SE468168B - Hiv-1, p24 peptider, diagnostiska antigener och foerfarande foer saerskiljande diagnostik av preliminaert hiv-1 positiva serumprov - Google Patents

Description

468 168 10 15 20 25 30 35 2 Det har observerats att en liten andel sera från människor som sannolikt inte är HIV-l-infekterade inne- håller antikroppar mot ett eller ett fåtal HIV-l-protei- ner, varav de flesta härrör från virusets inre gag-del.

Ett exempel på ett sådant protein är p24~proteinet. Sådana reaktiviteter kan ge upphov till "obestämda" HIV-l-reak- tioner vid elektroforetisk immunoblotting (EIB). De är en konstant källa till problem i laboratorier som skall be- kräfta HIV-l-antikroppscreeningresultat. Anti-p24-reak- tioner är ett stort diagnostiskt problem i både utvecklade länder och utvecklingsländer. Det är dyrt att utföra åt- skilliga konfirmativa tester på vart och ett av dessa sera. Utvärderingen av den biologiska orsaken till dessa reaktioner och utveckling av tester som underlättar sär- skiljandet av "sanna" från "falska" HIV-1-antikroppar är sålunda viktiga forskningsobjekt.

En av de mest kända typerna av falsk-positiv HIV-l- EIB-reaktivitet kännetecknas av en reaktivitet med p24- proteinet med eller utan dess prekursor_p55 i gag-delen, men ingen reaktivitet med något annat HIV-l-protein. Mest sannolikt erhålls ett falskt HIV-1-antikropptest när tes- ter baserade pà helvirus används, och särskilt alla tester där p24-proteiner är involverade. Ett enkelt anti-p24-band kan vara en signal på en tidig HIV-infektion, bero på en HIV-2-infektion, vara en följd av en "kryptisk" anti-HIV- serologisk reaktion (se Ranki AM, Krohn M, Allain JP, et al.: Long latency precedes overt seroconversion in sexually transmitted human immunodeficiency virus infec- tion. Lancet 1987, ii:589-593), eller vara en falskt positiv reaktion hos en person som aldrig varit i kontakt med HIV.

De vanligaste konfirmativa testerna är Western blot- ting, inhiberings-EIA, peptid-EIA och radioimmunoprecipi- tation. Vanligtvis är 3 eller 4 konfirmativa tester nöd- vändiga för särskiljande mellan falskt och sant positiva sera. 10 15 20 25 30 35 468 168 3 Renat HIV-l-helvirus fraktioneras vid Western blot- ting med avseende på molekylvikten genom användning av elektrofores pà en polyakrylamidgel. De separerade HIV-l- proteinerna, som fungerar som virala antigener, överförs därefter från gelen via elektroforetisk blotting till ett nitrocellulosamembran. Alternativt kan rekombinanta pro- teiner eller syntetiska peptider som motsvarar HIV-l-pro- teinerna användas som antigener. Membranet skärs till remsor, som därefter bringas att reagera med test- och kontrollserum eller plasmaprover. Om anti-HIV-l-anti- kroppar är närvarande i provet, binder de under inkube- ringen till de virala antigenerna på nitrocellulosaremsor- na. Detta antigen-antikroppkomplex detekteras med hjälp av en antihuman immunoglobulin G(IgG)-antikropp, som är kon- jugerad till ett enzym, vilket i närvaro av ett substrat ger ett färgat band på remsorna. Om en fullständig (nor- mal) HIV-l-seropositivitet enligt a) ovan föreligger, är antikroppar mot nästan samtliga virusproteiner närvarande.

Detta test är ganska känsligt och det medger separation av immunsvaret mot olika proteiner härrörande från olika de- lar av en virusorganism.

Reaktioner mot både gag(gag = p24, pl7, p55)-protei- 9P4l, 99160, gpl20)-proteiner från virusets hölje är erforderliga för ner från virusets inre delar och env(env = denna test. Risken för att ett sådant mönster skall uppstå slumpmässigt är mycket liten. Om en patient har antikrop- par mot ett fàtal enstaka virusproteiner, är otillförlit- ligheten mera uttalad. Då är det nödvändigt att särskilja ett ofullständigt men sant immunsvar mot HIV-l från en antikroppreaktion mot ett annat protein med förmåga att inducera samma antikroppar som ett HIV-l-protein (falsk positivitet). Reaktioner med pl7, p24 och p55 är vanligast bland gag-reaktioner, varvid pl7-reaktioner är mest van- liga och p55 minst vanliga. De olika bandens förekomst och intensitet vid EIB är beroende på om infektionen nyligen ägt rum. Följaktligen är det omöjligt att vara absolut säker på om ett enkelt gag-band är sant eller falskt genom 4-68 168 10 15 20 25 30 35 4 användning av endast en Western blot. Detta är en avsevärd nackdel med denna metod.

Inhiberings-EIA (kompetitions-EIA) är en teknik som särskiljer mellan falsk och sann reaktivitet genom konkur- rens mellan märkta, sant positiva antikroppar och serum- provet från patienten för bindning till HIV-1-proteiner, vilka är bundna till en fast fas. Om patientens serumprov inhiberar de märkta antikropparna, är det tydligt att de binder till samma ställen på HIV-1-proteinerna och att antikropparna i patientserumprovet binder lika starkt som de märkta antikropparna. Om reaktionen är falsk, är ingen av dessa betingelser uppfylld. Eftersom detta test är ett negativt test, dvs det är baserat på icke-reaktivitet hos eventuellt falskt positiva antikroppar och inte på direkt indikering, är emellertid detta test förenat med en viss otillförlitlighet.

Peptid-EIA är en teknik som ytterligare separerar immunsvaret till enstaka epitoper. Med hjälp av denna tek- nik är det möjligt att särskilja mellan sanna och falska reaktioner, eftersom orsakerna till immunsvaret är olika.

Det är möjligt att använda peptid-EIA för att indikera att antikroppar som framkallats mot env-proteiner är närva- rande. Peptid-EIA är en känsligare teknik än Western blot- ting vad beträffar indikering av env-antikroppar. För när- varande är emellertid användning av denna teknik något be- gränsad, eftersom testen kan ge fel utslag vid små varia- tioner i virusets peptidsekvens, såsom hos vissa patienter från Afrika.

Vid radioimmunoprecipitationstestet, RIPA, binds antikropparna från patientserumprovet till radioaktivt märkta HIV-l-proteiner. Antigen-antikroppkomplexen immobi- liseras på protein A-pärlor och solubiliseras därefter och underkastas elektrofores i polyakrylamid. Denna test krä- ver hög affinitet för antikropparna och är ganska känslig.

