 및 HTLV-I 동시진단 키트의 양성 패널을 사용한 감도측정]

실시예 2, (4)의 방법으로 제조한 HIV-I, 2 및 HTLV-I 동시진단 키트의 항 HIV-I, 2항체 및 HTLV-I 항체측정 감도를 확인하고자 미국 BBI의 PRZ 201 패널과 PRP 203 패널을 사용하여 시험하였다.

[표 8] HIV-I, 2 및 HTLV-I 동시진단 키트의 양성 패널 측정결과

HIV-I, 2 및 HTLV-I 동시진단 키트를 사용한 시험결과 PRZ 201 패널을 사용한 항 HIV-I, 2 항체 측정은 아주 양호한 결과를 보여주었으며 PRP 203 패널을 사용한 항 HTLV-I 측정결과는 11번 검체의 음성대조액 외에 3번의 검체도 음성판정 하였으나 패널 설명서에 보듯이 이 검체는 웨스턴 블로팅에서는 판정보유 검체이며 몇 개의 ELISA 키트로 검사시에는 모두 음성판정을 내린 다소 애매한 검체인 것으로 생각되어 HIV-I, 2 및 HTLV-I 동시진단 키트의 감도는 양호한 것으로 판정되었다.

Claims (29)

1. 검출 목적의 분석 대상물과 항원 항체 반응으로 결합될 고상 결합 물질을 제조하는데 있어, HIV-I 항원 50∼50μ1을 0내지 10℃ 또는 20 내지 30℃에서 12 내지 20시간 동안 1 차로 흡착한 후 1차 흡착 반응 여액을 제거한 다음 HCV 항원 150∼300μ1을 0.1내지 10℃ 또는 20내지 30℃에서 12 내지 20시간 동안 추가 흡착하며, HIV-I 항원이 카보네이트 완충액(pH 9 내지 10)에 p24항원이 0.01∼1.0㎍/㎖, gp41이 0.02∼3.0㎍/㎖의 농도로, HCV 항원이 0.1M NaHCO₃(8 내지 9) 완충액에 DA703이 0.025∼2.5, DA168이 0.05∼5.0, DA99가 0.03∼3.0㎍/㎖의 농도인 항원액을 사용하여 동일 고상에 흡착시키고 동일 효소와 동일 지시약을 사용하여 측정 대상의 검체와 반응시킴을 특징을 하는 HCV와 HIV-1항체 동시진단 면역진단법.
2. 제1항에 있어서, 각 항원을 교차 결합체인 글루타르 알데히드를 사용하여 개개의 항원을 다량체로 만들어 흡착시킴으로써 흡착항원의 항체결합부위의 노출과 구조의 안정화를 극대화시킴을 특징으로하는 HCV와 HIV-1항체 동시진단 면역진단법.
3. 검출 목적의 분석 대상물과 항원 항체 반응으로 결합될 고상 결합 물질을 제조하는 데 있어, hHIV-1, 2 항원 50∼50μ1을 0내지 10℃ 또는 20 내지 30℃에서 12 내지 20시간 동안 1차 흡착 반응 여액을 흡입 제거한 다음 HCV 항원 150∼300μ1을 추가 흡착하며, HIV-I, 2 항원이 카보네이트 완충액(pH 9 내지 10)에 p24항원이 0.01∼1.0, gp41이 0.02∼3.0, gp35항원이 0.025∼2.5㎍/㎖의 농도이며, HCV 항원은 0.1M NaHCO3(8 내지 9) 완충액에 DA703이 0.025∼2.5㎍/㎖의 농도이며, DA168이 0.04∼4.0, DA99가 0.025∼2.5㎍/㎖의 농도인 항원액을 사용하여 동일 고상에 흡착시키고 동일 효소와 동일 지시약을 사용하여 측정 대상의 검체와 반응시킴을 특징으로 하는 HCV와 HIV-1항체 동시진단 면역 진단법.
