KR100467395B1 - HIV-1항원p24및gp41의제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사람에게 인간면역결핍증을 일으키는 HIV-1 항원 p24 및 gp41 유전자를 합성하여 대장균 발현벡터에 결합시켜 재조합 발현벡터를 만들고, 이를 대장균에 형질전환하여 항원 p24 및 항원 gp41을 발현시킨 다음, 항원 p24는 산침전, 니켈-친화 크로마토그래피 및 CM-세파로스 크로마토그래피를 이용하여 분리하고, 항원 gp41은 DEAE-세파로스 크로마토그래피를 이용하여 분리하는 항원 p24 및 항원 gp41의 제조방법을 제공한다.
Description
[산업상 이용 분야]
본 발명은 HIV-1 항원 p24 및 gp41의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 인간의 후천성 면역 결핍중 (Acquired Immunodificiency Syndrome : AIDS)을 일으키는 HIV-1 바이러스의 p24 및 gp41의 유전자를 대장균에서 발현시킨 다음 HIV-1 항원 p24 및 gp41을 제조하는 방법에 관한 것이다.
[종래 기술]
HIV-1 바이러스의 게놈은 약 10Kb 뉴클레오티드로 구성된 리트로 바이러스(retro virus)로서, 게놈은 gag, po1, env 유전자와 조절유전자들로 구성되어 있다. gag 유전자 산물은 비리온(viron)의 코아(core) 핵단백질을 암호화하고 있고, po1 유전자는 핵산합성과 재조합에 관련된 작용을 하는 단백질을 암호화하고 있으며, env 유전자는 HIV-1 바이러스의 엔벨롭(enveope)부분을 암호화한다(Vaishnav at al, Ann. Rev. Biochem. 60, 577, 1991). 또한 조절유전자들로는 tat, rev 그리고 nef등이 있으며, 이 유전자 산물들은 HIV-1 바이러스의 증식에 필수적인 단백질로서 바이러스의 증식율을 조절하는데 중요한 역할을 한다(Steffy K. at a1, Microbiol. Rev, 55, 193, 1991). 이들 이외에 다른 여러 종류의 부수적인 유전자 산물들(accessory gene products)이 존재하는 것으로 알려져 있다.
HIV-1 바이러스는 혈액 또는 체액을 통하여 한 감염자에서 다른 정상인에게 감염시키는 전염성이 매우 강하다. 따라서 혈액의 수혈 및 혈액제제를 사용시 HIV-1 바이러스의 감염을 판단하는 것이 매우 중요하므로, 가장 효과적이고 보편적으로 사용되는 방법인 HIV-1 항체검사방법으로 공혈자의 혈액 및 혈액제제를 검사한다(Schochetman at al, Annu. Rev. Microbiol. 43, 629, 1989). 항체진단 방법으로는 대부분 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)를 사용하고 있다. 이 방법은 저가의 표준화된 방법으로 높은 신뢰성을 보여주며, 빠른 시간내 대량으로 검사할 수 있는 장점을 갖고 있다(Schwartz at al, JAMA 259, 2574, 1988). 현재 HIV에 대한 여러 종류의 ELISA 키트가 미국 FDA(Food and Drug Administration)로부터 허가받았으며, 상품화되어 사용되고 있다(Gottfrid at al, TIBTECH, 35, 1990).
이들 ELISA 키트 대부분의 검사원리는 HIV 항원을 고형고상에 결합시킨후 검사 혈액내의 HIV 특이항체의 존재를 판단하는 방법으로 비경쟁적(noncompetitive)이며 간접적인(indirect) ELISA 방법이 주로 사용되고 있다(Jackson at al, Clin. Microbiol. Rev. 1, 124, 1988). HIV 항체진단시약으로 초기에는 H-9 또는 CEMT-림프구 세포주(cell line)을 이용하여 HIV 바이러스를 배양 분리한 후 비활성화시킨 전체 바이러스 분해물(whole virus lysate)을 항원으로 사용한 1세대 ELISA 키트들이 사용되었으나(Schochetman at al, Annu. Rev, Microbiol. 43, 629, 1989) 다음과 같은 몇 가지 문제점이 발견되었다.