Den kan särskilja ganska väl mellan sanna och falska reak- tioner. Den är särskilt fördelaktig för studier av env- reaktivitet med hjälp av RIPA. Nackdelarna med denna test 10 15 20 25 30 35 468 163 5 är att den är ganska dyr, tidskrävande och omständlig.

Dessutom föreligger en riskaspekt p g a arbetet med radio- aktivt material.

Följaktligen föreligger ett stort behov av ett för- farande för tillförlitligt, snabbt, enkelt och billigt särskiljande mellan falska och sanna HIV-l-antikroppreak- tioner, särskilt för U-länder, där falsk seropositivitet är ett stort problem.

Detta behov uppfylls med hjälp av föreliggande upp- finning. Jämfört med känd teknik är förfarandet enligt föreliggande uppfinning enklare vad beträffar särskiljande av sanna och falska HIV-1-anti-p24-reaktioner_ Dessutom är den säkrare och mer tillförlitlig än kända tekniker. Den är dessutom snabb, och testen utförs pà 3-4 h, jämfört med kända tekniker, där upp till 24 h är nödvändigt. Slutligen är den åtminstone 10 ggr billigare per test än en western blot och mycket billigare än de andra konventionella kon- firmativa testerna. I kombination med de konventionella metoderna ger förfarandet enligt föreliggande uppfinning en ytterligare säkerhetsmarginal, eftersom den positivt identifierar de falskt positiva reaktionerna. Sammanfatt- ningsvis är det i högre grad än med någon annan hittills känd metod möjligt att välja ut ytterligare icke-HIV-l- infekterade individer från en grupp individer som har diagnosticerats vara eventuellt HIV-l-positiva.

Beskrivning av uppfinningen I en aspekt hänför sig föreliggande uppfinning till peptider med formeln a) H-X-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Ile-Gln-Gly-Gln-Met-Val-His- -Gln-Ala-Ile-Ser-Pro-Arg-Thr-Leu-Asn-Ala-Trp-Val-Lys- -Val-Val-Glu-Glu-Lys-Ala-Phe-Ser-Pro-Glu-Val-Ile-Pro- -Met-Phe-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp- -Leu-Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly-X-Z b) H-X-Val-His-Gln-Ala-Ile-Ser-Pro-Arg-Thr-Leu-Asn-Ala- -Trp-Val-X-Z 468 168 6 c) H-X-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp-Leu- -Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly-His-Gln-Ala-Ala- -Met-Gln-Met-Leu-Lys-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala- -Glu-Trp-Asp-Arg-ValfHis-Pro-Val-His-Ala-Gly~Pro-Ile- 5 -Ala-Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-X-Z d) H-X-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala-Glu-Trp-Asp-Arg- -Val-His-Pro-Val-X-Z 10 e) H-X-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-Ile-Ala- -Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-Ser-Asp-Ile-Ala- -Gly-Thr-Thr-Ser-Thr-Leu-Gln-Glu-Gln-Ile-Gly-Trp-Met- -Thr-Asn-Asn-Pro-Pro-Ile-Pro-Val-Gly-Glu-Ile-Tyr-Lys- -Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys-Ile-X-Z 15 f) H-X-Glu-Ile-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn- -Lys-Ile-Val-Arg-Met-X-Z g) H-X-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys:Ile- 20 -Val-Arg-Met-Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Ile-Leu-Asp-Ile-Arg- -Gln-Gly-Pro-Lys-Glu-Pro-Phe-Arg-Asp-Tyr-Val-Asp-Arg- -Phe-Tyr-Lys-Thr-Leu-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala-Ser-Gln-Glu- -Val-Lys-Asn-Trp-Met-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn- -Ala-Asn-Pro-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly- 25 -X-Z h) H-X-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu~Val-Gln~Asn-Ala-Asn-Pro-Asp- -Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr- -Leu-Glu-Glu-Met-Met-Thr-Ala-Cys-Gln-Gly-Val-Gly-Gly- 30 -Pro-Gly-His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala-Met-Ser- -Gln~Val-Thr-Asn-Thr-Ala-Thr-Ile-Met-Met-X-Z, i både oxiderad och ej oxiderad form, varvid i den oxiderade formen en brygga bildats mellan de två cysteinföreningarna i peptiden 35 i) H-X-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Met- -Met-Thr-Ala-Cys-Gln-X-Z 10 15 20 25 30 35 468 168 7 där X representerar en kemisk bindning eller en kopplings- underlättande aminosyrasekvens, och Z representerar -NH eller -OH. 2 Peptiderna enligt föreliggande uppfinning benämns lämpligtvis a) HIV-l b) HIV-l C) HIV-1 d) HIV-l e) HIV-l f) HIV-l g) HIV-1 h) HIV-1 i) HIV-1 hxb2 hxb2 hxb2 hxb2 hxb2 hxb2 hxb2 hxb2 hxb2 133-193 143-156 173-233 203-218 213-273 260-276 262-338 318-378 335-351 939 939 939 939 939 939 939 939 939 I en annan aspekt hänför sig föreliggande uppfinning till ett diagnostiskt antigen med förmåga att binda till antikroppar med bindningsaffinitet för föreningar inne- hållande en aminosyrasekvens motsvarande en epitop eller samling av epitoper i HIV-1 p24.

I en ytterligare aspekt hänför sig föreliggande upp- finning till ett förfarande för särskiljande mellan ett falskt och sant diagnosticerat HIV-l-positivt serumprov från en individ, vilket förfarande kännetecknas av att åtminstone ett diagnostiskt antigen med förmåga att binda till antikroppar med bindningsaffinitet för föreningar innehållande en aminosyrasekvens motsvarande en epitop eller samling av epitoper i HIV-1-p24, eventuellt kopplat till en bärare, sätts till serumprovet, och att eventuellt bildade antigen/antikroppkomplex detekteras genom använd- ning av en immunoanalys, varigenom särskiljandet åstadkoms med basis på att serumprovet är falskt HIV-1-positivt om komplexen detekteras och sant HIV-1-positivt om komplexen inte detekteras. 468 168 10 15 20 25 30 35 8 Vid en föredragen utföringsform av förfarandet en- ligt uppfinningen är det diagnostiska antigenet ett diagnostiskt antigen enligt uppfinningen.

Andra kännetecken och särdrag hos uppfinningen fram- går av de efterföljande patentkraven.

Bland de hittills kända AIDS-inducerande retrovirusen är HIV-1 det mest kända i världen, medan det strukturellt delvis annorlunda HIV-2 huvudsakligen är begränsad till Västafrika. Retrovirusen HTLV-1 och HTLV-2 inducerar inte AIDS, utan AIDS-relaterade sjukdomar, t ex T-cell-leukemi.