4. 검출 목적의 분석 대상물과 항원 항체 반응으로 결합될 고상 결합 물질을 제조하는데 있어, HIV-I, 2 항원이 카보네이트 완충액(pH 9 내지 10)에 p24항원이 0.01∼1.0, gp41이 0.02∼3.0, gp항원이 0.025∼2.5㎍/㎖의 농도로, HIV-1, 2 항원이 50∼150μ1을 0 내지 10℃ 또는 20 내지 30℃에서 12 내지 20시간 동안 1차로 흡착한 후 흡착 반응 여액을 흡입 제거한 다음 0.1M NaHCO3(8 내지 9) 완충액에 HIV-1 바이러스 항원 단백질 0.08∼8.0㎍/㎖의 농도로 녹아있는 항원액 150∼300μ1을 추가 흡착하여 동일 고상에 흡착시키고 동일 효소와 동일 지시약을 사용하여 측정 대상의 검체와 반응시킴을 특징으로 하는 HTLV-1과 HIV-1, 2 항체 동시진단 면역 진단법.
5. 검출 목적의 분석 대상물과 항원 항체 반응으로 결합될 고상 결합 물질을 제조하는데 있어, HTLV-I 바이러스 분해물의 항원액을 50∼150μ1을 0.2 내지 0.4㎍/㎖의 농도로 0 내지 10℃ 또는 20 내지 30℃에서 12 내지 20시간 동안 1차로 흡착한 후 1차 흡착 반응 여액을 흡입 제거한 다음 HCV 및 HIV-1, 2항원액 150∼300μ1을 0.1 내지 10℃ 또는 20 내지 30℃에서 12 내지 20시간 동안 추가 흡착하며, 이때 HIV-1, 2 항원이 카보네이트 완충액(pH 9 내지 10)에 p24항원이 0.01∼1.0, gp41이 0.02∼2.0, gp35항원이 0.025∼2.5㎍/㎖의 농도로, HCV 항원은 0.1M NaHCO3(8 내지 9) 완충액에 DA168이 0.04∼4.5, DA99가 0.025∼2.5㎍/㎖의 농도인 항원액을 사용하여 동일 고상에 흡착시키고 동일 효소와 동일 지시약을 사용하여 측정 대상의 검체와 반응시킴을 특징으로 하는 HCV와 HIV-1, 2, HTLV-1 항체 동시진단 면역 진단법.
6. 제1항에 있어서 항원을 고상에 결합시킨후 세척액(pH 7.4의 인산염 완충액＋0.5% 트윈20)으로 1회 세척한 후 1.0% 탈지유＋0.5% 소혈청 알부민＋1.0% 트리톤 X－100으로 반응시켜 특이도를 개선시키는 방법을 행하는 HCV와 HIV-1항체 동시진단 면역 진단법.
7. 제1항에 있어서 항원 결합 반응을 끝낸후 세척액으로 각 구멍을 3회 세척한 다음 각 구멍당 280μ1씩 메탄올 또는 에탄올을 분주하고 2∼3초 후 흡입 제거하고 150∼230℃에서 30∼60초 동안 고온 처리하여 건조 고정화하여 단백질과 고상간의 결합을 더욱 고정화하여 고정 고상을 안정화시키는 방법을 행하는 HCV와 HIV-1 항체 동시진단 면역 진단법.
8. 제1항에 있어서, 진단 키트 구성물 중 검체 희석액 및 효소표지 항체 희석액 트리톤 X－100 또는 트윈 20을 0.1∼1.0% 농도로 첨가하여 민감도 및 특이도를 향상시키는 방법을 행하는 HCV와 HIV-1항체 동시진단 면역 진단법.
9. 제1항에 있어서, 고상에 결합된 HCV 및 HIV-1 항원은 유원자 재조합 방법으로 제조된 것임을 특징으로 하는 HCV와 HIV-1항체 동시진단 면역 진단법.