첫째, 바이러스를 직접 배양한 후 분리정제하여 항원으로 사용할 때 세포배양유래 일부 물질에 의하여 위양성(false postivie)문제가 초래되었다. 예를 들면, 인간 혈액내의 HLA-DR 항체와 H-9 세포주의 일부 항원과 비특이적으로 결합하여 위양성을 일으키는 것으로 밟혀졌다(Kuhnl at al, Lancet 1, 1222, 1985).
둘째, 바이러스 분해물을 사용하는 많은 시약들은 항원으로 사용되는 바이러스 전체 분해물에서 감염초기 형성 항체에 대한 항원의 절대 농도가 낮은 이유로 감염초기 검체에 특히 위음성(false negative)반응을 일으키고 있다(Saah at al, J, Clin. Microbiol. 25, 1605, 1987).
셋쩨, 바이러스 분해물 항원은 생산시 생산비가 고가이며, 바이러스 배양 등 취급시 감염의 위험성이 있다.
따라서, 바이러스 분해물을 항원으로 사용하는 HIV 항체진단시약들의 문제점들이 개선된 특이도가 우수하며 감염초기 상태의 항체를 보다 잘 검출할 수 있는 검사시약 개발이 필요하게 되었다.
최근에 유전공학 기술의 발달로 유전자 재조합항원이나 합성 펩티드(peptide)항원의 사용이 가능해짐에 따라 이러한 1세대 시약들의 문제점들이 개선된 2세대 항체진단 시약들이 개발되고 있다(Tegtmeier GE, J. Clin. Immunoassay 11, 123, 1988). 유전자 재조합항원은 항원 유전자를 발현벡터에 결합시킨후 대장균 효모 또는 동물세포 등의 숙주세포에 도입시킨 다음 항원을 발현정제하여 생산한다. 현재 HIV 항체 진단시약의 원료로 사용되는 재조합 HIV 항원들은 주로 대장균에서 생산된 대장균 단백질과 융합된 형태의 단백질들로, 기존 1세대 시약들의 단점들을 상당 부분 개선하였다. 그러나, 재조합 HIV융합 항원들을 사용할 경우 대장균 단백질 부위인 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase)에 대하여 혈액내 항체가 반응하는 경우가 있으며, 또한 재조합 항원 정제시 잔여 불순물 등으로 인한 위양성 반응이 발생된다는 보고도 있다(Dowbenko at al, Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 7784, 1985).
합성 펩티드를 항원으로 사용할 때는 한 유전자중 일부 아미노산서열(10-20개)을 사용하므로 특히 변이가 심한 HIV 바이러스의 항체를 진단하는데 있어서 위음성을 초래할 문제가 있다. 그리고 펩티드 합성 및 정제가 고가이며, 항원흡착 플레이트 생산에 있어서도 균일성 및 로트(Lot)간 변이차가 심하여 제품화에 있어 단점으로 지적되고 있다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위한 것으로서, HIV-1 항체진단의 감도 및 특이도를 높일수 있을 뿐 아니라 이 진단시약의 생산원가를 절감시킬 수 있는 유전자 재조합 기술을 이용한 HIV-1 항원 p24 및 gp41의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, T7 프로모터 및 폴리히스티딘 융합단백질 유전자를 포함하는 발현벡터에 HIV-1 p24유전자를 결합시켜 재조합 발현벡터를 제조하는 단계, 상기 재조합 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 형질전환된 숙주세포를 제조하는 단계, 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 항원 p24를 발현시키는 단계, 상기 항원 p24의 리폴딩, 산침전, 니켈-친화 크로마토그래피 및 CM-세파로스 크로마토그래피를 이용한 분리정제 단계를 포함하는 항원 p24의 제조 방법을 제공하며,
상기 재조합 발현벡터는 pRSETA-p24가 바람직하고,
상기 형질전환된 숙주세포는 BL21 DE3/pRSETA-p24가 바람직하다.
또한 상기 항원 p24를 니켈-친화 크로마토그래피 방법으로 정제시 0.4M 우레아, 0.5M NaCl, 50mM 인산 나트륨 완충액(pH 5.2)으로 정제하는 것이 바람직하다.
한편 상기 항원 p24를 CM-세파로스 크로마토그래피 방법으로 정제시 약 pH 5.2, 50mM 초산 나트륨 완충액으로 정제하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 상기 항원 p24의 제조 방법에 따라 제조된 항원 p24를 제공한다.
