SE468168B - HIV-1, P24 PEPTIDES, DIAGNOSTIC ANTIGENS AND PROCEDURES FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSTICS OF PRELIMINARY HIV-1 POSITIVE SERUM TESTS - Google Patents

HIV-1, P24 PEPTIDES, DIAGNOSTIC ANTIGENS AND PROCEDURES FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSTICS OF PRELIMINARY HIV-1 POSITIVE SERUM TESTS

Info

Publication number
SE468168B
SE468168B SE9000595A SE9000595A SE468168B SE 468168 B SE468168 B SE 468168B SE 9000595 A SE9000595 A SE 9000595A SE 9000595 A SE9000595 A SE 9000595A SE 468168 B SE468168 B SE 468168B
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
ala
thr
leu
gly
ile
Prior art date
Application number
SE9000595A
Other languages
Swedish (sv)
Other versions
SE9000595D0 (en
SE9000595L (en
Inventor
J Blomberg
Original Assignee
Replico Medical Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Replico Medical Ab filed Critical Replico Medical Ab
Priority to SE9000595A priority Critical patent/SE468168B/en
Publication of SE9000595D0 publication Critical patent/SE9000595D0/en
Priority to AU74448/91A priority patent/AU7444891A/en
Priority to PCT/SE1991/000114 priority patent/WO1991013360A1/en
Publication of SE9000595L publication Critical patent/SE9000595L/en
Publication of SE468168B publication Critical patent/SE468168B/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

468 168 10 15 20 25 30 35 2 Det har observerats att en liten andel sera från människor som sannolikt inte är HIV-l-infekterade inne- håller antikroppar mot ett eller ett fåtal HIV-l-protei- ner, varav de flesta härrör från virusets inre gag-del. 468 168 10 15 20 25 30 35 2 It has been observed that a small proportion of sera from humans who are not likely to be HIV-1-infected contain antibodies to one or a few HIV-1 proteins, most of which are derived from the internal gag part of the virus.

Ett exempel på ett sådant protein är p24~proteinet. Sådana reaktiviteter kan ge upphov till "obestämda" HIV-l-reak- tioner vid elektroforetisk immunoblotting (EIB). De är en konstant källa till problem i laboratorier som skall be- kräfta HIV-l-antikroppscreeningresultat. Anti-p24-reak- tioner är ett stort diagnostiskt problem i både utvecklade länder och utvecklingsländer. Det är dyrt att utföra åt- skilliga konfirmativa tester på vart och ett av dessa sera. Utvärderingen av den biologiska orsaken till dessa reaktioner och utveckling av tester som underlättar sär- skiljandet av "sanna" från "falska" HIV-1-antikroppar är sålunda viktiga forskningsobjekt.An example of such a protein is the p24 ~ protein. Such reactivities can give rise to "indeterminate" HIV-1 reactions by electrophoretic immunoblotting (EIB). They are a constant source of problems in laboratories that have to confirm HIV-1 antibody screening results. Anti-p24 reactions are a major diagnostic problem in both developed and developing countries. It is expensive to perform several confirmatory tests on each of these sera. The evaluation of the biological cause of these reactions and the development of tests that facilitate the distinction between "true" and "false" HIV-1 antibodies are thus important research objects.

En av de mest kända typerna av falsk-positiv HIV-l- EIB-reaktivitet kännetecknas av en reaktivitet med p24- proteinet med eller utan dess prekursor_p55 i gag-delen, men ingen reaktivitet med något annat HIV-l-protein. Mest sannolikt erhålls ett falskt HIV-1-antikropptest när tes- ter baserade pà helvirus används, och särskilt alla tester där p24-proteiner är involverade. Ett enkelt anti-p24-band kan vara en signal på en tidig HIV-infektion, bero på en HIV-2-infektion, vara en följd av en "kryptisk" anti-HIV- serologisk reaktion (se Ranki AM, Krohn M, Allain JP, et al.: Long latency precedes overt seroconversion in sexually transmitted human immunodeficiency virus infec- tion. Lancet 1987, ii:589-593), eller vara en falskt positiv reaktion hos en person som aldrig varit i kontakt med HIV.One of the most well-known types of false-positive HIV-1 EIB reactivity is characterized by a reactivity with the p24 protein with or without its precursor_p55 in the gag moiety, but no reactivity with any other HIV-1 protein. A false HIV-1 antibody test is most likely to be obtained when tests based on whole viruses are used, and in particular all tests involving p24 proteins. A simple anti-p24 band may be a signal of an early HIV infection, be due to an HIV-2 infection, be the result of a "cryptic" anti-HIV serological reaction (see Ranki AM, Krohn M, Allain JP, et al .: Long latency precedes overt seroconversion in sexually transmitted human immunodeficiency virus infection (Lancet 1987, ii: 589-593), or be a false positive reaction in a person who has never been in contact with HIV.

De vanligaste konfirmativa testerna är Western blot- ting, inhiberings-EIA, peptid-EIA och radioimmunoprecipi- tation. Vanligtvis är 3 eller 4 konfirmativa tester nöd- vändiga för särskiljande mellan falskt och sant positiva sera. 10 15 20 25 30 35 468 168 3 Renat HIV-l-helvirus fraktioneras vid Western blot- ting med avseende på molekylvikten genom användning av elektrofores pà en polyakrylamidgel. De separerade HIV-l- proteinerna, som fungerar som virala antigener, överförs därefter från gelen via elektroforetisk blotting till ett nitrocellulosamembran. Alternativt kan rekombinanta pro- teiner eller syntetiska peptider som motsvarar HIV-l-pro- teinerna användas som antigener. Membranet skärs till remsor, som därefter bringas att reagera med test- och kontrollserum eller plasmaprover. Om anti-HIV-l-anti- kroppar är närvarande i provet, binder de under inkube- ringen till de virala antigenerna på nitrocellulosaremsor- na. Detta antigen-antikroppkomplex detekteras med hjälp av en antihuman immunoglobulin G(IgG)-antikropp, som är kon- jugerad till ett enzym, vilket i närvaro av ett substrat ger ett färgat band på remsorna. Om en fullständig (nor- mal) HIV-l-seropositivitet enligt a) ovan föreligger, är antikroppar mot nästan samtliga virusproteiner närvarande.The most common confirmatory tests are Western blotting, inhibition EIA, peptide EIA and radioimmunoprecipitation. Usually 3 or 4 confirmatory tests are necessary to distinguish between false and true positive sera. Purified HIV-1 whole virus is fractionated by Western blotting with respect to molecular weight using electrophoresis on a polyacrylamide gel. The separated HIV-1 proteins, which act as viral antigens, are then transferred from the gel via electrophoretic blotting to a nitrocellulose membrane. Alternatively, recombinant proteins or synthetic peptides corresponding to the HIV-1 proteins can be used as antigens. The membrane is cut into strips, which are then reacted with test and control sera or plasma samples. If anti-HIV-1 antibodies are present in the sample, they bind to the viral antigens on the nitrocellulose strips during the incubation. This antigen-antibody complex is detected by an anti-human immunoglobulin G (IgG) antibody, which is conjugated to an enzyme which, in the presence of a substrate, produces a colored band on the strips. If complete (normal) HIV-1 seropositivity according to a) above is present, antibodies to almost all viral proteins are present.

Detta test är ganska känsligt och det medger separation av immunsvaret mot olika proteiner härrörande från olika de- lar av en virusorganism.This test is quite sensitive and it allows the separation of the immune response against different proteins derived from different parts of a viral organism.

Reaktioner mot både gag(gag = p24, pl7, p55)-protei- 9P4l, 99160, gpl20)-proteiner från virusets hölje är erforderliga för ner från virusets inre delar och env(env = denna test. Risken för att ett sådant mönster skall uppstå slumpmässigt är mycket liten. Om en patient har antikrop- par mot ett fàtal enstaka virusproteiner, är otillförlit- ligheten mera uttalad. Då är det nödvändigt att särskilja ett ofullständigt men sant immunsvar mot HIV-l från en antikroppreaktion mot ett annat protein med förmåga att inducera samma antikroppar som ett HIV-l-protein (falsk positivitet). Reaktioner med pl7, p24 och p55 är vanligast bland gag-reaktioner, varvid pl7-reaktioner är mest van- liga och p55 minst vanliga. De olika bandens förekomst och intensitet vid EIB är beroende på om infektionen nyligen ägt rum. Följaktligen är det omöjligt att vara absolut säker på om ett enkelt gag-band är sant eller falskt genom 4-68 168 10 15 20 25 30 35 4 användning av endast en Western blot. Detta är en avsevärd nackdel med denna metod.Reactions to both gag (gag = p24, p17, p55) -protein- 9P41, 99160, gp120) -proteins from the envelope of the virus are required for down from the inner parts of the virus and env (env = this test. The risk that such a pattern will If a patient has antibodies to a few single virus proteins, the unreliability is more pronounced, then it is necessary to distinguish an incomplete but true immune response to HIV-1 from an antibody reaction to another capable protein. to induce the same antibodies as an HIV-1 protein (false positivity) Reactions with p17, p24 and p55 are most common among gag reactions, with p17 reactions being most common and p55 least common.The occurrence and intensity of the different bands at the EIB depends on whether the infection has recently taken place.Therefore, it is impossible to be absolutely sure whether a simple gag band is true or false by using only one Western blot. is a considerable disadvantage of this method.

Inhiberings-EIA (kompetitions-EIA) är en teknik som särskiljer mellan falsk och sann reaktivitet genom konkur- rens mellan märkta, sant positiva antikroppar och serum- provet från patienten för bindning till HIV-1-proteiner, vilka är bundna till en fast fas. Om patientens serumprov inhiberar de märkta antikropparna, är det tydligt att de binder till samma ställen på HIV-1-proteinerna och att antikropparna i patientserumprovet binder lika starkt som de märkta antikropparna. Om reaktionen är falsk, är ingen av dessa betingelser uppfylld. Eftersom detta test är ett negativt test, dvs det är baserat på icke-reaktivitet hos eventuellt falskt positiva antikroppar och inte på direkt indikering, är emellertid detta test förenat med en viss otillförlitlighet.Inhibition EIA (competition EIA) is a technique that distinguishes between false and true reactivity by competition between labeled, true positive antibodies and the patient's serum sample for binding to HIV-1 proteins, which are bound to a solid phase. . If the patient's serum sample inhibits the labeled antibodies, it is clear that they bind to the same sites on the HIV-1 proteins and that the antibodies in the patient serum sample bind as strongly as the labeled antibodies. If the reaction is false, none of these conditions are met. However, since this test is a negative test, ie it is based on non-reactivity of any false positive antibodies and not on direct indication, this test is associated with a certain unreliability.

Peptid-EIA är en teknik som ytterligare separerar immunsvaret till enstaka epitoper. Med hjälp av denna tek- nik är det möjligt att särskilja mellan sanna och falska reaktioner, eftersom orsakerna till immunsvaret är olika.Peptide EIA is a technique that further separates the immune response into individual epitopes. With the help of this technique, it is possible to distinguish between true and false reactions, since the causes of the immune response are different.

