JP2994031B2 - Ｈｉｖ−１又はｈｉｖ−２抗体の存在又は量の確定方法、免疫特異的試薬、合成ペプチド、診断用キット、ｈｉｖ−１又はｈｉｖ−２抗体の調製方法、免疫原及び抗体 - Google Patents
Ｈｉｖ−１又はｈｉｖ−２抗体の存在又は量の確定方法、免疫特異的試薬、合成ペプチド、診断用キット、ｈｉｖ−１又はｈｉｖ−２抗体の調製方法、免疫原及び抗体Info
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- G01N33/56988—HIV or HTLV
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- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
- C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、ヒト免疫不全ウィルス（“HIV"）抗原の抗
体結合特異性を有する合成ペプチドに関するものであ
り、より詳細に言うならば、本発明は天然HIVペプチド
の或る配列異型（variant）は、単独で又は担体蛋白質
に化学的に結合した形で使用され、HIV抗体を検出する
ためのイムノアッセイに用いられるとき、天然配列ペプ
チドと同等の又はそれよりすぐれた試薬を提供するとい
う発見に関する。本発明はさらに、機器を使用すること
なくHIVに対する抗体を迅速に目で検出し得る診断法に
合成ペプチド及び／又はペプチド蛋白質結合物を使用す
るという方法にも関する。
体結合特異性を有する合成ペプチドに関するものであ
り、より詳細に言うならば、本発明は天然HIVペプチド
の或る配列異型（variant）は、単独で又は担体蛋白質
に化学的に結合した形で使用され、HIV抗体を検出する
ためのイムノアッセイに用いられるとき、天然配列ペプ
チドと同等の又はそれよりすぐれた試薬を提供するとい
う発見に関する。本発明はさらに、機器を使用すること
なくHIVに対する抗体を迅速に目で検出し得る診断法に
合成ペプチド及び／又はペプチド蛋白質結合物を使用す
るという方法にも関する。
発明の背景 ヒト免疫不全ウィルス１型（“HIV"）が後天性免疫不
全症候群（“AIDS"）の病原物質であることが1983年
［バレーシヌッシ（Barre−Sinoussi）ら、サイエンス2
20巻868−871ページ、1983］及び1984年［ガロ（Garo）
ら、サイエンス224巻500−503ページ、1984年］に確認
された。ヒト免疫不全ウィルス２型（“HIV−2"）は198
6年に確認され、中央及び西アフリカのAIDSの重要な原
因であり［クラベル（Clavel）ら、サイエンス223巻、3
43−346ページ］、ヨーロッパ［ブルックナー（Bruckne
r）ら、ランセット（Lancet）i;223ページ、1987;サイ
モット（Saimot）ら、ランセットi;688、1988］及び米
国（ニュージャーシーMMWR 87巻33−35ページ、1988）
でも若干の報告症例がある。
全症候群（“AIDS"）の病原物質であることが1983年
［バレーシヌッシ（Barre−Sinoussi）ら、サイエンス2
20巻868−871ページ、1983］及び1984年［ガロ（Garo）
ら、サイエンス224巻500−503ページ、1984年］に確認
された。ヒト免疫不全ウィルス２型（“HIV−2"）は198
6年に確認され、中央及び西アフリカのAIDSの重要な原
因であり［クラベル（Clavel）ら、サイエンス223巻、3
43−346ページ］、ヨーロッパ［ブルックナー（Bruckne
r）ら、ランセット（Lancet）i;223ページ、1987;サイ
モット（Saimot）ら、ランセットi;688、1988］及び米
国（ニュージャーシーMMWR 87巻33−35ページ、1988）
でも若干の報告症例がある。
２種類のレトロウィルスは速い突然変異「ハーン（Ha
hn）ら、サイエンス232巻1548−1553ページ、1986;ウェ
ン−サイウング（Wen−Hsiung）ら、Molec Biol Evol 5
（４）巻313−330ページ、1988;サージ（Saag）ら、ネ
イチャー（Nature）334巻440−444ページ、1988」並び
に遺伝的多型を示し、DNA配列決定によってHIV−１の13
以上の菌株とHIV−２の４菌株が特徴づけられた［マイ
ヤース（Myers）ら、ヒトレトロウィルスとAIDS（Human
Retrovirus and AIDS）1988;核酸及びアミノ酸配列の
編集（A Compilation of nucleic acid and amino acid
sequences）、ロスアラモス国立研究所、ロスアラモ
ス、ニューメキシコ87545、米国］。
hn）ら、サイエンス232巻1548−1553ページ、1986;ウェ
ン−サイウング（Wen−Hsiung）ら、Molec Biol Evol 5
（４）巻313−330ページ、1988;サージ（Saag）ら、ネ
イチャー（Nature）334巻440−444ページ、1988」並び
に遺伝的多型を示し、DNA配列決定によってHIV−１の13
以上の菌株とHIV−２の４菌株が特徴づけられた［マイ
ヤース（Myers）ら、ヒトレトロウィルスとAIDS（Human
Retrovirus and AIDS）1988;核酸及びアミノ酸配列の
編集（A Compilation of nucleic acid and amino acid
sequences）、ロスアラモス国立研究所、ロスアラモ
ス、ニューメキシコ87545、米国］。
米国食品薬品庁（“USFDA"）が現在米国での使用を許
可しているHIV感染のテストは、抗原として粉砕HIV−１
ウィルスを用い［ペトリッシアニ（Petricciani）ら、A
nn Int Med 103巻726−729ページ、1985;オステルホル
ム（Osterholm）ら、New Eng J 312巻1185−1188ペー
ジ、1985）これらの抗原製剤中のHIV−１蛋白質が感染
症の間接的測定単位としての抗体を検出するという考察
に基づいている［アラン（Allan）ら、サイエンス 228
巻1091−1094ページ、1985;ウエイン−ホプソン（Wain
−Hopuson）ら、細胞（Cell）40巻、９−17ページ、198
5］。これらのテストは、HIV−１に汚染されている血液
をスクリーニングし、AIDSウィルス感染を診断するのに
は有用であるが、単一のHIV分離物を抗原ソースとして
用いる場合は（例えばBH8分離物、米国特許第4520113
号）感度の点で制限がある、というのはHIVは上記のよ
うに速い突然変異並びに多数の遺伝的異型を生じ、抗原
性異型が存在するからである［ルーニー（Looney）ら、
サイエンス 241巻、257−359ページ、1988;パルカー
（Palker）ら、Proc Nat′1 Acad Sci USA 85巻1932−1
936ページ、1988］。感度が悪いのは、抗原ソースとし
てウィルス溶解物を使用する現在許可されているアッセ
イキットでは、HIVgp41エンベロープ蛋白質の免疫優性
領域の保存が悪いことにも起因するらしい［ステッケル
ベルグ（Steckelberg）＆コッケリル（Cockerill）,May
o Clinic Proc 63巻377−380ページ、1988］。その上、
現在のキットはHIV−１蛋白質マーカーを用いているか
ら、HIV−２の75％以上は検出されない［クラベル（Cla
vel）ら、New Eng J Med 316巻1180−1185ページ、198
7］。
可しているHIV感染のテストは、抗原として粉砕HIV−１
ウィルスを用い［ペトリッシアニ（Petricciani）ら、A
nn Int Med 103巻726−729ページ、1985;オステルホル
ム（Osterholm）ら、New Eng J 312巻1185−1188ペー
ジ、1985）これらの抗原製剤中のHIV−１蛋白質が感染
症の間接的測定単位としての抗体を検出するという考察
に基づいている［アラン（Allan）ら、サイエンス 228
巻1091−1094ページ、1985;ウエイン−ホプソン（Wain
−Hopuson）ら、細胞（Cell）40巻、９−17ページ、198
5］。これらのテストは、HIV−１に汚染されている血液
をスクリーニングし、AIDSウィルス感染を診断するのに
は有用であるが、単一のHIV分離物を抗原ソースとして
用いる場合は（例えばBH8分離物、米国特許第4520113
号）感度の点で制限がある、というのはHIVは上記のよ
うに速い突然変異並びに多数の遺伝的異型を生じ、抗原
性異型が存在するからである［ルーニー（Looney）ら、
サイエンス 241巻、257−359ページ、1988;パルカー
（Palker）ら、Proc Nat′1 Acad Sci USA 85巻1932−1
936ページ、1988］。感度が悪いのは、抗原ソースとし
てウィルス溶解物を使用する現在許可されているアッセ
イキットでは、HIVgp41エンベロープ蛋白質の免疫優性
領域の保存が悪いことにも起因するらしい［ステッケル
ベルグ（Steckelberg）＆コッケリル（Cockerill）,May
o Clinic Proc 63巻377−380ページ、1988］。その上、
現在のキットはHIV−１蛋白質マーカーを用いているか
ら、HIV−２の75％以上は検出されない［クラベル（Cla
vel）ら、New Eng J Med 316巻1180−1185ページ、198
7］。
抗原ソースとして全ウィルスの溶解物を使用するHIV
感染テストは、特異性の点で著しい欠点を有する。この
ウィルスは細胞培養で増殖させなければならず、HLAお
よびその他の細胞培養物がこの抗原に混入して間違った
陽性結果を引き起こすかも知れない［アイゼンシュテッ
ド（Eisenstaedt）ら、Am J Public Health 78巻450−4
54、1988;ゲデスト（Goedest）Ann Int Med 105巻、609
−610ページ、1988］。HIV感染症の発生率が低い集団で
は、現在のテストで繰り返し陽性である10人のうち実際
にHIVに感染しているのは１人以下である［オステルホ
ルム（Osterholm）ら、New Eng J Meg 312巻、1185−11
88ページ、1985］。
感染テストは、特異性の点で著しい欠点を有する。この
ウィルスは細胞培養で増殖させなければならず、HLAお
よびその他の細胞培養物がこの抗原に混入して間違った
陽性結果を引き起こすかも知れない［アイゼンシュテッ
ド（Eisenstaedt）ら、Am J Public Health 78巻450−4
54、1988;ゲデスト（Goedest）Ann Int Med 105巻、609
−610ページ、1988］。HIV感染症の発生率が低い集団で
は、現在のテストで繰り返し陽性である10人のうち実際
にHIVに感染しているのは１人以下である［オステルホ
ルム（Osterholm）ら、New Eng J Meg 312巻、1185−11
88ページ、1985］。
現在ある多数のテストの不十分な感度及び特異的に関
連して、或るテストは陽性サンプルと陰性サンプルとを
識別する能力をもっている。ワード（Ward）ら、JAMA25
6巻、357−361ページ、1986、は、一つのテストで得ら
れた陽性結果の半数以上が陽性／陰性境界値のほんの少
し上にあることを見いだした。最適のテストはほとんど
全てのサンプルで陽性と陰性との間に大きい差を示し、
それによって間違った陽性の試験結果の可能性を減ら
す。
連して、或るテストは陽性サンプルと陰性サンプルとを
識別する能力をもっている。ワード（Ward）ら、JAMA25
6巻、357−361ページ、1986、は、一つのテストで得ら
れた陽性結果の半数以上が陽性／陰性境界値のほんの少
し上にあることを見いだした。最適のテストはほとんど
全てのサンプルで陽性と陰性との間に大きい差を示し、
それによって間違った陽性の試験結果の可能性を減ら
す。
その後改良されたHIV試験法−米国内での使用はまだU
SFDAによって許可されていないが−組換えDNA法によっ
て生成したHIV［ソーン（Thorn）ら、J Clin Microbiol
25巻1207−1212ページ、1987;バーク（Burke）ら、Ann
Int Med 106巻、671−676ページ、1987;ドーソン（Daw
son）ら、J Infect Dis 157巻、149−157ページ、1988;
ベルツ（Beltz）ら、米国特許第4753873号］、HIV蛋白
質に関連した合成ペプチド［ローゼン（Rosen）ら、PCT
出願第WO87/08005号；ワング（Wang）ら、Proc Natl Ac
ad Sci USA 86巻、6159−6163、1986;米国特許第473589
6号；コサンド（Cosand），米国特許第4629783号；スミ
ス（Smith）ら、J Clin Microbiol 25巻1498−1504ペー
ジ、1987;グナン（Gnann）ら、Ｊ Infect Dis 156巻、
261−267ページ、1987］、又は因子の組み合わせ［レス
リー（Leslie）ら、Vox Sang 54巻84−91ページ、198
8］を用いてきた。抗原ソースとして組換え蛋白質又は
合成ペプチドを用いる場合は組織培養汚染物による非特
異性は軽減される、そしてどちらの抗原ソースも製造プ
ロセスにおいてHIVにさらす必要がない。その上合成ペ
プチドは、純粋に化学的手段によって標準化される抗原
の製造を可能とし、遺伝子工学によって生成するHIV蛋
白質断片の製造に用いられるEsherichia coli又はその
他の宿主の蛋白質の混入に起因する非特異性を排除する
ことができる。必要ならばHIV−１又はHIV−２の突然変
異によって新しいペプチドをすみやかに製造プロセスに
組み込むこともできる；これらの突然変異は診断テスト
に用いるペプチドの抗原性に影響を与える。これらの改
良措置はHIV−１に対する抗体のテストを改善したが、
感度及び特異性のより一層の改善、HIV−２感染の発
見、及び“陽性及び陰性サンプルを識別する迅速且つ簡
単な分析試験にこれらの試薬を適用すること”に関して
はかなりの困難が残っている。
SFDAによって許可されていないが−組換えDNA法によっ
て生成したHIV［ソーン（Thorn）ら、J Clin Microbiol
25巻1207−1212ページ、1987;バーク（Burke）ら、Ann
Int Med 106巻、671−676ページ、1987;ドーソン（Daw
son）ら、J Infect Dis 157巻、149−157ページ、1988;
ベルツ（Beltz）ら、米国特許第4753873号］、HIV蛋白
質に関連した合成ペプチド［ローゼン（Rosen）ら、PCT
出願第WO87/08005号；ワング（Wang）ら、Proc Natl Ac
ad Sci USA 86巻、6159−6163、1986;米国特許第473589
6号；コサンド（Cosand），米国特許第4629783号；スミ
ス（Smith）ら、J Clin Microbiol 25巻1498−1504ペー
ジ、1987;グナン（Gnann）ら、Ｊ Infect Dis 156巻、
261−267ページ、1987］、又は因子の組み合わせ［レス
リー（Leslie）ら、Vox Sang 54巻84−91ページ、198
8］を用いてきた。抗原ソースとして組換え蛋白質又は
合成ペプチドを用いる場合は組織培養汚染物による非特
異性は軽減される、そしてどちらの抗原ソースも製造プ
ロセスにおいてHIVにさらす必要がない。その上合成ペ
プチドは、純粋に化学的手段によって標準化される抗原
の製造を可能とし、遺伝子工学によって生成するHIV蛋
白質断片の製造に用いられるEsherichia coli又はその
他の宿主の蛋白質の混入に起因する非特異性を排除する
ことができる。必要ならばHIV−１又はHIV−２の突然変
異によって新しいペプチドをすみやかに製造プロセスに
組み込むこともできる；これらの突然変異は診断テスト
に用いるペプチドの抗原性に影響を与える。これらの改
良措置はHIV−１に対する抗体のテストを改善したが、
感度及び特異性のより一層の改善、HIV−２感染の発
見、及び“陽性及び陰性サンプルを識別する迅速且つ簡
単な分析試験にこれらの試薬を適用すること”に関して
はかなりの困難が残っている。
発明の概要 今や、Ｃ末端を介して担体蛋白質に結合した少なくと
も１つの合成ペプチドを含む免疫特異的試薬を使用する
ことによって、技術的に存在するこれらの及びその他の
困難を克服し、テストサンプル中のHIV−１又はHIV−２
に対する抗体の存在又はその量を確認する改善された分
析試験結果が得られることが明らかになった。免疫特異
的試薬に使われる合成ペプチドは、HIV−１のp24又はgp
41又はHIV−２のgp32蛋白質の免疫反応特異性を有する
天然又は非天然のペプチドである。本発明の免疫特異的
試薬は、例えば血液又は血清などの液体サンプルを本発
明の免疫特異的試薬と接触させ、それからその試薬に結
合した抗体の存在又は量を測定するという方法で使用さ
れる。
も１つの合成ペプチドを含む免疫特異的試薬を使用する
ことによって、技術的に存在するこれらの及びその他の
困難を克服し、テストサンプル中のHIV−１又はHIV−２
に対する抗体の存在又はその量を確認する改善された分
析試験結果が得られることが明らかになった。免疫特異
的試薬に使われる合成ペプチドは、HIV−１のp24又はgp
41又はHIV−２のgp32蛋白質の免疫反応特異性を有する
天然又は非天然のペプチドである。本発明の免疫特異的
試薬は、例えば血液又は血清などの液体サンプルを本発
明の免疫特異的試薬と接触させ、それからその試薬に結
合した抗体の存在又は量を測定するという方法で使用さ
れる。
よって、本発明の一面において、担体蛋白質に化学的
に結合したペプチドは“遊離”ペプチドより大きい陽性
／陰性テスト比をもたらし、陽性サンプルと陰性サンプ
ルとをよりよく識別することが明らかになった。本発明
のこの面の代表的実施態様において、ペプチドはそのカ
ルボキシル末端（Ｃ−termini）に付加したシステイン
を介してその担体蛋白質に結合し、HIV−１又はHIV−２
に対する抗体を検出するための免疫特異的試薬として用
いられる。
に結合したペプチドは“遊離”ペプチドより大きい陽性
／陰性テスト比をもたらし、陽性サンプルと陰性サンプ
ルとをよりよく識別することが明らかになった。本発明
のこの面の代表的実施態様において、ペプチドはそのカ
ルボキシル末端（Ｃ−termini）に付加したシステイン
を介してその担体蛋白質に結合し、HIV−１又はHIV−２
に対する抗体を検出するための免疫特異的試薬として用
いられる。
好都合に正常血清に対しては低レベルの反応性を示す
反応性ペプチドのいくつかの天然配列異型は、不十分な
感度を有し、陽性血清の５−10％で低い反応性を与える
ことも明らかになった。同じ領域からのその他の天然異
型ペプチドは陽性サンプルとの高い反応性を示すが、正
常血清とでも許容し得ない程高い反応性を示し、その結
果低い陽性／陰性比を与え、HIV抗体を含むサンプルと
含まないサンプルとの識別が十分でない。HIV−１抗体
を検出するためのあらゆる所望クリテリアを満足する天
然ペプチドは見つかっていない。
反応性ペプチドのいくつかの天然配列異型は、不十分な
感度を有し、陽性血清の５−10％で低い反応性を与える
ことも明らかになった。同じ領域からのその他の天然異
型ペプチドは陽性サンプルとの高い反応性を示すが、正
常血清とでも許容し得ない程高い反応性を示し、その結
果低い陽性／陰性比を与え、HIV抗体を含むサンプルと
含まないサンプルとの識別が十分でない。HIV−１抗体
を検出するためのあらゆる所望クリテリアを満足する天
然ペプチドは見つかっていない。
本発明の他の面よりみれば、陽性サンプルとは高レベ
ルの反応性を維持し、陰性サンプルとは低い反応性を示
す天然HIV−１及びHIV−２の非天然配列異型がつくられ
る。好適な非天然ペプチドの担体蛋白質との化学的結合
物はこれまでに試験された天然ペプチドより高い陽性／
陰性テスト比を与える、そして遊離ペプチドでなく、そ
れらペプチドと担体蛋白質との化学的結合物のみが小さ
い粒状の固体支持体に結合するのに適していることが、
HIV−１抗体の検出のための迅速且つ簡単な分析試験法
の開発中にわかった。天然及び非天然HIV−２ペプチド
の同様な結合物は両方共、HIV−２の検出のために適し
ている。
ルの反応性を維持し、陰性サンプルとは低い反応性を示
す天然HIV−１及びHIV−２の非天然配列異型がつくられ
る。好適な非天然ペプチドの担体蛋白質との化学的結合
物はこれまでに試験された天然ペプチドより高い陽性／
陰性テスト比を与える、そして遊離ペプチドでなく、そ
れらペプチドと担体蛋白質との化学的結合物のみが小さ
い粒状の固体支持体に結合するのに適していることが、
HIV−１抗体の検出のための迅速且つ簡単な分析試験法
の開発中にわかった。天然及び非天然HIV−２ペプチド
の同様な結合物は両方共、HIV−２の検出のために適し
ている。
本発明のまた別の面よりみれば、担体蛋白質に結合し
た本発明の合成ペプチド、例えばBSA又はKLH、を含む免
疫特異的試薬は単独で又はキットの形で提供され、HIV
−１及びHIV−２に対する抗体のイムノアッセイに使用
される。完了までの時間が15分以下で、HIV−１及び／
又はHIV−２抗体を検出する単純な視覚的終点を与える
特に好適な新しい迅速分析試験法が提供される。
た本発明の合成ペプチド、例えばBSA又はKLH、を含む免
疫特異的試薬は単独で又はキットの形で提供され、HIV
−１及びHIV−２に対する抗体のイムノアッセイに使用
される。完了までの時間が15分以下で、HIV−１及び／
又はHIV−２抗体を検出する単純な視覚的終点を与える
特に好適な新しい迅速分析試験法が提供される。
定義 免疫化学及びペプチド化学において一般に用いられる
いくつかの用語及び略語が下記の説明及びクレイム中に
出てくる。下記の定義は説明のためのものである。
いくつかの用語及び略語が下記の説明及びクレイム中に