Föreliggande uppfinning hänför sig därför till HIV-1, liksom till för HIV-1-proteiner unika aminosyrasekvenser.

HIV-l-virusets inre delar, t ex nukleokapsiden eller den RNA-innehållande kärnan, är skyddad av ett hölje. De inre delarna, kallade gag (gruppspecifikt antigen), och höljet, kallat env, är uppbyggda av olika proteiner. Dessa proteiner, dvs prekursorerna, förekommer övervägande i början av virusets livscykel, medan andra är övervägande i senare faser. l Följande tabell anger huvudsakliga gener och gen- produkter hos HIV-1. gen Genprodukter/proteiner gruppspecifikt antigen/kärna (gag) .u-:- polymeras (pol) p17, p24, p55 p3l, p51, p66 hölje (env) gp4l, gpl20, gp16O p protein 9P Siffrorna anger de ungefärliga molekylvikterna för protei- glykoprotein nerna uttryckta i kilodaltons. p55 är en prekursor till p24 och pl7. gp16O är en prekursor till gpl2O och gp4l. 10 15 20 25 30 35 468 16si 9 I ett visst skede av virusets livscykel klyver ett enzym p24-molekylen från p55-molekylen. Hela p24-proteinet utgör således en del av det ursprungliga p55-proteinet.

Eftersom föreliggande uppfinning hänför sig till peptider med förmåga att reagera med antikroppar som inducerats av en aminosyrasekvens motsvarande en epitop eller samling av epitoper hos HIV-1 p24, är även p55 inkluderat i denna definition. Det i föreliggande patentansökan och i patent- kraven genomgående använda uttrycket "en epitop eller sam- ling av epitoper hos HIV-1 p24" är sålunda avsett att in- kludera samma epitop eller epitoper hos HIV-1 p55.

Peptiderna enligt föreliggande uppfinning har förmåga att reagera med antikroppar som framkallats mot en amino- syrasekvens som motsvarar eller är nära relaterad till en epitop eller samling av epitoper hos HIV-l p24-proteinet.

Alla dessa nya peptider och/eller delar därav reage- rar på ett unikt, specifikt sätt med ovannämnda icke- HIV-l-antikroppar.

I peptiderna enligt föreliggande uppfinning represen- terar X en kemisk bindning eller en sekvens med åtminstone 4, företrädesvis 8, särskilda aminosyrarester, vilka var och en är valda från den grupp som består av -Thr- och -Ser-. När X är en aminosyrasekvens kan den befinna sig antingen i C- eller N-änden av peptiden, men inte i båda ändarna samtidigt. Om den t ex är belägen i C-änden, mot- svarar X i N-änden en kemisk bindning och vice versa.

Emellertid kan X vara en bindning i båda ändarna av pepti- den enligt föreliggande uppfinning. Aminosyrasekvensen fungerar som en kopplingsunderlättande spacer, som möjlig- gör riktig bindning till bäraren till vilken peptiderna enligt föreliggande uppfinning skall bindas under sär- skiljningsförfarandet. Sekvensen X bör inte vara en amino- syrasekvens som skadligt påverkar resultatet vid diagnos- metoden. Följaktligen bör den inte ha alltför stor ladd- ning eller vara alltför hydrofob, och den bör heller inte störa peptidernas konformation. Aminosyrorna treonin och serin uppfyller dessa krav särskilt väl, och vilken som 468 168 10 15 20 25 30 35 lO helst av aminosyrorna i sekvensen X kan vara treonin eller serin. Antalet aminosyror i denna spacer-sekvens bör vara åtminstone 4, men vid en föredragen utföringsform enligt föreliggande uppfinning används 8 aminosyror.

Polypeptiderna enligt föreliggande uppfinning kan via aminosyrasekvensen X vara bundna till en bärare genom fysikalisk/kemisk interaktion, såsom t ex kovalent bind- ning, jonbindning, vätebindning eller hydrofob bindning.

Exempel på kovalent bindning är ester-, eter- och disul- fidbindning.

Det här använda uttrycket "bärare" bör tolkas vittom- fattande, och det kan vara vilket material som helst som är förenligt med och inte skadligt påverkar förfarandet enligt föreliggande uppfinning, t ex hartser, mikroplat- tor, plastytor, geler, matriser etc.

Det här använda uttrycket "epitop" avser antigen el- ler immunogen determinant och hänför sig till en specifik del av en struktur hos ett antigen som inducerar ett immunsvar, och de producerade antikropparna är riktade mot denna del.

Immunoanalysmetoden enligt föreliggande uppfinning kan vara en enzymimmunoanalys (EIA), radioimmunoanalys (RIA), immunoanalys som involverar märkning med en metall, en fluorescensimmunoanalys (FIA) eller en immunoanalys vid vilken peptiden är löslig och inhiberar en annan reaktion.

Såsom angetts ovan har peptiderna enligt föreliggande uppfinning förmåga att binda till antikroppar som fram- kallats mot aminosyrasekvenser motsvarande en epitop eller samling av epitoper i HIV-1 p24. Sålunda har dessa anti- kroppar inte framkallats mot HIV-l-proteiner. Det är rim- ligt att förmoda att p24-antikroppreaktioner antingen be- ror på slumpmässig eller selektionsstyrd antigenisk mimi- kry mellan den C-terminala delen hos p24-aminosyrasekven- sen och en okänd icke-HIV-epitop. Ursprunget kan vara autoimmunitet eller immunisering med ett annat retrovirus än HIV. 10 15 20 25 30 35 468 168 ll Kort beskrivning av ritningarna Fig l visar fördelning av absorbansskillnaderna vid EIA med från HIV-1 gag erhållna syntetiska peptider.

Fig 2 visar reaktivitetsmönster för sex långa, synte- tiska peptider som erhållits från HIV-1 p24.

Fig 3 visar elektroforetisk immunoblotting med HIV-l- antigen för ett p24 EIB-reaktivt och ett HIV-l gag 318-378-reaktivt, humant serum (nr I, tabell 3) före och efter trefaldig absorption "i brunn" med till fast fas bundet HIV-l gag 318-378 (A), HTLV-1 gag 118-140 (B), eller brunnar som skenbelagts med PBS (C).

FÖRSÖK Identifieringgav HIV-1 p24-reaktiva sera Först utfördes ett standardmässigt HIV-1-helvirus- antikroppscreeningtest, Organon Vironostica-anti-HIV I (Organon Technica). Serumprover tillåts reagera med HIV-l- helvirus bundet till en fast fas. Eventuell bindning av antikroppar till virusets olika delar detekteras genom mätning av provets absorbans. Prover som uppvisar en absorbans överstigande ett förutbestämt tröskelvärde bedöms vara positiva.