Det är möjligt att använda peptid-EIA för att indikera att antikroppar som framkallats mot env-proteiner är närva- rande. Peptid-EIA är en känsligare teknik än Western blot- ting vad beträffar indikering av env-antikroppar. För när- varande är emellertid användning av denna teknik något be- gränsad, eftersom testen kan ge fel utslag vid små varia- tioner i virusets peptidsekvens, såsom hos vissa patienter från Afrika.It is possible to use peptide EIA to indicate that antibodies raised against env proteins are present. Peptide EIA is a more sensitive technique than Western blotting in terms of indicating env antibodies. At present, however, the use of this technique is somewhat limited, as the test may give the wrong result for small variations in the peptide sequence of the virus, such as in some patients from Africa.

Vid radioimmunoprecipitationstestet, RIPA, binds antikropparna från patientserumprovet till radioaktivt märkta HIV-l-proteiner. Antigen-antikroppkomplexen immobi- liseras på protein A-pärlor och solubiliseras därefter och underkastas elektrofores i polyakrylamid. Denna test krä- ver hög affinitet för antikropparna och är ganska känslig.In the radioimmunoprecipitation test, RIPA, the antibodies from the patient serum sample bind to radiolabeled HIV-1 proteins. The antigen-antibody complexes are immobilized on protein A beads and then solubilized and subjected to polyacrylamide electrophoresis. This test requires high affinity for the antibodies and is quite sensitive.

Den kan särskilja ganska väl mellan sanna och falska reak- tioner. Den är särskilt fördelaktig för studier av env- reaktivitet med hjälp av RIPA. Nackdelarna med denna test 10 15 20 25 30 35 468 163 5 är att den är ganska dyr, tidskrävande och omständlig.It can distinguish quite well between true and false reactions. It is particularly advantageous for studies of env reactivity using RIPA. The disadvantages of this test are that it is quite expensive, time consuming and cumbersome.

Dessutom föreligger en riskaspekt p g a arbetet med radio- aktivt material.In addition, there is a risk aspect due to the work with radioactive material.

Följaktligen föreligger ett stort behov av ett för- farande för tillförlitligt, snabbt, enkelt och billigt särskiljande mellan falska och sanna HIV-l-antikroppreak- tioner, särskilt för U-länder, där falsk seropositivitet är ett stort problem.Consequently, there is a great need for a procedure for reliable, rapid, simple and inexpensive differentiation between false and true HIV-1 antibody responses, especially for developing countries, where false seropositivity is a major problem.

Detta behov uppfylls med hjälp av föreliggande upp- finning. Jämfört med känd teknik är förfarandet enligt föreliggande uppfinning enklare vad beträffar särskiljande av sanna och falska HIV-1-anti-p24-reaktioner_ Dessutom är den säkrare och mer tillförlitlig än kända tekniker. Den är dessutom snabb, och testen utförs pà 3-4 h, jämfört med kända tekniker, där upp till 24 h är nödvändigt. Slutligen är den åtminstone 10 ggr billigare per test än en western blot och mycket billigare än de andra konventionella kon- firmativa testerna. I kombination med de konventionella metoderna ger förfarandet enligt föreliggande uppfinning en ytterligare säkerhetsmarginal, eftersom den positivt identifierar de falskt positiva reaktionerna. Sammanfatt- ningsvis är det i högre grad än med någon annan hittills känd metod möjligt att välja ut ytterligare icke-HIV-l- infekterade individer från en grupp individer som har diagnosticerats vara eventuellt HIV-l-positiva.This need is met with the aid of the present invention. Compared to the prior art, the process of the present invention is simpler in distinguishing between true and false HIV-1 anti-p24 reactions. In addition, it is safer and more reliable than known techniques. It is also fast, and the test is performed in 3-4 hours, compared to known techniques, where up to 24 hours is necessary. Finally, it is at least 10 times cheaper per test than a western blot and much cheaper than the other conventional confirmatory tests. In combination with the conventional methods, the process of the present invention provides an additional safety margin, as it positively identifies the false positive reactions. In summary, it is possible to a greater extent than with any other method known to date to select additional non-HIV-1-infected individuals from a group of individuals who have been diagnosed as possibly HIV-1-positive.

Beskrivning av uppfinningen I en aspekt hänför sig föreliggande uppfinning till peptider med formeln a) H-X-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Ile-Gln-Gly-Gln-Met-Val-His- -Gln-Ala-Ile-Ser-Pro-Arg-Thr-Leu-Asn-Ala-Trp-Val-Lys- -Val-Val-Glu-Glu-Lys-Ala-Phe-Ser-Pro-Glu-Val-Ile-Pro- -Met-Phe-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp- -Leu-Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly-X-Z b) H-X-Val-His-Gln-Ala-Ile-Ser-Pro-Arg-Thr-Leu-Asn-Ala- -Trp-Val-X-Z 468 168 6 c) H-X-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp-Leu- -Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly-His-Gln-Ala-Ala- -Met-Gln-Met-Leu-Lys-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala- -Glu-Trp-Asp-Arg-ValfHis-Pro-Val-His-Ala-Gly~Pro-Ile- 5 -Ala-Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-X-Z d) H-X-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala-Glu-Trp-Asp-Arg- -Val-His-Pro-Val-X-Z 10 e) H-X-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-Ile-Ala- -Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-Ser-Asp-Ile-Ala- -Gly-Thr-Thr-Ser-Thr-Leu-Gln-Glu-Gln-Ile-Gly-Trp-Met- -Thr-Asn-Asn-Pro-Pro-Ile-Pro-Val-Gly-Glu-Ile-Tyr-Lys- -Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys-Ile-X-Z 15 f) H-X-Glu-Ile-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn- -Lys-Ile-Val-Arg-Met-X-Z g) H-X-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys:Ile- 20 -Val-Arg-Met-Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Ile-Leu-Asp-Ile-Arg- -Gln-Gly-Pro-Lys-Glu-Pro-Phe-Arg-Asp-Tyr-Val-Asp-Arg- -Phe-Tyr-Lys-Thr-Leu-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala-Ser-Gln-Glu- -Val-Lys-Asn-Trp-Met-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn- -Ala-Asn-Pro-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly- 25 -X-Z h) H-X-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu~Val-Gln~Asn-Ala-Asn-Pro-Asp- -Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr- -Leu-Glu-Glu-Met-Met-Thr-Ala-Cys-Gln-Gly-Val-Gly-Gly- 30 -Pro-Gly-His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala-Met-Ser- -Gln~Val-Thr-Asn-Thr-Ala-Thr-Ile-Met-Met-X-Z, i både oxiderad och ej oxiderad form, varvid i den oxiderade formen en brygga bildats mellan de två cysteinföreningarna i peptiden 35 i) H-X-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Met- -Met-Thr-Ala-Cys-Gln-X-Z 10 15 20 25 30 35 468 168 7 där X representerar en kemisk bindning eller en kopplings- underlättande aminosyrasekvens, och Z representerar -NH eller -OH. 2 Peptiderna enligt föreliggande uppfinning benämns lämpligtvis a) HIV-l b) HIV-l C) HIV-1 d) HIV-l e) HIV-l f) HIV-l g) HIV-1 h) HIV-1 i) HIV-1 hxb2 hxb2 hxb2 hxb2 hxb2 hxb2 hxb2 hxb2 hxb2 133-193 143-156 173-233 203-218 213-273 260-276 262-338 318-378 335-351 939 939 939 939 939 939 939 939 939 I en annan aspekt hänför sig föreliggande uppfinning till ett diagnostiskt antigen med förmåga att binda till antikroppar med bindningsaffinitet för föreningar inne- hållande en aminosyrasekvens motsvarande en epitop eller samling av epitoper i HIV-1 p24.Description of the Invention In one aspect, the present invention relates to peptides of the formula a) HX-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Ile-Gln-Gly-Gln-Met-Val-His--Gln-Ala-Ile-Ser -Pro-Arg-Thr-Leu-Asn-Ala-Trp-Val-Lys- -Val-Val-Glu-Glu-Lys-Ala-Phe-Ser-Pro-Glu-Val-Ile-Pro- -Met-Phe -Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp- -Leu-Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly-XZ b) HX-Val -His-Gln-Ala-Ile-Ser-Pro-Arg-Thr-Leu-Asn-Ala- -Trp-Val-XZ 468 168 6 c) HX-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala- Thr-Pro-Gln-Asp-Leu- -Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly-His-Gln-Ala-Ala- -Met-Gln-Met-Leu-Lys-Glu- Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala- -Glu-Trp-Asp-Arg-ValfHis-Pro-Val-His-Ala-Gly ~ Pro-Ile- 5 -Ala-Pro-Gly-Gln-Met -Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-XZ d) HX-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala-Glu-Trp-Asp-Arg- -Val-His-Pro-Val-XZ E) HX-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-Ile-Ala- -Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-Ser- Asp-Ile-Ala- -Gly-Thr-Thr-Ser-Thr-Leu-Gln-Glu-Gln-Ile-Gly-Trp-Met- -Thr-Asn-Asn-Pro-Pro-Ile-Pro-Val- Gly-Glu-Ile-Tyr -Lys- -Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys-Ile-XZ f) HX-Glu-Ile-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly- Leu-Asn--Lys-Ile-Val-Arg-Met-XZ g) HX-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys: Ile-20 -Val-Arg- Met-Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Ile-Leu-Asp-Ile-Arg- -Gln-Gly-Pro-Lys-Glu-Pro-Phe-Arg-Asp-Tyr-Val-Asp-Arg- - Phe-Tyr-Lys-Thr-Leu-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala-Ser-Gln-Glu- -Val-Lys-Asn-Trp-Met-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln -Asn- -Ala-Asn-Pro-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly- 25 -XZ h) HX-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu ~ Val-Gln ~ Asn-Ala-Asn-Pro-Asp- -Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr- -Leu-Glu-Glu-Met-Met-Thr -Ala-Cys-Gln-Gly-Val-Gly-Gly- 30 -Pro-Gly-His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala-Met-Ser- -Gln ~ Val-Thr- Asn-Thr-Ala-Thr-Ile-Met-Met-XZ, in both oxidized and non-oxidized form, wherein in the oxidized form a bridge is formed between the two cysteine compounds in the peptide i) HX-Lys-Ala-Leu-Gly -Pro-Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Met- -Met-Thr-Ala-Cys-Gln-XZ 10 15 20 25 30 35 468 168 7 where X represents is a chemical bond or a linker-facilitating amino acid sequence, and Z represents -NH or -OH. The peptides of the present invention are suitably termed a) HIV-1 b) HIV-1 C) HIV-1 d) HIV-1 e) HIV-1 f) HIV-1 g) HIV-1 h) HIV-1 i) HIV -1 hxb2 hxb2 hxb2 hxb2 hxb2 hxb2 hxb2 hxb2 hxb2 133-193 143-156 173-233 203-218 213-273 260-276 262-338 318-378 335-351 939 939 939 939 939 939 939 939 939 In another In this aspect, the present invention relates to a diagnostic antigen capable of binding to antibodies with binding affinity for compounds containing an amino acid sequence corresponding to an epitope or collection of epitopes in HIV-1 p24.