出てくる。下記の定義は説明のためのものである。
ここに用いられる用語“ペプチド”はアミノ酸から成
る蛋白質の線状配列部分である。本発明のペプチドは典
型的にはアミノ酸約５ないし約22の長さを有する。“天
然”ペプチド又は−配列異型とは、天然ソースから分離
され、前に文献に報告されているペプチド配列異型の１
つを意味する−現在HIV−１の配列異型は13種類報告さ
れている。“非天然”ペプチド又は−配列異型とは、報
告された、現在公知のあらゆる天然配列と異なるアミノ
酸配列を意味する。
る蛋白質の線状配列部分である。本発明のペプチドは典
型的にはアミノ酸約５ないし約22の長さを有する。“天
然”ペプチド又は−配列異型とは、天然ソースから分離
され、前に文献に報告されているペプチド配列異型の１
つを意味する−現在HIV−１の配列異型は13種類報告さ
れている。“非天然”ペプチド又は−配列異型とは、報
告された、現在公知のあらゆる天然配列と異なるアミノ
酸配列を意味する。
用語“抗原性ドメイン”又は“エピトープ”は概して
アミノ酸約６−約11の長さをもつ蛋白質又はペプチド内
の領域で、抗体と特異的に相互作用してそれに結合する
ことができる領域を意味する。
アミノ酸約６−約11の長さをもつ蛋白質又はペプチド内
の領域で、抗体と特異的に相互作用してそれに結合する
ことができる領域を意味する。
ここで用いられる下記の頭字語は以下に示す意味を有
する； EIA＝酵素免疫測定法 ELISA＝エライサ法 HIV＝ヒト免疫不全ウィルス HIV−１又はHIV−２（HIVの１型と２型） SIV＝サル免疫不全ウィルス KLH＝スカシガイのヘモシアニン BSA＝ウシ血清アルブミン （Ｓ）MBS＝（スルホ）マレイミドベンゾイル−Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル （Sulfo）SMCC＝（スルホ）スクシンイミジル−４−
（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート SPDP＝Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオネート p24蛋白質＝HIV−１のGAG遺伝子の蛋白質生成物の中
央部蛋白溶解断片 gp41及びgp32＝それぞれHIV−１及びHIV−２のENV遺
伝子の蛋白質生成物の経膜的部分蛋白質溶解断片 AA＝アミノ酸 下記の１文字のアミノ酸コードを用いて特異的アミノ
酸をあらわす。
する； EIA＝酵素免疫測定法 ELISA＝エライサ法 HIV＝ヒト免疫不全ウィルス HIV−１又はHIV−２（HIVの１型と２型） SIV＝サル免疫不全ウィルス KLH＝スカシガイのヘモシアニン BSA＝ウシ血清アルブミン （Ｓ）MBS＝（スルホ）マレイミドベンゾイル−Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル （Sulfo）SMCC＝（スルホ）スクシンイミジル−４−
（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート SPDP＝Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオネート p24蛋白質＝HIV−１のGAG遺伝子の蛋白質生成物の中
央部蛋白溶解断片 gp41及びgp32＝それぞれHIV−１及びHIV−２のENV遺
伝子の蛋白質生成物の経膜的部分蛋白質溶解断片 AA＝アミノ酸 下記の１文字のアミノ酸コードを用いて特異的アミノ
酸をあらわす。
アラニン＝Ａ ロイシン＝Ｌ アルギニン＝Ｒ リジン＝Ｋ アスパラギン＝Ｎ メチオニン＝Ｍ アスパラギン酸＝Ｄ フェニルアラニン＝Ｆ システイン＝Ｃ プロリン＝Ｐ グルタミン酸＝Ｅ セリン＝Ｓ グルタミン＝Ｑ スレオニン＝Ｔ グリシン＝Ｇ トリプトファン＝Ｔ ヒスチジン＝Ｈ チロシン＝Ｔ イソロイシン＝Ｉ バリン＝Ｖ 特に記さない限り、すべてのアミノ酸は天然Ｌ型アミ
ノ酸である。
ノ酸である。
図面の簡単な説明 図１は、HIV−１のgp41蛋白質、分離物HXB2、オーバ
ーラップするペプチドのアミノ酸配列、及びこれらペプ
チドをペプチド−蛋白質結合物としてHIV−１に対する
抗体を含む（HIV＋）又は含まない（HIV−）ヒト血清プ
ールに対して試験した場合のこれらペプチドの免疫反応
性を示す； 図２は、ペプチド2S09の非天然異型のアミノ酸反応性
を示す；このペプチドは図１において蛋白質と結合した
場合には高い免疫反応性を有することが示された。各非
天然ペプチドの抗原性は、遊離ペプチドとして、ペプチ
ド2S09のBSA結合物へのHIV−１抗体の結合を阻止する能
力によってあらわされる。非天然アミノ酸は、各ペプチ
ドのカルボキシル末端に付加した非天然グリシン（Ｇ）
及びシステイン（Ｃ）を除いて、担体蛋白質への結合を
容易にする点で目立っている；図３は、ペプチド2S09の
その他の天然及び非天然異型のアミノ酸配列を示す。各
ペプチドの抗原性は遊離ペプチドとして、ザイールのHI
V−１分離物で報告される天然配列異型である2S09かペ
プチド5S67かどちらかのBSA結合物に対するHIV−１抗体
の結合を阻止する能力によってあらわされる（グアン
ら、サイエンス 237巻1346−1349ページ、1987;アリゾ
ン（Alizon）ら、細胞46巻、36ページ、1986）。各ペプ
チドは非天然のカルボキシル末端GCを含み、ペプチド2S
09から得られるアミノ酸配列のその他の異型が強調され
る； 図４は、図２及び３において遊離ペプチドとして大部
分が抗原性をもつことがわかったペプチドの各々につい
て、それをBSA結合物として用いてHIV−１抗体に直接結
合させたときの免疫反応性を示す。ペプチド2S09のAA
（アミノ酸）異型が目立っており、各ペプチドはBSAへ
のその結合を容易にするためにカルボキシル末端GCを含
んでいる； 図５は、HIV−２のgp32蛋白質、分離物ROD、のオーバ
ーラップするペプチドのAA配列を示す。これらはこの領
域のSIV AA配列とほぼ一致する。これらのペプチドの
抗原性を試験するために、ペプチド−蛋白質結合物を用
い、SIV/HIV−２に対する抗体を含む（SIV＋）又は含ま
ない（SIV−）マカークザル血清のプールに対して試験
した； 図６は、図５において高い免疫反応性をもつことがわ
かったペプチドであるペプチド2S27の天然及び非天然異
型のAA配列を示す。各ペプチドの抗原性は、遊離ペプチ
ドとしてペプチド2S27のBSA結合物とSIV/HIV−２抗体と
の結合を阻止する能力によってあらわされる。非天然性
AAが目立っており、各ペプチドはBSAへの結合を容易に
するためにカルボキシル末端GCを含む； 図７は、図６において遊離ペプチドとして最も大きい
抗原性を示したペプチドの各々について、BSA結合物と
して用いてSIV/HIV−２抗体に直接結合させる場合の免
疫反応性を示す。ペプチド2S27のAA異型が目立ってい
る。各ペプチドはBSAへの化学的結合を容易にするため
にカルボキシル末端Ｃを含む、そして大部分は終わりか
ら２番目のＧスペーサーを含む； 図８は、HIV−１ p24蛋白質のオーバーラップするペ
プチドのAA配列と、これらのペプチドをプールし、ペプ
チド／蛋白質結合として、HIV−１抗体を含む（HIV＋）
又は含まない（HIV−）ヒト血清に対して試験したとき
のこれらペプチドの免疫反応性を示す。先ず異なるペプ
チド群を上記のようにBSAに結合させ、各プールの結合
物を最初に試験した。個々のペプチド−BSA結合物は、
プール中の反応性を示したペプチドからのみつくられ
た； 図９は、非天然ペプチド4S36を遊離ペプチドとして又
はBSAに化学的に結合した同量のペプチドとして３種類
のポリスチレンEIAミクロタイタープレートにコーティ
ングした場合の非天然ペプチド4S36の免疫反応性を示
す。最高の陽性／陰性比（≧20）、及び陽性及び陰性サ
ンプル間の最大の識別度はBSA−ペプチド結合物での
み、そして正常ヒト血清に対して低い反応性をもったプ
ラスチック（プラスチック１型）でのみ得られることに
注目すべきである； 図10Aは、94のヒト血清（内42がHIV−１抗体を含み、
52は含んでいない）を用いてEIAによって試験したとき
の、天然ペプチド2S06及び2S09のペプチド−KLH結合物
の免疫反応性を示す； 図10Bは、184のヒト血清（内98がHIV−１抗体を含
み、86は含んでいなかった）を用いてEIAによって試験
したときの、天然ペプチド2S09のペプチド−BSA結合物
の免疫反応性を示す； 図10Cは、185のヒト血清（内98はHIV−１抗体を含
み、87は含んでいなかった）を用いてEIAによって試験
したときの、天然ペプチド5S67のペプチド−BSA結合物
の免疫反応性を示す； 図11Aは、183のヒト血清（内98はHIV抗体を含み、85
は含んでいなかった）を用いてEIAによって試験したと
きの、非天然ペプチド4S36のペプチド−BSA結合物の免
疫反応性を示す； 図11Bは、185のヒト血清（内98はHIV−１抗体を含
み、87は含んでいなかった）を用いてEIAによって試験
したときの、非天然ペプチド5S76のペプチド−BSA結合
物の免疫反応性を示す； 図11Cは、183ヒト血清（内98はHIV−１抗体を含み、8
5は含んでいなかった）を用いてEIAによって試験したと
きの、非天然ペプチド4S36の結合ペプチド−BSA結合物
の免疫反応性を示す； 図12は、マカークザルの血清（その内７血清はHIV−
２抗体を含み、13血清は含んでいなかった）を用いてEI
Aによって試験したときの、天然ペプチド2S24、2S25、2
S27、5S84、5S85、5S86、及び非天然ペプチド5S88、5S9
0、5S91、及び5S92のペプチド−BSA結合物の免疫反応性
を示す； 図13は、HIV−１（図13A）、HIV−２（図13B）及び複
合HIV−１プラスHIV−２ EIA（図13C）試験の個々の免
疫反応性を示す:30がHIV−１抗体陽性、23がHIV−2/SIV
抗体陽性、HIV−１抗体のないヒト血清 15、SIV/HIV−
２抗体のないカマークザル血清 15であった。すべての
ペプチドはＣ末端でBSAに結合したものを用いた。HIV−
１プレートに非天然ペプチド4S36及び5S76の結合物をコ
ーティングした。HIV−２プレートにはペプチド2S24及
び5S86をコーティングし、複合HIV−１プラスHIV−２プ
レートには4S36（HIV−１）及び2S24プラス5S86（HIV−
２）をコーティングした； 図14は本発明の迅速試験装置の平面図である； 図15は図14の迅速試験装置の分解側面図である。
ーラップするペプチドのアミノ酸配列、及びこれらペプ
チドをペプチド−蛋白質結合物としてHIV−１に対する
抗体を含む（HIV＋）又は含まない（HIV−）ヒト血清プ
ールに対して試験した場合のこれらペプチドの免疫反応
性を示す； 図２は、ペプチド2S09の非天然異型のアミノ酸反応性
を示す；このペプチドは図１において蛋白質と結合した
場合には高い免疫反応性を有することが示された。各非
天然ペプチドの抗原性は、遊離ペプチドとして、ペプチ
ド2S09のBSA結合物へのHIV−１抗体の結合を阻止する能
力によってあらわされる。非天然アミノ酸は、各ペプチ
ドのカルボキシル末端に付加した非天然グリシン（Ｇ）
及びシステイン（Ｃ）を除いて、担体蛋白質への結合を
容易にする点で目立っている；図３は、ペプチド2S09の
その他の天然及び非天然異型のアミノ酸配列を示す。各
ペプチドの抗原性は遊離ペプチドとして、ザイールのHI
V−１分離物で報告される天然配列異型である2S09かペ
プチド5S67かどちらかのBSA結合物に対するHIV−１抗体
の結合を阻止する能力によってあらわされる（グアン
ら、サイエンス 237巻1346−1349ページ、1987;アリゾ
ン（Alizon）ら、細胞46巻、36ページ、1986）。各ペプ
チドは非天然のカルボキシル末端GCを含み、ペプチド2S
09から得られるアミノ酸配列のその他の異型が強調され
る； 図４は、図２及び３において遊離ペプチドとして大部
分が抗原性をもつことがわかったペプチドの各々につい
て、それをBSA結合物として用いてHIV−１抗体に直接結
合させたときの免疫反応性を示す。ペプチド2S09のAA
（アミノ酸）異型が目立っており、各ペプチドはBSAへ
のその結合を容易にするためにカルボキシル末端GCを含
んでいる； 図５は、HIV−２のgp32蛋白質、分離物ROD、のオーバ
ーラップするペプチドのAA配列を示す。これらはこの領
域のSIV AA配列とほぼ一致する。これらのペプチドの
抗原性を試験するために、ペプチド−蛋白質結合物を用
い、SIV/HIV−２に対する抗体を含む（SIV＋）又は含ま
ない（SIV−）マカークザル血清のプールに対して試験
した； 図６は、図５において高い免疫反応性をもつことがわ
かったペプチドであるペプチド2S27の天然及び非天然異
型のAA配列を示す。各ペプチドの抗原性は、遊離ペプチ
ドとしてペプチド2S27のBSA結合物とSIV/HIV−２抗体と
の結合を阻止する能力によってあらわされる。非天然性
AAが目立っており、各ペプチドはBSAへの結合を容易に
するためにカルボキシル末端GCを含む； 図７は、図６において遊離ペプチドとして最も大きい
抗原性を示したペプチドの各々について、BSA結合物と
して用いてSIV/HIV−２抗体に直接結合させる場合の免
疫反応性を示す。ペプチド2S27のAA異型が目立ってい
る。各ペプチドはBSAへの化学的結合を容易にするため
にカルボキシル末端Ｃを含む、そして大部分は終わりか
ら２番目のＧスペーサーを含む； 図８は、HIV−１ p24蛋白質のオーバーラップするペ
プチドのAA配列と、これらのペプチドをプールし、ペプ
チド／蛋白質結合として、HIV−１抗体を含む（HIV＋）
又は含まない（HIV−）ヒト血清に対して試験したとき
のこれらペプチドの免疫反応性を示す。先ず異なるペプ
チド群を上記のようにBSAに結合させ、各プールの結合
物を最初に試験した。個々のペプチド−BSA結合物は、
プール中の反応性を示したペプチドからのみつくられ
た； 図９は、非天然ペプチド4S36を遊離ペプチドとして又
はBSAに化学的に結合した同量のペプチドとして３種類
のポリスチレンEIAミクロタイタープレートにコーティ
ングした場合の非天然ペプチド4S36の免疫反応性を示
す。最高の陽性／陰性比（≧20）、及び陽性及び陰性サ
ンプル間の最大の識別度はBSA−ペプチド結合物での
み、そして正常ヒト血清に対して低い反応性をもったプ
ラスチック（プラスチック１型）でのみ得られることに
注目すべきである； 図10Aは、94のヒト血清（内42がHIV−１抗体を含み、
52は含んでいない）を用いてEIAによって試験したとき
の、天然ペプチド2S06及び2S09のペプチド−KLH結合物
の免疫反応性を示す； 図10Bは、184のヒト血清（内98がHIV−１抗体を含
み、86は含んでいなかった）を用いてEIAによって試験
したときの、天然ペプチド2S09のペプチド−BSA結合物
の免疫反応性を示す； 図10Cは、185のヒト血清（内98はHIV−１抗体を含
み、87は含んでいなかった）を用いてEIAによって試験
したときの、天然ペプチド5S67のペプチド−BSA結合物
の免疫反応性を示す； 図11Aは、183のヒト血清（内98はHIV抗体を含み、85
は含んでいなかった）を用いてEIAによって試験したと
きの、非天然ペプチド4S36のペプチド−BSA結合物の免
疫反応性を示す； 図11Bは、185のヒト血清（内98はHIV−１抗体を含
み、87は含んでいなかった）を用いてEIAによって試験
したときの、非天然ペプチド5S76のペプチド−BSA結合
物の免疫反応性を示す； 図11Cは、183ヒト血清（内98はHIV−１抗体を含み、8
5は含んでいなかった）を用いてEIAによって試験したと
きの、非天然ペプチド4S36の結合ペプチド−BSA結合物
の免疫反応性を示す； 図12は、マカークザルの血清（その内７血清はHIV−
２抗体を含み、13血清は含んでいなかった）を用いてEI
Aによって試験したときの、天然ペプチド2S24、2S25、2
S27、5S84、5S85、5S86、及び非天然ペプチド5S88、5S9
0、5S91、及び5S92のペプチド−BSA結合物の免疫反応性
を示す； 図13は、HIV−１（図13A）、HIV−２（図13B）及び複
合HIV−１プラスHIV−２ EIA（図13C）試験の個々の免
疫反応性を示す:30がHIV−１抗体陽性、23がHIV−2/SIV
抗体陽性、HIV−１抗体のないヒト血清 15、SIV/HIV−
２抗体のないカマークザル血清 15であった。すべての
ペプチドはＣ末端でBSAに結合したものを用いた。HIV−
１プレートに非天然ペプチド4S36及び5S76の結合物をコ
ーティングした。HIV−２プレートにはペプチド2S24及
び5S86をコーティングし、複合HIV−１プラスHIV−２プ
レートには4S36（HIV−１）及び2S24プラス5S86（HIV−
２）をコーティングした； 図14は本発明の迅速試験装置の平面図である； 図15は図14の迅速試験装置の分解側面図である。
特殊な実施例の説明 本発明の一面によって、例えば血液又は血清サンプル
などの液体サンプル中のHIV−１又はHIV−２抗体の存在
又は量が下記のように測定される;C末端を介して担体蛋
白質に結合した少なくとも１つの合成ペプチドを含み、
HIV−１のp24又はgp41蛋白質、又はHIV−２のgp32蛋白
質の抗原性ドメインに特異的な免疫反応特異性を有する
免疫特異的試薬と上記液体サンプルとを接触させ、その
後その免疫特異的試薬に結合した抗体の存在又は量を調
べる。
などの液体サンプル中のHIV−１又はHIV−２抗体の存在
又は量が下記のように測定される;C末端を介して担体蛋
白質に結合した少なくとも１つの合成ペプチドを含み、
HIV−１のp24又はgp41蛋白質、又はHIV−２のgp32蛋白
質の抗原性ドメインに特異的な免疫反応特異性を有する
免疫特異的試薬と上記液体サンプルとを接触させ、その
後その免疫特異的試薬に結合した抗体の存在又は量を調
べる。
本発明の実施において担体蛋白質に対するＣ−末端結
合のために用いられる代表的ペプチドは好適には天然に
発生するHIV−１及びHIV−２蛋白質の抗原性ドメインを
代表するアミノ酸配列を有する合成ペプチドである（天
然に発生するHIV−１及びHIV−２蛋白質の配列について
は、マイヤーズ（Myers）らの“ヒトレトロウィルス及
びAIDS（Human Retroviruses and AIDS）"1988、“核酸
及びアミノ酸配列の概要”ロスアラモス国立研究所、ロ
スアラモス、ニューメキシコ、87545、USA、参照）。本
発明のその他のペプチドは、HIV−１及びHIV−２の抗原
性ドレインに特徴的な免疫反応特異性を有する非天然合
成ペプチドを含める、これについては以下で詳述する。
これらのペプチドは例えば下記のような方法によって、
化学的に合成される；同時性多ペプチド合成（SMPS）と
して知られる標準メリフィールド（Merrifield）固相合
成法の変法を用いる−この方法では約70−100のペプチ
ドを同時に合成することができる（米国特許第41631211
号参照）。この方法を用いて、11のペプチド又は少数の
アミノ酸に含まれる一次及び二次構造エピトープ又は抗
原性ドメインすべてを表現し、HIV−１のgag遺伝子によ
って規定されるp24蛋白質のすべてHIV−１及びHIV−２
のeuv遺伝子によって規定される経膜的糖蛋白質の部分
を表現するペプチドが合成された。HIV−１について用
いられた最初の配列はHIVHXB2クローンのそれであり、H
IV−２ではHIVRODクローンのそれであった（マイヤーズ
ら、同上）。しかしenv経膜的糖蛋白質の免疫優性領域
が確認された場合は、その免疫反応性領域の公知の一般
的天然配列異型のすべて並びにこの領域の多くの非天然
配列異型の多くはここに記載の方法で合成された。本発
明の代表的ペプチドは約５ないし約22のアミノ酸、好適
には約11ないし約20のアミノ酸、より好適には約15ない
し約17のアミノ酸を含む。ペプチドは20以下のアミノ酸
の長さを有し、より長い分子によって生ずる硬い二次構
造を避けるのが好適である。このような硬い二次構造
は、ペプチドの形が感染患者に見いだされるHIVgp41,gp
32,又はp24抗体の抗原結合部位に適応するのを妨げる。
この技術において一般的に記されるが、図１に示される
ようなGC Ｃ末端テールをもたないいくつかのペプチ
ド、例えばペプチド4S24（19AA′s,コサンド参照）は、
部分的にオーバーラップするより短いペプチド2S01（14
AA′ｓ）又はペプチド4S25（26AA′s,コサンド及びワン
グら、上記）に比較して、また部分的にオーバーラップ
するペプチド2S04（17AA′ｓ）又は3S36（17AA′ｓ）に
比較しても、免疫反応性が低いのは、このような二次構
造の考察を反映するものかも知れない。組換えDNA法
［ベルツ（Beltz）らの米国特許第4753873号参照］によ
って作成される非常に大きい蛋白質のペプチドのような
ペプチドは強い二次及び三次構造的硬さをもつと考えら
れる；これは或るエピトープのアクセスし易さを制限
し、ベルツらが認めたようにいくつかの抗体陽性サンプ
ルの免疫反応性の低下に寄与する。本発明に用いるより
小さいペプチドサイズは、ペプチドそのものだけを（担
体蛋白質と結合せずに）用いる場合にはイムノアッセイ
には不都合であると考えられる。このような小さい遊離
ペプチドは結合プロセス中に傷つけられ、低い免疫反応
性に通ずる。結合中のエピトープ妨害は、例えばグナン
らの考察（J Infect Dis 156巻261−267ページ）を説明
するかも知れない；その考察では、ポリスチレンに直接
結合した小さい免疫反応性ペプチドと反応する陽性サン
プルの65％は、1:128希釈で試験したとき、1.0以下のA4
92値を与えた。非結合ペプチドの結合中におこるような
エピトープ妨害はローゼン（Rosen）ら（PCT出願087/06
065）が好適ペプチドとして、より長いペプチドを使用
したこと並びにその中に開示されている複数（multipl