본 발명은 또한 T7 프로모터 및 폴리히스티딘 융합단백질 유전자를 포함하는 발현벡터에 HIV-1 gp41유전자를 결합시켜 재조합 발현벡터를 제조하는 단계, 상기 재조합 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 형질전환된 숙주세포를 제조하는 단계, 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 항원 gp41을 발현시키는 단계, 상기 항원 gp41을 8M 우레아, 50mM Tris, 10mM DTT(pH 9.6) 및 DEAE-세파로스 크로마토그래피 방법을 이용한 분리정제 단계를 포함하는 항원 gp41의 제조 방법을 제공하며,
상기 gp41의 제조 방법에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 pRSETA-gp41이 바람직하고,
상기 형질전환된 숙주세포는 BL21 DE3/pRSETA-gp41이 바람직하다.
또한 본 발명은 상기 항원 gp41의 제조 방법에 따라 제조된 항원 gp41을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항원 p24 및 항원 gp41을 pH 9.6, 0.1M NaCO3 완충액에서 플레이트에 분주하여 약 4℃에서 흡착시키는 단계, 상기 항원이 흡착된 플레이트내의 반응여액을 흡입제거하는 단계, 흡입제거된 상기 항원이 흡착된 플레이트내에 0.25% 소혈청알부민, 0.05% Tween20을 함유한 PBS를 분주하여 상온에서 반응시키는 단계, 상기 반응 후 상기 항원이 흡착된 플레이트를 0.8% NaCl, 0.05% Tween20을 포함하는 세척액으로 세척하고 메탄올을 분주한 후 이를 흡입제거한 다음 플레이트를 건조시켜 상기 항원들을 플레이트에 더욱 안정하게 고정화하는 단계를 포함하는 HIV-1 항원 흡착 플레이트의 제조 방법을 제공하며,
상기 항원 흡착 플레이트의 제조시, 항원 p24 및 항원 gp41의 농도는 각각 0.3∼0.5㎍/㎖ 및 0.2∼0.4㎍/㎖인 것이 바람직하다.
[대표적인 실시예]
일반적으로 인체가 HIV-1 바이러스에 감염되면 초기에 주로 항원 p24에 대한 항체가 가장 먼저 생성되는 것으로 보고되고 있고(Bedarida G at al, Lancet 2, 1456, 1986) 이 p24 항체는 대부분의 감염자에서 강한 반응성을 보이는 것으로 나타나 항원 p24는 항체진단 시약의 중요한 원료로 사용되고 있다.
본 발명에서는 이들 두 항원의 운전자를 합성하여 N 말단 부위가 6개의 히스티딘 아미노산으로 구성되어 있는 작은 크기의 펩티드(약 30개 아미노산)를 융합 파트너로 사용하는 대장균 발현벡터(pRSETA 플라스미드)에 각각 클로닝하여 이들 항원 의 재조합 발현벡터를 만든다.
항원 p24는 대장균에서 발현후 세포를 파쇄하고 봉입체를 회수한 다음 리폴딩(refolding)과 산침전 방법을 거쳐 분리한다. 분리된 항원 p24를 니켈-친화 크로마토그래피와 CM-세파로스 크로마토그래피로 최종 정제한다. 항원 gp41은 대장균에서 발현시킨후 세포를 파쇄하고 봉입체를 회수한 다음 8M 우레아 용액에 용해하여 DEAE-세파로스 크로마토그래피를 이용하여 정제한다.
상기의 방법은 N 말단 부위에 각각 약 30개의 아미노산으로 구성된 작은 펩티드가 융합파트너로 결합된 p24 융합 단백질, gp41융합 단백질 고발현 세포주, 고가인 유도제(inducer)를 사용하지 않는 배양방법, 그리고 고순도의 항원을 고효율로 생산하는 경제적인 정제공정을 제공한다.
또한 정제된 고순도의 두 항원은 우수한 항원성을 나타내며, 항체진단 시약의 항원 원료로 사용할 때 진단시약의 감도 및 특이도를 향상시킬 수 있다.
다음은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 기재한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1
HIV-1 항원 p24의 제조
(1) 항원 p24 발현 균주제조
p24 유전자를 대장균에서 발현시키고자 HIV-1의 p24 유전자를 DNA 합성기를 이용하여 여러 조각으로 합성하여 분리하였다.