I en ytterligare aspekt hänför sig föreliggande upp- finning till ett förfarande för särskiljande mellan ett falskt och sant diagnosticerat HIV-l-positivt serumprov från en individ, vilket förfarande kännetecknas av att åtminstone ett diagnostiskt antigen med förmåga att binda till antikroppar med bindningsaffinitet för föreningar innehållande en aminosyrasekvens motsvarande en epitop eller samling av epitoper i HIV-1-p24, eventuellt kopplat till en bärare, sätts till serumprovet, och att eventuellt bildade antigen/antikroppkomplex detekteras genom använd- ning av en immunoanalys, varigenom särskiljandet åstadkoms med basis på att serumprovet är falskt HIV-1-positivt om komplexen detekteras och sant HIV-1-positivt om komplexen inte detekteras. 468 168 10 15 20 25 30 35 8 Vid en föredragen utföringsform av förfarandet en- ligt uppfinningen är det diagnostiska antigenet ett diagnostiskt antigen enligt uppfinningen.In a further aspect, the present invention relates to a method for distinguishing between a false and true diagnosed HIV-1 positive serum sample from an individual, which method is characterized in that at least one diagnostic antigen capable of binding to antibodies with binding affinity for compounds containing an amino acid sequence corresponding to an epitope or collection of epitopes in HIV-1-p24, optionally linked to a carrier, is added to the serum sample, and any antigen / antibody complexes formed are detected using an immunoassay, thereby making the distinction based on the serum sample is false HIV-1 positive if the complexes are detected and true HIV-1 positive if the complexes are not detected. 468 168 10 15 20 25 30 35 8 In a preferred embodiment of the method according to the invention, the diagnostic antigen is a diagnostic antigen according to the invention.

Andra kännetecken och särdrag hos uppfinningen fram- går av de efterföljande patentkraven.Other features and characteristics of the invention appear from the appended claims.

Bland de hittills kända AIDS-inducerande retrovirusen är HIV-1 det mest kända i världen, medan det strukturellt delvis annorlunda HIV-2 huvudsakligen är begränsad till Västafrika. Retrovirusen HTLV-1 och HTLV-2 inducerar inte AIDS, utan AIDS-relaterade sjukdomar, t ex T-cell-leukemi.Among the AIDS-inducing retroviruses known to date, HIV-1 is the best known in the world, while the structurally partially different HIV-2 is mainly limited to West Africa. The retroviruses HTLV-1 and HTLV-2 do not induce AIDS, but AIDS-related diseases, such as T-cell leukemia.

Föreliggande uppfinning hänför sig därför till HIV-1, liksom till för HIV-1-proteiner unika aminosyrasekvenser.The present invention therefore relates to HIV-1, as well as to amino acid sequences unique to HIV-1 proteins.

HIV-l-virusets inre delar, t ex nukleokapsiden eller den RNA-innehållande kärnan, är skyddad av ett hölje. De inre delarna, kallade gag (gruppspecifikt antigen), och höljet, kallat env, är uppbyggda av olika proteiner. Dessa proteiner, dvs prekursorerna, förekommer övervägande i början av virusets livscykel, medan andra är övervägande i senare faser. l Följande tabell anger huvudsakliga gener och gen- produkter hos HIV-1. gen Genprodukter/proteiner gruppspecifikt antigen/kärna (gag) .u-:- polymeras (pol) p17, p24, p55 p3l, p51, p66 hölje (env) gp4l, gpl20, gp16O p protein 9P Siffrorna anger de ungefärliga molekylvikterna för protei- glykoprotein nerna uttryckta i kilodaltons. p55 är en prekursor till p24 och pl7. gp16O är en prekursor till gpl2O och gp4l. 10 15 20 25 30 35 468 16si 9 I ett visst skede av virusets livscykel klyver ett enzym p24-molekylen från p55-molekylen. Hela p24-proteinet utgör således en del av det ursprungliga p55-proteinet.The internal parts of the HIV-1 virus, such as the nucleocapsid or the RNA-containing nucleus, are protected by a sheath. The inner parts, called gag (group-specific antigen), and the envelope, called env, are made up of different proteins. These proteins, ie the precursors, occur predominantly at the beginning of the virus' life cycle, while others are predominant in later phases. l The following table lists the main genes and gene products of HIV-1. gene Gene products / proteins group-specific antigen / core (gag) .u -: - polymerase (pol) p17, p24, p55 p3l, p51, p66 envelope (env) gp4l, gp120, gp16O p protein 9P The numbers indicate the approximate molecular weights of proteins glycoproteins expressed in kilodaltons. p55 is a precursor to p24 and p7. gp16O is a precursor to gpl2O and gp4l. At a certain stage in the life cycle of the virus, an enzyme cleaves the p24 molecule from the p55 molecule. Thus, the entire p24 protein forms part of the original p55 protein.

Eftersom föreliggande uppfinning hänför sig till peptider med förmåga att reagera med antikroppar som inducerats av en aminosyrasekvens motsvarande en epitop eller samling av epitoper hos HIV-1 p24, är även p55 inkluderat i denna definition. Det i föreliggande patentansökan och i patent- kraven genomgående använda uttrycket "en epitop eller sam- ling av epitoper hos HIV-1 p24" är sålunda avsett att in- kludera samma epitop eller epitoper hos HIV-1 p55.Since the present invention relates to peptides capable of reacting with antibodies induced by an amino acid sequence corresponding to an epitope or collection of epitopes of HIV-1 p24, p55 is also included in this definition. Thus, the term "an epitope or collection of epitopes of HIV-1 p24" as used throughout the present patent application and claims is intended to include the same epitope or epitopes of HIV-1 p55.

Peptiderna enligt föreliggande uppfinning har förmåga att reagera med antikroppar som framkallats mot en amino- syrasekvens som motsvarar eller är nära relaterad till en epitop eller samling av epitoper hos HIV-l p24-proteinet.The peptides of the present invention are capable of reacting with antibodies raised against an amino acid sequence corresponding to or closely related to an epitope or collection of epitopes of the HIV-1 p24 protein.

Alla dessa nya peptider och/eller delar därav reage- rar på ett unikt, specifikt sätt med ovannämnda icke- HIV-l-antikroppar.All of these novel peptides and / or portions thereof react in a unique, specific manner with the aforementioned non-HIV-1 antibodies.

I peptiderna enligt föreliggande uppfinning represen- terar X en kemisk bindning eller en sekvens med åtminstone 4, företrädesvis 8, särskilda aminosyrarester, vilka var och en är valda från den grupp som består av -Thr- och -Ser-. När X är en aminosyrasekvens kan den befinna sig antingen i C- eller N-änden av peptiden, men inte i båda ändarna samtidigt. Om den t ex är belägen i C-änden, mot- svarar X i N-änden en kemisk bindning och vice versa.In the peptides of the present invention, X represents a chemical bond or sequence having at least 4, preferably 8, specific amino acid residues, each of which is selected from the group consisting of -Thr- and -Ser-. When X is an amino acid sequence, it may be at either the C- or N-terminus of the peptide, but not at both ends simultaneously. For example, if it is located at the C-terminus, X at the N-terminus corresponds to a chemical bond and vice versa.

Emellertid kan X vara en bindning i båda ändarna av pepti- den enligt föreliggande uppfinning. Aminosyrasekvensen fungerar som en kopplingsunderlättande spacer, som möjlig- gör riktig bindning till bäraren till vilken peptiderna enligt föreliggande uppfinning skall bindas under sär- skiljningsförfarandet. Sekvensen X bör inte vara en amino- syrasekvens som skadligt påverkar resultatet vid diagnos- metoden. Följaktligen bör den inte ha alltför stor ladd- ning eller vara alltför hydrofob, och den bör heller inte störa peptidernas konformation. Aminosyrorna treonin och serin uppfyller dessa krav särskilt väl, och vilken som 468 168 10 15 20 25 30 35 lO helst av aminosyrorna i sekvensen X kan vara treonin eller serin. Antalet aminosyror i denna spacer-sekvens bör vara åtminstone 4, men vid en föredragen utföringsform enligt föreliggande uppfinning används 8 aminosyror.However, X may be a bond at both ends of the peptide of the present invention. The amino acid sequence acts as a coupling-facilitating spacer, which enables proper binding to the carrier to which the peptides of the present invention are to be bound during the discrimination process. The sequence X should not be an amino acid sequence that adversely affects the result of the diagnostic method. Consequently, it should not have too much charge or be too hydrophobic, nor should it interfere with the conformation of the peptides. The amino acids threonine and serine meet these requirements particularly well, and any of the amino acids in the sequence X may be threonine or serine. The number of amino acids in this spacer sequence should be at least 4, but in a preferred embodiment of the present invention, 8 amino acids are used.

Polypeptiderna enligt föreliggande uppfinning kan via aminosyrasekvensen X vara bundna till en bärare genom fysikalisk/kemisk interaktion, såsom t ex kovalent bind- ning, jonbindning, vätebindning eller hydrofob bindning.The polypeptides of the present invention may be linked via the amino acid sequence X to a carrier by physical / chemical interaction, such as, for example, covalent bonding, ionic bonding, hydrogen bonding or hydrophobic bonding.

Exempel på kovalent bindning är ester-, eter- och disul- fidbindning.Examples of covalent bonding are ester, ether and disulfide bonding.

Det här använda uttrycket "bärare" bör tolkas vittom- fattande, och det kan vara vilket material som helst som är förenligt med och inte skadligt påverkar förfarandet enligt föreliggande uppfinning, t ex hartser, mikroplat- tor, plastytor, geler, matriser etc.The term "carrier" as used herein should be construed broadly, and may be any material which is compatible with and does not adversely affect the process of the present invention, such as resins, microplates, plastic surfaces, gels, matrices, etc.

Det här använda uttrycket "epitop" avser antigen el- ler immunogen determinant och hänför sig till en specifik del av en struktur hos ett antigen som inducerar ett immunsvar, och de producerade antikropparna är riktade mot denna del.As used herein, the term "epitope" refers to antigen or immunogenic determinant and refers to a specific portion of a structure of an antigen that induces an immune response, and the antibodies produced are directed to that portion.

Immunoanalysmetoden enligt föreliggande uppfinning kan vara en enzymimmunoanalys (EIA), radioimmunoanalys (RIA), immunoanalys som involverar märkning med en metall, en fluorescensimmunoanalys (FIA) eller en immunoanalys vid vilken peptiden är löslig och inhiberar en annan reaktion.The immunoassay method of the present invention may be an enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), immunoassay involving metal labeling, a fluorescence immunoassay (FIA) or an immunoassay in which the peptide is soluble and inhibits another reaction.