e）ペプチドの使用も説明するかも知れない。
合のために用いられる代表的ペプチドは好適には天然に
発生するHIV−１及びHIV−２蛋白質の抗原性ドメインを
代表するアミノ酸配列を有する合成ペプチドである（天
然に発生するHIV−１及びHIV−２蛋白質の配列について
は、マイヤーズ（Myers）らの“ヒトレトロウィルス及
びAIDS（Human Retroviruses and AIDS）"1988、“核酸
及びアミノ酸配列の概要”ロスアラモス国立研究所、ロ
スアラモス、ニューメキシコ、87545、USA、参照）。本
発明のその他のペプチドは、HIV−１及びHIV−２の抗原
性ドレインに特徴的な免疫反応特異性を有する非天然合
成ペプチドを含める、これについては以下で詳述する。
これらのペプチドは例えば下記のような方法によって、
化学的に合成される；同時性多ペプチド合成（SMPS）と
して知られる標準メリフィールド（Merrifield）固相合
成法の変法を用いる−この方法では約70−100のペプチ
ドを同時に合成することができる（米国特許第41631211
号参照）。この方法を用いて、11のペプチド又は少数の
アミノ酸に含まれる一次及び二次構造エピトープ又は抗
原性ドメインすべてを表現し、HIV−１のgag遺伝子によ
って規定されるp24蛋白質のすべてHIV−１及びHIV−２
のeuv遺伝子によって規定される経膜的糖蛋白質の部分
を表現するペプチドが合成された。HIV−１について用
いられた最初の配列はHIVHXB2クローンのそれであり、H
IV−２ではHIVRODクローンのそれであった（マイヤーズ
ら、同上）。しかしenv経膜的糖蛋白質の免疫優性領域
が確認された場合は、その免疫反応性領域の公知の一般
的天然配列異型のすべて並びにこの領域の多くの非天然
配列異型の多くはここに記載の方法で合成された。本発
明の代表的ペプチドは約５ないし約22のアミノ酸、好適
には約11ないし約20のアミノ酸、より好適には約15ない
し約17のアミノ酸を含む。ペプチドは20以下のアミノ酸
の長さを有し、より長い分子によって生ずる硬い二次構
造を避けるのが好適である。このような硬い二次構造
は、ペプチドの形が感染患者に見いだされるHIVgp41,gp
32,又はp24抗体の抗原結合部位に適応するのを妨げる。
この技術において一般的に記されるが、図１に示される
ようなGC Ｃ末端テールをもたないいくつかのペプチ
ド、例えばペプチド4S24（19AA′s,コサンド参照）は、
部分的にオーバーラップするより短いペプチド2S01（14
AA′ｓ）又はペプチド4S25（26AA′s,コサンド及びワン
グら、上記）に比較して、また部分的にオーバーラップ
するペプチド2S04（17AA′ｓ）又は3S36（17AA′ｓ）に
比較しても、免疫反応性が低いのは、このような二次構
造の考察を反映するものかも知れない。組換えDNA法
［ベルツ（Beltz）らの米国特許第4753873号参照］によ
って作成される非常に大きい蛋白質のペプチドのような
ペプチドは強い二次及び三次構造的硬さをもつと考えら
れる；これは或るエピトープのアクセスし易さを制限
し、ベルツらが認めたようにいくつかの抗体陽性サンプ
ルの免疫反応性の低下に寄与する。本発明に用いるより
小さいペプチドサイズは、ペプチドそのものだけを（担
体蛋白質と結合せずに）用いる場合にはイムノアッセイ
には不都合であると考えられる。このような小さい遊離
ペプチドは結合プロセス中に傷つけられ、低い免疫反応
性に通ずる。結合中のエピトープ妨害は、例えばグナン
らの考察（J Infect Dis 156巻261−267ページ）を説明
するかも知れない；その考察では、ポリスチレンに直接
結合した小さい免疫反応性ペプチドと反応する陽性サン
プルの65％は、1:128希釈で試験したとき、1.0以下のA4
92値を与えた。非結合ペプチドの結合中におこるような
エピトープ妨害はローゼン（Rosen）ら（PCT出願087/06
065）が好適ペプチドとして、より長いペプチドを使用
したこと並びにその中に開示されている複数（multipl
e）ペプチドの使用も説明するかも知れない。
上記とは対照的に、本発明の免疫試薬は、ここに記載
するように小さい合成ペプチドを免疫試薬として使用す
る前に、担体蛋白質に化学的にカップリングすることに
よって形成される。したがって典型的アッセイ装置のポ
リスチレン表面に結合していない短いペプチドのため
の、又はその短いペプチドとプラスチック表面との相互
作用によっておこるエピトープの遮蔽又は立体障害のた
めに抗原性ペプチドが見逃されるということはない。本
発明の合成ペプチドに結合する適切な担体蛋白質は、分
子量約5000ダルトン以上の天然に発生する又は合成のペ
プチド又は蛋白質分子で、分析すべきテストサンプルと
は免疫反応性を示さず、合成ペプチドの反応性に大きく
寄与したりそれを減じたりしないものである。代表的担
体蛋白質としてはウシ血清アルブミン（BSA）、スカシ
ガイのヘモシアニン（KLH）、ヒト血清アルブミン、ポ
リ−Ｌ−リジン、ウシ ガンマグロブリン、その他の類
似のポリペプチド分子がある。現在好適担体蛋白質はBS
A及びKLHであり、BSAは最適アッセイ感度及び特異性を
得るために現在特に好適である。本発明の合成ペプチド
は、それらのカルボキシル末端を介して担体蛋白質に化
学的に結合したとき高度の免疫反応性を保有することが
明らかにされた。これらペプチドと担体蛋白質との結合
は、適した結合剤、例えばマレイミド安息香酸、ｐ−メ
チルジチオ安息香酸、無水マレイン酸、無水琥珀酸、グ
ルタルアルデヒド、又はその他の類似の結合剤などを用
い、一般的ペプチド結合手段によって実現される。とく
に適した結合剤は、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル（MBS）、スルフォマレイ
ミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（SMB
S）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（SMCC）、
スルフォスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（sulfoSMC
C）及びＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチ
オ）プロピオネート（SPDP）である。
するように小さい合成ペプチドを免疫試薬として使用す
る前に、担体蛋白質に化学的にカップリングすることに
よって形成される。したがって典型的アッセイ装置のポ
リスチレン表面に結合していない短いペプチドのため
の、又はその短いペプチドとプラスチック表面との相互
作用によっておこるエピトープの遮蔽又は立体障害のた
めに抗原性ペプチドが見逃されるということはない。本
発明の合成ペプチドに結合する適切な担体蛋白質は、分
子量約5000ダルトン以上の天然に発生する又は合成のペ
プチド又は蛋白質分子で、分析すべきテストサンプルと
は免疫反応性を示さず、合成ペプチドの反応性に大きく
寄与したりそれを減じたりしないものである。代表的担
体蛋白質としてはウシ血清アルブミン（BSA）、スカシ
ガイのヘモシアニン（KLH）、ヒト血清アルブミン、ポ
リ−Ｌ−リジン、ウシ ガンマグロブリン、その他の類
似のポリペプチド分子がある。現在好適担体蛋白質はBS
A及びKLHであり、BSAは最適アッセイ感度及び特異性を
得るために現在特に好適である。本発明の合成ペプチド
は、それらのカルボキシル末端を介して担体蛋白質に化
学的に結合したとき高度の免疫反応性を保有することが
明らかにされた。これらペプチドと担体蛋白質との結合
は、適した結合剤、例えばマレイミド安息香酸、ｐ−メ
チルジチオ安息香酸、無水マレイン酸、無水琥珀酸、グ
ルタルアルデヒド、又はその他の類似の結合剤などを用
い、一般的ペプチド結合手段によって実現される。とく
に適した結合剤は、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル（MBS）、スルフォマレイ
ミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（SMB
S）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（SMCC）、
スルフォスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（sulfoSMC
C）及びＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチ
オ）プロピオネート（SPDP）である。
担体蛋白質への結合を容易にするために、本発明の合
成ペプチドは、抗原性ドメインをあらわすペプチド部分
のカルボキシル末端に位置するアミノ酸スペーサーテー
ルをもっているのが好ましい。適切なスペーサーテール
は、ペプチドと担体蛋白質との結合の際に抗原性ドメイ
ンの免疫反応性を保護し、所望のアミノ酸を結合にあず
かるようにする機能をもつ。適切なスペーサーテール
は、０ないし４個のグリシンAAスペーサーを有し、担体
蛋白質に結合するためのシステイン基に終わるペプチド
セグメントである。ここに詳細に説明され、図に示され
る特に好適な実施例において、アミノ酸スペーサーテー
ルはペプチド中でＣ末端−GC基によってあらわされる、
但しその他のスペーサーテールもこの目的のために用い
られる。約50のHIV−１抗体陽性血清のプールに対する
免疫反応性、又は約６のHIV−２抗体陽性血清のプール
に対する並びにHIV−１又はHIV−２抗体のないことがわ
かっている血清のプールに対する免疫反応性について、
本発明の好適ペプチドがEIA法によってスクリーニング
された。血清プールを用いてEIAスクリーニングするこ
とによって、HIV感染中の霊長類において最大の抗体反
応をおこすペプチドを確認し、個々の人に見られるエピ
トープの配列決定（Mapping）は避けた。ひとたび有望
なペプチド領域が確認されたならば（図１、５、８）そ
の後の合成によって最適免疫反応性ペプチドが解明され
（図２−４、６、７）、それから最適ペプチドを多数の
個々の血清に対してスクリーニングした（以下参照、図
10−13）。これらの最適ペプチド−Ｃ末端がBSAに結合
したもの−のなかで最もよいものを、機器を必要としな
い目で見る迅速試験の開発のために用いた（図14）。
成ペプチドは、抗原性ドメインをあらわすペプチド部分
のカルボキシル末端に位置するアミノ酸スペーサーテー
ルをもっているのが好ましい。適切なスペーサーテール
は、ペプチドと担体蛋白質との結合の際に抗原性ドメイ
ンの免疫反応性を保護し、所望のアミノ酸を結合にあず
かるようにする機能をもつ。適切なスペーサーテール
は、０ないし４個のグリシンAAスペーサーを有し、担体
蛋白質に結合するためのシステイン基に終わるペプチド
セグメントである。ここに詳細に説明され、図に示され
る特に好適な実施例において、アミノ酸スペーサーテー
ルはペプチド中でＣ末端−GC基によってあらわされる、
但しその他のスペーサーテールもこの目的のために用い
られる。約50のHIV−１抗体陽性血清のプールに対する
免疫反応性、又は約６のHIV−２抗体陽性血清のプール
に対する並びにHIV−１又はHIV−２抗体のないことがわ
かっている血清のプールに対する免疫反応性について、
本発明の好適ペプチドがEIA法によってスクリーニング
された。血清プールを用いてEIAスクリーニングするこ
とによって、HIV感染中の霊長類において最大の抗体反
応をおこすペプチドを確認し、個々の人に見られるエピ
トープの配列決定（Mapping）は避けた。ひとたび有望
なペプチド領域が確認されたならば（図１、５、８）そ
の後の合成によって最適免疫反応性ペプチドが解明され
（図２−４、６、７）、それから最適ペプチドを多数の
個々の血清に対してスクリーニングした（以下参照、図
10−13）。これらの最適ペプチド−Ｃ末端がBSAに結合
したもの−のなかで最もよいものを、機器を必要としな
い目で見る迅速試験の開発のために用いた（図14）。
これらの研究は、配列IWGCSGKLICTTAVPGC（2S09）
（下線部分は免疫反応性を保護し、結合を容易にするた
めにスペーサーテールに付加した非天然アミノ酸を意味
する）をもつgp41天然配列ペプチドが、システインを介
して担体蛋白質に結合したときHIV−１抗体の検出のた
めに最大に免疫反応性であることを明らかにした（図
１）。さらに、配列DQARLNSWGCAFRGVC（2S24）ARLNSWGC
AFRQVCHGC（2S25）、及びSWGCAFRQVCHTTVPGC（2S27）を
もつ３つのgp32天然配列は、システインを介して担体蛋
白質に結合したときHIV−２抗体の検出のために最大に
免疫反応性であることが明らかになった（図５）。p24
蛋白質でも、システインを介して担体蛋白質に化学的に
結合したときに顕著な免疫反応性を示す配列ALGPAATLEE
MMTACGC（5G94）をもつペプチドが確認された（図
８）。
（下線部分は免疫反応性を保護し、結合を容易にするた
めにスペーサーテールに付加した非天然アミノ酸を意味
する）をもつgp41天然配列ペプチドが、システインを介
して担体蛋白質に結合したときHIV−１抗体の検出のた
めに最大に免疫反応性であることを明らかにした（図
１）。さらに、配列DQARLNSWGCAFRGVC（2S24）ARLNSWGC
AFRQVCHGC（2S25）、及びSWGCAFRQVCHTTVPGC（2S27）を
もつ３つのgp32天然配列は、システインを介して担体蛋
白質に結合したときHIV−２抗体の検出のために最大に
免疫反応性であることが明らかになった（図５）。p24
蛋白質でも、システインを介して担体蛋白質に化学的に
結合したときに顕著な免疫反応性を示す配列ALGPAATLEE
MMTACGC（5G94）をもつペプチドが確認された（図
８）。
本発明のペプチドによってあらわれるHIV−１に対す
る免疫反応性領域は、ワング（Wang）らの米国特許第47
35896号及びコサンド（Cosand）の米国特許第4679783号
によって確認された領域のＣ末端に位置する。配列RILA
VERYLKDQQLLGIWGCSをもつワングの免疫反応性ペプチド
及び配列IKQLQARILAVERYLKDQQ（4S24）及びRILAVERYLKD
QQLLGIWGCSGKLIC（4S25）をもつコサンドの免疫反応性
ペプチドは、本発明の目的であるペプチドとは下記の点
で異なる。ワンダのペプチド全体の18/21を占めそのＣ
末端をすべて含む本発明のより短いペプチドAVERYLKDQQ
LLQC（2S01）、ERYKLDQQLLGIWGC（2S02），及びYLKDQQL
LGIWGCSGC（2S03）は、Ｃ末端を介してBSAに化学的に結
合した担体蛋白質結合物として用いたときの本発明の免
疫反応性ペプチドより著しく小さい免疫反応性をもつ
（図１）。ペプチドIKQLQARILAVERYLKDQQ（コサンド参
照、上記）はどの観点でも本発明のHIV−１免疫反応性
ペプチドにオーバーラップしない、そしてGCを介してBS
Aに結合している遥かに長いペプチドRILAVERYLKDQQLLGI
WGCSGKLIC（4S25コサンド、参照，上記）は、GCスペー
サーを介してBSAに結合したＣ末端化学的結合物として
用いるとき、KDQQLLGIWGCSGKLGC（2S04）、QQLLGIWGCSG
KLICGC（3S36）、LLGIWGCSGKLICTTGC（2S06）及びLGIWG
CSGKLICTTAGC（2S07）を含む本発明のいくつかの比較的
短いペプチドより低い又は同等の免疫反応性を示す（図
１）。しかしながらワングら、又はコサンドの特許いず
れにも見いだされなかった重要な配列を含む本発明の新
しいペプチドを用いて最良の免疫反応性が得られる。こ
れらの配列はワング及びコサンドのペプチドについたＣ
末端であり、例えばBSAなどの担体蛋白質にカルボキシ
ル末端GCを介して結合するときペプチドの免疫反応性を
維持するのに重要である。このより高い反応性を示すペ
プチドは、IWGCSGKLICTTAVPGC（2S09）,GCSGKLICTTAVPW
NGC（2S11）、CSGKLICTTAVPWNAGC（3S51）,SGKLICTTAVP
WNASGC（2S13）、GKLICTTAVPWNASWGC（3S55）及びKLICT
TAVPWNASWSGC（2S15）である（図１）。これらの天然配
列高反応性ペプチドのいくつかは、ローゼンらが記載し
たもの（PCT出願 WO87/06005）と類似している。しか
しながら非結合型のペプチドを使ったローゼンとは異な
り、これらのペプチドの最適免疫反応性はそれらをペプ
チド−担体蛋白質結合物として用いたとき、例えばそれ
らのＣ末端に付加したグリシン−システインスペーサー
を介してBSAに結合させたときにのみ得られる（図１、
５、８、９）。最大陽性／陰性比、及びHIVに対する抗
体を含むサンプル（HIV抗体陽性）とこれを含まないサ
ンプル（HIV抗体陰性）との最も良い識別は、このよう
な結合物でのみ得られ、ペプチドそのものでは得られな
い（図９）。さらに、これらペプチドの迅速診断分析試
験への適用は、Ｃ末端ペプチド−蛋白質結合物によって
のみ可能であり、ペプチドそのものでは迅速試験のため
のコロイド金又はEIA法には適さない。これについては
後でより詳しく述べる。（実施例15−19、４表）。
る免疫反応性領域は、ワング（Wang）らの米国特許第47
35896号及びコサンド（Cosand）の米国特許第4679783号
によって確認された領域のＣ末端に位置する。配列RILA
VERYLKDQQLLGIWGCSをもつワングの免疫反応性ペプチド
及び配列IKQLQARILAVERYLKDQQ（4S24）及びRILAVERYLKD
QQLLGIWGCSGKLIC（4S25）をもつコサンドの免疫反応性
ペプチドは、本発明の目的であるペプチドとは下記の点
で異なる。ワンダのペプチド全体の18/21を占めそのＣ
末端をすべて含む本発明のより短いペプチドAVERYLKDQQ
LLQC（2S01）、ERYKLDQQLLGIWGC（2S02），及びYLKDQQL
LGIWGCSGC（2S03）は、Ｃ末端を介してBSAに化学的に結
合した担体蛋白質結合物として用いたときの本発明の免
疫反応性ペプチドより著しく小さい免疫反応性をもつ
（図１）。ペプチドIKQLQARILAVERYLKDQQ（コサンド参
照、上記）はどの観点でも本発明のHIV−１免疫反応性
ペプチドにオーバーラップしない、そしてGCを介してBS
Aに結合している遥かに長いペプチドRILAVERYLKDQQLLGI
WGCSGKLIC（4S25コサンド、参照，上記）は、GCスペー
サーを介してBSAに結合したＣ末端化学的結合物として
用いるとき、KDQQLLGIWGCSGKLGC（2S04）、QQLLGIWGCSG
KLICGC（3S36）、LLGIWGCSGKLICTTGC（2S06）及びLGIWG
CSGKLICTTAGC（2S07）を含む本発明のいくつかの比較的
短いペプチドより低い又は同等の免疫反応性を示す（図
１）。しかしながらワングら、又はコサンドの特許いず
れにも見いだされなかった重要な配列を含む本発明の新
しいペプチドを用いて最良の免疫反応性が得られる。こ
れらの配列はワング及びコサンドのペプチドについたＣ
末端であり、例えばBSAなどの担体蛋白質にカルボキシ
ル末端GCを介して結合するときペプチドの免疫反応性を
維持するのに重要である。このより高い反応性を示すペ
プチドは、IWGCSGKLICTTAVPGC（2S09）,GCSGKLICTTAVPW
NGC（2S11）、CSGKLICTTAVPWNAGC（3S51）,SGKLICTTAVP
WNASGC（2S13）、GKLICTTAVPWNASWGC（3S55）及びKLICT
TAVPWNASWSGC（2S15）である（図１）。これらの天然配
列高反応性ペプチドのいくつかは、ローゼンらが記載し
たもの（PCT出願 WO87/06005）と類似している。しか
しながら非結合型のペプチドを使ったローゼンとは異な
り、これらのペプチドの最適免疫反応性はそれらをペプ
チド−担体蛋白質結合物として用いたとき、例えばそれ
らのＣ末端に付加したグリシン−システインスペーサー
を介してBSAに結合させたときにのみ得られる（図１、
５、８、９）。最大陽性／陰性比、及びHIVに対する抗
体を含むサンプル（HIV抗体陽性）とこれを含まないサ
ンプル（HIV抗体陰性）との最も良い識別は、このよう
な結合物でのみ得られ、ペプチドそのものでは得られな
い（図９）。さらに、これらペプチドの迅速診断分析試
験への適用は、Ｃ末端ペプチド−蛋白質結合物によって
のみ可能であり、ペプチドそのものでは迅速試験のため
のコロイド金又はEIA法には適さない。これについては
後でより詳しく述べる。（実施例15−19、４表）。
カルボキシル末端GCを介して担体蛋白質に結合したと
きHIV抗体の検出のための高い性能を保持するペプチド
をもつこれら結合物のなかで最も有望なものを多数の血
清標本に対して試験した。これらの研究は、EIAに使用
するためのペプチド−蛋白質結合物を作るにはBSAがKLH
よりすぐれていること（図１、５、10、11）、HIV−１
−又はHIV−２抗体の検出において十分の感度を得るた
めには１個以上のペプチドとBSAとの結合物が好適であ
ること（図10−13）、そしてHIV−１のために適したペ
プチドはHIV−２の検出のためには適さないこと（図1
3）などを示している。グナン（Gnann）ら［サイエンス
（Science）237巻1346−1349ページ、1987］が記載した
ように、ザイールの分離物で報告された、ロイシンの代
わりにヒスチジン置換基を含む配列異型は、HXB2配列異
型とでは低い免疫反応性をもつ若干の血清においてHIV
−１抗体を検出することができることが確認された（図
４及び10C）。しかしながら、これらのヒスチジン含有
配列異型は、HIV抗体を含まない血清との許容し得ない
高い反応性を与える（図10C）。カルボキシル末端によ