분리된 p24 유전자를 대장균 발현벡터인 pRSETA 플라스미드의 BamH I과 EcoR I자리(site) 사이에 T4 리가제(Ligase)를 이용하여 결합시켜, 재조합 발현벡터 pRSETA-p24를 만들었다(참조, 도 1). 재조합 발현벡터를 대장균 BL21 DE3에 CaCl2방법으로 형질전환시켰으며, 재조합 발현벡터 pRSETA-p24로 형질전환된 균주를 LB-암피실린 아가로스 플레이트에서 분리하여 배양하였다.
(2) p24 항원발현
상기 배양된 항원 p24 발현균주(BL21 DE3/pRSETA-p24)를 50㎍/㎖ 암피실린을 함유한 20㎖ LB배양액에 접종후 37℃에서 14시간 배양하였다. 이렇게 배양시킨 종균 5㎖을 위와 동일한 배양액 2ℓ에 접종후 37℃에서 14시간 배양하였다. 배양시킨 균체를 회수하여 항원 p24의 발현율 및 항원성을 SDS-PAGE와 웨스턴 블라팅 방법으로 확인하였다(참조, 도 2).
확인결과 항원 p24 발현율은 발현균주의 전체 단백질의 약 25% 이상으로 고발현되었으며, 항원성에 있어서도 매우 강하게 나타났다. 특히 본 발현에 있어서 고가인 유도제를 사용하지 않아도 과발현이 일어나므로 항원생산시 경비를 대폭 절감시킬 수 있었다.
(3) p24 항원 정제
p24 항원이 발현된 상기 BL21 DE3/pRSETA-p24 균주 배양액 2ℓ를 12,000xg에서 30분간 원심분리하여 균체를 분리하였다. 분리된 균체를 PBS(phosphate bufferd saline)완충액으로 2회 세척후 세척된 균체 10g당 TE-1(Tris 6g, EDTA 0.372g, NaCl 5.8g/ℓ, pH8.0)완충액 30㎖을 넣어 잘 현탁하여 초음파 분쇄기로 균체를 파쇄하였다. 파쇄된 균체를 12,000xg로 30분간 원심분리하여 상등액을 제거한후 봉입체(inclusion)를 분리하였다.
분리한 봉입체에 TE-1완충액 30㎖을 첨가하고 잘 현탁시킨후 라이소자임을 0.2mg/㎖, DNase I을 10㎍/㎖되게 첨가하여 37℃에서 60분간 혼합하였다. 이렇게 반응시킨 반응액을 12,000xg에서 30분간 원심분리시켜 봉입체를 다시 회수하였다. 회수된 봉입체에 TE-III(Tris 6g, EDTA 3.9g/ℓ, pH 8.0) 완충액 30㎖을 넣어 잘 현탁한후 Triton X-100을 0.5%되게 첨가하여 37℃에서 30분간 혼합한다. 다시 위 반응액을 12,000xg에서 30분간 원심분리하여 봉입체를 회수하였다.
이것을 TE-II(Tris 6g, EDTA 0.37g/ℓ, pH 8.0)에서 세척후 8M 우레아, 20mM 인산 나트륨(sodium phosphate), 0.5M NaCl 완충액 30㎖로 녹인후 증류수로 희석하여 단백질농도가 1-2mg/㎖정도 되게 하였다. 이 용액에 1M NaOH를 가하여 pH 12로 조정후 NaOH로 pH 11로 맞춘 증류수로 5배 희석하였으며, 희석된 항원 p24액에 1M H3PO4용액을 가하여 pH 10.5가 되게 조정하였다. 위 반응액을 상온에서 14시간동안 보관하여 리폴딩 시켰으며, 1M H3PO4 용액을 점차적으로 가하여 pH 5.7로 조정후 대장균 단백질을 산침전시켰다. 산침전시킨 용액을 12,000xg에서 30분간 원심분리후 상등액을 취하였다.