Såsom angetts ovan har peptiderna enligt föreliggande uppfinning förmåga att binda till antikroppar som fram- kallats mot aminosyrasekvenser motsvarande en epitop eller samling av epitoper i HIV-1 p24. Sålunda har dessa anti- kroppar inte framkallats mot HIV-l-proteiner. Det är rim- ligt att förmoda att p24-antikroppreaktioner antingen be- ror på slumpmässig eller selektionsstyrd antigenisk mimi- kry mellan den C-terminala delen hos p24-aminosyrasekven- sen och en okänd icke-HIV-epitop. Ursprunget kan vara autoimmunitet eller immunisering med ett annat retrovirus än HIV. 10 15 20 25 30 35 468 168 ll Kort beskrivning av ritningarna Fig l visar fördelning av absorbansskillnaderna vid EIA med från HIV-1 gag erhållna syntetiska peptider.As indicated above, the peptides of the present invention are capable of binding to antibodies raised against amino acid sequences corresponding to an epitope or collection of epitopes in HIV-1 p24. Thus, these antibodies have not been raised against HIV-1 proteins. It is reasonable to assume that p24 antibody responses are due to either random or selection-driven antigenic mimicry between the C-terminal portion of the p24 amino acid sequence and an unknown non-HIV epitope. The origin may be autoimmunity or immunization with a retrovirus other than HIV. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Fig. 1 shows the distribution of the absorbance differences at EIA with synthetic peptides obtained from HIV-1 gag.

Fig 2 visar reaktivitetsmönster för sex långa, synte- tiska peptider som erhållits från HIV-1 p24.Figure 2 shows reactivity patterns of six long, synthetic peptides obtained from HIV-1 p24.

Fig 3 visar elektroforetisk immunoblotting med HIV-l- antigen för ett p24 EIB-reaktivt och ett HIV-l gag 318-378-reaktivt, humant serum (nr I, tabell 3) före och efter trefaldig absorption "i brunn" med till fast fas bundet HIV-l gag 318-378 (A), HTLV-1 gag 118-140 (B), eller brunnar som skenbelagts med PBS (C).Figure 3 shows electrophoretic immunoblotting with HIV-1 antigen for a p24 EIB-reactive and an HIV-1 gag 318-378-reactive human serum (No. I, Table 3) before and after triple absorption "in well" with to solid phase bound HIV-1 gag 318-378 (A), HTLV-1 gag 118-140 (B), or wells sham coated with PBS (C).

FÖRSÖK Identifieringgav HIV-1 p24-reaktiva sera Först utfördes ett standardmässigt HIV-1-helvirus- antikroppscreeningtest, Organon Vironostica-anti-HIV I (Organon Technica). Serumprover tillåts reagera med HIV-l- helvirus bundet till en fast fas. Eventuell bindning av antikroppar till virusets olika delar detekteras genom mätning av provets absorbans. Prover som uppvisar en absorbans överstigande ett förutbestämt tröskelvärde bedöms vara positiva.EXPERIMENTS Identification of HIV-1 p24-reactive sera First, a standard HIV-1 whole virus antibody screening test, Organon Vironostica anti-HIV I (Organon Technica), was performed. Serum samples are allowed to react with HIV-1 whole virus bound to a solid phase. Any binding of antibodies to the different parts of the virus is detected by measuring the absorbance of the sample. Samples showing an absorbance exceeding a predetermined threshold are judged to be positive.

I föreliggande fall testades ca 150 000 friska per- soner i södra regionen av Sverige, och 785 bedömdes vara positiva. Blodgivare, gravida kvinnor och heterosexuella personer som befarade att de var HIV-smittade, men som väsentligen saknade riskbeteende, utgjorde majoriteten av dessa provgivare.In the present case, about 150,000 healthy people were tested in the southern region of Sweden, and 785 were judged to be positive. Blood donors, pregnant women and heterosexuals who feared that they were infected with HIV, but who had essentially no risk behavior, made up the majority of these donors.

Därefter underkastades dessa 785 positiva sera en konfirmativ elektroimmunoblottinganalys (EIB), dvs en Western blot (beskriven ovan). Nio av de 785 proverna upp- visade ett enkelt p24-mönster av serologisk aktivitet.Subsequently, these 785 positive sera were subjected to a confirmatory electroimmunoblotting assay (EIB), i.e. a Western blot (described above). Nine of the 785 samples showed a simple p24 pattern of serological activity.

Bland personerna som donerat dessa 9 sera var 5 kvinnor, 3 män och en av okänt kön. Åldrarna var 22, 24, 24, 24, 25, 33, 36 och 57. som angavs på Åldern var okänd för en person. De orsaker ifyllningsformuläret inför testet var: blodgivare 4, graviditet 3 och okända 2. Personerna kon- taktades inte, eftersom det inte ansågs vara nödvändigt 4es 163 10 15 20 25 30 35 12 att oroa dem i detta skede av undersökningen beträffande naturen av de falskt positiva HIV-serologiska reaktio- nerna. 20 bekräftat HIV-l-positiva sera och 17 seronegativa, ej selekterade svenska blodgivare användes som kontroller.Among the people who donated these 9 sera were 5 women, 3 men and one of unknown sex. The ages were 22, 24, 24, 24, 25, 33, 36 and 57. The age indicated was unknown to one person. The reasons for filling out the test form were: blood donor 4, pregnancy 3 and unknown 2. The persons were not contacted as it was not considered necessary 4es 163 10 15 20 25 30 35 12 to worry them at this stage of the examination regarding the nature of the false positive HIV serological reactions. 20 confirmed HIV-1-positive sera and 17 seronegative, unselected Swedish blood donors were used as controls.

När reaktiviteter påträffades för tre eller två (oxiderad och ej oxiderad HIV-l gag 318-378 och HIV-1 gag 262-338) av peptiderna, undersöktes deras ursprung på nytt. De visade sig vara tidiga sera från patienter som kort därefter övergick till fullständig EIB-seropositivitet.When reactivities were found for three or two (oxidized and non-oxidized HIV-1 gag 318-378 and HIV-1 gag 262-338) of the peptides, their origin was re-examined. They were found to be early sera from patients who shortly thereafter switched to complete EIB seropositivity.

Dessa sera kunde följaktligen inte inkluderas i studien.Consequently, these sera could not be included in the study.

Internationellt accepterade kriterier för bedömning av HIV-1-seropositivitet följdes (se The Consortium for Retrovirus Serology Standardization. Serological diagnosis of human immunodeficiency virus infection by Western Blot testing. JAMA 260:674-679 (1988) and Centers for Disease Control: Interpretation and use of the Western blot assay for serodiagnosis of human immunodeficiency virus type 1 infections. MMWR 1989, 38:l-7).Internationally accepted criteria for assessing HIV-1 seropositivity were followed (see The Consortium for Retrovirus Serology Standardization. Serological diagnosis of human immunodeficiency virus infection by Western Blot testing. JAMA 260: 674-679 (1988) and Centers for Disease Control: Interpretation and use of the Western blot assay for serodiagnosis of human immunodeficiency virus type 1 infections. MMWR 1989, 38: 1-7).

Immunoanalyser Fyra kommersiella analyser användes: Ett HIV-l-hel- virusantikropptest, nämligen Organon Vironostica anti-HIV (Organon Technica), HIV-1-antikropp-EIA enligt Abbott, där ett rekombinant antigen har framställts från bakterier, konfirmativ HIV-1-antikroppkompetitions-EIA enligt Abbott ENVACORE och ett HIV-l-elektroforetiskt immunoblot (EIB)- system enligt Du Pont Biotech. Dessa analyser användes enligt tillverkarens instruktioner.Immunoassays Four commercial assays were used: An HIV-1 whole virus antibody test, namely Organon Vironostica anti-HIV (Organon Technica), Abbott's HIV-1 antibody EIA, in which a recombinant antigen has been prepared from bacteria, confirmatory HIV-1 antibody competition EIA according to Abbott ENVACORE and an HIV-1 electrophoretic immunoblot (EIB) system according to Du Pont Biotech. These assays were used according to the manufacturer's instructions.

EIB-remsor mättes med en Bio-Rad 620 videodensito- meter (Richmond, California, USA) (se Blomberg J, Klasse PJ: Quantification of immunoglobulin G on electrophoretic immunoblot strips as a tool for human immunodeficiency virus serodiagnosis. J Clin Microbiol 1988, 26:lll-ll5).EIB strips were measured with a Bio-Rad 620 video densitometer (Richmond, California, USA) (see Blomberg J, Class PJ: Quantification of immunoglobulin G on electrophoretic immunoblot strips as a tool for human immunodeficiency virus serodiagnosis. J Clin Microbiol 1988, 26: lll-ll5).