I föreliggande fall testades ca 150 000 friska per- soner i södra regionen av Sverige, och 785 bedömdes vara positiva. Blodgivare, gravida kvinnor och heterosexuella personer som befarade att de var HIV-smittade, men som väsentligen saknade riskbeteende, utgjorde majoriteten av dessa provgivare.

Därefter underkastades dessa 785 positiva sera en konfirmativ elektroimmunoblottinganalys (EIB), dvs en Western blot (beskriven ovan). Nio av de 785 proverna upp- visade ett enkelt p24-mönster av serologisk aktivitet.

Bland personerna som donerat dessa 9 sera var 5 kvinnor, 3 män och en av okänt kön. Åldrarna var 22, 24, 24, 24, 25, 33, 36 och 57. som angavs på Åldern var okänd för en person. De orsaker ifyllningsformuläret inför testet var: blodgivare 4, graviditet 3 och okända 2. Personerna kon- taktades inte, eftersom det inte ansågs vara nödvändigt 4es 163 10 15 20 25 30 35 12 att oroa dem i detta skede av undersökningen beträffande naturen av de falskt positiva HIV-serologiska reaktio- nerna. 20 bekräftat HIV-l-positiva sera och 17 seronegativa, ej selekterade svenska blodgivare användes som kontroller.

När reaktiviteter påträffades för tre eller två (oxiderad och ej oxiderad HIV-l gag 318-378 och HIV-1 gag 262-338) av peptiderna, undersöktes deras ursprung på nytt. De visade sig vara tidiga sera från patienter som kort därefter övergick till fullständig EIB-seropositivitet.

Dessa sera kunde följaktligen inte inkluderas i studien.

Internationellt accepterade kriterier för bedömning av HIV-1-seropositivitet följdes (se The Consortium for Retrovirus Serology Standardization. Serological diagnosis of human immunodeficiency virus infection by Western Blot testing. JAMA 260:674-679 (1988) and Centers for Disease Control: Interpretation and use of the Western blot assay for serodiagnosis of human immunodeficiency virus type 1 infections. MMWR 1989, 38:l-7).

Immunoanalyser Fyra kommersiella analyser användes: Ett HIV-l-hel- virusantikropptest, nämligen Organon Vironostica anti-HIV (Organon Technica), HIV-1-antikropp-EIA enligt Abbott, där ett rekombinant antigen har framställts från bakterier, konfirmativ HIV-1-antikroppkompetitions-EIA enligt Abbott ENVACORE och ett HIV-l-elektroforetiskt immunoblot (EIB)- system enligt Du Pont Biotech. Dessa analyser användes enligt tillverkarens instruktioner.

EIB-remsor mättes med en Bio-Rad 620 videodensito- meter (Richmond, California, USA) (se Blomberg J, Klasse PJ: Quantification of immunoglobulin G on electrophoretic immunoblot strips as a tool for human immunodeficiency virus serodiagnosis. J Clin Microbiol 1988, 26:lll-ll5).

Peptid-EIA-analyser utfördes ungefär som beskrivits (se Blomberg J, Nilsson I, Andersson M: Viral antibody screening system that uses a standardized single dilution immunoglobulin G enzyme immunoassay with multiple anti- lO 15 20 25 30 35 468 168 13 gens. J Clin Microbiol 1983, l7:108l-1091 och Klasse PJ, Pipkorn R, Blomberg J: Presence of antibodies to a puta- tively immunosuppressive part of human immunodeficiency virus (HIV) envelope glycoprotein gp4l is strongly asso- ciated with health among HIV-positive subjects. Proc Natl Acad Soi USA 1988, 85:5225-5229). 100 ul av 20 pl/ml peptid i PBS-M (PBS: 8,0 g NaCl, 0,2 g KHZPO4, 1,4 g Na2HP04-2H20, 0,2 g KCl per liter) (PBS-M: PBS med 10 ul/ml natriummertiolat) fick först binda under 2-6 h vid rumstemperatur, därefter över natten vid 4°C. 200 pl blockeringslösning (4% bovint serumalbumin (BSA)/0,2% gelatin/0,05% Tween 20) tillsattes, fick binda under 2-6 h vid rumstemperatur, därefter över natten vid 4°C, och frystes. På användningsdagen tinades plattorna och tvätta- des tre gånger i tvättvätska (nyligen tillverkad av 0,05% Tween 20 i PBS). 100 ul lämpligt spädda kontroll- och testsera spädda till l/50 i spädningsmedel I (3% BSA, 0,2% gelatin, 0,05% Tween 20 i PBS-M) tillsattes därefter, och plattorna inkuberades under skakning vid rumstemperatur under 1 h. Efter ytterligare en tvättning tillsattes 100 pl biotinylerat, med affinitetskromatografi renat get- antihumant IgG (Sigma), som spätts till l/1500 i späd- ningsmedel II (0,2% gelatin i PBS-M), och inkuberades under skakning vid rumstemperatur under 1 h. Efter tvätt- ning tillsattes 100 pl avidinperoxidas (Sigma), som spätts till 1/300 i spädningsmedel II, och plattorna inkuberades under skakning under l h vid rumstemperatur. Plattorna tvättades noggrant och slogs torra. 100 ul substratlösning (20 mg o-fenylendiamin + 10 ul 30% H202 i färgbuffert, varav ny tillverkades varje dag) (färgbuffert: 34,7 mM citronsyra, 66,7 mM Na2HPO4, pH 5,0) tillsattes, och plat- torna inkuberades i mörker vid rumstemperatur under 30 min och avlästes vid 450 nm i en mikroplattfotometer. 468 168 10 15 20 25 30 35 14 Syntetiska peptider Följande peptider användes vid försöken: Tabell 1. Använda syntetiska peptider vid föreliggande studie. Pilarna visar cysteinrester som vi har försökt förena genom oxidation.