ってBSA又はその他の抗体蛋白質に結合した単一のペプ
チド又はペプチド組み合わせをEIA法の抗原として用い
た場合、感度又は陽性サンプルと陰性サンプルとの区別
に関して最適アッセイ性能を与える、発見ずみのエピト
ープの天然配列異型は見つかっていない（図10）。そこ
で、HIV抗体を含まない血清に対しては所望でない非特
異的反応性を示すことのない、HIV抗体のための高い免
疫反応性を保持する配列を決定するために、免疫優性HI
V−1gp41エピトープの50以上の非天然配列異型を合成し
た。本発明の重要な点は、HIV抗体には高度の免疫反応
性を保持し、HIV抗体のない正常なヒト血清とは不都合
に反応しない、図２−４、６、７、11に示されるHIV−
１及びHIV−２両方の非天然配列異型の発見である（図1
1）。これらの高度に免疫反応性の非天然配列異型は技
術的に開示されたペプチドとは著しく異なる。これらの
ペプチドのうち２つ、4S36と4S76、はそれらのカルボキ
シル末端によるBSAとの結合物として用いたとき、優れ
たアッセイ性能を与え、高レベルの感度及び特異性、非
常に高レベルの陽性及び陰性サンプル間の識別（図11
C）、そして２つの商業的に承認されたEIA試験で間違っ
た陽性反応を与えることが判明した血清サンプルに対し
ては非常に低い反応性（実施例８、表１）を示した。こ
の種のアッセイ性能−陽性は492nmの吸光度が1.25以下
でなく、陽性の最低と陰性の最高との間のA492値の間隔
は1.0吸光単位以上である−は、ペプチド−BSA結合物と
して用いられるここに記載の結合非天然ペプチドによっ
て可能となる。この種のアッセイ性能は最適であり、ベ
ルツ（Beltz）らの米国特許第4753873号に記載されてい
る組換えDNA法によってつくられる非常に大きいポリペ
プチド−それはここに記載の領域を含めたHIVのgp120及
びgp41の大部分を含む−の性能とよい対照となる。ベル
ツらの特許に記載されているA490単位における陽性及び
陰性サンプル間の間隔はたった0.1で、陽性サンプルの1
1％が1.2以下のA492値を有する。本発明の合成ペプチド
法は、ベルツらの特許の場合のように単一のHIV分離物
に依存するよりもむしろ、HIVエンベロープの臨界的免
疫優性領域に対する抗原性変異の全範囲をあらわすいく
つかの異なるペプチドを挿入することができる。また、
ペプチド合成によって、免疫優性領域のみが使用抗原に
含まれ、HIVenv遺伝子生成物のあり得る交差反応部分を
含むことによって導入される非特異性、又は組換えDNA
によって表現される蛋白質をつくるために用いる細菌性
宿主に由来する汚染蛋白質に起因する非特異性を避ける
ことができる。
きHIV抗体の検出のための高い性能を保持するペプチド
をもつこれら結合物のなかで最も有望なものを多数の血
清標本に対して試験した。これらの研究は、EIAに使用
するためのペプチド−蛋白質結合物を作るにはBSAがKLH
よりすぐれていること（図１、５、10、11）、HIV−１
−又はHIV−２抗体の検出において十分の感度を得るた
めには１個以上のペプチドとBSAとの結合物が好適であ
ること（図10−13）、そしてHIV−１のために適したペ
プチドはHIV−２の検出のためには適さないこと（図1
3）などを示している。グナン（Gnann）ら［サイエンス
（Science）237巻1346−1349ページ、1987］が記載した
ように、ザイールの分離物で報告された、ロイシンの代
わりにヒスチジン置換基を含む配列異型は、HXB2配列異
型とでは低い免疫反応性をもつ若干の血清においてHIV
−１抗体を検出することができることが確認された（図
４及び10C）。しかしながら、これらのヒスチジン含有
配列異型は、HIV抗体を含まない血清との許容し得ない
高い反応性を与える（図10C）。カルボキシル末端によ
ってBSA又はその他の抗体蛋白質に結合した単一のペプ
チド又はペプチド組み合わせをEIA法の抗原として用い
た場合、感度又は陽性サンプルと陰性サンプルとの区別
に関して最適アッセイ性能を与える、発見ずみのエピト
ープの天然配列異型は見つかっていない（図10）。そこ
で、HIV抗体を含まない血清に対しては所望でない非特
異的反応性を示すことのない、HIV抗体のための高い免
疫反応性を保持する配列を決定するために、免疫優性HI
V−1gp41エピトープの50以上の非天然配列異型を合成し
た。本発明の重要な点は、HIV抗体には高度の免疫反応
性を保持し、HIV抗体のない正常なヒト血清とは不都合
に反応しない、図２−４、６、７、11に示されるHIV−
１及びHIV−２両方の非天然配列異型の発見である（図1
1）。これらの高度に免疫反応性の非天然配列異型は技
術的に開示されたペプチドとは著しく異なる。これらの
ペプチドのうち２つ、4S36と4S76、はそれらのカルボキ
シル末端によるBSAとの結合物として用いたとき、優れ
たアッセイ性能を与え、高レベルの感度及び特異性、非
常に高レベルの陽性及び陰性サンプル間の識別（図11
C）、そして２つの商業的に承認されたEIA試験で間違っ
た陽性反応を与えることが判明した血清サンプルに対し
ては非常に低い反応性（実施例８、表１）を示した。こ
の種のアッセイ性能−陽性は492nmの吸光度が1.25以下
でなく、陽性の最低と陰性の最高との間のA492値の間隔
は1.0吸光単位以上である−は、ペプチド−BSA結合物と
して用いられるここに記載の結合非天然ペプチドによっ
て可能となる。この種のアッセイ性能は最適であり、ベ
ルツ（Beltz）らの米国特許第4753873号に記載されてい
る組換えDNA法によってつくられる非常に大きいポリペ
プチド−それはここに記載の領域を含めたHIVのgp120及
びgp41の大部分を含む−の性能とよい対照となる。ベル
ツらの特許に記載されているA490単位における陽性及び
陰性サンプル間の間隔はたった0.1で、陽性サンプルの1
1％が1.2以下のA492値を有する。本発明の合成ペプチド
法は、ベルツらの特許の場合のように単一のHIV分離物
に依存するよりもむしろ、HIVエンベロープの臨界的免
疫優性領域に対する抗原性変異の全範囲をあらわすいく
つかの異なるペプチドを挿入することができる。また、
ペプチド合成によって、免疫優性領域のみが使用抗原に
含まれ、HIVenv遺伝子生成物のあり得る交差反応部分を
含むことによって導入される非特異性、又は組換えDNA
によって表現される蛋白質をつくるために用いる細菌性
宿主に由来する汚染蛋白質に起因する非特異性を避ける
ことができる。
本発明の免疫特異的試薬は、液体サンプル、例えば血
液又は血清サンプル中のHIV蛋白質に対する抗体を検出
する、又はHIV蛋白質抗原を検出するためのイムノアッ
セイに用いられる。その試薬は、熟練せる当業者には公
知の種々のアッセイフォーマット、例えばエライサ法
（ELISAアッセイ）、その他の酵素免疫測定法（EIAアッ
セイ）、ラジオイムノアッセイ（RIAアッセイ）、及び
免疫特異的結合パートナーを必要とするその他のアッセ
イフォーマットに広く用いられる。その試薬は好適には
HIV蛋白質に対する抗体の検出のためのアッセイに用い
られ、分析すべき液体サンプルを本発明の試薬と接触さ
せ、試薬に結合した抗体の存在又は量をサンプル中に存
在するHIV抗体の存在又は量のインディケーションとし
て測定する。好適には、試薬／抗体複合物をサンプル混
合物から分離し、形成された試薬／抗体コンプレックス
の検出のために検出可能の標識を用いる。分離は、試薬
を固相に固定するか、形成されたコンプレックスを反応
混合物から濾別するか、又は当業者には一般的なその他
の方法によって行われる。適切な固相としてはミクロタ
イタープレート、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、
ラテックスビーズ、微粒子、セルロースマトリックス、
ニトロセルロースマトリックス、シリカゲル、及びその
他類似の固相表面があるが、これに制限されるものでは
ない。当業者には公知のように、試薬／抗体コンプレッ
クスの検出に役立つ種々の標識が用いられる。例えば適
切な標識として酵素、放射性核種、発光部分、蛍光標
識、化学発光標識、磁性粒子及び直接目に見える例えば
コロイド金のような標識があるが、これに制限されるも
のではない。
液又は血清サンプル中のHIV蛋白質に対する抗体を検出
する、又はHIV蛋白質抗原を検出するためのイムノアッ
セイに用いられる。その試薬は、熟練せる当業者には公
知の種々のアッセイフォーマット、例えばエライサ法
（ELISAアッセイ）、その他の酵素免疫測定法（EIAアッ
セイ）、ラジオイムノアッセイ（RIAアッセイ）、及び
免疫特異的結合パートナーを必要とするその他のアッセ
イフォーマットに広く用いられる。その試薬は好適には
HIV蛋白質に対する抗体の検出のためのアッセイに用い
られ、分析すべき液体サンプルを本発明の試薬と接触さ
せ、試薬に結合した抗体の存在又は量をサンプル中に存
在するHIV抗体の存在又は量のインディケーションとし
て測定する。好適には、試薬／抗体複合物をサンプル混
合物から分離し、形成された試薬／抗体コンプレックス
の検出のために検出可能の標識を用いる。分離は、試薬
を固相に固定するか、形成されたコンプレックスを反応
混合物から濾別するか、又は当業者には一般的なその他
の方法によって行われる。適切な固相としてはミクロタ
イタープレート、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、
ラテックスビーズ、微粒子、セルロースマトリックス、
ニトロセルロースマトリックス、シリカゲル、及びその
他類似の固相表面があるが、これに制限されるものでは
ない。当業者には公知のように、試薬／抗体コンプレッ
クスの検出に役立つ種々の標識が用いられる。例えば適
切な標識として酵素、放射性核種、発光部分、蛍光標
識、化学発光標識、磁性粒子及び直接目に見える例えば
コロイド金のような標識があるが、これに制限されるも
のではない。
現在、HIV抗体の検出のために合衆国でUSFDAによって
承認されている試験法はEIA法である。これは高価な機
器を必要とし、完了までの時間が２ないし４時間かか
り、多数の血清を一度に試験するように設計されてい
る。多くの場合には、機器に頼らない、簡単なフォーマ
ットと目で見える終点をもち、少数のサンプルで行うこ
とができ、15分以内で終了する信頼できる試験法があれ
ば、HIV抗体の検出の改善が可能となる。よって、５個
より少ないサンプルと対照とを用い、目による試験を行
うように設計された方法及び簡単な装置による迅速試験
フォーマットがここに提供される。この装置を使用する
ための２種類のフォーマットは以下の実施例15及び16に
記載されている。各場合に本発明のペプチド／蛋白質結
合物を用いて、15分以内に終わる簡単な目による試験を
実施する。実施例に説明されるように、これらの目的の
ためには遊離のペプチドは無効であるか、比較的効果が
小さい、一方ペプチド/BSA結合物はよく機能する。概し
て、EIA試験で最もよい性能を与える同じペプチド／蛋
白質結合物も、簡単に実施できる目による迅速試験にお
いてすぐれた性能を発揮する。
承認されている試験法はEIA法である。これは高価な機
器を必要とし、完了までの時間が２ないし４時間かか
り、多数の血清を一度に試験するように設計されてい
る。多くの場合には、機器に頼らない、簡単なフォーマ
ットと目で見える終点をもち、少数のサンプルで行うこ
とができ、15分以内で終了する信頼できる試験法があれ
ば、HIV抗体の検出の改善が可能となる。よって、５個
より少ないサンプルと対照とを用い、目による試験を行
うように設計された方法及び簡単な装置による迅速試験
フォーマットがここに提供される。この装置を使用する
ための２種類のフォーマットは以下の実施例15及び16に
記載されている。各場合に本発明のペプチド／蛋白質結
合物を用いて、15分以内に終わる簡単な目による試験を
実施する。実施例に説明されるように、これらの目的の
ためには遊離のペプチドは無効であるか、比較的効果が
小さい、一方ペプチド/BSA結合物はよく機能する。概し
て、EIA試験で最もよい性能を与える同じペプチド／蛋
白質結合物も、簡単に実施できる目による迅速試験にお
いてすぐれた性能を発揮する。
上述の発見は、熟練せる当業者には明らかないくつか
の変更を含むものである。例えば、本発明は、Ｇ（グリ
シン）スペーサー及びＣ（システイン）Ｃ末端アミノ酸
を経てBSAに結合したとき、HIV抗体の検出のためにこれ
までに報告されたペプチドのどれよりもすぐれた天然及
び非天然両方のペプチドを明白にしている。しかしなが
ら、このようなペプチド／蛋白質結合物ですぐれたアッ
セイ性能が得られるという発見は、下記のような類似の
結合物にもあてはまるかも知れない:1）結合するＣ末端
アミノ酸が異なる、システインでなく例えばメチオニ
ン、チロシン、リジン、アルギニン、グルタミン酸又は
アスパラギン酸など;2）結合のために用いる蛋白質が異
なる、例えばウシ ガンマグロブリン、KLH,ポリ−Ｌ−
リジン、又はHIV抗体を含まない正常ヒト血清との結合
物のイムノアッセイ反応性には貢献しない分子量5000以
上のその他の純粋ポリペプチド又は蛋白質;3）ここに詳
細に示されるもの以外のリンカーを用いて、ペプチド上
のチオール、カルボキシル、又はその他の基と、結合の
ために用いるポリペプチド又は蛋白質上の類似の反応性
基との間に共有結合を形成せしめる;4）０−４グリシン
を用いて反応性ペプチドとＣ末端アミノ酸との間を架橋
する;5）ペプチドのＣ末端の１−３アミノ酸を変化させ
る。しかしながら、これらの変更のいくつかは、ここに
記載される好適ペプチド/BSA結合物に比較してアッセイ
性能が劣ることがわかった。例えば、本発明のペプチド
は、システイン及びそれらのＣ末端を介して蛋白質担体
に結合するとき高度に反応性である。この同じペプチド
は、アミノ基及びそのＮ末端を介して結合するときに
は、最適に免疫反応性であることは期待できない、なぜ
ならばこの結果、ペプチドの別の部分が抗体との相互作
用にさらされるからである。ペプチドの方向づけが重要
であるというこの原理を証明したのはドライベルグ（Dr
yberg）及びオルドストン（Oldstone）（J Esp Med 164
巻、1344−1349ページ、1986）であった。実際、最適免
疫反応性をもったペプチド4S36及び5S70（図２−４）が
それらのアミノ基を介して、カルボジイミドを用いてカ
ルボイシル化ラテックスに共有結合した場合、すべての
免疫反応性は失われる（実施例16参照）。
の変更を含むものである。例えば、本発明は、Ｇ（グリ
シン）スペーサー及びＣ（システイン）Ｃ末端アミノ酸
を経てBSAに結合したとき、HIV抗体の検出のためにこれ
までに報告されたペプチドのどれよりもすぐれた天然及
び非天然両方のペプチドを明白にしている。しかしなが
ら、このようなペプチド／蛋白質結合物ですぐれたアッ
セイ性能が得られるという発見は、下記のような類似の
結合物にもあてはまるかも知れない:1）結合するＣ末端
アミノ酸が異なる、システインでなく例えばメチオニ
ン、チロシン、リジン、アルギニン、グルタミン酸又は
アスパラギン酸など;2）結合のために用いる蛋白質が異
なる、例えばウシ ガンマグロブリン、KLH,ポリ−Ｌ−
リジン、又はHIV抗体を含まない正常ヒト血清との結合
物のイムノアッセイ反応性には貢献しない分子量5000以
上のその他の純粋ポリペプチド又は蛋白質;3）ここに詳
細に示されるもの以外のリンカーを用いて、ペプチド上
のチオール、カルボキシル、又はその他の基と、結合の
ために用いるポリペプチド又は蛋白質上の類似の反応性
基との間に共有結合を形成せしめる;4）０−４グリシン
を用いて反応性ペプチドとＣ末端アミノ酸との間を架橋
する;5）ペプチドのＣ末端の１−３アミノ酸を変化させ
る。しかしながら、これらの変更のいくつかは、ここに
記載される好適ペプチド/BSA結合物に比較してアッセイ
性能が劣ることがわかった。例えば、本発明のペプチド
は、システイン及びそれらのＣ末端を介して蛋白質担体
に結合するとき高度に反応性である。この同じペプチド
は、アミノ基及びそのＮ末端を介して結合するときに
は、最適に免疫反応性であることは期待できない、なぜ
ならばこの結果、ペプチドの別の部分が抗体との相互作
用にさらされるからである。ペプチドの方向づけが重要
であるというこの原理を証明したのはドライベルグ（Dr
yberg）及びオルドストン（Oldstone）（J Esp Med 164
巻、1344−1349ページ、1986）であった。実際、最適免
疫反応性をもったペプチド4S36及び5S70（図２−４）が
それらのアミノ基を介して、カルボジイミドを用いてカ
ルボイシル化ラテックスに共有結合した場合、すべての
免疫反応性は失われる（実施例16参照）。
下記の実施例は、本発明に定義された天然及び非天然
ペプチド／蛋白質結合物を用いる、HIV抗体検出用の数
種のアッセイ及び試薬の計画及びアッセイフォーマット
を説明する。これらは、EIA試験ではポリスチレン プ
ラスチック表面に結合した抗原としての結合物の使用、
迅速試験フォーマットに使用するためのコロイド金で標
識した抗原としての結合物、そして迅速EIAフォーマッ
トではラテックスに結合した抗原としての結合物の使用
を含める。しかしながら、熟練せる当業者にはその他の
応用も容易に理解でき、本発明の範囲はペプチド−蛋白
質結合物のこのような他の可能な同等の使用を含むこと
を意味する。例えば、用いられる固体表面はポリスチレ
ン表面又はラテックスビーズに限られることなく、ガラ
ス、ポリプロピレン、デキストラン、ナイロン、ニトロ
セルロース、ゼラチン、紙、シリカゲル、赤血球、リポ
ソームなどを含める。同様に、ペプチド／蛋白質結合物
と、ペプチド／ペプチドポリマーとは同様によく機能
し、またこのような結合物の標識化はコロイド金に限る
必要はない。ペプチド含有ポリマーを標識化する別の方
法は、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、抗体標識、リ
ポソーム標識、遊離基標識又はバクテリオファージ標識
を含める。診断試薬としての有用性に加えて、ここに記
載されるペプチド／蛋白質結合物は、免疫原として用い
られ、例えば動物を免疫して診断用ペプチドエピトーム
に対するポリクローナル抗体を高め、ハイブリドーマ
テクノロジーの準備にマウスに免疫反応をおこしてその
ペプチドに対するモノクローナル抗体をつくり、また霊
長類を免疫して、あらわれるペプチド内に含まれるHIV
蛋白質の重要ドメインに向けられる防御的免疫反応をひ
き起こすために利用される。記載されるHIVペプチド−
蛋白質結合物のこれらのおよびその他の利用は熟練せる
当業者には明らかである。
ペプチド／蛋白質結合物を用いる、HIV抗体検出用の数
種のアッセイ及び試薬の計画及びアッセイフォーマット
を説明する。これらは、EIA試験ではポリスチレン プ
ラスチック表面に結合した抗原としての結合物の使用、
迅速試験フォーマットに使用するためのコロイド金で標
識した抗原としての結合物、そして迅速EIAフォーマッ
トではラテックスに結合した抗原としての結合物の使用
を含める。しかしながら、熟練せる当業者にはその他の
応用も容易に理解でき、本発明の範囲はペプチド−蛋白
質結合物のこのような他の可能な同等の使用を含むこと
を意味する。例えば、用いられる固体表面はポリスチレ
ン表面又はラテックスビーズに限られることなく、ガラ
ス、ポリプロピレン、デキストラン、ナイロン、ニトロ
セルロース、ゼラチン、紙、シリカゲル、赤血球、リポ
ソームなどを含める。同様に、ペプチド／蛋白質結合物
と、ペプチド／ペプチドポリマーとは同様によく機能
し、またこのような結合物の標識化はコロイド金に限る
必要はない。ペプチド含有ポリマーを標識化する別の方
法は、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、抗体標識、リ
ポソーム標識、遊離基標識又はバクテリオファージ標識
を含める。診断試薬としての有用性に加えて、ここに記
載されるペプチド／蛋白質結合物は、免疫原として用い
られ、例えば動物を免疫して診断用ペプチドエピトーム
に対するポリクローナル抗体を高め、ハイブリドーマ
テクノロジーの準備にマウスに免疫反応をおこしてその
ペプチドに対するモノクローナル抗体をつくり、また霊
長類を免疫して、あらわれるペプチド内に含まれるHIV
蛋白質の重要ドメインに向けられる防御的免疫反応をひ
き起こすために利用される。記載されるHIVペプチド−
蛋白質結合物のこれらのおよびその他の利用は熟練せる
当業者には明らかである。
実施例 下記の実施例は、本発明の典型的な、現在好適な方法
および材料のいくつかを詳細に説明するためのものであ
る。これらの実施例は、本発明の概念を説明する目的で
提供されるものであり、添付のクレイムによって明らか
にされる発明の範囲を制限するものではない。ヒト血清
を使うイムノアッセイのすべてでは、血清サンプルはキ
ング カウンティ ヘルス デパートメント、シアト
ル、ワシントン、米国、から入手し、各血清は、商売上
の免許をもつゲネティック システムズ（Genetic Syst
ems）及び／又はデュポン（DuPont）EIA試験法で試験し
てHIV抗体陽性又は陰性と特徴づけた。アカゲザル（Mac
aca mulatta）の血清は、ワシントン大学、シアトル、
ワシントン、米国、から入手し、SIV全ウィルス溶解物E
IAによって、被験ペプチドエピトープの領域の配列がHI
V−２とほぼ同じであるSIVに対する抗体を含むか又は含
まないと特徴づけた。
および材料のいくつかを詳細に説明するためのものであ
る。これらの実施例は、本発明の概念を説明する目的で
提供されるものであり、添付のクレイムによって明らか
にされる発明の範囲を制限するものではない。ヒト血清
を使うイムノアッセイのすべてでは、血清サンプルはキ
ング カウンティ ヘルス デパートメント、シアト
ル、ワシントン、米国、から入手し、各血清は、商売上
の免許をもつゲネティック システムズ（Genetic Syst
ems）及び／又はデュポン（DuPont）EIA試験法で試験し