Peptid-EIA-analyser utfördes ungefär som beskrivits (se Blomberg J, Nilsson I, Andersson M: Viral antibody screening system that uses a standardized single dilution immunoglobulin G enzyme immunoassay with multiple anti- lO 15 20 25 30 35 468 168 13 gens. J Clin Microbiol 1983, l7:108l-1091 och Klasse PJ, Pipkorn R, Blomberg J: Presence of antibodies to a puta- tively immunosuppressive part of human immunodeficiency virus (HIV) envelope glycoprotein gp4l is strongly asso- ciated with health among HIV-positive subjects. Proc Natl Acad Soi USA 1988, 85:5225-5229). 100 ul av 20 pl/ml peptid i PBS-M (PBS: 8,0 g NaCl, 0,2 g KHZPO4, 1,4 g Na2HP04-2H20, 0,2 g KCl per liter) (PBS-M: PBS med 10 ul/ml natriummertiolat) fick först binda under 2-6 h vid rumstemperatur, därefter över natten vid 4°C. 200 pl blockeringslösning (4% bovint serumalbumin (BSA)/0,2% gelatin/0,05% Tween 20) tillsattes, fick binda under 2-6 h vid rumstemperatur, därefter över natten vid 4°C, och frystes. På användningsdagen tinades plattorna och tvätta- des tre gånger i tvättvätska (nyligen tillverkad av 0,05% Tween 20 i PBS). 100 ul lämpligt spädda kontroll- och testsera spädda till l/50 i spädningsmedel I (3% BSA, 0,2% gelatin, 0,05% Tween 20 i PBS-M) tillsattes därefter, och plattorna inkuberades under skakning vid rumstemperatur under 1 h. Efter ytterligare en tvättning tillsattes 100 pl biotinylerat, med affinitetskromatografi renat get- antihumant IgG (Sigma), som spätts till l/1500 i späd- ningsmedel II (0,2% gelatin i PBS-M), och inkuberades under skakning vid rumstemperatur under 1 h. Efter tvätt- ning tillsattes 100 pl avidinperoxidas (Sigma), som spätts till 1/300 i spädningsmedel II, och plattorna inkuberades under skakning under l h vid rumstemperatur. Plattorna tvättades noggrant och slogs torra. 100 ul substratlösning (20 mg o-fenylendiamin + 10 ul 30% H202 i färgbuffert, varav ny tillverkades varje dag) (färgbuffert: 34,7 mM citronsyra, 66,7 mM Na2HPO4, pH 5,0) tillsattes, och plat- torna inkuberades i mörker vid rumstemperatur under 30 min och avlästes vid 450 nm i en mikroplattfotometer. 468 168 10 15 20 25 30 35 14 Syntetiska peptider Följande peptider användes vid försöken: Tabell 1. Använda syntetiska peptider vid föreliggande studie. Pilarna visar cysteinrester som vi har försökt förena genom oxidation.Peptide EIA assays were performed approximately as described (see Blomberg J, Nilsson I, Andersson M: Viral antibody screening system that uses a standardized single dilution immunoglobulin G enzyme immunoassay with multiple anti- 10 20 25 25 35 468 168 13 gens. J Clin Microbiol 1983, 17: 108l-1091 and Klasse PJ, Pipkorn R, Blomberg J: Presence of antibodies to a puta- tively immunosuppressive part of human immunodeficiency virus (HIV) envelope glycoprotein gp4l is strongly associated with health among HIV-positive subjects. Proc Natl Acad Soi USA 1988, 85: 5225-5229). 100 μl of 20 μl / ml peptide in PBS-M (PBS: 8.0 g NaCl, 0.2 g KH 2 PO 4, 1.4 g Na 2 HPO 4 -2H 2 O, 0.2 g KCl per liter) (PBS-M: PBS with 10 μl / ml sodium merthiolate) was first allowed to bind for 2-6 hours at room temperature, then overnight at 4 ° C. 200 μl of blocking solution (4% bovine serum albumin (BSA) / 0.2% gelatin / 0.05% Tween 20) was added, allowed to bind for 2-6 hours at room temperature, then overnight at 4 ° C, and frozen. On the day of use, the plates were thawed and washed three times in washing liquid (recently made from 0.05% Tween 20 in PBS). 100 μl of suitably diluted control and test sera diluted to 1/50 in diluent I (3% BSA, 0.2% gelatin, 0.05% Tween 20 in PBS-M) were then added, and the plates were incubated with shaking at room temperature for 1 After further washing, 100 μl of biotinylated, affinity chromatographed purified goat anti-human IgG (Sigma), which is diluted to 1/1500 in diluent II (0.2% gelatin in PBS-M), was added and incubated with shaking at After washing, 100 μl of avidin peroxidase (Sigma), which is diluted to 1/300 in diluent II, was added and the plates were incubated with shaking for 1 h at room temperature. The plates were washed thoroughly and dried. 100 μl of substrate solution (20 mg of o-phenylenediamine + 10 μl of 30% H 2 O 2 in dye buffer, of which new was made daily) (dye buffer: 34.7 mM citric acid, 66.7 mM Na 2 HPO 4, pH 5.0) was added, and the plates incubated in the dark at room temperature for 30 minutes and read at 450 nm in a microplate photometer. 468 168 10 15 20 25 30 35 14 Synthetic peptides The following peptides were used in the experiments: Table 1. Synthetic peptides used in the present study. The arrows show cysteine residues that we have tried to unite through oxidation.

EIV-1 hïb2 Qgg 133~193 PIVQKIQGQXVEQAISPRTLKLïïEYYEE1APSFEVIPKFSALSEGATPQDLKÉ!LXTVGG EIV-1 lïb2 ggg 143-156 VEQAISFETLKARV EIV-1 Iïb2 gg; 173-231 SÅLSEGATPQDLKÉXLFTïGGEQlA!Q!L!ETIKEEAA2ïDRVEPVEAG?IAPGQ!iEPEG EïV'1 hIb2 säs 201-218 rwzxsszzzisxvzrv EïY~1 hrë2 sig 210-:so Arwnavsvvzisplipsçxzz Exv-1 1:22 gg; 213-27: naïfipvzzsæzAæeçxxzyxesnzisfwswzqscïswxfsxærlrvszzïxnï11Ls;xz1 EIY-1 hXh2 ggg 223-243 IAPGQV?E°R3SBIAGTï5TL ...a EIY-1 hIb2 2:4 2f°'276 sïïxzwïzzczxszvax EIV-1 hXÉ2 gg 262-338 YfišïïILGLKXEYEXYSPTSILDÉRQGFIEPYRÉYYDRFYITLRAEQA°QÉTE¥ïKÉETLlVQKAKP3CKTILil*” " u-U sïv-1 hxrz gg; 2:4-:oo szzqsyxzërzsïvsar sß<> sso v v fizv-1 :xt gå; sas-3: fsfL:vçxAx?acxf*¥f1=fl=11ß°f=fxfAcqsvss§ss:;zv¿¿;1w=^vfx:¿:;xn .a-...Jv- ...uk-uu ...wg .EIV-1 hïb2 Qgg 133 ~ 193 PIVQKIQGQXVEQAISPRTLKLïïEYYEE1APSFEVIPKFSALSEGATPQDLKÉ! LXTVGG EIV-1 lïb2 ggg 143-156 VEQAISFETLKARV EIV-1 Iïg 173-231 SÅLSEGATPQDLKÉXLFTïGGEQlA! Q! L! ETIKEEAA2ïDRVEPVEAG? IAPGQ! IEPEG EïV'1 hIb2 season 201-218 rwzxsszzzisxvzrv EïY ~ 1 hrë2 sig 210-: so Arvnaps 1; 213-27: nai f pvzzsæzAæeçxxzyxesnzisfwswzqscïswxfsxærlrvszzïxnï11Ls; XZ1 EIY-1 hXh2 ggg 223-243 IAPGQV? E ° R3SBIAGTï5TL EIY ... A-1 hIb2 2: 4 ° 2f '276 sïïxzwïzzczxszvax EIV-1 HXE2 gg Y f šïïILGLKXEYEXYSPTSILDÉRQGFIEPYRÉYYDRFYITLRAEQA 262-338 ° QÉTE ¥ ïKÉETLlVQKAKP3CKTILil * ”" UU sïv-1 hxrz gg; 2: 4-: oo szzqsyxzërzsïvsar sß <> sso vv fi zv-1: xt gå; sas-3: fsfL: vçxAx? Acxf * ¥ f1 = fl = 11 ß ° f = fxfAcqsvss§ss :; zv¿¿; 1w = ^ vfx: ¿:; xn .a -... Jv- ... uk-uu ... wg.

HIV-1 EXEZ gg; 335-351 IÅLGPÅÅTLÉEXEÉACQ ïïï-1 hXf2 säg 24:-sr: facasvss2:szAavLAsAxsçv:s fïV~1 iïf2 2:1 35;-:sz xaavaisixsçvfxsifïxxçacx 10 15 20 25 30 35 468 168 15 Såsom framgår av tabellen ovan användes vid försöken några kortare fragment av de längre peptiderna enligt upp- finningen. Av dessa kortare peptider är endast HIV-l hxb2 gag 143-156, 203-218, 260-276 och 335-351 inbegripna i föreliggande uppfinning. Peptidernas aminosyrasekvenser är här uttryckta med enbokstavssymbolsystemet i ett försök att på ett enklare sätt visa relationen mellan de längre peptiderna och de kortare fragmenten därav.HIV-1 EXEZ gg; 335-351 IÅLGPÅÅTLÉEXEÉACQ ïïï-1 hXf2 säg 24: -sr: facasvss2: szAavLAsAxsçv: s fïV ~ 1 iïf2 2: 1 35; -: sz xaavaisixsçvfxsifïxxçacx shorter fragments of the longer peptides according to the invention. Of these shorter peptides, only HIV-1 hxb2 gag 143-156, 203-218, 260-276 and 335-351 are included in the present invention. The amino acid sequences of the peptides are expressed here with the one-letter symbol system in an attempt to more easily show the relationship between the longer peptides and the shorter fragments thereof.

Både de korta och långa peptiderna (17-77 aa) använ- des i ett försök att uppfånga så mycket antikroppreaktivi- tet som möjligt.Both the short and long peptides (17-77 aa) were used in an attempt to capture as much antibody reactivity as possible.

Peptiderna syntetiserades genom användning av Fmoc- kemi på en automatisk peptidsyntetiseringsmaskin med fast fas och av typ Applied Biosystems 43OA. De renades där- efter med hjälp av HPLC av typ omvänd fas på en C18- kolonn. Deras renhet var 95% enligt ett analytiskt HPLC- förfarande. Peptiden HIV-1 gag 318-378 testades både i oxiderad och ej oxiderad form.The peptides were synthesized using Fmoc chemistry on a solid phase automatic peptide synthesizer and type Applied Biosystems 43OA. They were then purified by reverse phase HPLC on a C18 column. Their purity was 95% by an analytical HPLC method. The peptide HIV-1 gag 318-378 was tested in both oxidized and non-oxidized form.

Enligt uppfinningen kan peptiderna användas som ett diagnostiskt antigen antingen löst i serumprovet eller bundet till en bärare. I det följande kommer några sätt att använda det diagnostiska antigenet enligt föreliggande uppfinning att beskrivas.According to the invention, the peptides can be used as a diagnostic antigen either dissolved in the serum sample or bound to a carrier. In the following, some ways of using the diagnostic antigen of the present invention will be described.

Reaktivitet för p24-reaktiva sera i kommersiella HIV-l- antikropptester ,¿g,;~e Vid detta försök utfördes tre kommersiella antikropp- EIA, dvs den ovannämnda Organon Vironostica anti-HIV-ana- lysen, HIV-1-antikropp-EIA enligt Abbott och konfirmativ HIV-1-antikroppkompetitions-EIA enligt Abbott ENVACORE.Reactivity of p24-reactive sera in commercial HIV-1 antibody assays, ¿g,; ~ e In this experiment, three commercial antibody EIAs were performed, i.e. the above-mentioned Organon Vironostica anti-HIV assay, HIV-1 antibody-EIA according to Abbott and confirmatory HIV-1 antibody competition EIA according to Abbott ENVACORE.