EIV-1 hïb2 Qgg 133~193 PIVQKIQGQXVEQAISPRTLKLïïEYYEE1APSFEVIPKFSALSEGATPQDLKÉ!LXTVGG EIV-1 lïb2 ggg 143-156 VEQAISFETLKARV EIV-1 Iïb2 gg; 173-231 SÅLSEGATPQDLKÉXLFTïGGEQlA!Q!L!ETIKEEAA2ïDRVEPVEAG?IAPGQ!iEPEG EïV'1 hIb2 säs 201-218 rwzxsszzzisxvzrv EïY~1 hrë2 sig 210-:so Arwnavsvvzisplipsçxzz Exv-1 1:22 gg; 213-27: naïfipvzzsæzAæeçxxzyxesnzisfwswzqscïswxfsxærlrvszzïxnï11Ls;xz1 EIY-1 hXh2 ggg 223-243 IAPGQV?E°R3SBIAGTï5TL ...a EIY-1 hIb2 2:4 2f°'276 sïïxzwïzzczxszvax EIV-1 hXÉ2 gg 262-338 YfišïïILGLKXEYEXYSPTSILDÉRQGFIEPYRÉYYDRFYITLRAEQA°QÉTE¥ïKÉETLlVQKAKP3CKTILil*” " u-U sïv-1 hxrz gg; 2:4-:oo szzqsyxzërzsïvsar sß<> sso v v fizv-1 :xt gå; sas-3: fsfL:vçxAx?acxf*¥f1=fl=11ß°f=fxfAcqsvss§ss:;zv¿¿;1w=^vfx:¿:;xn .a-...Jv- ...uk-uu ...wg .

HIV-1 EXEZ gg; 335-351 IÅLGPÅÅTLÉEXEÉACQ ïïï-1 hXf2 säg 24:-sr: facasvss2:szAavLAsAxsçv:s fïV~1 iïf2 2:1 35;-:sz xaavaisixsçvfxsifïxxçacx 10 15 20 25 30 35 468 168 15 Såsom framgår av tabellen ovan användes vid försöken några kortare fragment av de längre peptiderna enligt upp- finningen. Av dessa kortare peptider är endast HIV-l hxb2 gag 143-156, 203-218, 260-276 och 335-351 inbegripna i föreliggande uppfinning. Peptidernas aminosyrasekvenser är här uttryckta med enbokstavssymbolsystemet i ett försök att på ett enklare sätt visa relationen mellan de längre peptiderna och de kortare fragmenten därav.

Både de korta och långa peptiderna (17-77 aa) använ- des i ett försök att uppfånga så mycket antikroppreaktivi- tet som möjligt.

Peptiderna syntetiserades genom användning av Fmoc- kemi på en automatisk peptidsyntetiseringsmaskin med fast fas och av typ Applied Biosystems 43OA. De renades där- efter med hjälp av HPLC av typ omvänd fas på en C18- kolonn. Deras renhet var 95% enligt ett analytiskt HPLC- förfarande. Peptiden HIV-1 gag 318-378 testades både i oxiderad och ej oxiderad form.

Enligt uppfinningen kan peptiderna användas som ett diagnostiskt antigen antingen löst i serumprovet eller bundet till en bärare. I det följande kommer några sätt att använda det diagnostiska antigenet enligt föreliggande uppfinning att beskrivas.

Reaktivitet för p24-reaktiva sera i kommersiella HIV-l- antikropptester ,¿g,;~e Vid detta försök utfördes tre kommersiella antikropp- EIA, dvs den ovannämnda Organon Vironostica anti-HIV-ana- lysen, HIV-1-antikropp-EIA enligt Abbott och konfirmativ HIV-1-antikroppkompetitions-EIA enligt Abbott ENVACORE.

Såsom angetts ovan erhölls de nio HIV-l p24-reaktiva serumen från 785 upprepat positiva sera från en HIV-l- antikroppscreeningtest. Dessa erhölls i sin tur från ca 150 OOO sera som underkastats HIV-1-antikroppscreening- tester på primära testställen. Fördelningen av reaktivi- teter hos de 9 serumen med p24-band i HIV-l-EIB visas i tabell 2. 468 368 10 15 20 25 30 35 16 TABELL 2 Egenskaper hos nio analyserade HIV-l p24-reaktiva sera och uppgifter om patienterna från vilka dessa erhållits HIV-l-hel- Rekonbinant Reaktiv virus-EIA HIV-l-EIA vid EIA enligt enligt Serum med lång Organon Abbott EIB- Orsak nr Papua (A492) (A492) mönster Kon inner :in rest A 262-338 0,594/0,194 0,061/0,122 p24 K 25 graviditet B 133-193 0,1Z3/0.162 0,064/0,308 p24 K 24 blodgivare C 133-193 0,141/0,130 0,128/0,357 p24 M 22 blodgivare D 133-193 0,2?9/0,130 0,040/0,234 p24 K 24 blodgivare E 133-193 0,209/0,137 0,109/0,244 p24+p55 M ? okänd F 318-378 0,056/0,109 0,448/0,216 p24+p55 K 33 graviditet G infin ROH/dlß OJSWOJ96 fli M 24 Mowhæm H 318-328 0,090/0,154 i0,282/0,251 p24 K 136 graviditet I ingen 0,165/0,129 0,048/0,320 p24 K 57 okänd Såsom framgår av tabell 2 reagerade endast fem sera i helvirus-EIA enligt Organon, medan två endast reagerade vid rekombinant HIV-1-antigen;§laQenligt Abbott. Om värdet till vänster om snedstrecket i tabellen är högre än värdet på högra sidan, anses serumet ha reagerat. De kvarvarande två hade varit reaktiva vid Organon-testen på det remitte- rande teststället, men var inte positiva i föreliggande uppfinnares laboratorium. Inget serum reagerade vid kompe- titions-EIA enligt Abbott ENVACORE (ej visat). Sera som var reaktiva vid Organon-testen kom från testställen där Organon-tester användes, och de som reagerade vid rekombi- nant-testen enligt Abbott kom från ställen där detta test användes. Såsom dessutom framgår av tabellen var tre av fem Organon-reaktiva sera positiva vid EIA med peptiderna gag 133-193 och en med peptiden 262-338 enligt föreliggan- Û) 10 15 20 25 30 35 468 168 17 de uppfinning. Dessa fyra sera var negativa vid HIV-1 EIA enligt Abbott, medan de tvâ sera som var reaktiva vid rekombinant EIA enligt Abbott var positiva vid EIA med peptiden gag 318-378 enligt föreliggande uppfinning och negativa vid helvirus-EIA enligt Organon. Sålunda kan reaktivitetsmönstret vid kommersiella anti-HIV-tester vara en indikation på vilken del av p24-molekylen som anti-p24- antikropparna är riktade mot.