てHIV抗体陽性又は陰性と特徴づけた。アカゲザル（Mac
aca mulatta）の血清は、ワシントン大学、シアトル、
ワシントン、米国、から入手し、SIV全ウィルス溶解物E
IAによって、被験ペプチドエピトープの領域の配列がHI
V−２とほぼ同じであるSIVに対する抗体を含むか又は含
まないと特徴づけた。
実施例１ ペプチドの合成、樹脂のペプチドのHF分解、及びHPLC
によるペプチドの適切性の証明 普通は、同時マルチペプチド合成（SMPS）として知ら
れ、米国特許第4631211号に開示されているメリフィー
ルド固相ペプチド合成法の変法を用いて、72−96のペプ
チドを一度に合成した。この実施例では、96の個々のペ
プチドをペプチドアミドとして下記のように合成した：
約0.6meq/gm樹脂の置換レベルをもつ４−メチルベンゾ
ヒドリルアミン樹脂（コロラド バイオテクノロジー協
会、ブルダー、コロラド 米国;PAM又は標準メリフィー
ルド樹脂を含むその他の樹脂を用いることもできる）10
0mgを、樹脂を十分保持できる、あらかじめ秤量した20
×25mm、74ミクロンメッシュサイズのポリプロピレン製
バッグ96個の各々に秤取した。各バッグをその後インパ
ルス ヒートシーター［アクシール社（Accu Seal Corp
oration）サンジェゴ、カリフォルニア、米国］で封止
し、墨で書いた数字のラベルもバッグにヒートシール
し、合成操作中を通じて各“Ｔバッグ”が識別できるよ
うにした。用意した包みを塩化メチレン中で振とうする
ことにより徹底的に洗い、細かい樹脂を除去し、正しく
封止されていないバッグを見つけた、そして秤量して残
留樹脂重量と各バッグの合成のための最初の重量を確認
した。合成に用いるアミノ酸はオムニ バイオケミカル
（Omni Biochemical）（サンジェゴ、カリフォルニア、
米国）から入手した［他のソースのアミノ酸、例えばア
プライド バイオシステム社（Applied Biosystems In
c）、フォスターシティー、カリフォルニア、米国、ペ
ニンスラ ラボラトリース（Peninsula Laborarories）
ベルモント、カルフォルニア、米国、及びバチェム（Ba
chem），トレンス、カリフォルニア、米国、のアミノ酸
も使うことができる］、そしてＮ−アルファーアミノを
tertブチルオキシカルボニル（ｔ−Boc）基で保護し
た。このようなアミノ酸はその他に側鎖保護基を含んで
いた、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、セリン及
びスレオニンのためにはベンジル；システインのために
はｐ−メチルベンジル；ヒスチジンのためにはジニトロ
フェニル；リジンのためにはオルト−クロロ−ベンジル
オキシカルボニル、；アルギニンのためにはトシル；チ
ロシンのためにはオルト−ブロモ−ベンジルオキシカル
ボニルなど。ｔ−Bocで保護されたアミノ酸アラニン、
フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、イソロ
イシン、ロイシン、アスパラギン、グルタミン、プロリ
ン、及びバリンは、側鎖を保護せずに用いられた。
によるペプチドの適切性の証明 普通は、同時マルチペプチド合成（SMPS）として知ら
れ、米国特許第4631211号に開示されているメリフィー
ルド固相ペプチド合成法の変法を用いて、72−96のペプ
チドを一度に合成した。この実施例では、96の個々のペ
プチドをペプチドアミドとして下記のように合成した：
約0.6meq/gm樹脂の置換レベルをもつ４−メチルベンゾ
ヒドリルアミン樹脂（コロラド バイオテクノロジー協
会、ブルダー、コロラド 米国;PAM又は標準メリフィー
ルド樹脂を含むその他の樹脂を用いることもできる）10
0mgを、樹脂を十分保持できる、あらかじめ秤量した20
×25mm、74ミクロンメッシュサイズのポリプロピレン製
バッグ96個の各々に秤取した。各バッグをその後インパ
ルス ヒートシーター［アクシール社（Accu Seal Corp
oration）サンジェゴ、カリフォルニア、米国］で封止
し、墨で書いた数字のラベルもバッグにヒートシール
し、合成操作中を通じて各“Ｔバッグ”が識別できるよ
うにした。用意した包みを塩化メチレン中で振とうする
ことにより徹底的に洗い、細かい樹脂を除去し、正しく
封止されていないバッグを見つけた、そして秤量して残
留樹脂重量と各バッグの合成のための最初の重量を確認
した。合成に用いるアミノ酸はオムニ バイオケミカル
（Omni Biochemical）（サンジェゴ、カリフォルニア、
米国）から入手した［他のソースのアミノ酸、例えばア
プライド バイオシステム社（Applied Biosystems In
c）、フォスターシティー、カリフォルニア、米国、ペ
ニンスラ ラボラトリース（Peninsula Laborarories）
ベルモント、カルフォルニア、米国、及びバチェム（Ba
chem），トレンス、カリフォルニア、米国、のアミノ酸
も使うことができる］、そしてＮ−アルファーアミノを
tertブチルオキシカルボニル（ｔ−Boc）基で保護し
た。このようなアミノ酸はその他に側鎖保護基を含んで
いた、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、セリン及
びスレオニンのためにはベンジル；システインのために
はｐ−メチルベンジル；ヒスチジンのためにはジニトロ
フェニル；リジンのためにはオルト−クロロ−ベンジル
オキシカルボニル、；アルギニンのためにはトシル；チ
ロシンのためにはオルト−ブロモ−ベンジルオキシカル
ボニルなど。ｔ−Bocで保護されたアミノ酸アラニン、
フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、イソロ
イシン、ロイシン、アスパラギン、グルタミン、プロリ
ン、及びバリンは、側鎖を保護せずに用いられた。
SMPS合成の各段階において、溶媒及び反応体と、樹脂
及び成長するペプチド鎖との接触を完全にするために、
機械的振とう機上で烈しく撹拌し、前の段階からの溶媒
のすべては、その次の段階のための溶媒を添加する前に
除去された。樹脂を含むパックを塩化メチレン中で１分
間洗い、それから５％ジイソプロピルエチルアミン（DI
EA）−塩化メチレン溶液で２分間づつ３回、それから塩
化メチレン中で１分間づつ２回洗った。樹脂のパックを
分類し、カルボキシル末端アミノ酸として所望の、個々
のアミノ酸のために適した容器に入れた。96のこの群の
すべてのペプチドはＣ末端システイン、その次にグリシ
ンスペーサーを含んでいたから、これらパックのすべて
は、最初の２アミノ酸については一緒に処理された。ア
ミノ酸を塩化メチレンか、90％塩化メチレン＋10％ジメ
チルフォルムアミド（DMF）に、0.2M濃度に溶解し、樹
脂の８倍モル過剰の容量をもつ適当な反応びんに入れ
た。各アミノ酸溶液を使用直前に、0.2Mジイソプロピル
カルボジイミド−塩化メチレン溶液から成る活性化溶液
2ml/樹脂パックによって活性化した。適したアミノ酸の
各樹脂パックへの添加は振とう機上で１時間かけて行わ
れた。そしてその後30秒間DMFで洗い、ジイソプロピル
尿素及び残っているすべてのアミノ酸を除去し、さらに
30秒間塩化メチレンで洗った。樹脂パックのすべてを最
初の大きい反応びんに合一し、塩化メチレンで１分間づ
つ２回洗った。各樹脂に結合したアミノ酸をその後脱保
護し、55％三フッ化酢酸（TFA）、45％塩化メチレンで3
0分処理することによってＮ−アルファ−ｔ−Boc基を除
去し、塩化メチレンで１分間、イソプロパノールで１分
間づつ２回洗って樹脂を収縮させ、残っているTFAを全
部除去し、塩化メチレンで１分間づつ２回洗った。アル
ファ−アミノ塩を、氷冷した５％DIEA−CH2Cl2×３で中
和し、それから塩化メチレンで２回洗った。保護アミノ
酸の結合、洗浄、脱保護などは、すべての所望アミノ酸
がペプチド鎖に付加するまで繰り返された。この時点で
Ｎ−アルファ−ｔ−Boc基は、55％TFA/45％CH2Cl2で30
分間処理することによって各ペプチドから除去され、そ
の後CH2Cl2で１分間洗い、イソプロパノールで１分間づ
つ２回、CH2Cl2で１分間づつ２回洗い、凍結乾燥した。
完全に乾燥した樹脂パックを秤量し、重量増加を理論値
と比較することによって結合完了を予想した。ヒスチジ
ンを含むペプチドはさらに0.5Mチオフェノールで処理す
ることによってジニトロフェニル側鎖保護基を除去し
た。チオフェノールの個々の量を３回、各々１時間かけ
て加え、その後DMFで10回洗い、イソプロパノールか塩
化メチレンのどちらかで10回洗った。そのチオフェノー
ル処理樹脂を凍結乾燥機で完全に乾燥させた。HF分解、
抽出及び凍結乾燥後にHPLCによって検査したときに高純
度を示さなかったペプチドでは、再合成を行い、ピクリ
ン酸で結合完了をモニターした。結合段階後、樹脂パッ
クを0.05Mピクリン酸−塩化メチレン溶液で処理した。
目で黄色が認められれば定性的に結合完了とし、そのピ
クリン酸を５％DIEA−塩化メチレン溶液で溶出し、358n
mで測定することによって定量した。この方法は樹脂上
の未反応のアミンをたった0.5％に至るまで検出した。
及び成長するペプチド鎖との接触を完全にするために、
機械的振とう機上で烈しく撹拌し、前の段階からの溶媒
のすべては、その次の段階のための溶媒を添加する前に
除去された。樹脂を含むパックを塩化メチレン中で１分
間洗い、それから５％ジイソプロピルエチルアミン（DI
EA）−塩化メチレン溶液で２分間づつ３回、それから塩
化メチレン中で１分間づつ２回洗った。樹脂のパックを
分類し、カルボキシル末端アミノ酸として所望の、個々
のアミノ酸のために適した容器に入れた。96のこの群の
すべてのペプチドはＣ末端システイン、その次にグリシ
ンスペーサーを含んでいたから、これらパックのすべて
は、最初の２アミノ酸については一緒に処理された。ア
ミノ酸を塩化メチレンか、90％塩化メチレン＋10％ジメ
チルフォルムアミド（DMF）に、0.2M濃度に溶解し、樹
脂の８倍モル過剰の容量をもつ適当な反応びんに入れ
た。各アミノ酸溶液を使用直前に、0.2Mジイソプロピル
カルボジイミド−塩化メチレン溶液から成る活性化溶液
2ml/樹脂パックによって活性化した。適したアミノ酸の
各樹脂パックへの添加は振とう機上で１時間かけて行わ
れた。そしてその後30秒間DMFで洗い、ジイソプロピル
尿素及び残っているすべてのアミノ酸を除去し、さらに
30秒間塩化メチレンで洗った。樹脂パックのすべてを最
初の大きい反応びんに合一し、塩化メチレンで１分間づ
つ２回洗った。各樹脂に結合したアミノ酸をその後脱保
護し、55％三フッ化酢酸（TFA）、45％塩化メチレンで3
0分処理することによってＮ−アルファ−ｔ−Boc基を除
去し、塩化メチレンで１分間、イソプロパノールで１分
間づつ２回洗って樹脂を収縮させ、残っているTFAを全
部除去し、塩化メチレンで１分間づつ２回洗った。アル
ファ−アミノ塩を、氷冷した５％DIEA−CH2Cl2×３で中
和し、それから塩化メチレンで２回洗った。保護アミノ
酸の結合、洗浄、脱保護などは、すべての所望アミノ酸
がペプチド鎖に付加するまで繰り返された。この時点で
Ｎ−アルファ−ｔ−Boc基は、55％TFA/45％CH2Cl2で30
分間処理することによって各ペプチドから除去され、そ
の後CH2Cl2で１分間洗い、イソプロパノールで１分間づ
つ２回、CH2Cl2で１分間づつ２回洗い、凍結乾燥した。
完全に乾燥した樹脂パックを秤量し、重量増加を理論値
と比較することによって結合完了を予想した。ヒスチジ
ンを含むペプチドはさらに0.5Mチオフェノールで処理す
ることによってジニトロフェニル側鎖保護基を除去し
た。チオフェノールの個々の量を３回、各々１時間かけ
て加え、その後DMFで10回洗い、イソプロパノールか塩
化メチレンのどちらかで10回洗った。そのチオフェノー
ル処理樹脂を凍結乾燥機で完全に乾燥させた。HF分解、
抽出及び凍結乾燥後にHPLCによって検査したときに高純
度を示さなかったペプチドでは、再合成を行い、ピクリ
ン酸で結合完了をモニターした。結合段階後、樹脂パッ
クを0.05Mピクリン酸−塩化メチレン溶液で処理した。
目で黄色が認められれば定性的に結合完了とし、そのピ
クリン酸を５％DIEA−塩化メチレン溶液で溶出し、358n
mで測定することによって定量した。この方法は樹脂上
の未反応のアミンをたった0.5％に至るまで検出した。
24の個々のペプチドを同時処理することのできるHF分
解装置（マルチプルペプチド システムズ、ラジョラ、
カリフォルニア、米国）中で、それらペプチドをその樹
脂から分離し、同時に側鎖保護基を除去した。標準高HF
法を用いた（90％ v/v無水フッ化水素（HF）、10％ v
/v アニソール、０℃、60分）。分解後、N2気流と真空
との組み合わせによってHFを除去した。樹脂パックをエ
ーテルで３回洗ってカルボニウムイオン掃去剤を除去し
た。その後15％酢酸でそれから45％酢酸で抽出した。15
％酢酸で抽出したペプチドの１部を凍結してHPLCによる
分析に用い、残りの抽出液は一緒にして凍結乾燥した。
凍結乾燥ペプチドは逆相クロマトグラフィーによって分
析した、この場合、シンクロパック（Synchropak）Ｃ−
４カラム［スペルコ（Supelco）、ベレフォンテ、ペン
シルバニア、米国］を用い、０−30％アセトニトリルの
直線勾配で0.33％/minの流速で、及び0.1％三フッ化酢
酸で1ml/minの流速で溶出した。ベックマンHPLC421型
（ベックマン インスツルメント、パロアルト、カリフ
ォルニア、米国）及びヒューレット パッカード社製ダ
イオード−アレー ディテクター1040A型（ヒューレッ
ト パッカード、パロアルト、カリフォルニア、米国）
を用いた。許容し得る純度をもつと思われるペプチドは
クロマトグラムの≧90％を構成する単一のピークを示し
た。これらのペプチドを選択し、HIV抗体を検出するイ
ムノアッセイに用いる抗原としてさらに評価した。上述
の操作を繰り返し、図１−８に示される合成ペプチドの
各々を合成した。
解装置（マルチプルペプチド システムズ、ラジョラ、
カリフォルニア、米国）中で、それらペプチドをその樹
脂から分離し、同時に側鎖保護基を除去した。標準高HF
法を用いた（90％ v/v無水フッ化水素（HF）、10％ v
/v アニソール、０℃、60分）。分解後、N2気流と真空
との組み合わせによってHFを除去した。樹脂パックをエ
ーテルで３回洗ってカルボニウムイオン掃去剤を除去し
た。その後15％酢酸でそれから45％酢酸で抽出した。15
％酢酸で抽出したペプチドの１部を凍結してHPLCによる
分析に用い、残りの抽出液は一緒にして凍結乾燥した。
凍結乾燥ペプチドは逆相クロマトグラフィーによって分
析した、この場合、シンクロパック（Synchropak）Ｃ−
４カラム［スペルコ（Supelco）、ベレフォンテ、ペン
シルバニア、米国］を用い、０−30％アセトニトリルの
直線勾配で0.33％/minの流速で、及び0.1％三フッ化酢
酸で1ml/minの流速で溶出した。ベックマンHPLC421型
（ベックマン インスツルメント、パロアルト、カリフ
ォルニア、米国）及びヒューレット パッカード社製ダ
イオード−アレー ディテクター1040A型（ヒューレッ
ト パッカード、パロアルト、カリフォルニア、米国）
を用いた。許容し得る純度をもつと思われるペプチドは
クロマトグラムの≧90％を構成する単一のピークを示し
た。これらのペプチドを選択し、HIV抗体を検出するイ
ムノアッセイに用いる抗原としてさらに評価した。上述
の操作を繰り返し、図１−８に示される合成ペプチドの
各々を合成した。
実施例２ 合成ペプチドとKLH又はBSAとの化学的結合 図１−８の合成ペプチドを、ペプチドの溶解度に応じ
て10mMボレート又はその他の緩衝液中で、４℃、pH8
で、ゆるやかに撹拌しながら、10mM DTT、又は固定DTT
（レダクタクリル、カルビオヘム、サンジエゴ、カリフ
ォルニア、米国）で一晩還元した。KLHは10mM燐酸緩衝
液−pH7.2−中に10−30mg/ml濃度に溶解し、BSAは20−8
0mg/mlの濃度に溶解して、ヘテロ二官能性リンカーMBS
（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル）、SPDP［Ｎ−スクシンイミジル−３−
（２ピリジルジチオ）プロピオネート］、又はスルフォ
ーSMCC［スルフォースクシンイミジル ４（Ｎ−マレイ
ミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト］で処理した。ヘテロ二官能性リンカーを蛋白質溶液
に、BSA100に対して又はKLH1000に対してモル過剰に加
えた。MBSはDMFに10mg/ml濃度で、SPDPは無水アルコー
ルに10mg/ml濃度で溶解し、これらの各々を蛋白質溶液
に滴下し、混合した。一方スルフォーSMCC乾燥粉末は蛋
白質溶液に溶解した。各々の蛋白質−リンカー混合物を
室温で15分ないし１時間反応させ、それからセファデッ
クスG25を用いるゲル クロマトグラフィーによって、
遊離リンカーをBSA−リンカー又はKLH−リンカーから分
離させた;KLH−MBSでは50mM燐酸塩、pH6を用い、BSA−S
PDPでは10mM酢酸塩、100mMNaCl、pH4.6を用い、BSA SM
CCでは100mM 燐酸塩、1mM EDTA,pH6.5を用いた。可溶
性DTTを用いた場合は、セファデックスG10カラムクロマ
トグラフィーによって還元ペプチドをDTTから分離し、
レダクタクリルを用いた場合は遠心分離してから0.22ミ
クロンフィルターを通して濾過した。還元ペプチドとリ
ンカー処理KLH又はBSAとを、100−1000ペプチド/KLH−M
BS、１−50ペプチド/BSA−SMCC、及び0.1−10ペプチド/
BSA−SPDPのモル比で合一した。各還元ペプチドを撹拌
しながらリンカー処理蛋白質に加え、N2で覆い、それか
ら１時間室温でおだやかに撹拌し、一晩４℃で静置し
た。SMCC−BSA結合物をさらに、最終濃度1mMのメルカプ
トエチルアミンで４時間処理し、それから４℃で100容
量の緩衝液（20mM燐酸塩、1mMEDTA,0.05％アジ化ナトリ
ウム、pH6.5）に対して一晩透析した。その他のすべて
の結合物はアジ化ナトリウムの最終濃度0.05％に調節さ
れた。結合物のペプチド／蛋白質の最適モル比は溶解度
及び抗原性（EIAによって評価した）によって決定し
た。例えば最もよい比は、約1:1（SPDP−BSA）、10:1
（SMCC−BSA）、及び100:1（MBS−KLH）であることがわ
かった。
て10mMボレート又はその他の緩衝液中で、４℃、pH8
で、ゆるやかに撹拌しながら、10mM DTT、又は固定DTT
（レダクタクリル、カルビオヘム、サンジエゴ、カリフ
ォルニア、米国）で一晩還元した。KLHは10mM燐酸緩衝
液−pH7.2−中に10−30mg/ml濃度に溶解し、BSAは20−8
0mg/mlの濃度に溶解して、ヘテロ二官能性リンカーMBS
（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル）、SPDP［Ｎ−スクシンイミジル−３−
（２ピリジルジチオ）プロピオネート］、又はスルフォ
ーSMCC［スルフォースクシンイミジル ４（Ｎ−マレイ
ミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト］で処理した。ヘテロ二官能性リンカーを蛋白質溶液
に、BSA100に対して又はKLH1000に対してモル過剰に加
えた。MBSはDMFに10mg/ml濃度で、SPDPは無水アルコー
ルに10mg/ml濃度で溶解し、これらの各々を蛋白質溶液
に滴下し、混合した。一方スルフォーSMCC乾燥粉末は蛋
白質溶液に溶解した。各々の蛋白質−リンカー混合物を
室温で15分ないし１時間反応させ、それからセファデッ
クスG25を用いるゲル クロマトグラフィーによって、
遊離リンカーをBSA−リンカー又はKLH−リンカーから分
離させた;KLH−MBSでは50mM燐酸塩、pH6を用い、BSA−S
PDPでは10mM酢酸塩、100mMNaCl、pH4.6を用い、BSA SM
CCでは100mM 燐酸塩、1mM EDTA,pH6.5を用いた。可溶
性DTTを用いた場合は、セファデックスG10カラムクロマ
トグラフィーによって還元ペプチドをDTTから分離し、
レダクタクリルを用いた場合は遠心分離してから0.22ミ
クロンフィルターを通して濾過した。還元ペプチドとリ
ンカー処理KLH又はBSAとを、100−1000ペプチド/KLH−M
BS、１−50ペプチド/BSA−SMCC、及び0.1−10ペプチド/
BSA−SPDPのモル比で合一した。各還元ペプチドを撹拌
しながらリンカー処理蛋白質に加え、N2で覆い、それか
ら１時間室温でおだやかに撹拌し、一晩４℃で静置し
た。SMCC−BSA結合物をさらに、最終濃度1mMのメルカプ
トエチルアミンで４時間処理し、それから４℃で100容
量の緩衝液（20mM燐酸塩、1mMEDTA,0.05％アジ化ナトリ
ウム、pH6.5）に対して一晩透析した。その他のすべて
の結合物はアジ化ナトリウムの最終濃度0.05％に調節さ
れた。結合物のペプチド／蛋白質の最適モル比は溶解度
及び抗原性（EIAによって評価した）によって決定し
た。例えば最もよい比は、約1:1（SPDP−BSA）、10:1
（SMCC−BSA）、及び100:1（MBS−KLH）であることがわ
かった。
実施例３ 遊離ペプチド又はペプチド−蛋白質結合物の免疫反応性
を評価するイムノアッセイ 最初に図１−13の遊離ペプチド又はペプチド−蛋白質
結合物を免疫反応性によってスクリーニングした、その
ためにはポリスチレン ミクロタイターEIAプレート
（コスター、ケンブリッジ、マッセチュセッツ、米国）
の各ウェルに、トリス緩衝液、10mM、pH8、中の５−50
マイクログラム/ml濃度のペプチドを0.2ml量コーティン
グし、４℃で一晩置いた。EIAによって免疫反応性を示
すペプチド又はペプチド−蛋白質結合物をさらに希釈し
て、コーティングし、HIV抗体で最大の免疫反応性を示