10. 제1항에 있어서, HCV 항원이 한국형 HCV로서 바이러스 코어 부분과 비구조 영역 각 부분에 단백질들 중 하나 또는 둘 이상을 혼합하여 사용하는 방법을 행하는 HCV와 HIV-1항체 동시진단 면역 진단법.
11. 제4항에 있어서, HTLV-1이 비이온 계면활성제인 NP-40을 사용하여 약독화하여 제조된 것을 특징으로 하는 HTLV-1과 HTLV-1, 2 항체 동시진단 면역 진단법.
12. 제3항에 있어서, 각 항원을 교차 결합제인 글루타르 알데히드를 사용하여 개개의 항원을 다량체로 만들거나 두 개의 다른 항원을 혼합하여 다량제 항원을 형성한 후 흡착시킴으로써 흡착항원의 항체 결합부위에 노출과 구조의 안정화를 극대화시킴을 특징으로 하는 HCV와 HIV-1, 2 항체 동시진단 면역 진단법.
13. 제3항에 있어서, 항원을 고상에 결합시킨 후 세척액(pH 7.4의 인산염 완충액＋0.5% 트윈20)으로 1회 세척한 후 1.0% 탈지유＋0.5% 소혈청 알부민＋1.0% 트리톤 X－100으로 반응시켜 특이도를 개선시키는 방법을 행하는 HCV와 HIV-1, 2 항체 동시진단 면역 진단법.
14. 제3항에 있어서, 항원 결합 반응을 끝낸 후 용액을 흡입 제거한 후 세척액으로 각 구멍을 3회 세척한 다음 각 구멍당 280μ1씩 메탄올 또는 에탄올을 분주하고 2∼3초 후 흡입 제거하고 150∼230℃에서 30∼60초 동안 고온 처리하여 건조 고정화하여 단백질과 고상간의 결합을 더욱 고정화하여 고정 고상을 안정화시키는 방법을 행하는 HCV와 HIV-1, 2 항체 동시진단 면역 진단법.
15. 제3항에 있어서, 진단 키트 구성물 중 검체 희석액 및 효소표지 항체 희석액에 트리톤 X－100 또는 트윈 20을 0.1∼1.0% 농도로 첨가하여 민감도 및 특이도를 향상시키는 방법을 행하는 HCV와 HIV-1, 2항체 동시진단 면역 진단법.
16. 제3항에 있어서, 고상에 결합된 HCV와 HIV-1 및 HIV-2 항원은 유전자 재조합 방법으로 제조된 것임을 특징으로하는 HCV와 HIV-1, 2 항체 동시진단 면역 진단법.
17. 제3항에 있어서, HCV 항원이 한국형 HCV로서 바이러스 코어 부분과 비구조 영역 각부분에 단백질들 중 하나 또는 둘 이상을 혼합하여 사용하는 방법을 행하는 HCV와 HIV-1, 2 항체 동시진단 면역 진단법.
18. 제4항에 있어서, 각 항원을 교차 결합제인 글루타르 알데히드를 사용하여 개개의 항원을 다량체로 만들거나 두 개의 다른 항원을 혼합하여 다량체 항원을 형성한 후 흡착시킴으로써 흡착항원의 항체 결합부위에 노출과 구조의 안정화를 극대화시킴을 특징으로 하는 HTLV-1과 HIV-1, 2 항체 동시진단 면역 진단법.
19. 제4항에 있어서, 항원을 고상에 결합시킨 후 세척액(pH 7.4의 인산염 완충액＋0.5% 트윈20)으로 1회 세척한 후 1.0% 탈지유＋0.5% 소혈청 알부민＋1.0% 트리톤 X－100으로 반응시켜 특이도를 개선시키는 방법을 행하는 HTLV-1과 HIV-1, 2 항체 동시진단 면역 진단법.