Reaktivitet för p24-positiva sera med syntetiska peptider erhållna från p24. Jämförelse med bekräftat HIV-l-anti- kroppositiva och -negativa blodgivarsera Fördelningen mellan IgG-reaktiviteter, dvs absorbans- skillnaderna, vid EIA för HIV-1 p24-antikroppositiva sera för fem långa och tio korta p24-härledda, syntetiska pep- tider visas i fig la, lb och lc. Sera i dessa försök var a) nio p24-reaktiva sera, b) 20 bekräftat HIV-1-anti- kroppositiva sera och c) sera från 17 HIV-seronegativa blodgivare. I tabell 3 visas reaktivitetsfrekvensen (en absorbansskillnad överstigande 0,4) för syntetiska pep- tider härledda från HIV-1 p24-sekvensen. 468 768 18 TABELL 3 Reaktivitetsfrekvens (absorbansskillnad överstigande 0,4) för syntetiska peptider härledda från HIV-1 p24-sekvensen 5 Frekvens Frekvens Frekvens för svenska för svenska för svenska bekräftade serunnega- p24-reaktiva HIV-l-posi- tiva blöd- 10 Peptid sera tiva sera givarsera 1\'=9 N=20 N=l7 HIV-l hxb2 gag 133-193 5 3 HIV-1 hxb2 gag 143-156 0 2 15 HIV-l hxb2 gag 173-233 0 1 0 HIV-l hxbZ gag 203-218 0 1 0 HIV-l hxb2 gag 210-230 0 0 0 20 HIV-l hxb2 gag 213-273 0 6 1 HIV-1 hxb2 gag 223-243 0 0 0 HIV-l hxb2 gag 260-276 0 3 0 HIV-l hxb2 gag 262-338 1 3 3 25 HIV-l hxb2 gag 284-300 0 0 0 HIV-1 hxb2 gag 318-378 2 15 0 sanna, i oxiderad form 1 15 0 HIV-l hxb2 gag 335-351 0 5 0 30 HIV-l hxb2 gag 348-373 0 0 0 HIV-l hxbZ gag 359-382 0 0 0 35 10 15 20 25 30 35 468 168 19 Enligt fig la reagerade fyra p24-positiva sera, varav två starkt, med den N-terminala långa peptiden HIV-1 gag 133-193, ett serum med HIV-1 gag 262-338 och två med den C-terminala HIV-1 gag 318-378 i oxiderad form. Ett serum hade en reaktivitet med gag 133-193 strax under det stipu- lerade tröskelvärdet för en absorbansskillnad av 0,4.

Ingen av de p24-positiva serumen reagerade med någon av de kortare HIV-1 gag-peptiderna.

Däremot reagerade 15 av 20 bekräftat HIV-1-positiva sera mycket starkt med peptid 318-378 både i ej oxiderad och oxiderad form (fig lb) och i mindre omfattning med de andra långa p24-härledda peptiderna. Serum från HIV-1- seronegativa svenska blodgivare var i hög grad icke-reak- tiva med samtliga peptider (fig lo). Peptiderna 213-273 och 262-338 reagerade emellertid även signifikant med några blodgivarsera, och de resultat som erhölls härvid måste tolkas med viss försiktighet.

Inget av de falska HIV-antikroppositiva serumen eller blodgivarserumen reagerade med de tio kortare p24-härledda peptiderna. Fem av de bekräftade HIV-antikroppositiva se- rumen reagerade med HIV-1 gag 335-351, tre med HIV-1 gag 260-276, två med HIV-1 gag 143-156 och en med HIV-1 gag 203-218 (se tabell 3). Sålunda var de kortare peptiderna inte användbara för demonstration av falskt positiva HIV- antikroppar, men var användbara för en ytterligare be- skrivning av några av de p24-epitoper som påträffats hos HIV-1-infekterade personer.

Reaktivitetsfrekvenserna för långa, syntetiska p24- härledda peptider visas i tabell 4. 21 68 '16 10 15 20 25 30 35 c) 20 TABELL 4 Reaktivitetsfrekvens för långa, syntetiska peptider här- ledda från HIV-1 p24.

Peptid Grupp Sannolikhet (exakt test enligt Fisher) sero- nega- FP/TP FP/BD TP/BD bekräf- tiva p24- tat po- blod- HIV gag positiv sitiv givare (FP) (TP) (BD) 133-193 4/9 3/20 0/17 0,10 0,008 ns 173-233 0/9 1/20 0/17 ns ns ns 213-273 0/9 5/20 1/17 0,13 ns 0,13 262-338 1/9 3/20 3/17 ns ns ns 318-378 2/9 15/20 0/17 0,01 0,11 0,000001 18-378 ox 0/9 15/20 0/17 0,0002 ns 0,000001 Förutom den förväntade signifikant högre reaktivite- ten för bekräftade HIV-antikroppositiva sera gentemot blodgivarsera eller falskt positiva sera, visades en av- sevärd skillnad mellan falskt positiva sera och blodgivar- sera med peptiden HIV-1 gag 133-193 (p=O;OO8). Skillnaden mellan falskt positiva sera och blodgivarsera för pepti- derna HIV-1 gag 318-378 (ej oxiderad) och HIV-l gag 262-338 uppnådde endast en gränslinjesignifikans (p=O,ll) eller var inte signifikant. Reaktivitetsmönstret för de sex långa p24-peptiderna visas i fig 2, i vilken de skuggade ytorna visar en absorbansskillnad överstigande 0,4. Antalet sera som uppvisade ett visst reaktivitets- mönster visas under "nr". FP = p24-reaktiva (falskt positiva) sera. TP = BD = bekräftat HIV-1-antikroppositiva sera. HIV-l-seronegativa blodgivarsera. Peptid- numreringen framgår av tabell l. 10 15 20 25 30 35 468 168 21 Absorption av p24-positiva sera med immobiliserade peptider p24-antikroppositiva sera späddes för erhållande av en absorbansökning av 0,5-1,0 i förhållande till det i brunnen med negativt kontrollprov i EIA-utspädningsvätska (3% BSA, O,2% gelatin i PBS-M). Sera inkuberades under l h i brunnar som i förväg belagts med p24-peptider. Superna- tanten överfördes därefter till en intilliggande brunn och inkuberades under ytterligare l h. Detta upprepades ytter- ligare en gång. Totalt gjordes sålunda 3 st l h långa ab- sorptioner. Supernatanten späddes därefter till hälften i blottinglösning, överfördes till en EIB-brunn och tilläts reagera vid en HIV-1-EIB (Du Pont) vid standardbetingelser för övrigt. Vid de flesta försöken användes brunnar som belagts med den EIA-reaktiva p24-peptiden tillsammans med följande kontroller: Brunnar som belagts med en ej reaktiv p24-peptid, en icke-HIV-peptid (HTLV-1 gag 118-140) och brunnar som parallellt skenbelagts med PBS. p24-bandets intensitet mättes med hjälp av reflektansdensitometri på EIB-remsorna (se Blomberg J, Klasse PJ: Quantification of immunoglobulin G on electrophoretic immunoblot strips as a tool for human immunodeficiency virus serodiagnosis. J Clin Microbiol 1988, 26:ll1-115 and Blomberg J, Klasse PJ: Specificities and sensitivities of three systems for de- termination of antibodies to human immunodeficiency virus by electrophoretic immunoblotting. J Clin Microbiol 26:lO6-110 (1988)).