し、正常血清で最小の非特異的反応性を示すことができ
る最低濃度を定めた。EIA試験は下記のように行った：
コーティング溶液を各ウェルから除去し、ウェルを50mM
燐酸塩、100mM NaCl、0.05％トゥウィーン20、pH7.4
（PBST）で、37℃で30分間ふさいだ。それからウェルを
ミクロタイタープレート ウオッシャーで吸引して乾燥
させ、50mM燐酸塩、100mMNaCl、0.05％トゥウイーン2
0、pH7.4（PBST）の溶液で３回洗った。試験すべき霊長
類血清の1:101希釈液（１％BSA,1％NRSを含むPBSTで）
を0.2mlとして、洗浄した各ウェルに加え、そのプレー
トを37℃で30分間インキュベートした。その後プレート
をPBSTで３回洗い、ヒトIgG,IgA,及びIgMを識別するヤ
ギ抗ヒト（GAH）過酸化酵素結合物（オルガノン テク
ニカ、キャッペル、メルバーン、ペンシルバニア、米
国）の1:2000希釈液を0.2ml量各ウェル加え、プレート
を37℃で30分間インキュベートした。プレートをPBSTで
３回洗い、0.1Mクエン酸pH5.2、0.1mg/ml ｏ−フェニ
レンジアミン、0.01％H2O2から成る基質0.2ml/ウェルと
共に室温で、暗所で10分間インキュベートした。4N H2
SO4 50マイクロリッターで反応をとめ、発現した色を
マルチスキャン プレートリーダーでA492で測定した。
各実験系列にはポジティブ−及びネガティブ対照が含ま
れ、全テストは二重又は四重に行われた。大部分のペプ
チド及びペプチド結合物は最初はHIV陽性又はHIV陰性血
清のプールの1:101希釈にたいしてスクリーニングさ
れ、同じ血清プールを用いて種々の遊離ペプチド又はペ
プチド−蛋白質結合物の免疫反応性を定量的に比較する
ことができた。上の条件は最適試験性能を与えることが
わかった、そして以下のEIA実施例に用いられた。
を評価するイムノアッセイ 最初に図１−13の遊離ペプチド又はペプチド−蛋白質
結合物を免疫反応性によってスクリーニングした、その
ためにはポリスチレン ミクロタイターEIAプレート
（コスター、ケンブリッジ、マッセチュセッツ、米国）
の各ウェルに、トリス緩衝液、10mM、pH8、中の５−50
マイクログラム/ml濃度のペプチドを0.2ml量コーティン
グし、４℃で一晩置いた。EIAによって免疫反応性を示
すペプチド又はペプチド−蛋白質結合物をさらに希釈し
て、コーティングし、HIV抗体で最大の免疫反応性を示
し、正常血清で最小の非特異的反応性を示すことができ
る最低濃度を定めた。EIA試験は下記のように行った：
コーティング溶液を各ウェルから除去し、ウェルを50mM
燐酸塩、100mM NaCl、0.05％トゥウィーン20、pH7.4
（PBST）で、37℃で30分間ふさいだ。それからウェルを
ミクロタイタープレート ウオッシャーで吸引して乾燥
させ、50mM燐酸塩、100mMNaCl、0.05％トゥウイーン2
0、pH7.4（PBST）の溶液で３回洗った。試験すべき霊長
類血清の1:101希釈液（１％BSA,1％NRSを含むPBSTで）
を0.2mlとして、洗浄した各ウェルに加え、そのプレー
トを37℃で30分間インキュベートした。その後プレート
をPBSTで３回洗い、ヒトIgG,IgA,及びIgMを識別するヤ
ギ抗ヒト（GAH）過酸化酵素結合物（オルガノン テク
ニカ、キャッペル、メルバーン、ペンシルバニア、米
国）の1:2000希釈液を0.2ml量各ウェル加え、プレート
を37℃で30分間インキュベートした。プレートをPBSTで
３回洗い、0.1Mクエン酸pH5.2、0.1mg/ml ｏ−フェニ
レンジアミン、0.01％H2O2から成る基質0.2ml/ウェルと
共に室温で、暗所で10分間インキュベートした。4N H2
SO4 50マイクロリッターで反応をとめ、発現した色を
マルチスキャン プレートリーダーでA492で測定した。
各実験系列にはポジティブ−及びネガティブ対照が含ま
れ、全テストは二重又は四重に行われた。大部分のペプ
チド及びペプチド結合物は最初はHIV陽性又はHIV陰性血
清のプールの1:101希釈にたいしてスクリーニングさ
れ、同じ血清プールを用いて種々の遊離ペプチド又はペ
プチド−蛋白質結合物の免疫反応性を定量的に比較する
ことができた。上の条件は最適試験性能を与えることが
わかった、そして以下のEIA実施例に用いられた。
実施例４ HIV−１及びHIV−２の天然配列ペプチドの免疫反応性の
比較 図１及び５のペプチドを実施例１に記載したように合
成し、実施例２に記載したようにKLH又はBSAに結合させ
た。これらのペプチド−蛋白質結合物は全部10マイクロ
グラム ペプチド/mlの濃度でポリスチレンミクロタイ
ター プレートにコーティングされ、実施例３に記載し
たように、HIV−１抗体（図１）又はHIV1抗体（図５）
を含む血清プール（それぞれHIV＋/SIV＋）、並びにHIV
−１抗体又はHIV−２抗体を含まないプール血清（それ
ぞれHIV−/SIV−）の1:101希釈液を用いて免疫反応性を
評価した。ペプチド2S04,4S25,3S36,2S06,2S07,2S09,2S
11、3S51、2S13,3S55、2S15のBSA−SMCC結合物（図１）
ではHIV抗体に対して顕著な免疫反応性が認められ、配
列IWGCSGKLICTTAVPGCをもつペプチド2S09の結合物では
わずかによりすぐれた免疫反応性が認められた。HIV−
２感染患者からの血清は米国では比較的手に入らないか
ら、HIV−２合成ペプチドの免疫反応性は、ワシントン
大学霊長類センター、ワシントン、米国、から入手した
SIV感染マカークザルの血清を用いて評価した。SIVのAA
配列は合成したペプチド領域においてHIV−２のそれと
ほぼ同じである（参照、マイヤーズら、ヒト レトロウ
ィルスとAIDS、1988。“核酸及びアミノ酸配列の編集”
ロスアラモス国立研究所、ロスアラモス、ニューメキシ
コ、87545、米国）。ペプチド2S23、2S24、2S25、2S2
7、及び2S28のBSA−SMCC結合物では、SIV/HIV−２抗体
で顕著な免疫反応性が認められた、最高の免疫反応性が
認められたのは、図５に示されるように2S24（配列 DQ
ARLNSWGCAFRQVCをもつ）、2S25（配列 ARLNSWGCAFRQVC
HGCをもつ）及び2S27（配列 SWGCAFRQCHTTVPGCをも
つ）であった。概して、KLH結合物よりもBSAで、よりよ
い免疫反応性が認められた。
比較 図１及び５のペプチドを実施例１に記載したように合
成し、実施例２に記載したようにKLH又はBSAに結合させ
た。これらのペプチド−蛋白質結合物は全部10マイクロ
グラム ペプチド/mlの濃度でポリスチレンミクロタイ
ター プレートにコーティングされ、実施例３に記載し
たように、HIV−１抗体（図１）又はHIV1抗体（図５）
を含む血清プール（それぞれHIV＋/SIV＋）、並びにHIV
−１抗体又はHIV−２抗体を含まないプール血清（それ
ぞれHIV−/SIV−）の1:101希釈液を用いて免疫反応性を
評価した。ペプチド2S04,4S25,3S36,2S06,2S07,2S09,2S
11、3S51、2S13,3S55、2S15のBSA−SMCC結合物（図１）
ではHIV抗体に対して顕著な免疫反応性が認められ、配
列IWGCSGKLICTTAVPGCをもつペプチド2S09の結合物では
わずかによりすぐれた免疫反応性が認められた。HIV−
２感染患者からの血清は米国では比較的手に入らないか
ら、HIV−２合成ペプチドの免疫反応性は、ワシントン
大学霊長類センター、ワシントン、米国、から入手した
SIV感染マカークザルの血清を用いて評価した。SIVのAA
配列は合成したペプチド領域においてHIV−２のそれと
ほぼ同じである（参照、マイヤーズら、ヒト レトロウ
ィルスとAIDS、1988。“核酸及びアミノ酸配列の編集”
ロスアラモス国立研究所、ロスアラモス、ニューメキシ
コ、87545、米国）。ペプチド2S23、2S24、2S25、2S2
7、及び2S28のBSA−SMCC結合物では、SIV/HIV−２抗体
で顕著な免疫反応性が認められた、最高の免疫反応性が
認められたのは、図５に示されるように2S24（配列 DQ
ARLNSWGCAFRQVCをもつ）、2S25（配列 ARLNSWGCAFRQVC
HGCをもつ）及び2S27（配列 SWGCAFRQCHTTVPGCをも
つ）であった。概して、KLH結合物よりもBSAで、よりよ
い免疫反応性が認められた。
実施例５ A.ペプチド2S06及び2S09のKLH−MBS結合物の免疫反応性
の評価 図10Aは、ヘテロ二官能性リンカーMBSを用いてＣ末端
GCスペーサーを介してKLHに結合したときの合成天然ペ
プチド2S06及び2S09（図１）の免疫反応性を示す。血清
サンプルを提供してくれたシアトル キング カウンテ
ィ保健部がゲネティック システムズ EIA法によって
評価した場合、血清標本の42がHIV−１抗体を含み、52
が含んでいなかった。陽性サンプルすべてを陰性サンプ
ルと区別した。しかしながら陽性サンプルの多くの免疫
反応性は低く（A492は1.0以下）、陰性サンプルの若干
は0.20より少し高いA492値を有し、その結果陽性と陰性
との識別はよくなかった。この不十分な識別のため、改
良された担体蛋白質及び／又はリンカーを探すことにな
った。
の評価 図10Aは、ヘテロ二官能性リンカーMBSを用いてＣ末端
GCスペーサーを介してKLHに結合したときの合成天然ペ
プチド2S06及び2S09（図１）の免疫反応性を示す。血清
サンプルを提供してくれたシアトル キング カウンテ
ィ保健部がゲネティック システムズ EIA法によって
評価した場合、血清標本の42がHIV−１抗体を含み、52
が含んでいなかった。陽性サンプルすべてを陰性サンプ
ルと区別した。しかしながら陽性サンプルの多くの免疫
反応性は低く（A492は1.0以下）、陰性サンプルの若干
は0.20より少し高いA492値を有し、その結果陽性と陰性
との識別はよくなかった。この不十分な識別のため、改
良された担体蛋白質及び／又はリンカーを探すことにな
った。
B.ペプチド2S09及び5S67のBSA結合物の免疫反応性の評
価 図10Bは、ヘテロ二官能性リンカーSMCCを用いて、Ｃ
末端を介してBSAに結合した場合の、合成提供ペプチドI
WGCSGKLICTTAVPGC（2S09）の反応性を示す。サンプルを
提供したシアトル キング カウンティ保健部がゲネテ
ィック システムズ EIA法によって評価した全部で184
のヒト血清のうち98がHIV−１抗体を含み、86が含んで
いなかった。陰性サンプルは低いA492値を示し、大部分
の陽性サンプルはより高いA492値を示したという点で、
図5Aに比較してアッセイ性能の改良が認められる。これ
は、SMCCリンカーを用いたペプチド−BSA結合物がリン
カーとしてMBSを用いたペプチド−KLH結合物よりすぐれ
たEIA試験性能を与えることを示している。しかしなが
ら、いくつかの陽性サンプルはこの結合物では非常に低
い−これらの陰性サンプルから確実に区別するにはあま
りに低い−免疫反応性をもっていた。低い反応性の若干
は、ザイールからのHIV分離物で報告されたように（グ
ナンら、サイエンス 237巻、1346−1349ページ、198
7）このエピトーム領域における遺伝的異型の抗原的差
異によるかも知れないので、天然配列異型プチド5S67
（図３）を合成し、SMCCによってBSAに化学的に結合せ
しめ、同じ血清に対して、それに加えてもう一つの陰性
血清サンプル（図10C）に対して試験した。天然2S09−B
SA結合物で低い免疫反応性を示した患者血清の多くは、
5S67−BSAではより高い反応性を与えた。しかしながら
ペプチド5SはHIV−１抗体を含まない血清と許容し得な
い高い反応性を示した（図10C）。このため、HIV−１抗
体を含む大部分の血清との高い免疫反応性を保持し、HI
V抗体のない血清とは低い反応性を示すペプチド2S09の
非天然配列異型を探索することになった。
価 図10Bは、ヘテロ二官能性リンカーSMCCを用いて、Ｃ
末端を介してBSAに結合した場合の、合成提供ペプチドI
WGCSGKLICTTAVPGC（2S09）の反応性を示す。サンプルを
提供したシアトル キング カウンティ保健部がゲネテ
ィック システムズ EIA法によって評価した全部で184
のヒト血清のうち98がHIV−１抗体を含み、86が含んで
いなかった。陰性サンプルは低いA492値を示し、大部分
の陽性サンプルはより高いA492値を示したという点で、
図5Aに比較してアッセイ性能の改良が認められる。これ
は、SMCCリンカーを用いたペプチド−BSA結合物がリン
カーとしてMBSを用いたペプチド−KLH結合物よりすぐれ
たEIA試験性能を与えることを示している。しかしなが
ら、いくつかの陽性サンプルはこの結合物では非常に低
い−これらの陰性サンプルから確実に区別するにはあま
りに低い−免疫反応性をもっていた。低い反応性の若干
は、ザイールからのHIV分離物で報告されたように（グ
ナンら、サイエンス 237巻、1346−1349ページ、198
7）このエピトーム領域における遺伝的異型の抗原的差
異によるかも知れないので、天然配列異型プチド5S67
（図３）を合成し、SMCCによってBSAに化学的に結合せ
しめ、同じ血清に対して、それに加えてもう一つの陰性
血清サンプル（図10C）に対して試験した。天然2S09−B
SA結合物で低い免疫反応性を示した患者血清の多くは、
5S67−BSAではより高い反応性を与えた。しかしながら
ペプチド5SはHIV−１抗体を含まない血清と許容し得な
い高い反応性を示した（図10C）。このため、HIV−１抗
体を含む大部分の血清との高い免疫反応性を保持し、HI
V抗体のない血清とは低い反応性を示すペプチド2S09の
非天然配列異型を探索することになった。
実施例６ HIV−1gp41免疫反応性ペプチドの非天然配列異型の合成
及び最初の評価 図２及び図３は、実施例１の方法を用いて合成したペ
プチド2S09及び5S67の47の配列異型を示す。目立つアミ
ノ酸はこれらペプチドの天然配列からの異型である。遊
離ペプチドとして、ヒトHIV−１抗体と、ポリスチレン
ミクロタイター プレートに結合した天然ペプチド2S
09及び5S67のBSA−SMCC結合物との結合を阻止する能力
によって、ヒトHIV−１抗体に対する免疫反応性を保持
するこれらを確認した。図４は、図２及び図３で最大の
免疫反応性を示した７天然配列異型及び21非天然配列異
型の直接的抗体結合活性を示す。陽性血清プールに対す
るA492免疫反応性／陰性血清プールに対するA492免疫反
応性の比が最もよい結合物を、さらに評価した。非天然
ペプチドのいくつかの結合物は、図10Bの最小免疫反応
性血清で試験したとき、ペプチド2S09よりも高い免疫反
応性を与えたが、これらの若干は、ペプチド5S67で見ら
れたように（図10C）、陰性血清に対して高い非特異的
反応性を示した。その他のペプチドは大部分の陽性血清
では免疫反応性を保持し、陰性血清では免疫反応性の変
化はなかった。２つの特に好適な非天然配列ペプチド、
4S36及び5S76をさらに評価した。
及び最初の評価 図２及び図３は、実施例１の方法を用いて合成したペ
プチド2S09及び5S67の47の配列異型を示す。目立つアミ
ノ酸はこれらペプチドの天然配列からの異型である。遊
離ペプチドとして、ヒトHIV−１抗体と、ポリスチレン
ミクロタイター プレートに結合した天然ペプチド2S
09及び5S67のBSA−SMCC結合物との結合を阻止する能力
によって、ヒトHIV−１抗体に対する免疫反応性を保持
するこれらを確認した。図４は、図２及び図３で最大の
免疫反応性を示した７天然配列異型及び21非天然配列異
型の直接的抗体結合活性を示す。陽性血清プールに対す
るA492免疫反応性／陰性血清プールに対するA492免疫反
応性の比が最もよい結合物を、さらに評価した。非天然
ペプチドのいくつかの結合物は、図10Bの最小免疫反応
性血清で試験したとき、ペプチド2S09よりも高い免疫反
応性を与えたが、これらの若干は、ペプチド5S67で見ら
れたように（図10C）、陰性血清に対して高い非特異的
反応性を示した。その他のペプチドは大部分の陽性血清
では免疫反応性を保持し、陰性血清では免疫反応性の変
化はなかった。２つの特に好適な非天然配列ペプチド、
4S36及び5S76をさらに評価した。
実施例７ ペプチド4S36及び5S76のBSA結合物の免疫反応性の評価 図11Aは、ヘテロ二官能性リンカーSMCCを用いてＣ−
末端によりBSAに化学的に結合させ、ポリスチレン ミ
クロタイター プレートにコーティングし、183のヒト
血清に対してEIA法で試験したときの、非天然ペプチド4
S36（VQGCSGKLICTTAVPGC）の免疫反応性を示す。同じ98
の陽性血清、並びに図10Bの86の陰性血清のうちの85を
用いた。ペプチドのＮ−末端のイソロイシンの代わりに
バリンを置換したものを除いて、低陽性の免疫反応性
が、同じ配列をもつ天然配列ペプチドに比較して著しく
増加した。98の陽性サンプルのうち、A492が1.0以下で
あったものは１つもなかった。一方陰性血清のA492値は
比較的低いままであった。図11Bは、ポリスチレン ミ
クロタイター プレートにコーティングし、図10Bと同
じ陽性及び陰性血清に対し、またもう１つの陰性血清に
対してEIA法で試験したときの、非天然ペプチド5S76（I
WGCSGKMICTTAVPGC）の類似のＣ末端BSA−SMCC結合物の
免疫反応性を示す。５陽性サンプルが1.0以下のA492を
与えたが、残りの数値は高く、図10Bでは弱く反応した
幾つかの血清に対して強い免疫反応性をもつものも含ま
れた。図11Cは、ポリスチレン ミクロタイター プレ
ートにコーティングし、図11Aと同じ血清に対してEIA法
で試験したときの、結合非天然ペプチド4S36及び5S67
の、BSA−SMCC結合物との免疫反応性を示す。陰性血清
との反応性は低いままであるが、陽性血清と結合非天然
ペプチドとの免疫反応性はどちらのペプチドでもペプチ
ド単独よりは大きかった、その結果1.25以下のA492値を
もつ陽性サンプルはなく、最低陽性と最高陰性とのA492
値の開きは1.0以上の吸収単位となった。これらのEIA試
験性能結果は、同じ試験血清で試験した他のいかなるEI
A試薬の性能よりも優れており、今までに文献に記載さ
れた結果よりも優れている。
末端によりBSAに化学的に結合させ、ポリスチレン ミ
クロタイター プレートにコーティングし、183のヒト
血清に対してEIA法で試験したときの、非天然ペプチド4
S36（VQGCSGKLICTTAVPGC）の免疫反応性を示す。同じ98
の陽性血清、並びに図10Bの86の陰性血清のうちの85を
用いた。ペプチドのＮ−末端のイソロイシンの代わりに
バリンを置換したものを除いて、低陽性の免疫反応性
が、同じ配列をもつ天然配列ペプチドに比較して著しく
増加した。98の陽性サンプルのうち、A492が1.0以下で
あったものは１つもなかった。一方陰性血清のA492値は
比較的低いままであった。図11Bは、ポリスチレン ミ
クロタイター プレートにコーティングし、図10Bと同
じ陽性及び陰性血清に対し、またもう１つの陰性血清に
対してEIA法で試験したときの、非天然ペプチド5S76（I
WGCSGKMICTTAVPGC）の類似のＣ末端BSA−SMCC結合物の
免疫反応性を示す。５陽性サンプルが1.0以下のA492を
与えたが、残りの数値は高く、図10Bでは弱く反応した
幾つかの血清に対して強い免疫反応性をもつものも含ま
れた。図11Cは、ポリスチレン ミクロタイター プレ
ートにコーティングし、図11Aと同じ血清に対してEIA法
で試験したときの、結合非天然ペプチド4S36及び5S67
の、BSA−SMCC結合物との免疫反応性を示す。陰性血清
との反応性は低いままであるが、陽性血清と結合非天然
ペプチドとの免疫反応性はどちらのペプチドでもペプチ
ド単独よりは大きかった、その結果1.25以下のA492値を
もつ陽性サンプルはなく、最低陽性と最高陰性とのA492
値の開きは1.0以上の吸収単位となった。これらのEIA試
験性能結果は、同じ試験血清で試験した他のいかなるEI
A試薬の性能よりも優れており、今までに文献に記載さ
れた結果よりも優れている。
実施例８ ペプチド4S36及び5S76のBSA結合物の免疫反応特異性 図11Cの結果は、Ｃ−末端を介してBSA又はその他の担
体蛋白質に２個以上の合成非天然gp41ペプチドを組み合
わせて結合させることによって、すぐれたアッセイ性能
及び特に良い感度が得られることを示している。このよ
うなアッセイの感度が商売上許可されたイムノアッセイ
にどの程度匹敵するかを評価するために、HIV抗体検出
のための、ゲネティック システムズ（シアトル、ワシ
ントン、米国）又はデュポン（ウィルミントン、デラウ
ェア、米国）のどちらか又は両方の市販のEIAアッセイ
で間違った陽性結果を与えた12のヒト血清を、キング
カウンティ保健部（シアトル）から入手した。これら市
販のEIAシステムでは陽性であったにもかかわらず、こ
れらの各々の血清でのウエスターン ブロット 確認試
験は完全に陰性であった。
体蛋白質に２個以上の合成非天然gp41ペプチドを組み合
わせて結合させることによって、すぐれたアッセイ性能
及び特に良い感度が得られることを示している。このよ
うなアッセイの感度が商売上許可されたイムノアッセイ
にどの程度匹敵するかを評価するために、HIV抗体検出
のための、ゲネティック システムズ（シアトル、ワシ
ントン、米国）又はデュポン（ウィルミントン、デラウ
ェア、米国）のどちらか又は両方の市販のEIAアッセイ
で間違った陽性結果を与えた12のヒト血清を、キング
カウンティ保健部（シアトル）から入手した。これら市
販のEIAシステムでは陽性であったにもかかわらず、こ
れらの各々の血清でのウエスターン ブロット 確認試
験は完全に陰性であった。
12ヒト血清群を実施例３の方法にしたがい、合成ペプ
チド4S36及び5S76の組み合わせを用いて試験し、市販の
ゲネティック システムズ及びデュポンEIAアッセイで
得た結果と比較した。結果を下表に示す： １表は、非天然合成ペプチド4S36及び5S76のBSA結合