Såsom angetts ovan erhölls de nio HIV-l p24-reaktiva serumen från 785 upprepat positiva sera från en HIV-l- antikroppscreeningtest. Dessa erhölls i sin tur från ca 150 OOO sera som underkastats HIV-1-antikroppscreening- tester på primära testställen. Fördelningen av reaktivi- teter hos de 9 serumen med p24-band i HIV-l-EIB visas i tabell 2. 468 368 10 15 20 25 30 35 16 TABELL 2 Egenskaper hos nio analyserade HIV-l p24-reaktiva sera och uppgifter om patienterna från vilka dessa erhållits HIV-l-hel- Rekonbinant Reaktiv virus-EIA HIV-l-EIA vid EIA enligt enligt Serum med lång Organon Abbott EIB- Orsak nr Papua (A492) (A492) mönster Kon inner :in rest A 262-338 0,594/0,194 0,061/0,122 p24 K 25 graviditet B 133-193 0,1Z3/0.162 0,064/0,308 p24 K 24 blodgivare C 133-193 0,141/0,130 0,128/0,357 p24 M 22 blodgivare D 133-193 0,2?9/0,130 0,040/0,234 p24 K 24 blodgivare E 133-193 0,209/0,137 0,109/0,244 p24+p55 M ? okänd F 318-378 0,056/0,109 0,448/0,216 p24+p55 K 33 graviditet G infin ROH/dlß OJSWOJ96 fli M 24 Mowhæm H 318-328 0,090/0,154 i0,282/0,251 p24 K 136 graviditet I ingen 0,165/0,129 0,048/0,320 p24 K 57 okänd Såsom framgår av tabell 2 reagerade endast fem sera i helvirus-EIA enligt Organon, medan två endast reagerade vid rekombinant HIV-1-antigen;§laQenligt Abbott. Om värdet till vänster om snedstrecket i tabellen är högre än värdet på högra sidan, anses serumet ha reagerat. De kvarvarande två hade varit reaktiva vid Organon-testen på det remitte- rande teststället, men var inte positiva i föreliggande uppfinnares laboratorium. Inget serum reagerade vid kompe- titions-EIA enligt Abbott ENVACORE (ej visat). Sera som var reaktiva vid Organon-testen kom från testställen där Organon-tester användes, och de som reagerade vid rekombi- nant-testen enligt Abbott kom från ställen där detta test användes. Såsom dessutom framgår av tabellen var tre av fem Organon-reaktiva sera positiva vid EIA med peptiderna gag 133-193 och en med peptiden 262-338 enligt föreliggan- Û) 10 15 20 25 30 35 468 168 17 de uppfinning. Dessa fyra sera var negativa vid HIV-1 EIA enligt Abbott, medan de tvâ sera som var reaktiva vid rekombinant EIA enligt Abbott var positiva vid EIA med peptiden gag 318-378 enligt föreliggande uppfinning och negativa vid helvirus-EIA enligt Organon. Sålunda kan reaktivitetsmönstret vid kommersiella anti-HIV-tester vara en indikation på vilken del av p24-molekylen som anti-p24- antikropparna är riktade mot.As indicated above, the nine HIV-1p24-reactive sera from 785 repeatedly received positive sera from an HIV-1 antibody screening test. These, in turn, were obtained from approximately 150,000 sera subjected to HIV-1 antibody screening tests at primary test sites. The distribution of reactivities of the 9 sera with p24 bands in HIV-1-EIB is shown in Table 2. 468 368 10 15 20 25 30 35 16 TABLE 2 Properties of nine analyzed HIV-1 p24-reactive sera and data on patients from which these were obtained HIV-1-whole- Recombinant Reactive Virus-EIA HIV-1-EIA at EIA according to Serum with long Organon Abbott EIB- Cause No. Papua (A492) (A492) pattern Con inner: in residue A 262-338 0.594 / 0.194 0.061 / 0.122 p24 K 25 pregnancy B 133-193 0.1Z3 / 0.162 0.064 / 0.308 p24 K 24 blood donor C 133-193 0.141 / 0.130 0.128 / 0.357 p24 M 22 blood donor D 133-193 0.2? 9 / 0.130 0.040 / 0.234 p24 K 24 blood donor E 133-193 0.209 / 0.137 0.109 / 0.244 p24 + p55 M? unknown F 318-378 0.056 / 0.109 0.448 / 0.216 p24 + p55 K 33 pregnancy G in fi n ROH / dlß OJSWOJ96 fl i M 24 Mowhæm H 318-328 0.090 / 0.154 i0.282 / 0.251 p24 K 136 pregnancy I none 0.165 / 0.129 0.048 / 0.320 p24 K 57 unknown As shown in Table 2, only five sera in whole virus EIA reacted according to Organon, while two reacted only by recombinant HIV-1 antigen; If the value to the left of the slash in the table is higher than the value on the right, the serum is considered to have reacted. The remaining two had been reactive in the Organon tests at the referring test site, but were not positive in the present inventors' laboratory. No serum reacted to competition EIA according to Abbott ENVACORE (not shown). Sera that were reactive in the Organon test came from test sites where Organon tests were used, and those that reacted in the Abbott recombinant test came from sites where this test was used. In addition, as shown in the table, three of five Organon-reactive sera were positive for EIA with the peptides gag 133-193 and one with the peptides 262-338 of the present invention. These four sera were negative in Abbott's HIV-1 EIA, while the two sera reactive in Abbott's recombinant EIA were positive in EIA with the peptide gag 318-378 of the present invention and negative in whole virus EIA of Organon. Thus, the pattern of reactivity in commercial anti-HIV assays may be an indication of which portion of the p24 molecule the anti-p24 antibodies are directed to.

Reaktivitet för p24-positiva sera med syntetiska peptider erhållna från p24. Jämförelse med bekräftat HIV-l-anti- kroppositiva och -negativa blodgivarsera Fördelningen mellan IgG-reaktiviteter, dvs absorbans- skillnaderna, vid EIA för HIV-1 p24-antikroppositiva sera för fem långa och tio korta p24-härledda, syntetiska pep- tider visas i fig la, lb och lc. Sera i dessa försök var a) nio p24-reaktiva sera, b) 20 bekräftat HIV-1-anti- kroppositiva sera och c) sera från 17 HIV-seronegativa blodgivare. I tabell 3 visas reaktivitetsfrekvensen (en absorbansskillnad överstigande 0,4) för syntetiska pep- tider härledda från HIV-1 p24-sekvensen. 468 768 18 TABELL 3 Reaktivitetsfrekvens (absorbansskillnad överstigande 0,4) för syntetiska peptider härledda från HIV-1 p24-sekvensen 5 Frekvens Frekvens Frekvens för svenska för svenska för svenska bekräftade serunnega- p24-reaktiva HIV-l-posi- tiva blöd- 10 Peptid sera tiva sera givarsera 1\'=9 N=20 N=l7 HIV-l hxb2 gag 133-193 5 3 HIV-1 hxb2 gag 143-156 0 2 15 HIV-l hxb2 gag 173-233 0 1 0 HIV-l hxbZ gag 203-218 0 1 0 HIV-l hxb2 gag 210-230 0 0 0 20 HIV-l hxb2 gag 213-273 0 6 1 HIV-1 hxb2 gag 223-243 0 0 0 HIV-l hxb2 gag 260-276 0 3 0 HIV-l hxb2 gag 262-338 1 3 3 25 HIV-l hxb2 gag 284-300 0 0 0 HIV-1 hxb2 gag 318-378 2 15 0 sanna, i oxiderad form 1 15 0 HIV-l hxb2 gag 335-351 0 5 0 30 HIV-l hxb2 gag 348-373 0 0 0 HIV-l hxbZ gag 359-382 0 0 0 35 10 15 20 25 30 35 468 168 19 Enligt fig la reagerade fyra p24-positiva sera, varav två starkt, med den N-terminala långa peptiden HIV-1 gag 133-193, ett serum med HIV-1 gag 262-338 och två med den C-terminala HIV-1 gag 318-378 i oxiderad form. Ett serum hade en reaktivitet med gag 133-193 strax under det stipu- lerade tröskelvärdet för en absorbansskillnad av 0,4.Reactivity of p24-positive sera with synthetic peptides obtained from p24. Comparison with confirmed HIV-1 antibody-positive and negative blood donor sera The distribution between IgG reactivities, ie the absorbance differences, at EIA for HIV-1 p24 antibody-positive sera for five long and ten short p24-derived synthetic peptides is shown in Figs. 1a, 1b and 1c. Sera in these trials were a) nine p24-reactive sera, b) 20 confirmed HIV-1 antibody-positive sera and c) sera from 17 HIV seronegative blood donors. Table 3 shows the reactivity frequency (an absorbance difference exceeding 0.4) for synthetic peptides derived from the HIV-1 p24 sequence. 468 768 18 TABLE 3 Reactivity frequency (absorbance difference exceeding 0.4) for synthetic peptides derived from the HIV-1 p24 sequence 5 Frequency Frequency Frequency for Swedish for Swedish for Swedish confirmed serunnega-p24-reactive HIV-1-positive haemorrhagic 10 Peptide sera tiva sera givarsera 1 \ '= 9 N = 20 N = 17 HIV-1 hxb2 gag 133-193 5 3 HIV-1 hxb2 gag 143-156 0 2 15 HIV-1 hxb2 gag 173-233 0 1 0 HIV- l hxbZ gag 203-218 0 1 0 HIV-l hxb2 gag 210-230 0 0 0 20 HIV-l hxb2 gag 213-273 0 6 1 HIV-1 hxb2 gag 223-243 0 0 0 HIV-l hxb2 gag 260- 276 0 3 0 HIV-1 hxb2 gag 262-338 1 3 3 25 HIV-1 hxb2 gag 284-300 0 0 0 HIV-1 hxb2 gag 318-378 2 15 0 true, in oxidized form 1 15 0 HIV-1 hxb2 gag 335-351 0 5 0 30 HIV-1 hxb2 gag 348-373 0 0 0 HIV-1 hxbZ gag 359-382 0 0 0 35 10 15 20 25 30 35 468 168 19 According to Fig. 1a, four p24-positive sera reacted, of which two strongly, with the N-terminal long peptide HIV-1 gag 133-193, one serum with HIV-1 gag 262-338 and two with the C-terminal HIV-1 gag 318-378 in oxidized form . A serum had a reactivity with gag 133-193 just below the stipulated threshold value for an absorbance difference of 0.4.

Ingen av de p24-positiva serumen reagerade med någon av de kortare HIV-1 gag-peptiderna.None of the p24-positive sera reacted with any of the shorter HIV-1 gag peptides.

Däremot reagerade 15 av 20 bekräftat HIV-1-positiva sera mycket starkt med peptid 318-378 både i ej oxiderad och oxiderad form (fig lb) och i mindre omfattning med de andra långa p24-härledda peptiderna. Serum från HIV-1- seronegativa svenska blodgivare var i hög grad icke-reak- tiva med samtliga peptider (fig lo). Peptiderna 213-273 och 262-338 reagerade emellertid även signifikant med några blodgivarsera, och de resultat som erhölls härvid måste tolkas med viss försiktighet.In contrast, 15 of 20 confirmed HIV-1-positive sera reacted very strongly with peptide 318-378 both in non-oxidized and oxidized form (Fig. 1b) and to a lesser extent with the other long p24-derived peptides. Serum from HIV-1 seronegative Swedish blood donors was highly non-reactive with all peptides (Fig. Lo). However, peptides 213-273 and 262-338 also reacted significantly with some blood donor sera, and the results obtained must be interpreted with some caution.