분리한 상등액을 0.4M 우레아, 0.5M NaCl, 50mM 인산 나트륨 완충액(pH 8.0)에서 2회 투석후 니켈-친화 크로마토그래피를 실시하였다. 니켈-친화 수지에 결합된 단백질중 항원 p24을 용출시키는 방법으로 먼저 0.4M 우레아, 0.5M NaCl, 20mM 인산 나트륨(pH 6.0)으로 대장균의 단백질을 용출시킨후, 0.4M 우레아, 0.5M NaCl, 20mM 인산 나트륨(pH 4.0) 완충액으로 pH 6에서 pH 4로 직선적(gradient)으로 낮추어 용출된 항원 p24을 용출시켰다(참조, 도 3). SDS-PAGE를 통하여, 니켈-친화 크로마토그래피의 정제결과 약 95% 이상의 순도를 지닌 항원 p24를 분리할 수 있었다.
1차 니켈-친화 크로마토그래피로 정제한 항원 p24액을 50mM 초산 나트륨 완충액(pH 5.2)에서 2회 투석하였으며, 투석후 양이온 수지인 CM-세파로스 크로마토그래피를 이용하여 50mM 초산 나트륨 완충액(pH 5.2)에서 2차 정제를 실시하였다. 이때 항원 p24를 0-1M NaCl 밀도구배로 용출시켰으며(참조, 도 4) 각 분획은 SDS-PAGE로 정제도를 조사하였다(참조, 도 2). 2차 정제된 항원 p24는 99% 이상의 순도를 나타내었다.
실시예 2
HIV-1 항원 gp41의 제조
(1) 항원 gp41 발현 균주제조
HIV-1 바이러스 게놈중 항원성이 강한 반응을 나타내는 부위를 포함하는 gp41 유전자의 일부분을 DNA 합성기로 이용하여 여러 조각으로 합성하여 분리하였다. 이렇게 분리한 gp41 유전자 조각을 결합 후 대장균 발현벡터인 pRSETA 플라스미드의 BamH I과 Pst I 제한효소 자리에 결합시켜, 재조합 발현벡터 pRSETA-gp41을 만들었다(참조, 도 5). 이 재조합 발현벡터 pRSETA-gp41로 형질전환된 균주를 LB-암피실린 아가로스 플레이트에서 분리하여 배양하였다.
(2) 항원 gp41 발현
상기 배양된 항원 gp41 발현균주(BL21 DE3/pRSETA-gp41)를 50㎍/㎖ 암피실린을 함유한 20㎖ LB 배양액에 접종후 37℃에서 14시간 배양하였다. 이렇게 배양시킨 종균 5㎖를 위와 동일한 배양액 2ℓ에 접종후 37℃에서 14시간동안 배양하였다. 배양시킨 균체를 회수하여 발현된 항원단백질의 발현율 및 항원성을 실험하였다(참조, 도 6). 실험결과, 항원 gp41의 발현율은 발현균주 전체 단백질의 약 20% 정도로 고발현되었으며, 항원성에 있어서도 매우 강하게 나타났다.
본 발명에 있어서 장점은 항원 p24에 있어서와 마찬가지로 발현시 고가인 유도제를 사용하지 않아도 과발현이 일어나므로 항원생산시 경비를 많이 절감시킬 수 있다.
(3) 항원 gp41 정제
항원 gp41이 발현된 상기 BL21 DE3/pRSETA-gp41 균주 배양액 2ℓ를 12,000xg에서 30분간 원심분리하여 균체를 분리시켰다. 분리된 균체를 PBS 완충액으로 2회 세척후, 세척된 균체 10g당 TE-I 완충액 30㎖를 넣어 잘 현탁하여 초음파분쇄기로 파쇄하였다. 파쇄된 균체를 12,000xg로 30분간 원심분리하여 봉입체를 분리하였다. 분리한 봉입체에 TE-I 완충액 30㎖를 첨가하고 잘 현탁시킨후 라이소자임을 0.2mg/㎖, DNase I을 10㎍/㎖되게 첨가하여 37℃에서 60분간 반응시켰다. 이렇게 반응시킨 용액은 12,000xg에서 30분간 원심분리시켜 봉입체를 다시 회수하였다. 회수된 봉입체에 TE-III 완충액 30㎖을 넣어 잘 현탁후 Triton-X-100을 0.5%되게 첨가하여 37℃에서 30분간 혼합하였다. 위 반응액을 12,000xg에서 30분간 원심분리하여 봉입체를 회수하였다. 이 봉입체를 TE-II 완충액으로 1회 세척후, 8M 우레아, 50mM Tris, 10mM DTT 완충액(pH 9.6)에서 용해시킨후, DEAE-세파로스(Pharmacia)를 이용하여 음이온 크로마토그래피를 실시하였다. 이때 사용된 완충액은 8M 우레아, 50mM Tris, 10mM DTT(pH 9.6)이었다. 동일 완충액에서 0-1M NaCl 직선 밀도 구배로 항원 gp41을 용출시켰다(참조, 도 7). 용출된 각 분획을 SDS-PAGE로 항원량 및 정제도를 확인하였다. 확인결과 98% 이상의 항원 gp41의 순도를 나타내었다(참조, 도 6).