物を用いてポリスチレンプレートをコーティングするEI
A法の免疫反応性を示す。ペプチド4S36及び5S76を用い
るアッセイでは12サンプル中たった１個だけが（８％）
陽性であったのに対し、デュポン及びゲネティックシス
テムズの商売上許可されたアッセイではそれぞれ12中７
（58％）及び12中11（92％）が陽性であった。これらの
結果は、市販の２アッセイに比較して、実施例８及び図
11Cにおいて構成されたEIA試験の特異性がすぐれている
ことを示している。
チド4S36及び5S76の組み合わせを用いて試験し、市販の
ゲネティック システムズ及びデュポンEIAアッセイで
得た結果と比較した。結果を下表に示す： １表は、非天然合成ペプチド4S36及び5S76のBSA結合
物を用いてポリスチレンプレートをコーティングするEI
A法の免疫反応性を示す。ペプチド4S36及び5S76を用い
るアッセイでは12サンプル中たった１個だけが（８％）
陽性であったのに対し、デュポン及びゲネティックシス
テムズの商売上許可されたアッセイではそれぞれ12中７
（58％）及び12中11（92％）が陽性であった。これらの
結果は、市販の２アッセイに比較して、実施例８及び図
11Cにおいて構成されたEIA試験の特異性がすぐれている
ことを示している。
実施例９ 4S36及び5S76のBSA結合物を用いるHIV−１抗体に関する
血清変換の検出 実施例２の方法によってSMCCを用いてＣ末端を介して
BSAに結合させ、実施例３の方法によるイムノアッセイ
に用いる場合の非天然ペプチド4S36（VWGCSGKLICTTAVPG
C）及び5S76（IWGCSGKMICTTAVPGC）の組み合わせペプチ
ド−BSA結合物の免疫反応性を、HIV−１に感染した１人
から集めた個々の９血清の１群（“パネルA"）（ボスト
ン バイオメディカ社（“BBI"）、ボストン、マサチュ
セッツ、米国、から購入した）で評価した。またBBI血
清変換パネルＡは、市販のEIAアッセイを用いて、下記
の会社のEIAアッセイ用製品プロトコールにしたがっ
て、試験された：アボット ラボラトリーズ社（“アボ
ット”）、セルラー プロダクツ コーポレーション
（“セル プロ”）、デュポンコーポレーション（“デ
ュポン”。エレクトロヌクレオニックス（“ENI"）、ゲ
ネチック システムズ コーポレーション（“ゲネ シ
ス”）、オルト ディアグノスティックス コーポレー
ション（“オルト”）及びオルガノン テクニカ社
（“オルグ テック”）。パネルＡにより、商売上許可
されたHIV−１抗体試験の免疫反応性と、BSAとのＣ末端
結合物として用いられる本発明の２つの非天然合成ペプ
チドの免疫反応性とを直接比較することができる。結果
は下記の２表に示される： ２表に示されるように、組み合わせ非天然ペプチド結合
物は、アボット、デュポン、ENI、ゲン シス、オルト
を含む商売上許可された６試験には等しく敏感であっ
た、その他の試験に関する反応性についてはBBIから提
供されたデータを用いる。サンプル番号３は、サンプル
１及び２に比較してA492の２倍の増加を示した、そのレ
ベルは信頼するには不十分なレベルであるが、この血清
変換パネルではオルグテック イムノアッセイより感度
が低い可能性があることを示唆している。２表には、迅
速試験フォーマットでペプチド4S36及び5S70のBSA結合
物でこれらの血清を試験した結果も示される、これにつ
いては実施例16に、より詳細に記す。これらの結合物
は、迅速試験フォーマットを用いても６市販試験に匹敵
する感度を示した。
血清変換の検出 実施例２の方法によってSMCCを用いてＣ末端を介して
BSAに結合させ、実施例３の方法によるイムノアッセイ
に用いる場合の非天然ペプチド4S36（VWGCSGKLICTTAVPG
C）及び5S76（IWGCSGKMICTTAVPGC）の組み合わせペプチ
ド−BSA結合物の免疫反応性を、HIV−１に感染した１人
から集めた個々の９血清の１群（“パネルA"）（ボスト
ン バイオメディカ社（“BBI"）、ボストン、マサチュ
セッツ、米国、から購入した）で評価した。またBBI血
清変換パネルＡは、市販のEIAアッセイを用いて、下記
の会社のEIAアッセイ用製品プロトコールにしたがっ
て、試験された：アボット ラボラトリーズ社（“アボ
ット”）、セルラー プロダクツ コーポレーション
（“セル プロ”）、デュポンコーポレーション（“デ
ュポン”。エレクトロヌクレオニックス（“ENI"）、ゲ
ネチック システムズ コーポレーション（“ゲネ シ
ス”）、オルト ディアグノスティックス コーポレー
ション（“オルト”）及びオルガノン テクニカ社
（“オルグ テック”）。パネルＡにより、商売上許可
されたHIV−１抗体試験の免疫反応性と、BSAとのＣ末端
結合物として用いられる本発明の２つの非天然合成ペプ
チドの免疫反応性とを直接比較することができる。結果
は下記の２表に示される： ２表に示されるように、組み合わせ非天然ペプチド結合
物は、アボット、デュポン、ENI、ゲン シス、オルト
を含む商売上許可された６試験には等しく敏感であっ
た、その他の試験に関する反応性についてはBBIから提
供されたデータを用いる。サンプル番号３は、サンプル
１及び２に比較してA492の２倍の増加を示した、そのレ
ベルは信頼するには不十分なレベルであるが、この血清
変換パネルではオルグテック イムノアッセイより感度
が低い可能性があることを示唆している。２表には、迅
速試験フォーマットでペプチド4S36及び5S70のBSA結合
物でこれらの血清を試験した結果も示される、これにつ
いては実施例16に、より詳細に記す。これらの結合物
は、迅速試験フォーマットを用いても６市販試験に匹敵
する感度を示した。
実施例10 HIV−２のgp32の配列異型の合成及び評価 図６に示す合成ペプチドを実施例１の方法により合成
し、実施例３の方法によって免疫反応性を評価した。
し、実施例３の方法によって免疫反応性を評価した。
図６はペプチド2S27の３天然配列異型及び６非天然配
列異型の、ペプチド2S27−BSA結合物と抗体との結合を
阻止する、遊離ペプチドとしての能力を説明する。４非
天然配列異型、5S88、5S90、5S91、及び5S92は顕著な免
疫反応性を有することがわかった。
列異型の、ペプチド2S27−BSA結合物と抗体との結合を
阻止する、遊離ペプチドとしての能力を説明する。４非
天然配列異型、5S88、5S90、5S91、及び5S92は顕著な免
疫反応性を有することがわかった。
実施例11 HIV−２の天然及び非天然配列ペプチドの免疫反応性 図５及び図６に見られる最大の免疫反応性をもつ天然
及び非天然のHIV−２配列異型の免疫反応性を、HIV−２
抗体を含む又は含まないマカークザル血清で、実施例３
の方法で、実施例２のように結合したペプチドを用いて
評価した。結果は図７に示す。これらの図の天然及び非
天然配列異型は両方とも、陽性サンプルと陰性サンプル
とを容易に分けることができ、2S24、2S25、2S27、5S8
5、5S86、及び5S92で最も好ましい性能が認められた。H
IV−２に感染した西アフリカの患者からの血清サンプル
を含めた多数の血清を試験することにより、これら天然
及び非天然ペプチドのなかで最良のものの評価が今後さ
らにおこなわれるかも知れない。
及び非天然のHIV−２配列異型の免疫反応性を、HIV−２
抗体を含む又は含まないマカークザル血清で、実施例３
の方法で、実施例２のように結合したペプチドを用いて
評価した。結果は図７に示す。これらの図の天然及び非
天然配列異型は両方とも、陽性サンプルと陰性サンプル
とを容易に分けることができ、2S24、2S25、2S27、5S8
5、5S86、及び5S92で最も好ましい性能が認められた。H
IV−２に感染した西アフリカの患者からの血清サンプル
を含めた多数の血清を試験することにより、これら天然
及び非天然ペプチドのなかで最良のものの評価が今後さ
らにおこなわれるかも知れない。
実施例12 HIV−２抗体に関する血清変換の検出感度 実験的に０週にSIVに感染させた７匹のマカークザル
から16週間にわたって集めた一連の血清を用いて、マカ
ークザルの血清変換の検出についてHIV−２ペプチドBSA
結合物2S24、（2S24＋5S86）、及び5S92を評価した。結
果は下の３表に示す。
から16週間にわたって集めた一連の血清を用いて、マカ
ークザルの血清変換の検出についてHIV−２ペプチドBSA
結合物2S24、（2S24＋5S86）、及び5S92を評価した。結
果は下の３表に示す。
３表からわかるように、各々の結合物は血清変換を検
出した。最も感度の良いEIA試験は、Ｃ末端を介してBSA
に結合したペプチド2S24及び5S86の組み合わせを用いた
ものである。
出した。最も感度の良いEIA試験は、Ｃ末端を介してBSA
に結合したペプチド2S24及び5S86の組み合わせを用いた
ものである。
実施例13 HIV−１ペプチド結合物のHIV−２血清に対する反応性及
びその逆（HIV−２ペプチド結合物のHIV−１血清に対す
る反応性） HIV−1gp41ペプチドに対応するペプチド4s36（VWGCSG
KLICTTAVPGC）及び5S76（IWGCSGKMICTTAVPGC）を実施例
２の方法によりそれらのＣ末端を介して結合させ、これ
を実施例３のEIA法に用い、HIV−１抗体陽性血清 30、
HIV−2/SIV抗体陽性血清 23、HIV−１抗体陰性血清 1
5、HIV−2/SIV抗体陰性血清 15を試験した。図13Aに示
されるように、結合ペプチド4S36及び5S76はHIV−１抗
体陽性サンプルのみを検出し、HIV−２抗体陽性サンプ
ル23すべてを検出しなかった。HIV−2/SIV天然ペプチド
に対応するペプチド2S24（DQARLNSWGCAFRQVC）及び5S86
（SWGCAFRQVCHTSVPGC）を、実施例２の方法によりそれ
らのＣ末端を介してBSAに結合させ、実施例３の方法に
よるEIA法に用い、上記の血清パネルを試験した。図13B
に示されるように、結合ペプチド2S24及び5S86はHIV−
２抗体陽性サンプル23すべてを検出し、HIV−１抗体陽
性サンプル30のうち４つは0.4以上のA492を与えた。検
出ペプチド4S36及び5S76をそれから結合ペプチド2S24及
び5S86と結合させ、EIAに用いて同じ血清パネルを試験
した。図13Cに示されるように、HIV−１プラスHIV−２
結合抗原プレートはHIV−１及びHIV−２抗体陽性をすべ
て検出した。HIV−１又はHIV−２抗体陰性血清すべては
３種類の抗原試験組み合わせすべてで陰性であった。
びその逆（HIV−２ペプチド結合物のHIV−１血清に対す
る反応性） HIV−1gp41ペプチドに対応するペプチド4s36（VWGCSG
KLICTTAVPGC）及び5S76（IWGCSGKMICTTAVPGC）を実施例
２の方法によりそれらのＣ末端を介して結合させ、これ
を実施例３のEIA法に用い、HIV−１抗体陽性血清 30、
HIV−2/SIV抗体陽性血清 23、HIV−１抗体陰性血清 1
5、HIV−2/SIV抗体陰性血清 15を試験した。図13Aに示
されるように、結合ペプチド4S36及び5S76はHIV−１抗
体陽性サンプルのみを検出し、HIV−２抗体陽性サンプ
ル23すべてを検出しなかった。HIV−2/SIV天然ペプチド
に対応するペプチド2S24（DQARLNSWGCAFRQVC）及び5S86
（SWGCAFRQVCHTSVPGC）を、実施例２の方法によりそれ
らのＣ末端を介してBSAに結合させ、実施例３の方法に
よるEIA法に用い、上記の血清パネルを試験した。図13B
に示されるように、結合ペプチド2S24及び5S86はHIV−
２抗体陽性サンプル23すべてを検出し、HIV−１抗体陽
性サンプル30のうち４つは0.4以上のA492を与えた。検
出ペプチド4S36及び5S76をそれから結合ペプチド2S24及
び5S86と結合させ、EIAに用いて同じ血清パネルを試験
した。図13Cに示されるように、HIV−１プラスHIV−２
結合抗原プレートはHIV−１及びHIV−２抗体陽性をすべ
て検出した。HIV−１又はHIV−２抗体陰性血清すべては
３種類の抗原試験組み合わせすべてで陰性であった。
実施例14 p24合成ペプチドの血清プール及び個々の血清に対する
免疫反応性 図８は、SMCCを用いてＣ末端を介してBSAに結合し、H
IV−１抗体を含む人からの約50の血清のプール、又はHI
V−１抗体のない人からの約30の血清のプールと反応さ
せたときの、HIV−1p24の合成ペプチドの免疫反応性及
びAA配列を示す。図からわかるように、ペプチド5S93−
5S96を含むプールのみが明らかな免疫反応性を示し、そ
のプールのなかで特に、配列ALGPAATLEEMMTACGCをもつ
ペプチド5S94が免疫反応性ペプチドであることがわかっ
た。リンカーとしてSMCCを用いてそのＣ末端を介してBS
Aに結合したこのペプチドを、HIV−１抗体を含む98の個
々の血清に対し、またこれを含まない85の個々の血清に
対して試験した。陰性血清は１つも反応しなかった（0/
85、０％）、17の陽性血清（17/98、17％）が免疫反応
性であった。無症候性感染から臨床的疾患及びAIDSへと
進行する間に、ヒトにはp24に対する抗体が失われるこ
とが報告された［フランチニ（Franchini）ら、“血液
（Blood）"69巻、（２）、437−441ページ、1987、及び
ウエーバー（Weber）ら、ランセット（Lancet）１巻119
−122ページ、1987］、これは、被験血清ではこのペプ
チドに対する抗体の発生頻度が低いことを説明するもの
かも知れない。
免疫反応性 図８は、SMCCを用いてＣ末端を介してBSAに結合し、H
IV−１抗体を含む人からの約50の血清のプール、又はHI
V−１抗体のない人からの約30の血清のプールと反応さ
せたときの、HIV−1p24の合成ペプチドの免疫反応性及
びAA配列を示す。図からわかるように、ペプチド5S93−
5S96を含むプールのみが明らかな免疫反応性を示し、そ
のプールのなかで特に、配列ALGPAATLEEMMTACGCをもつ
ペプチド5S94が免疫反応性ペプチドであることがわかっ
た。リンカーとしてSMCCを用いてそのＣ末端を介してBS
Aに結合したこのペプチドを、HIV−１抗体を含む98の個
々の血清に対し、またこれを含まない85の個々の血清に
対して試験した。陰性血清は１つも反応しなかった（0/
85、０％）、17の陽性血清（17/98、17％）が免疫反応
性であった。無症候性感染から臨床的疾患及びAIDSへと
進行する間に、ヒトにはp24に対する抗体が失われるこ
とが報告された［フランチニ（Franchini）ら、“血液
（Blood）"69巻、（２）、437−441ページ、1987、及び
ウエーバー（Weber）ら、ランセット（Lancet）１巻119
−122ページ、1987］、これは、被験血清ではこのペプ
チドに対する抗体の発生頻度が低いことを説明するもの
かも知れない。
実施例15 HIV抗体を検出する迅速試験 迅速試験を15分以内に行うための試験装置を図14及び
15のように作成した。図14及び図15に関して言えば、装
置は、複数のじょうご状のウェル（12）をもつ（各ウェ
ルは約200マイクロリッターの容積をもつ）プラスチッ
クスライド（10）と、直径約9mmの上方流入管へり（1
4）と、直径約2mmの底部流出管（16）から成る。流出管
（16）の下面は、装置内のこれに続いて配置されている
膜フィルター（18）と滑らかに均質に接触できるよう設
計されている。膜フィルターは、そこを通過する反応体
をその大きさによって分離し、あらかじめ定められた大
きさ以上−例えば0.22ミクロン以上−の粒子、又は0.45
ミクロン以上の粒子を保持する（選択した特殊フィルタ
ーによって）、但しその装置に置かれたその他のフィル
ターは、結合又は親和性によって分離することができる
（すなわちニトロセルロース、ガラス）。フィルター膜
の下には、ウェルに置かれた液体をすべて吸収する十分
の厚さ及び吸収容量をもった吸収パッド（20）がある。
これら３成分は、頂部プレート（22）と底部支持体（2
4）とから成るプラスチックホールダー（21）のなかに
すっぽり入れられる。その入れ物の２部分は摩擦によっ
てぴったり付き、スライド、フィルター膜及び吸収パッ
ドを試験実施のために適したように支持するのに役立
つ。
15のように作成した。図14及び図15に関して言えば、装
置は、複数のじょうご状のウェル（12）をもつ（各ウェ
ルは約200マイクロリッターの容積をもつ）プラスチッ
クスライド（10）と、直径約9mmの上方流入管へり（1
4）と、直径約2mmの底部流出管（16）から成る。流出管
（16）の下面は、装置内のこれに続いて配置されている
膜フィルター（18）と滑らかに均質に接触できるよう設
計されている。膜フィルターは、そこを通過する反応体
をその大きさによって分離し、あらかじめ定められた大
きさ以上−例えば0.22ミクロン以上−の粒子、又は0.45
ミクロン以上の粒子を保持する（選択した特殊フィルタ
ーによって）、但しその装置に置かれたその他のフィル
ターは、結合又は親和性によって分離することができる
（すなわちニトロセルロース、ガラス）。フィルター膜
の下には、ウェルに置かれた液体をすべて吸収する十分
の厚さ及び吸収容量をもった吸収パッド（20）がある。
これら３成分は、頂部プレート（22）と底部支持体（2
4）とから成るプラスチックホールダー（21）のなかに
すっぽり入れられる。その入れ物の２部分は摩擦によっ
てぴったり付き、スライド、フィルター膜及び吸収パッ
ドを試験実施のために適したように支持するのに役立
つ。
遊離ペプチド2S09（IWGCSGKLICTTAVPGC）及びリンカ
ーとしてSMCCを用いてＣ末端を介してBSAに結合した
（実施例２の方法による）ペプチド2S09をコロイド金
（粒度20ナノメーター、ヤンセン ライフ サイエンシ
ズ、ピスカタウエイ、ニュージャーシー、米国）と反応
させた。多大の努力にもかかわらず、遊離ペプチドはコ
ロイド金とでは使用できなかった。それは電解質のよう
に作用し、コロイド金を直ちに溶液から沈殿させた。数
種類の遊離ペプチドを粒度20のコロイド金に加えたが、
結果は同じであった。20nm金粒子は直ちに溶液から沈殿
し、この効果がペプチド特異的ではないことがわかっ
た。2S09ペプチド−BSA結合物の方はこれよりもずっとB
SA単独の場合のように振る舞い、下記のようにペプチド
−BSA−Au結合物を作ることができた:C末端及びSMCCを
介してBSAに結合させたペプチド IWGCSGKLICTTAVPGC
8ml量（A280＝0.50）を一晩４℃で蒸留水2Lに対して透
析した。直径20mlのコロイド金ゾル（G20、ヤンセン
ライフ サイエンシズ）2ml量を、0.2N K2CO3及び0.2N
H3PO4を用いてpH 5.0,5.2、5.5、5.8、6.0、6.1、6.
4に調節した。凝集を防ぐために、ミクロタイター プ
レートにおいて各pHに調節した金ゾル溶液200マイクロ
リッター量であらかじめチェックした。透析したペプチ
ド結合物20マイクロリッターを撹拌しながら各pHに調節
した金ゾル溶液に加え（このとき色は変化しない）、２
分間放置する。２組のミクロタイター ウェルに同じ金
ゾル溶液を容易して対照とし、ペプチド−蛋白質結合物
の代わりに緩衝液を加えた。10％NaCl 50マイクロリッ
ターを各ウェルに加えた。ペプチド−BSAを含まないも
のは、金ゾルの凝集の結果、灰色になった。各ウェルの
A580を測定した。最低値（最良の保護を意味する）はpH
6.1＞pH6.0≫その他のpHであった。pH6.1でより多量の
金ゾルを用いると、保護蛋白質の最小量は透析ペプチド
−BSA 70マイクロリッター（A280＝0,45）であること
が確認された。pH6.1の透析ペプチド−BSAを150,000×
ｇで70分間超遠心機にかけ、凝集物を除去し、超遠心物
の上澄液で最小保護蛋白質研究を繰り返し同じ結果を得
た。G20金ゾル1mlあたりペプチド−BSAの85マイクロリ
ッター量を保護のために選び、超遠心上澄液15mlを烈し
く撹拌しながら２分間で金ゾル176mlに加え、その後0,2
NK2CO3でpHを9.0に調節し、pH9の10％BSAを加えてBSAの
最終濃度を１％とした。その後溶液を４℃で30分間 12
000×ｇ（平均）で遠心分離した。上澄液を吸引して捨
てた;10％のものは捨てずに、ペレットを懸濁させるた
めに用いた。洗浄緩衝液トリス20mM、150mM NaCl,1％B
SA、0.05％NaN3、pH8.2を最初の量に加え、遠心分離を
繰り返した。上澄液除去、再懸濁、反復洗浄及び遠心を
２度繰り返した、pH9.0に調節した同じ洗浄緩衝液を用
いた。最終的再懸濁溶液のA520は6.68で、色は深紅色で
あった。上と全く同じプロトコールで、ただしHIVとは
無関係のペプチド及びマイコバクテリウム属蛋白質配列
を用いて対照ペプチド−BSA結合物を作った。
ーとしてSMCCを用いてＣ末端を介してBSAに結合した
（実施例２の方法による）ペプチド2S09をコロイド金
（粒度20ナノメーター、ヤンセン ライフ サイエンシ
ズ、ピスカタウエイ、ニュージャーシー、米国）と反応
させた。多大の努力にもかかわらず、遊離ペプチドはコ
ロイド金とでは使用できなかった。それは電解質のよう
に作用し、コロイド金を直ちに溶液から沈殿させた。数
種類の遊離ペプチドを粒度20のコロイド金に加えたが、
結果は同じであった。20nm金粒子は直ちに溶液から沈殿
し、この効果がペプチド特異的ではないことがわかっ
た。2S09ペプチド−BSA結合物の方はこれよりもずっとB
SA単独の場合のように振る舞い、下記のようにペプチド
−BSA−Au結合物を作ることができた:C末端及びSMCCを
介してBSAに結合させたペプチド IWGCSGKLICTTAVPGC
8ml量（A280＝0.50）を一晩４℃で蒸留水2Lに対して透
析した。直径20mlのコロイド金ゾル（G20、ヤンセン
ライフ サイエンシズ）2ml量を、0.2N K2CO3及び0.2N
H3PO4を用いてpH 5.0,5.2、5.5、5.8、6.0、6.1、6.