20. 제4항에 있어서, 항원 결합 반응을 끝낸 후 용액을 흡입 제거한 후 세척액으로 각 구멍을 3회 세척한 다음 각 구멍당 280μ1씩 메탄올 또는 에탄올을 분주하고 2∼3초 후 흡입 제거하고 150∼230℃에서 30∼60초 동안 고온 처리하여 건조 고정화하여 단백질과 고상간의 결합을 더욱 고정화하여 고정 고상을 안정화시키는 방법을 행하는 HTLV-1과 HIV-1, 2항체 동시진단 면역 진단법.
21. 제4항에 있어서, 진단 키트 구성물 중 검체 희석액 및 효소표지 항체 희석액 트리톤 X－100 또는 트윈 20을 0.1∼1.0% 농도로 첨거하여 민감도 및 특이도를 향상시키는 방법을 행하는 HTLV-1과 HIV-1, 2항체 동시진단 면역 진단법.
22. 제4항에 있어서, 고상에 결합된 HIV-1 및 HIV-2 항원은 유전자 재조합 방법으로 제조된 것이고, HTLV-1 항원은 바이러스 분해하여 얻은 항원액임을 특징으로 하는 HTLV-1과 HIV-1, 2 항체 동시진단 면역 진단법.
23. 제5항에 있어서, 각 항원을 교차 결합제인 글루타르 알데히드를 사용하여 개개의 항원을 다량체로 만들거나 두 개 이상의 다른 항원을 혼합하여 다량체 항원을 형성한 후 흡착시킴으로써 흡착항원의 항체결합부위에 노출과 구조의 안정화를 극대화시킴을 특징으로 하는 HCV, HIV-1, 2 HTLV-1 항체 동시진단 면역 진단법.
24. 제5항에 있어서, 항원을 고상에 결합시킨 후 세척액(pH 7.4의 인산염 완충액＋0.5% 트윈20)으로 1회 세척한 후 1.0% 탈지유＋0.5% 소혈청 알부민＋1.0% 트리톤 X－100으로 반응시켜 특이도를 개선시키는 방법을 행하는 HCV, HIV-1, 2 HTLV-1 항체 동시진단 면역 진단법.
25. 제5항에 있어서, 항원 결합 반응을 끝낸 후 용액을 흡입 제거한 후 세척액으로 각 구멍을 3회 세척한 다음 각 구멍당 280μ1씩 메탄올 또는 에탄올을 분주하고 2∼3초 후 흡입 제거하고 150∼230℃에서 30∼60초 동안 고온 처리하여 건조 고정화하여 단백질과 고상간의 결합을 더욱 고정화하여 고정 고상을 안정화시키는 방법을 행하는 HCV, HIV-1, 2 HTLV-1 항체 동시진단 면역 진단법.
26. 제5항에 있어서, 진단 키트 구성물 중 검체 희석액 및 효소표지 항체 희석액에 트리톤 X－100 또는 트윈 20을 0.1∼1.0% 농도로 첨가하여 민감도 및 특이도를 향상시키는 방법을 행하는 HCV, HIV-1, 2 HTLV-1 항체 동시진단 면역 진단법.
27. 제5항에 있어서, 고상에 결합된 HCV, HIV-1 및 HIV-2 항원은 유전자 재조합 방법으로 제조된 것이고, HTLV-1 항원 바이러스 분해하여 얻은 항원액임을 특징으로 하는 HCV, HIV-1, 2 HTLV-1 항체 동시진단 면역 진단법.
28. 제5항에 있어서, HCV 항원이 한국형 HCV로서 바이러스 코어 부분과 비구조 영역 각부분에 단백질들 중 하나 또는 둘 이상을 혼합하여 사용하는 방법을 행하는 HCV, HIV-1, 2 HTLV-1 항체 동시진단 면역 진단법.
29. 제5항에 있어서, HTLV-1이 비이온 계면활성제인 NP-40을 사용하여 약독화하여 제조된 것을 특징으로 하는 HCV, HIV-1, 2 HTLV-1 항체 동시진단 면역 진단법.