실시예 3 항원 p24 및 항원 gp41 단백질을 이용한 HIV-1 항체 진단
(1) 항원흡착 플레이트 제조
상기 실시예 1 및 2에서 정제한 항원 p24 및 항원 gp41을 0.1M NaCO3 완충액(pH 9.6)으로 항원 p24를 0.3∼0.5㎍/㎖, 항원 gp41을 0.2∼0.4㎍/㎖ 농도로 희석 혼합후 96웰 마이크로 플레이트(Nunc immunoplate polysorp)에 각 웰 당 125㎕씩 분주하여 4℃에서 14시간 흡착시켰다. 이렇게 흡착시킨 플레이트내 반응여액을 흡입제거한 다음 0.25% 소혈청알부민, 0.05% Tween20을 함유한 PBS로 각 웰 당 150㎕씩 분주하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 세척액(0.8% NaCl, 0.05% Tween20)으로 반응이 끝난 플레이트를 1회 세척후 메탄올을 이용하여 각 웰 당 200㎕씩 분주하고 2-3초 경과후 흡입제거한 다음 180℃에서 40초간 플레이트를 건조시켜 항원단백질과 고상간에 결합을 더욱 고정화하여 안정성을 증가시켰다. 제조된 항원흡착 플레이트는 실리카젤을 첨가한후 알루미늄팩으로 밀봉포장후 냉장보관하였다.
(2) 생산된 항원흡착 플레이트의 민감도 및 특이도 측정
상기 방법으로 제조한 항원흡착 플레이트와 검체희석액, 효소표지항체 희석액 등의 구성시약으로 조합된 HIV-1의 항체진단 키트를 사용하여 민감도 및 특이도 검사시험을 실시하였다. 민감도를 측정하기 위하여 패널 검체(panel sample)를 미국 BBI사(Boston Biomedica, Inc)의 HIV-1 PRB105 검체에 대하여 실험을 실시하여 표 1과 같은 결과를 얻었다. 실험결과, HIV-1 PRB 105 검체에 대하여 웨스턴 블라트 양성 및 미결정 검체(indeterminate sample)에 대하여 모두 양성반응을 나타내었다.
본 발명 키트의 특이도 검사는 적십자사 혈액원으로부터 정상인 혈청을 구입하여 실험하였다. 실험결과는 아래 표2와 같다.
본 발명 키트의 특이도 시험결과 사용된 검체들의 평균 O.D는 0.019이며, 사용검체 모두 음성으로 판정하였다.
전세계적으로 HIV 바이러스의 진단은 국민건강에 매우 중요한 부분이며, 국내 혈액원 및 보건소, 병원등에서 HIV 바이러스 진단이 매년 증가하고 있으며 혈액진단에 매우 중요한 부분을 담당하고 있다. 본 발명에서 개발한 항원 p24 및 gp41의 제조방법을 이용하여 이들 항원을 생산함으로써 HIV-1 항체진단의 감도 및 특이도를 높일수 있었으며 또한 이 진단시약의 생산원가를 절감시킬 수 있었다.
도 1은 HIV-1 항원 p24 재조합 발현벡터인 pRSETA-p24의 제조과정을 나타내는 도.
도 2는 BL21 DE3/pRSETA-p24 균주를 이용한 항원 p24의 발현 및 정제단계별 SDS-PAGE 및 웨스턴 블라트(Western Blot)분석 결과를 나타내는 도.
도 3은 니켈-친화(Nickel-affinity)크로마토그래피를 이용한 항원 p24 용출분획 결과를 나타내는 도.