4に調節した。凝集を防ぐために、ミクロタイター プ
レートにおいて各pHに調節した金ゾル溶液200マイクロ
リッター量であらかじめチェックした。透析したペプチ
ド結合物20マイクロリッターを撹拌しながら各pHに調節
した金ゾル溶液に加え（このとき色は変化しない）、２
分間放置する。２組のミクロタイター ウェルに同じ金
ゾル溶液を容易して対照とし、ペプチド−蛋白質結合物
の代わりに緩衝液を加えた。10％NaCl 50マイクロリッ
ターを各ウェルに加えた。ペプチド−BSAを含まないも
のは、金ゾルの凝集の結果、灰色になった。各ウェルの
A580を測定した。最低値（最良の保護を意味する）はpH
6.1＞pH6.0≫その他のpHであった。pH6.1でより多量の
金ゾルを用いると、保護蛋白質の最小量は透析ペプチド
−BSA 70マイクロリッター（A280＝0,45）であること
が確認された。pH6.1の透析ペプチド−BSAを150,000×
ｇで70分間超遠心機にかけ、凝集物を除去し、超遠心物
の上澄液で最小保護蛋白質研究を繰り返し同じ結果を得
た。G20金ゾル1mlあたりペプチド−BSAの85マイクロリ
ッター量を保護のために選び、超遠心上澄液15mlを烈し
く撹拌しながら２分間で金ゾル176mlに加え、その後0,2
NK2CO3でpHを9.0に調節し、pH9の10％BSAを加えてBSAの
最終濃度を１％とした。その後溶液を４℃で30分間 12
000×ｇ（平均）で遠心分離した。上澄液を吸引して捨
てた;10％のものは捨てずに、ペレットを懸濁させるた
めに用いた。洗浄緩衝液トリス20mM、150mM NaCl,1％B
SA、0.05％NaN3、pH8.2を最初の量に加え、遠心分離を
繰り返した。上澄液除去、再懸濁、反復洗浄及び遠心を
２度繰り返した、pH9.0に調節した同じ洗浄緩衝液を用
いた。最終的再懸濁溶液のA520は6.68で、色は深紅色で
あった。上と全く同じプロトコールで、ただしHIVとは
無関係のペプチド及びマイコバクテリウム属蛋白質配列
を用いて対照ペプチド−BSA結合物を作った。
ペプチド−BSA−金結合物の免疫反応性を試験するた
めに、未希釈の結合物10マイクロリッターを、１％NRS,
1％BSA、50mM燐酸塩、100mMNaCl、pH7.4、0.05％NaN3で
1:100に希釈したヒト血清 20マイクロリッターと混合
し、室温で５分間インキュベートした。１％加熱滅菌St
ap−hylococcus aureus Cowan株Ｉ 20マイクロリッタ
ーを各血清に加え、さらに５分間室温でインキュベート
した。0.22ミクロン サイズの膜フィルターを有する上
述の装置のウェル（12）に各サンプル45マイクロリッタ
ーを入れた。20はHIV−１抗体を含み、20はそれを含ま
ない全部で40の血清サンプルを試験した。各サンプルの
液がその膜を通過し、吸収パッドに入った後、陽性血清
サンプル20のうち19並びに陽性血清と共に用いたマイコ
バクテリウム属ペプチド−BSA−金結合物において赤紫
色の点が残った。この試験は、この装置及びペプチド−
BSA−コロイド金結合物を用いてHIV抗体を検出する迅速
試験が実行可能であることを示した。さらに、このよう
な結合物をつくるためには遊離ペプチドは適さないこと
もわかった。
めに、未希釈の結合物10マイクロリッターを、１％NRS,
1％BSA、50mM燐酸塩、100mMNaCl、pH7.4、0.05％NaN3で
1:100に希釈したヒト血清 20マイクロリッターと混合
し、室温で５分間インキュベートした。１％加熱滅菌St
ap−hylococcus aureus Cowan株Ｉ 20マイクロリッタ
ーを各血清に加え、さらに５分間室温でインキュベート
した。0.22ミクロン サイズの膜フィルターを有する上
述の装置のウェル（12）に各サンプル45マイクロリッタ
ーを入れた。20はHIV−１抗体を含み、20はそれを含ま
ない全部で40の血清サンプルを試験した。各サンプルの
液がその膜を通過し、吸収パッドに入った後、陽性血清
サンプル20のうち19並びに陽性血清と共に用いたマイコ
バクテリウム属ペプチド−BSA−金結合物において赤紫
色の点が残った。この試験は、この装置及びペプチド−
BSA−コロイド金結合物を用いてHIV抗体を検出する迅速
試験が実行可能であることを示した。さらに、このよう
な結合物をつくるためには遊離ペプチドは適さないこと
もわかった。
実施例16 ラテックス粒子上に固定したペプチド−BSA−結合物を
用いる迅速HIV−1EIA試験 実施例15に記載された迅速EIA試験実施のための迅速
試験装置の有用性は下記のようにして証明された：非天
然ペプチド4S36（VWGCSGKLICTTAVPGC）及び5S70（IWGCS
GKQICTTAVPGC）を、遊離ペプチドとして及び実施例２に
記載の方法でシステイン結合−BSA結合物として、下記
のプロトコールによりカルボキシル化ラテックスに化学
的に結合させた。10％ラテックス 125マイクロリッタ
ー量を脱イオン水375マイクロリッター量に加え、等量
（0.5ml）の1Mカルボジイミド、pH4.5、と混合した。混
合物を室温で１時間おだやかに振とうした。それから90
00×ｇで10分間遠心分離し、上澄液を除去し、ペレット
を脱イオン水、pH4.5、に再懸濁するという方法で３回
洗った。遊離ペプチド1mg/ml濃度（4S36及び5S70の各ペ
プチド1mlあたり500マイクログラム）、又はペプチド4S
36及び5S70のペプチド−BSA結合物 500マイクログラム
/mlを最終的に洗浄した活性化ラテックスペレットに加
えた（最初のラテックス容量125マイクロリッターあた
りペプチド含有溶液1ml量）。ラテックス ペプチド混
合物を一晩４℃でおだやかに振とうした、それから9000
×ｇで10分間遠心分離し、上澄液を除去した。活性化ラ
テックスと合一する前と後に、遊離ペプチド溶液の及び
ペプチド−BSA結合物のA280を測定したところ、結合物
の60％、及び遊離ペプチドの45％がラテックスに結合し
ていることがわかった。ラテックスと付着した遊離ペプ
チド又は結合物のペレットを、0.03Mトリス、pH8.0,0.8
％NaCl,1％BSA及び0.05％NaN3から成る洗浄緩衝液と共
に遠心分離することにより各３回洗った。最終的に洗浄
したペレットは、NaN3濃度を0.1％に調節した同じ洗浄
緩衝液（ラテックス希釈緩衝液）を用いてラテックス濃
度0.625％になるように再懸濁させた。ペプチド−BSA結
合物をコーティングしたラテックスのこの保存溶液はラ
テックス希釈緩衝液で1:10〜1:30に希釈され、下記の迅
速EIA法に用い得ることが確認された。これに対して、
遊離ペプチドをコーティングしたラテックスの保存溶液
は、希釈しなくても、迅速EIAフォーマットにおいてHIV
抗体を含むサンプルと含まないサンプルとを区別するこ
とができなかった。迅速EIA法のために、血清標本を、
0.8％NaCl、0.05％NaN3、0.05％トライトンｘ−100を含
む0.03Mトリス、pH8、から成る血清希釈緩衝液で希釈し
た。アッセイのために、希釈血清１滴（20マイクロリッ
ター）を1:10希釈保存ラテックス１滴（20マイクロリッ
ター）に加え、混合し、試験管中で室温で１−２分間イ
ンキュベートした。この混合物１滴（20マイクロリッタ
ー）を、0.45ミクロン サイズの膜フィルターを備えた
実施例15の迅速試験装置に加えた。混合物はほとんど直
ぐに装置内に流入し、それに続いて洗浄液（血清希釈緩
衝液）各１滴（20マイクロリッター）、4mM MgCl2を加
えたラテックス希釈緩衝液で1:20に希釈したヤギ抗ヒト
免疫グロブリン（ガンマ鎖特異的、キャッペル−オルガ
ノン テクニカ、PA）に結合したアルカリホスファター
ゼから成るアルカリホスファターゼ結合物１滴、洗浄液
１滴、基質１滴を次々に加えた。基質は、NBT（ニトロ
ブルーテトラゾリウム、シグマ ケミカル社、セントル
イス、ミズリー、米国）及びBCIP（５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドキシルホスフェート、シグマ）の各々
100マイクログラム/mlを含む100mMトリス緩衝液から成
っていた。陽性は、図14の26に見られるように、概して
２分以内に膜上に青紫色の沈殿をあらわした。陰性は、
図14の28に見られるように、最低５分間は青色を発現し
なかった。３−４分後に4N H2SO4l滴を落とすことによ
って反応を止め、その試験装置は陽性（青紫色）又は陰
性（白い膜）の永久的証拠として、その結果を記録する
まで取っておくことができる。全部で200のヒト血清
（そのうち98はHIV−１抗体を含み、102はそれを含んで
いなかった）をこの迅速EIAで試験した。HIVを含むもの
97が迅速EIAフォーマットで紫色を与え、それを含まな
いものは一つも紫色を与えなかった。これは、上記のプ
ロトコール及び試験装置を用いる迅速EIAを用いてHIV抗
体を15分以内に検出できることを証明した。さらに、非
天然ペプチド4S36及び5S70のペプチド−BSA結合物は迅
速EIAに適しているが、同じペプチドでもそのアミノ基
を介してラテックスに共有結合した遊離ペプチドとして
この試験に用いる場合はこれらのペプチドは許容できな
いことも明らかになった。ラテックスに受動的に吸着し
た遊離ペプチド4S36は免疫反応性試薬を生成した、しか
しその反応動態及び陽性陰性サンプル間の識別は、この
試薬ではペプチド−BSA結合物でつくったラテックス試
薬よりもよくなかった。
用いる迅速HIV−1EIA試験 実施例15に記載された迅速EIA試験実施のための迅速
試験装置の有用性は下記のようにして証明された：非天
然ペプチド4S36（VWGCSGKLICTTAVPGC）及び5S70（IWGCS
GKQICTTAVPGC）を、遊離ペプチドとして及び実施例２に
記載の方法でシステイン結合−BSA結合物として、下記
のプロトコールによりカルボキシル化ラテックスに化学
的に結合させた。10％ラテックス 125マイクロリッタ
ー量を脱イオン水375マイクロリッター量に加え、等量
（0.5ml）の1Mカルボジイミド、pH4.5、と混合した。混
合物を室温で１時間おだやかに振とうした。それから90
00×ｇで10分間遠心分離し、上澄液を除去し、ペレット
を脱イオン水、pH4.5、に再懸濁するという方法で３回
洗った。遊離ペプチド1mg/ml濃度（4S36及び5S70の各ペ
プチド1mlあたり500マイクログラム）、又はペプチド4S
36及び5S70のペプチド−BSA結合物 500マイクログラム
/mlを最終的に洗浄した活性化ラテックスペレットに加
えた（最初のラテックス容量125マイクロリッターあた
りペプチド含有溶液1ml量）。ラテックス ペプチド混
合物を一晩４℃でおだやかに振とうした、それから9000
×ｇで10分間遠心分離し、上澄液を除去した。活性化ラ
テックスと合一する前と後に、遊離ペプチド溶液の及び
ペプチド−BSA結合物のA280を測定したところ、結合物
の60％、及び遊離ペプチドの45％がラテックスに結合し
ていることがわかった。ラテックスと付着した遊離ペプ
チド又は結合物のペレットを、0.03Mトリス、pH8.0,0.8
％NaCl,1％BSA及び0.05％NaN3から成る洗浄緩衝液と共
に遠心分離することにより各３回洗った。最終的に洗浄
したペレットは、NaN3濃度を0.1％に調節した同じ洗浄
緩衝液（ラテックス希釈緩衝液）を用いてラテックス濃
度0.625％になるように再懸濁させた。ペプチド−BSA結
合物をコーティングしたラテックスのこの保存溶液はラ
テックス希釈緩衝液で1:10〜1:30に希釈され、下記の迅
速EIA法に用い得ることが確認された。これに対して、
遊離ペプチドをコーティングしたラテックスの保存溶液
は、希釈しなくても、迅速EIAフォーマットにおいてHIV
抗体を含むサンプルと含まないサンプルとを区別するこ
とができなかった。迅速EIA法のために、血清標本を、
0.8％NaCl、0.05％NaN3、0.05％トライトンｘ−100を含
む0.03Mトリス、pH8、から成る血清希釈緩衝液で希釈し
た。アッセイのために、希釈血清１滴（20マイクロリッ
ター）を1:10希釈保存ラテックス１滴（20マイクロリッ
ター）に加え、混合し、試験管中で室温で１−２分間イ
ンキュベートした。この混合物１滴（20マイクロリッタ
ー）を、0.45ミクロン サイズの膜フィルターを備えた
実施例15の迅速試験装置に加えた。混合物はほとんど直
ぐに装置内に流入し、それに続いて洗浄液（血清希釈緩
衝液）各１滴（20マイクロリッター）、4mM MgCl2を加
えたラテックス希釈緩衝液で1:20に希釈したヤギ抗ヒト
免疫グロブリン（ガンマ鎖特異的、キャッペル−オルガ
ノン テクニカ、PA）に結合したアルカリホスファター
ゼから成るアルカリホスファターゼ結合物１滴、洗浄液
１滴、基質１滴を次々に加えた。基質は、NBT（ニトロ
ブルーテトラゾリウム、シグマ ケミカル社、セントル
イス、ミズリー、米国）及びBCIP（５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドキシルホスフェート、シグマ）の各々
100マイクログラム/mlを含む100mMトリス緩衝液から成
っていた。陽性は、図14の26に見られるように、概して
２分以内に膜上に青紫色の沈殿をあらわした。陰性は、
図14の28に見られるように、最低５分間は青色を発現し
なかった。３−４分後に4N H2SO4l滴を落とすことによ
って反応を止め、その試験装置は陽性（青紫色）又は陰
性（白い膜）の永久的証拠として、その結果を記録する
まで取っておくことができる。全部で200のヒト血清
（そのうち98はHIV−１抗体を含み、102はそれを含んで
いなかった）をこの迅速EIAで試験した。HIVを含むもの
97が迅速EIAフォーマットで紫色を与え、それを含まな
いものは一つも紫色を与えなかった。これは、上記のプ
ロトコール及び試験装置を用いる迅速EIAを用いてHIV抗
体を15分以内に検出できることを証明した。さらに、非
天然ペプチド4S36及び5S70のペプチド−BSA結合物は迅
速EIAに適しているが、同じペプチドでもそのアミノ基
を介してラテックスに共有結合した遊離ペプチドとして
この試験に用いる場合はこれらのペプチドは許容できな
いことも明らかになった。ラテックスに受動的に吸着し
た遊離ペプチド4S36は免疫反応性試薬を生成した、しか
しその反応動態及び陽性陰性サンプル間の識別は、この
試薬ではペプチド−BSA結合物でつくったラテックス試
薬よりもよくなかった。
実施例17 HIV−２抗体を検出する迅速EIA試験 実施例16のカルボジイミド カップリング法を用い
て、ペプチド2S24、5S86、及び5S92の共有結合したペプ
チド−BSA結合物を含むラテックスをつくった。その他
に、2S25はカルボキシル化ラテックスに受動的に吸着さ
せた。共有結合及び受動的吸着の前及び後に行ったA280
測定で、ペプチド−BSA結合物300マイクログラムが及び
受動的吸着ペプチド2S25の230マイクログラムが10％ラ
テックス125マイクロリッターに結合することがわかっ
た。実施例16に示したように処理し使用した後、両試料
共、HIV−２抗体を含む血清サンプル（HIV−２＋）とこ
れを含まない血清サンプル（HIV−２−）とを区別でき
ることがわかった。しかしながらシステイン結合 ペプ
チド−BSA結合物からつくられたラテックスでは、反応
動態はより速く、HIV−２抗体を含む血清サンプルと含
まない血清サンプルとの間のより良い識別が認められ
た。
て、ペプチド2S24、5S86、及び5S92の共有結合したペプ
チド−BSA結合物を含むラテックスをつくった。その他
に、2S25はカルボキシル化ラテックスに受動的に吸着さ
せた。共有結合及び受動的吸着の前及び後に行ったA280
測定で、ペプチド−BSA結合物300マイクログラムが及び
受動的吸着ペプチド2S25の230マイクログラムが10％ラ
テックス125マイクロリッターに結合することがわかっ
た。実施例16に示したように処理し使用した後、両試料
共、HIV−２抗体を含む血清サンプル（HIV−２＋）とこ
れを含まない血清サンプル（HIV−２−）とを区別でき
ることがわかった。しかしながらシステイン結合 ペプ
チド−BSA結合物からつくられたラテックスでは、反応
動態はより速く、HIV−２抗体を含む血清サンプルと含
まない血清サンプルとの間のより良い識別が認められ
た。
実施例18 HIV−１抗体及び／又はHIV−２抗体の同時検出のための
迅速EIA 実施例16及び17の試薬及び試験装置反応条件を用い
た。HIV−１（4S36及び5S70、図４）及びHIV−２（2S2
4、5S86、5S92、図７）の両方をあらわすペプチド−BSA
ラテックス試薬の組み合わせを含めることによって、
同じ試薬でHIV−１又はHIV−２に対する抗体を検出する
ことが可能になった。HIV−１のみをあらわすラテック
ス試薬は迅速試験でHIV−２抗体を確認することができ
なかったし、その反対も言える。
迅速EIA 実施例16及び17の試薬及び試験装置反応条件を用い
た。HIV−１（4S36及び5S70、図４）及びHIV−２（2S2
4、5S86、5S92、図７）の両方をあらわすペプチド−BSA
ラテックス試薬の組み合わせを含めることによって、
同じ試薬でHIV−１又はHIV−２に対する抗体を検出する
ことが可能になった。HIV−１のみをあらわすラテック
ス試薬は迅速試験でHIV−２抗体を確認することができ
なかったし、その反対も言える。
実施例19 非結合ペプチドとの反応の阻止による、迅速EIA試験に
おいて認められた陽性結果の特異性の確認 ４表は、10のHIV−１抗体陽性血清及び４つのHIV−２
抗体陽性血清を用いて、競合又は阻害非結合ペプチドの
存在する場合と存在しない場合で、HIV−１ラテックス
試薬、HIV−２ラテックス試薬、及びHIV−１プラスHIV
−２ラテックス試薬で試験したときに得られた結果を示
す。予想どうり、HIV−１ペプチドのペプチド−BSA結合
物を含むラテックス試薬はHIV−１抗体を検出し、HIV−
２抗体を検出しなかった、そしてHIV−２ペプチドのペ
プチド−BSA結合物を含むラテックス試薬はHIV−２抗体
を検出したが、HIV−１抗体を検出しなかった。それに
対して、両ラテックス試薬の組み合わせは両方の抗体を
検出した。ペプチド−BSA結合物に使用されたものと同
じHIV−1gp41の遊離ペプチドは抗体のHIV−１結合を阻
止したが、HIV−２ラテックス試薬を阻止しなかった、
この反対も言える。これは、検出された抗体がHIV経膜
的糖蛋白質に向けられることを確認し、さらにその抗体
がHIV−１、又はHIV−２に、又は両方に向けられるのか
どうかを明確にした。
おいて認められた陽性結果の特異性の確認 ４表は、10のHIV−１抗体陽性血清及び４つのHIV−２
抗体陽性血清を用いて、競合又は阻害非結合ペプチドの
存在する場合と存在しない場合で、HIV−１ラテックス
試薬、HIV−２ラテックス試薬、及びHIV−１プラスHIV
−２ラテックス試薬で試験したときに得られた結果を示
す。予想どうり、HIV−１ペプチドのペプチド−BSA結合
物を含むラテックス試薬はHIV−１抗体を検出し、HIV−
２抗体を検出しなかった、そしてHIV−２ペプチドのペ
プチド−BSA結合物を含むラテックス試薬はHIV−２抗体
を検出したが、HIV−１抗体を検出しなかった。それに
対して、両ラテックス試薬の組み合わせは両方の抗体を
検出した。ペプチド−BSA結合物に使用されたものと同
じHIV−1gp41の遊離ペプチドは抗体のHIV−１結合を阻
止したが、HIV−２ラテックス試薬を阻止しなかった、
この反対も言える。これは、検出された抗体がHIV経膜
的糖蛋白質に向けられることを確認し、さらにその抗体
がHIV−１、又はHIV−２に、又は両方に向けられるのか
どうかを明確にした。
実施例20 動物を免疫して抗ペプチド ポリクローナル又はモノク
ローナル抗体を生成せしめるためにHIV蛋白質のペプチ
ド−蛋白質結合物の使用 実施例２におけるように、ペプチドをKLHNI結合さ
せ、これを用いて最終ペプチド濃度500μg/mlになるよ
うにフロイント不完全アジュバントの乳濁液をつくる。
この乳濁液の50μｇ量をマウスにIP注射するか、100μ
ｇ量を家兎に肩甲骨下にIM注射した。１カ月後、同じ用
量レベルでブースター免疫を再び行い、各動物の血清に
ついて、遊離ペプチドか、又はKLH結合物をつくるのに
用いたもの（MBS）とは異なるヘテロ二官能性リンカー
（SMCC）によってBSAに結合したペプチドを使用して、E
IA法によってペプチドに対する抗体反応をテストした。
多価血清が直接又はその後にブースター免疫を行った後
に使用され、または、モノクローナル抗体が所望の場合
はその後標準ハイブリドーマ法が行われる［ギリス（Gi
llis）＆ブチャナン（Buchanan）、Infect Immu 49巻37
1 377ページ、1982］。
ローナル抗体を生成せしめるためにHIV蛋白質のペプチ
ド−蛋白質結合物の使用 実施例２におけるように、ペプチドをKLHNI結合さ
せ、これを用いて最終ペプチド濃度500μg/mlになるよ
うにフロイント不完全アジュバントの乳濁液をつくる。
この乳濁液の50μｇ量をマウスにIP注射するか、100μ
ｇ量を家兎に肩甲骨下にIM注射した。１カ月後、同じ用
量レベルでブースター免疫を再び行い、各動物の血清に
ついて、遊離ペプチドか、又はKLH結合物をつくるのに
用いたもの（MBS）とは異なるヘテロ二官能性リンカー
（SMCC）によってBSAに結合したペプチドを使用して、E
IA法によってペプチドに対する抗体反応をテストした。
多価血清が直接又はその後にブースター免疫を行った後
に使用され、または、モノクローナル抗体が所望の場合
はその後標準ハイブリドーマ法が行われる［ギリス（Gi
llis）＆ブチャナン（Buchanan）、Infect Immu 49巻37
1 377ページ、1982］。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平１−224397（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−153700（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−500597（ＪＰ，Ａ) 国際公開87／6005（ＷＯ，Ａ１) Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．237 （4820），ｐ1346−1349（1987) Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖ ｏｌ．22（２／３），ｐ173−182 （1988) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/155,16/18,7/08 G01N 33/569 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (13)
- 【請求項１】液体サンプル中のHIV−１またはHIV−２に
対する抗体の存在または量を確定するための方法であっ
て、以下の工程； （ａ）HIV−１のgp41蛋白質またはHIV−２のgp32蛋白質
の抗原性ドメインに特有の免疫反応特異性を有する少な
くとも１つの合成ペプチドを有する免疫特異的試薬と該
液体サンプルとを接触させる工程であって、 該HIV−１のgp41蛋白質の抗原性ドメインに特有の免疫
反応特異性を有する該合成ペプチドが、以下： および、そのマルチマーからなる群より選択され；およ
び 該HIV−２のgp32蛋白質の抗原性ドメインに特有の免疫
反応特異性を有する該合成ペプチドが、以下： および、そのマルチマーからなる群より選択され、 ここで、該合成ペプチドがそのＣ末端を介して担体蛋白
質に結合されている工程； （ｂ）該免疫特異的試薬と該液体サンプルとを反応さ
せ、HIV−１またはHIV−２に対する抗体が該サンプル中
に存在する場合、該少なくとも１つの合成ペプチドと該
抗体との複合体を形成させる工程；および （ｃ）該液体サンプル中のHIV−１またはHIV−２に対す
る抗体の存在または量の指標として、該複合体の存在ま
たは量を確定する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項２】前記免疫特異的試薬が固相に結合される、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】請求項１に記載の方法であって、前記免疫
特異的試薬が、4S36、5S76、AB14、2S04、2S09、ならび
にそのマルチマーからなる群より選択される少なくとも
１つの合成ペプチドを含む、方法。 - 【請求項４】請求項１に記載の方法であって、前記免疫
特異的試薬が、AB18、2S25、2S27、5S85、5S86、5S92、
ならびにそのマルチマーからなる群より選択される少な
くとも１つの合成ペプチドを含む、方法。 - 【請求項５】請求項３または４に記載の方法であって、
前記免疫特異的試薬が、少なくとも２つの合成ペプチド
を含む、方法。 - 【請求項６】請求項５に記載の方法であって、前記免疫
特異的試薬が、（ａ）4S36、5S76、AB14、2S04、2S09、
ならびにそのマルチマーからなる群より選択される少な
くとも１つの合成ペプチド；および（ｂ）AB18、2S25、
2S27、5S85、5S86、5S92、ならびにそのマルチマーから
なる群より選択される少なくとも１つの合成ペプチドを
含む、方法。 - 【請求項７】HIV−１のgp41蛋白質またはHIV−２のgp32
蛋白質に特有の免疫反応特異性を有する少なくとも１つ
の合成ペプチドを含む免疫特異的試薬であって、 該HIV−１のgp41蛋白質に特有の免疫反応特異性を有す
る該合成ペプチドが、以下： および、そのマルチマーからなる群より選択され；およ
び 該HIV−２のgp32蛋白質に特有の免疫反応特異性を有す
る該合成ペプチドが、以下： および、そのマルチマーからなる群より選択され、ここ
で、該合成ペプチドがそのＣ末端を介して担体蛋白質に
結合されている、免疫特異的試薬。 - 【請求項８】前記免疫特異的試薬が固相に結合される、
請求項７に記載の免疫特異的試薬。 - 【請求項９】請求項７に記載の免疫特異的試薬であっ
て、4S36、5S76、AB14、2S04、2S09、ならびにそのマル
チマーからなる群より選択される少なくとも１つの合成
ペプチドを含む、免疫特異的試薬。 - 【請求項１０】請求項７に記載の免疫特異的試薬であっ
て、AB18、2S25、2S27、5S85、5S86、5S92、ならびにそ
のマルチマーからなる群より選択される少なくとも１つ
の合成ペプチドを含む、免疫特異的試薬。 - 【請求項１１】少なくとも２つの合成ペプチドを含む、
請求項９または10に記載の免疫特異的試薬。 - 【請求項１２】請求項11に記載の免疫特異的試薬であっ
て、（ａ）4S36、5S76、AB14、2S04、2S09、ならびにそ
のマルチマーからなる群より選択される少なくとも１つ
の合成ペプチド；および（ｂ）AB18、2S25、2S27、5S8
5、5S86、5S92、ならびにそのマルチマーからなる群よ
り選択される少なくとも１つの合成ペプチドを含む、免
疫特異的試薬。 - 【請求項１３】HIV−１のgp41蛋白質またはHIV−２のgp
32蛋白質に特有の免疫反応特異性を有する少なくとも１
つの合成ペプチドを含む診断用キットであって、 該HIV−１のgp41蛋白質に特有の免疫反応特異性を有す
る該合成ペプチドが、以下： および、そのマルチマーからなる群より選択され；およ
び 該HIV−２のgp32蛋白質に特有の免疫反応特異性を有す
る該合成ペプチドが、以下： および、そのマルチマーからなる群より選択され、 ここで、該合成ペプチドがそのＣ末端を介して担体蛋白
質に結合されている、診断用キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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