Inget av de falska HIV-antikroppositiva serumen eller blodgivarserumen reagerade med de tio kortare p24-härledda peptiderna. Fem av de bekräftade HIV-antikroppositiva se- rumen reagerade med HIV-1 gag 335-351, tre med HIV-1 gag 260-276, två med HIV-1 gag 143-156 och en med HIV-1 gag 203-218 (se tabell 3). Sålunda var de kortare peptiderna inte användbara för demonstration av falskt positiva HIV- antikroppar, men var användbara för en ytterligare be- skrivning av några av de p24-epitoper som påträffats hos HIV-1-infekterade personer.None of the false HIV antibody-positive or blood donor sera reacted with the ten shorter p24-derived peptides. Five of the confirmed HIV antibody-positive sera reacted with HIV-1 gag 335-351, three with HIV-1 gag 260-276, two with HIV-1 gag 143-156 and one with HIV-1 gag 203-218 ( see Table 3). Thus, the shorter peptides were not useful for demonstrating false positive HIV antibodies, but were useful for a further description of some of the p24 epitopes found in HIV-1-infected individuals.

Reaktivitetsfrekvenserna för långa, syntetiska p24- härledda peptider visas i tabell 4. 21 68 '16 10 15 20 25 30 35 c) 20 TABELL 4 Reaktivitetsfrekvens för långa, syntetiska peptider här- ledda från HIV-1 p24.The reactivity frequencies of long synthetic p24-derived peptides are shown in Table 4. 21 68 '16 10 15 20 25 30 35 c) TABLE 4 Reactivity frequency of long, synthetic peptides derived from HIV-1 p24.

Peptid Grupp Sannolikhet (exakt test enligt Fisher) sero- nega- FP/TP FP/BD TP/BD bekräf- tiva p24- tat po- blod- HIV gag positiv sitiv givare (FP) (TP) (BD) 133-193 4/9 3/20 0/17 0,10 0,008 ns 173-233 0/9 1/20 0/17 ns ns ns 213-273 0/9 5/20 1/17 0,13 ns 0,13 262-338 1/9 3/20 3/17 ns ns ns 318-378 2/9 15/20 0/17 0,01 0,11 0,000001 18-378 ox 0/9 15/20 0/17 0,0002 ns 0,000001 Förutom den förväntade signifikant högre reaktivite- ten för bekräftade HIV-antikroppositiva sera gentemot blodgivarsera eller falskt positiva sera, visades en av- sevärd skillnad mellan falskt positiva sera och blodgivar- sera med peptiden HIV-1 gag 133-193 (p=O;OO8). Skillnaden mellan falskt positiva sera och blodgivarsera för pepti- derna HIV-1 gag 318-378 (ej oxiderad) och HIV-l gag 262-338 uppnådde endast en gränslinjesignifikans (p=O,ll) eller var inte signifikant. Reaktivitetsmönstret för de sex långa p24-peptiderna visas i fig 2, i vilken de skuggade ytorna visar en absorbansskillnad överstigande 0,4. Antalet sera som uppvisade ett visst reaktivitets- mönster visas under "nr". FP = p24-reaktiva (falskt positiva) sera. TP = BD = bekräftat HIV-1-antikroppositiva sera. HIV-l-seronegativa blodgivarsera. Peptid- numreringen framgår av tabell l. 10 15 20 25 30 35 468 168 21 Absorption av p24-positiva sera med immobiliserade peptider p24-antikroppositiva sera späddes för erhållande av en absorbansökning av 0,5-1,0 i förhållande till det i brunnen med negativt kontrollprov i EIA-utspädningsvätska (3% BSA, O,2% gelatin i PBS-M). Sera inkuberades under l h i brunnar som i förväg belagts med p24-peptider. Superna- tanten överfördes därefter till en intilliggande brunn och inkuberades under ytterligare l h. Detta upprepades ytter- ligare en gång. Totalt gjordes sålunda 3 st l h långa ab- sorptioner. Supernatanten späddes därefter till hälften i blottinglösning, överfördes till en EIB-brunn och tilläts reagera vid en HIV-1-EIB (Du Pont) vid standardbetingelser för övrigt. Vid de flesta försöken användes brunnar som belagts med den EIA-reaktiva p24-peptiden tillsammans med följande kontroller: Brunnar som belagts med en ej reaktiv p24-peptid, en icke-HIV-peptid (HTLV-1 gag 118-140) och brunnar som parallellt skenbelagts med PBS. p24-bandets intensitet mättes med hjälp av reflektansdensitometri på EIB-remsorna (se Blomberg J, Klasse PJ: Quantification of immunoglobulin G on electrophoretic immunoblot strips as a tool for human immunodeficiency virus serodiagnosis. J Clin Microbiol 1988, 26:ll1-115 and Blomberg J, Klasse PJ: Specificities and sensitivities of three systems for de- termination of antibodies to human immunodeficiency virus by electrophoretic immunoblotting. J Clin Microbiol 26:lO6-110 (1988)).Peptide Group Probability (exact test according to Fisher) serogen- FP / TP FP / BD TP / BD confirm p24- tat po- blood- HIV gag positive positive donor (FP) (TP) (BD) 133-193 4 / 9 3/20 0/17 0.10 0.008 ns 173-233 0/9 1/20 0/17 ns ns ns 213-273 0/9 5/20 1/17 0.13 ns 0.13 262-338 1/9 3/20 3/17 ns ns ns 318-378 2/9 15/20 0/17 0.01 0.11 0.000001 18-378 ox 0/9 15/20 0/17 0.0002 ns 0.000001 In addition to the expected significantly higher reactivity of confirmed HIV antibody-positive sera to blood donor sera or false-positive sera, a significant difference was shown between false-positive sera and blood donor sera with the peptide HIV-1 gag 133-193 (p = O; OO8). The difference between false positive sera and blood donor sera for the peptides HIV-1 gag 318-378 (not oxidized) and HIV-1 gag 262-338 achieved only a boundary line significance (p = 0.1, 11) or was not significant. The reactivity pattern of the six long p24 peptides is shown in Figure 2, in which the shaded surfaces show an absorbance difference in excess of 0.4. The number of sera that showed a certain reactivity pattern is shown under "no". FP = p24-reactive (false positive) sera. TP = BD = confirmed HIV-1 antibody-positive sera. HIV-1 seronegative blood donor sera. The peptide numbering is shown in Table 1. Absorption of p24-positive sera with immobilized peptides p24 antibody-positive sera were diluted to obtain an absorbance increase of 0.5-1.0 relative to that in the well. with negative control sample in EIA diluent (3% BSA, 0.2% gelatin in PBS-M). Sera were incubated for 1 hour in wells pre-coated with p24 peptides. The supernatant was then transferred to an adjacent well and incubated for an additional 1 h. This was repeated once more. A total of 3 1 h long absorbances were thus made. The supernatant was then half diluted in blotting solution, transferred to an EIB well and allowed to react with an HIV-1 EIB (Du Pont) under standard conditions. Most experiments used wells coated with the EIA-reactive p24 peptide along with the following controls: Wells coated with a non-reactive p24 peptide, a non-HIV peptide (HTLV-1 gag 118-140) and wells coated with parallel rail coated with PBS. The intensity of the p24 band was measured by reflectance densitometry on the EIB strips (see Blomberg J, Class PJ: Quantification of immunoglobulin G on electrophoretic immunoblot strips as a tool for human immunodeficiency virus serodiagnosis. J Clin Microbiol 1988, 26: ll1-115 and Blomberg J, Klasse PJ: Specificities and sensitivities of three systems for de- termination of antibodies to human immunodeficiency virus by electrophoretic immunoblotting. J Clin Microbiol 26: 106-110 (1988)).

För att försäkra sig om att peptidreaktiviteterna vid EIA verkligen var riktade mot p24 hos HIV-1, inkuberades 6 av de 8 p24-peptidreaktiva serumen (nr A-E och H i tabell 2) med p24-härledda peptider och kontrollpeptider i brun- nar på EIA-mikroplattor under tre på varandra följande absorptioner av vardera 1 h. För att förvissa sig om att en absorption av peptidreaktiv antikropp hade ägt rum, utfördes en EIA i samma brunnar efter fullbordandet av absorptionerna. De kvarvarande antikropparna studerades därefter i en standard HIV-1 EIB över natten. I två (nr A 468 168 10 15 20 25 30 35 22 och H) av de sex serumen minskade anti-p24-aktiviteten märkbart genom absorption med den immobiliserade peptid som hade reagerat starkt i EIA. Ett av dessa två sera var reaktivt med och absorberades av peptid 262-338 och ett med peptid 318-378. Anti-p24 EIB-banden minskade inte efter absorption med en annan HIV- eller HTLV-härledd, immobiliserad peptid eller med skenbelagda brunnar. (Jfr fig 3, där "+" = bekräftat HIV-antikroppositiv kontroll och "-" = HIV-antikroppnegativ serumkontroll. Pilarna visar positioner i HIV-1-proteinerna.) Sålunda stärktes argumenten för en lokalisering av antikroppreaktiviteten på dessa två delar av p24 i två av de för peptidabsorption underkastade peptidreaktiva p24-positiva serumen.To ensure that the peptide reactivities at EIA were indeed directed against p24 in HIV-1, 6 of the 8 p24 peptide reactive serums (Nos. AE and H in Table 2) were incubated with p24-derived peptides and control peptides in wells of EIA microplates during three consecutive absorptions of 1 hour each. To ensure that an absorption of peptide-reactive antibody had taken place, an EIA was performed in the same wells after the completion of the absorptions. The remaining antibodies were then studied in a standard HIV-1 EIB overnight. In two (Nos. A 468 168 10 15 20 25 30 22 22 and H) of the six sera, the anti-p24 activity was markedly reduced by absorption with the immobilized peptide which had reacted strongly in EIA. One of these two sera was reactive with and absorbed by peptide 262-338 and one with peptide 318-378. The anti-p24 EIB bands did not decrease after absorption with another HIV or HTLV-derived immobilized peptide or with sham-coated wells. (Cf. Fig. 3, where "+" = confirmed HIV antibody positive control and "-" = HIV antibody negative serum control. The arrows show positions in the HIV-1 proteins.) Thus, the arguments for a localization of the antibody reactivity on these two parts of p24 were strengthened in two of the peptide-reactive p24-positive sera subjected to peptide absorption.