도 4는 CM-세파로스(CM-sepharose)크로마토그래피를 이용한 항원 p24의 용출분획 결과를 나타내는 도.
도 5는 HIV-1 항원 gp41 재조합 발현벡터 pRSETA-gp41의 제조과정을 나타내는 도.
도 6은 BL21 DE3/pRSETA-gp41 균주를 이용한 항원 gp41의 발현 및 정제단계별 SDS-PAGE 및 웨스턴 블라트 분석 결과를 나타내는 도.
도 7은 DEAE-세파로스(DEAE-sepharose)크로마토그래피를 이용한 항원 gp41의 용출분획 결과를 나타내는 도.
Claims (10)
- T7 프로모터 및 N-말단에 6개의 히스티딘 잔기가 포함된 HIV-1 p24 항원 단백질을 암호하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;상기 재조합 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 형질전환된 숙주세포를 제조하는 단계;상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 발현된 항원 p24가 포함된 봉입체를 수득하는 단계;상기 봉입체로부터 단백질을 분리한 후 리폴딩 및 산침전시키고, 산침전물의 상등액을 수득하는 단계;상기 상등액을 니켈-친화 크로마토그래피에 통과시켜 N-말단에 6개의 히스티딘 잔기가 포함된 항원 p24를 포함하는 용출물을 수득하는 단계; 및상기 용출물을 CM-세파로스 크로마토그래피에 통과시켜 N-말단에 6개의 히스티딘 잔기가 포함된 항원 p24를 수득하는 단계;를 포함하는 N-말단에 6개의 히스티딘 잔기가 포함된 항원 p24의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 pRSETA-p24인 항원 p24의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 형질전환된 숙주세포는 BL21 DE3/pRSETA-p24인 항원 p24의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 항원 p24를 니켈-친화 크로마토그래피 방법으로 정제시 0.4M 우레아, 0.5M NaCl, 50mM 인산 나트륨 완충액(pH 5.2)으로 정제하는 항원 p24의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 항원 p24를 CM-세파로스 크로마토그래피 방법으로 정제시 pH 5.2, 50mM 초산 나트륨 완충액으로 정제하는 항원 p24의 제조 방법.
- T7 프로모터 및 N-말단에 6개의 히스티딘 잔기가 포함된 HIV-1 gp41 항원 단백질을 암호하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;상기 제조합 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 형질전환된 숙주세포를 제조하는 단계;상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 발현된 항원 gp41가 포함된 봉입체를 수득하는 단계; 및상기 봉입체를 8M 우레아, 50mM 트리스 및 10mM DTT(pH 9.6)에 용해시킨 후, 이를 DEAE-세파로스 컬럼에 주입하고 NaCl 농도구배를 실시하여 N-말단에 6개의 히스티딘 잔기가 포함된 항원 gp41을 수득하는 단계;를 포함하는 N-말단에 6개의 히스티딘 잔기가 포함된 항원 gp41의 제조 방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 pRSETA-gp41인 항원 gp41의 제조방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 형질전환된 숙주세포는 BL21 DE3/pRSETA-gp41인 항원 gp41의 제조 방법.
- 제 1항의 제조방법에 따라 제조된 HIV 항원 p24 및 제 6항의 제조방법에 따라 제조된 HIV 항원 gp41을 pH 9.6, 0.1M NaCO3 완충액에서 플레이트에 분주하여 약 4℃에서 흡착시키는 단계;상기 항원이 흡착된 플레이트내의 반응여액을 흡입제거하는 단계;흡입제거된 상기 항원이 흡착된 플레이트내에 0.25% 소혈청알부민, 0.05% Tween20을 함유한 PBS를 분주하여 상온에서 반응시키는 단계; 및상기 반응 후 상기 항원이 흡착된 플레이트를 0.8% NaCl, 0.05% Tween20을 포함하는 세척액으로 세척하고 메탄올을 분주한 후 이를 흡입제거한 다음 플레이트를 건조시켜 상기 항원들을 플레이트에 더욱 안정하게 고정화하는 단계;를 포함하는 HIV-1 항원 흡착 플레이트의 제조 방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 항원 p24 및 항원 gp41의 농도는 각각 0.3~0.5㎍/㎖ 및 0.2∼0.4㎍/㎖인 HIV-1 항원 흡착 플레이트의 제조 방법.
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