För att försäkra sig om att peptidreaktiviteterna vid EIA verkligen var riktade mot p24 hos HIV-1, inkuberades 6 av de 8 p24-peptidreaktiva serumen (nr A-E och H i tabell 2) med p24-härledda peptider och kontrollpeptider i brun- nar på EIA-mikroplattor under tre på varandra följande absorptioner av vardera 1 h. För att förvissa sig om att en absorption av peptidreaktiv antikropp hade ägt rum, utfördes en EIA i samma brunnar efter fullbordandet av absorptionerna. De kvarvarande antikropparna studerades därefter i en standard HIV-1 EIB över natten. I två (nr A 468 168 10 15 20 25 30 35 22 och H) av de sex serumen minskade anti-p24-aktiviteten märkbart genom absorption med den immobiliserade peptid som hade reagerat starkt i EIA. Ett av dessa två sera var reaktivt med och absorberades av peptid 262-338 och ett med peptid 318-378. Anti-p24 EIB-banden minskade inte efter absorption med en annan HIV- eller HTLV-härledd, immobiliserad peptid eller med skenbelagda brunnar. (Jfr fig 3, där "+" = bekräftat HIV-antikroppositiv kontroll och "-" = HIV-antikroppnegativ serumkontroll. Pilarna visar positioner i HIV-1-proteinerna.) Sålunda stärktes argumenten för en lokalisering av antikroppreaktiviteten på dessa två delar av p24 i två av de för peptidabsorption underkastade peptidreaktiva p24-positiva serumen.

De långa peptiderna är valda för optimering av den serologiska reaktiviteten med HIV gag-antikroppar. Långa peptider simulerar konformationella (icke-kontinuerliga) epitoper hos HIV-l p24 gag särskilt väl. Sådana långa pep- tider har aldrig tidigare använts för HIV-serologi. De långa peptiderna, särskilt HIV-l gag 133-193 och 318-378, är utmärkta reagens för både särskiljande av sann från falsk HIV-1-antikroppreaktivitet och för detektion av båda typerna av reaktivitet. I syfte att erhålla en maximal särskiljande effekt mellan falska och positiva reaktivi- teter, används företrädesvis en kombination av flera pep- tider enligt föreliggande.uppfining som diagnostiska anti- gener. i)

Claims (6)

468 168) 23 PATENTKRAV

1. Peptider av vilka flera kan användas i kombination för särskiljande mellan ett falskt och sant diagnostiserat HIV-1-positivt serumprov, vilket först har diagnostiserats vara positivt vid ett standardmässigt HIV-1-antikropp- screening-EIA-test och därefter uppvisat ett p24-mönster av serologisk aktivitet vid en elektroforetisk immunblot- tinganalys, k ä n n e t e c k n a d e därav, att de har formlerna a) H-X-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Ile-Gln-Gly-Gln-Met-Val-His- -Gln-Ala-Ile-Ser-Pro-Arg-Thr-Leu-Asn-Ala-Trp-Val-Lys- -Val-Val-Glu-Glu-Lys-Ala-Phe-Ser-Pro-Glu-Val-Ile-Pro- -Met-Phe-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp- -Leu-Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly-X-Z b) H-X-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp-Leu- -Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly-His-Gln-Ala-Ala- -Met-Gln-Met-Leu-Lys-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala- -Glu-Trp-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-Ile- -Ala-Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-X-Z c) H-X-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala-Glu-Trp-Asp-Arg- -Val-His-Pro-Val-X-Z d) H-X-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-Ile-Ala- -Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-Ser-Asp-I1e-Ala- -Gly-Thr-Thr-Ser-Thr-Leu-Gln-Glu-Gln-Ile-Gly-Trp-Met- -Thr-Asn-Asn-Pro-Pro-Ile-Pro-Val-Gly-Glu-Ile-Tyr-Lys- -Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys-Ile-X-Z e) H-X-Glu-Ile-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn- -Lys-Ile-Val-Arg-Met-X-Z f) H-X-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys-Ile- 468 168 24 -Val-Arg-Met-Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Ile-Leu-Asp-Ile-Arg- -Gln-Gly-Pro-Lys-Glu-Pro-Phe-Arg-Asp-Tyr-Val-Asp-Arg- -Phe-Tyr-Lys-Thr-Leu-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala-Ser-Gln-Glu- -Val-Lys-Asn-Trp-Met-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn- -Ala-Asn-Pro-Asp-Cys~Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala4Leu-Gly- -x-z g) H-X-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn-Ala-Asn-Pro-Asp- -Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr- -Leu-Glu-Glu-Met-Met-Thr-Ala-Cys-Gln-Gly-Val-Gly-Gly- -Pro-Gly-His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala-Met-Ser- -Gln-Val-Thr-Asn-Thr-Ala-Thr-Ile-Met-Met-X-Z, i både oxiderad och ej oxiderad form, varvid i den oxiderade for- men en brygga bildats mellan de två cysteinföreningarna i peptiden, och h) H-X-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Met- -Met-Thr-Ala-Cys-Gln-X-Z där ett X representerar en kemisk bindning och det andra representerar en kemisk bindning eller en kopplingsunder- lättande aminosyrasekvens, och Z representerer -NH2 eller -OH.

2. Peptid enligt kravet 1, k ä n n e t e c k - n a d därav, att den kopplingsunderlättande aminosyrasek- vensen representerar åtminstone 4, företrädesvis 8, amino- syrarester, vilka var och en är vald från den grupp som består av -Thr- och -Ser-.

3. Diagnostiska antigener, av vilka flera kan använ- das i kombination för särskiljande mellan ett falskt och sant diagnostiserat HIV-1-positivt serumprov, vilket först har diagnostiserats vara positivt vid ett standardmässigt HIV-1-antikroppscreening-EIA-test och därefter uppvisat ett p24-mönster av serologisk aktivitet vid en elektrofo- retisk immunblottinganalys, varvid de diagnostiska antige- nerna har förmåga att binda till antikroppar med bind- ningsaffinitet för föreningar innehållande en aminosyra- 468 168 25 sekvens motsvarande en epitop eller en samling av epitoper hos HIV-1 p24, k ä n n e t e c k n a d e därav, att var och en av antigenerna huvudsakligen består av ett antigen som är valt bland peptider som inbegriper aminosyrasekven- sen a) H-X-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Ile-Gln-Gly-Gln-Met-Val-His- -Gln-Ala-Ile-Ser-Pro-Arg-Thr-Leu-Asn-Ala-Trp-Val-Lys- -Val-Val-Glu-Glu-Lys-Ala-Phe-Ser-Pro-Glu-Val-Ile-Pro- -Met-Phe-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp- -Leu-Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly-X-Z b) H-X-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp-Leu- -Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly-His-Gln-Ala-Ala- -Met-Gln-Met-Leu-Lys-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-G1u-Ala-Ala- -Glu-Trp-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-Ile- -Ala-Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-X-Z c) H-X-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala-Glu-Trp-Asp-Arg- -Val-His-Pro-Val-X-Z d) H-X-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-Ile-Ala- -Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-Ser-Asp-Ile-Ala- -Gly-Thr-Thr-Ser-Thr-Leu-Gln-Glu-Gln-Ile-Gly-Trp-Met- -Thr-Asn-Asn-Pro-Pro-Ile-Pro-Val-Gly-Glu-Ile-Tyr-Lys- -Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-GlyPLeü3Asn-Lys-Ile-X-Z e) H-X-Glu-Ile-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn- -Lys-Ile-Val-Arg-Met-X-Z f) H-X-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys-Ile- -Val-Arg-Met-Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Ile-Leu-Asp-Ile-Arg- -Gln-Gly-Pro-Lys-Glu-Pro-Phe-Arg-Asp-Tyr-Val-Asp-Arg- -Phe-Tyr-Lys-Thr-Leu-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala-Ser-Gln-Glu- -Val-Lys-Asn-Trp-Met-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn- -Ala-Asn-Pro-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly- -x-z 468 168 26 g) H-X-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn-Ala-Asn-Pro-Asp- -Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr- -Leu-Glu-Glu-Met-Met-Thr-Ala-Cys-Gln-Gly-Val-Gly-G1y- -Pro-Gly-His-Lys-Ala-Arg-Va1-Leu-A1a-G1u-Ala-Met-Ser- -Gln-Val-Thr-Asn-Thr-Ala-Thr-Ile-Met-Met-X-Z, i bàde oxiderad och ej oxiderad form, varvid i den oxiderade for- men en brygga bildats mellan de två cysteinföreningarna i peptiden, och I h) H-X-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-A1a-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Met- -Met-Thr-Ala-Cys-Gln-X-Z där ett X representerar en kemisk bindning och det andra representerar en kemisk bindning eller en kopplingsunder- lättande aminosyrasekvens, och Z representerer -NH2 eller -OH.

4. Förfarande för särskiljande mellan ett falskt och sant diagnostiserat HIV-1-positivt serumprov, vilket först har diagnostiserats vara positivt vid ett standardmässigt HIV-1-antikroppscreening-EIA-test och därefter uppvisat ett p24-mönster av serologisk aktivitet vid en elektro- foretisk immunblottinganalys, k ä n n e t e c k n a t därav, att en kombination av flera peptider som är valda fràn den grupp som består av a) H-X-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Ile-Gln-Gly-Gln-Met-Val-His- -Gln-Ala-I1e-Ser-Pro-Arg-Thr-Leu-Asn-Ala-Trp-Val-Lys- -Val-Val-Glu-Glu-Lys-Ala-Phe-Ser-Pro-Glu-Val-Ile-Pro- -Met-Phe-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp- -Leu-Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly-X-Z, b) H-X-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp-Leu- -Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly-His-Gln-Ala-Ala- -Met-Gln-Met-Leu-Lys-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala- -Glu-Trp-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-Ile- -Ala-Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-X-Z 468 168 27 c) H-X-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala-Glu-Trp-Asp-Arg- -Val-His-Pro-Val-X-Z d) H-X-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-I1e-Ala- -Pro-Gly-Gln-Met-Arg-G1u-Pro-Arg-Gly-Ser-Asp-Ile-Ala- -Gly-Thr-Thr-Ser-Thr-Leu-Gln-Glu-Gln-Ile-Gly-Trp-Met- -Thr-Asn-Asn-Pro-Pro-I1e-Pro-Va1-Gly-G1u-Ile-Tyr-Lys- -Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys-Ile-X-Z e) H-X-Glu-Ile-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn- -Lys-Ile-Val-Arg-Met-X-Z f) H-X-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys-Ile- -Val-Arg-Met-Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Ile-Leu-Asp-Ile-Arg- -Gln-Gly-Pro-Lys-Glu-Pro-Phe-Arg-Asp-Tyr-Val-Asp-Arg- -Phe-Tyr-Lys-Thr-Leu-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala-Ser-Gln-G1u- -Val-Lys-Asn-Trp-Met-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn- -Ala-Asn-Pro-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly- -X-Z g) H-X-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn-Ala-Asn-Pro-Asp- -Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr- -Leu-Glu-Glu-Met-Met-Thr-Ala-Cys-Gln-Gly-Val-Gly-Gly- -Pro-Gly-His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala-Met-Ser- -Gln-Val-Thr-Asn-Thr-Ala-Thr-Ile-Met-Met-X-Z, i både oxiderad och ej oxiderad form, varvid i den oxiderade for- men en brygga bildats mellan de tvà cysteinföreningarna i peptiden, och h) H-X-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-G1u-Met- -Met-Thr-Ala-Cys-Gln-X-Z där ett X representerar en kemisk bindning och det andra representerar en kemisk bindning eller en kopplingsunder- lättande aminosyrasekvens, och Z representerer -NH2 eller -OH, 468 168 28 varvid peptiderna har förmåga att binda till antikroppar med bindningsaffinitet för föreningar innehållande en aminosyrasekvens motsvarande en epitop eller samling av epitoper hos HIV-l p24 och eventuellt är kopplade till en bärare, sätts såsom antigener till serumprovet, och att eventuella bildade antigen/antikroppkomplex detekteras genom användning av en immunanalys, varvid särskiljandet åstadkoms med basis på att serumprovet är falskt HIV-1- positivt om komplexen detekteras och sant HIV-1-positivt om komplexen inte detekteras.

5. Förfarande enligt kravet 4, k ä n n e t e c k - n a t därav, att en enzymimmunanalys (EIA), en radio- immunanalys (RIA), en immunanalys som involverar märkning med metall, en fluorescensimmunanalys (FIA) eller en immunanalys vid vilken peptiden är löslig och inhiberar en annan reaktion används som immunanalys för detektion av antikropp/antigenkomplexet.

6. Förfarande enligt kravet 4, k ä n n e t e c k - n a t därav, att var och en av peptiderna enligt kravet 1 sätts till serumprovet kopplade till en bärare i form av ett harts, en mikroplatta, en plastyta, en gel eller en matris.