De långa peptiderna är valda för optimering av den serologiska reaktiviteten med HIV gag-antikroppar. Långa peptider simulerar konformationella (icke-kontinuerliga) epitoper hos HIV-l p24 gag särskilt väl. Sådana långa pep- tider har aldrig tidigare använts för HIV-serologi. De långa peptiderna, särskilt HIV-l gag 133-193 och 318-378, är utmärkta reagens för både särskiljande av sann från falsk HIV-1-antikroppreaktivitet och för detektion av båda typerna av reaktivitet. I syfte att erhålla en maximal särskiljande effekt mellan falska och positiva reaktivi- teter, används företrädesvis en kombination av flera pep- tider enligt föreliggande.uppfining som diagnostiska anti- gener. i)The long peptides are selected for optimization of the serological reactivity with HIV gag antibodies. Long peptides simulate conformational (non-continuous) epitopes of HIV-1 p24 gag particularly well. Such long peptides have never before been used for HIV serology. The long peptides, especially HIV-1 gag 133-193 and 318-378, are excellent reagents for both distinguishing true from false HIV-1 antibody reactivity and for detecting both types of reactivity. In order to obtain a maximum distinguishing effect between false and positive reactivities, a combination of several peptides according to the present invention is preferably used as diagnostic antigens. in)

Claims (6)

468 168) 23 PATENTKRAV468 168) 23 PATENT CLAIMS 1. Peptider av vilka flera kan användas i kombination för särskiljande mellan ett falskt och sant diagnostiserat HIV-1-positivt serumprov, vilket först har diagnostiserats vara positivt vid ett standardmässigt HIV-1-antikropp- screening-EIA-test och därefter uppvisat ett p24-mönster av serologisk aktivitet vid en elektroforetisk immunblot- tinganalys, k ä n n e t e c k n a d e därav, att de har formlerna a) H-X-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Ile-Gln-Gly-Gln-Met-Val-His- -Gln-Ala-Ile-Ser-Pro-Arg-Thr-Leu-Asn-Ala-Trp-Val-Lys- -Val-Val-Glu-Glu-Lys-Ala-Phe-Ser-Pro-Glu-Val-Ile-Pro- -Met-Phe-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp- -Leu-Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly-X-Z b) H-X-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp-Leu- -Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly-His-Gln-Ala-Ala- -Met-Gln-Met-Leu-Lys-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala- -Glu-Trp-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-Ile- -Ala-Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-X-Z c) H-X-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala-Glu-Trp-Asp-Arg- -Val-His-Pro-Val-X-Z d) H-X-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-Ile-Ala- -Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-Ser-Asp-I1e-Ala- -Gly-Thr-Thr-Ser-Thr-Leu-Gln-Glu-Gln-Ile-Gly-Trp-Met- -Thr-Asn-Asn-Pro-Pro-Ile-Pro-Val-Gly-Glu-Ile-Tyr-Lys- -Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys-Ile-X-Z e) H-X-Glu-Ile-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn- -Lys-Ile-Val-Arg-Met-X-Z f) H-X-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys-Ile- 468 168 24 -Val-Arg-Met-Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Ile-Leu-Asp-Ile-Arg- -Gln-Gly-Pro-Lys-Glu-Pro-Phe-Arg-Asp-Tyr-Val-Asp-Arg- -Phe-Tyr-Lys-Thr-Leu-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala-Ser-Gln-Glu- -Val-Lys-Asn-Trp-Met-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn- -Ala-Asn-Pro-Asp-Cys~Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala4Leu-Gly- -x-z g) H-X-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn-Ala-Asn-Pro-Asp- -Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr- -Leu-Glu-Glu-Met-Met-Thr-Ala-Cys-Gln-Gly-Val-Gly-Gly- -Pro-Gly-His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala-Met-Ser- -Gln-Val-Thr-Asn-Thr-Ala-Thr-Ile-Met-Met-X-Z, i både oxiderad och ej oxiderad form, varvid i den oxiderade for- men en brygga bildats mellan de två cysteinföreningarna i peptiden, och h) H-X-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Met- -Met-Thr-Ala-Cys-Gln-X-Z där ett X representerar en kemisk bindning och det andra representerar en kemisk bindning eller en kopplingsunder- lättande aminosyrasekvens, och Z representerer -NH2 eller -OH.Peptides, several of which can be used in combination to distinguish between a false and true diagnosed HIV-1-positive serum sample, which has first been diagnosed to be positive in a standard HIV-1 antibody screening EIA test and then presented with a p24 pattern of serological activity in an electrophoretic immunoblotting assay, characterized in that they have the formulas a) HX-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Ile-Gln-Gly-Gln-Met-Val-His- - Gln-Ala-Ile-Ser-Pro-Arg-Thr-Leu-Asn-Ala-Trp-Val-Lys- -Val-Val-Glu-Glu-Lys-Ala-Phe-Ser-Pro-Glu-Val-Ile -Pro- -Met-Phe-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp- -Leu-Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly -XZ b) HX-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp-Leu- -Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly-His -Gln-Ala-Ala- -Met-Gln-Met-Leu-Lys-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala- -Glu-Trp-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val -His-Ala-Gly-Pro-Ile- -Ala-Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-XZ c) HX-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala -Ala-Glu-Trp-Asp-Arg- -Val-His-P ro-Val-XZ d) HX-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-Ile-Ala- -Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg- Gly-Ser-Asp-I1e-Ala- -Gly-Thr-Thr-Ser-Thr-Leu-Gln-Glu-Gln-Ile-Gly-Trp-Met- -Thr-Asn-Asn-Pro-Pro-Ile- Pro-Val-Gly-Glu-Ile-Tyr-Lys--Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys-Ile-XZ e) HX-Glu-Ile-Tyr-Lys-Arg- Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn- -Lys-Ile-Val-Arg-Met-XZ f) HX-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn- Lys-Ile-468 168 24 -Val-Arg-Met-Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Ile-Leu-Asp-Ile-Arg- -Gln-Gly-Pro-Lys-Glu-Pro-Phe-Arg -Asp-Tyr-Val-Asp-Arg- -Phe-Tyr-Lys-Thr-Leu-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala-Ser-Gln-Glu- -Val-Lys-Asn-Trp-Met-Thr -Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn- -Ala-Asn-Pro-Asp-Cys ~ Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala4Leu-Gly- -xz g) HX-Thr-Glu- Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn-Ala-Asn-Pro-Asp- -Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr- -Leu- Glu-Glu-Met-Met-Thr-Ala-Cys-Gln-Gly-Val-Gly-Gly- -Pro-Gly-His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala-Met-Ser - -Gln-Val-Thr-Asn-Thr-Ala-Thr-Ile-Met-Met-XZ, in both oxidized and non-oxidized form, v in the oxidized form a bridge is formed between the two cysteine compounds in the peptide, and h) HX-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Met- -Met-Thr -Ala-Cys-Gln-XZ where one X represents a chemical bond and the other represents a chemical bond or a linker facilitating amino acid sequence, and Z represents -NH 2 or -OH. 2. Peptid enligt kravet 1, k ä n n e t e c k - n a d därav, att den kopplingsunderlättande aminosyrasek- vensen representerar åtminstone 4, företrädesvis 8, amino- syrarester, vilka var och en är vald från den grupp som består av -Thr- och -Ser-.2. A peptide according to claim 1, characterized in that the linker-facilitating amino acid sequence represents at least 4, preferably 8, amino acid residues, each of which is selected from the group consisting of -Thr- and -Ser- . 3. Diagnostiska antigener, av vilka flera kan använ- das i kombination för särskiljande mellan ett falskt och sant diagnostiserat HIV-1-positivt serumprov, vilket först har diagnostiserats vara positivt vid ett standardmässigt HIV-1-antikroppscreening-EIA-test och därefter uppvisat ett p24-mönster av serologisk aktivitet vid en elektrofo- retisk immunblottinganalys, varvid de diagnostiska antige- nerna har förmåga att binda till antikroppar med bind- ningsaffinitet för föreningar innehållande en aminosyra- 468 168 25 sekvens motsvarande en epitop eller en samling av epitoper hos HIV-1 p24, k ä n n e t e c k n a d e därav, att var och en av antigenerna huvudsakligen består av ett antigen som är valt bland peptider som inbegriper aminosyrasekven- sen a) H-X-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Ile-Gln-Gly-Gln-Met-Val-His- -Gln-Ala-Ile-Ser-Pro-Arg-Thr-Leu-Asn-Ala-Trp-Val-Lys- -Val-Val-Glu-Glu-Lys-Ala-Phe-Ser-Pro-Glu-Val-Ile-Pro- -Met-Phe-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp- -Leu-Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly-X-Z b) H-X-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp-Leu- -Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly-His-Gln-Ala-Ala- -Met-Gln-Met-Leu-Lys-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-G1u-Ala-Ala- -Glu-Trp-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-Ile- -Ala-Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-X-Z c) H-X-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala-Glu-Trp-Asp-Arg- -Val-His-Pro-Val-X-Z d) H-X-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-Ile-Ala- -Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-Ser-Asp-Ile-Ala- -Gly-Thr-Thr-Ser-Thr-Leu-Gln-Glu-Gln-Ile-Gly-Trp-Met- -Thr-Asn-Asn-Pro-Pro-Ile-Pro-Val-Gly-Glu-Ile-Tyr-Lys- -Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-GlyPLeü3Asn-Lys-Ile-X-Z e) H-X-Glu-Ile-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn- -Lys-Ile-Val-Arg-Met-X-Z f) H-X-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys-Ile- -Val-Arg-Met-Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Ile-Leu-Asp-Ile-Arg- -Gln-Gly-Pro-Lys-Glu-Pro-Phe-Arg-Asp-Tyr-Val-Asp-Arg- -Phe-Tyr-Lys-Thr-Leu-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala-Ser-Gln-Glu- -Val-Lys-Asn-Trp-Met-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn- -Ala-Asn-Pro-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly- -x-z 468 168 26 g) H-X-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn-Ala-Asn-Pro-Asp- -Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr- -Leu-Glu-Glu-Met-Met-Thr-Ala-Cys-Gln-Gly-Val-Gly-G1y- -Pro-Gly-His-Lys-Ala-Arg-Va1-Leu-A1a-G1u-Ala-Met-Ser- -Gln-Val-Thr-Asn-Thr-Ala-Thr-Ile-Met-Met-X-Z, i bàde oxiderad och ej oxiderad form, varvid i den oxiderade for- men en brygga bildats mellan de två cysteinföreningarna i peptiden, och I h) H-X-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-A1a-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Met- -Met-Thr-Ala-Cys-Gln-X-Z där ett X representerar en kemisk bindning och det andra representerar en kemisk bindning eller en kopplingsunder- lättande aminosyrasekvens, och Z representerer -NH2 eller -OH.3. Diagnostic antigens, several of which can be used in combination to distinguish between a false and true diagnosed HIV-1-positive serum sample, which has first been diagnosed to be positive in a standard HIV-1 antibody screening EIA test and then presented a p24 pattern of serological activity in an electrophoretic immunoblotting assay, wherein the diagnostic antigens are capable of binding to antibodies with binding affinity for compounds containing an amino acid sequence corresponding to an epitope or collection of epitopes in HIV -1 p24, characterized in that each of the antigens consists essentially of an antigen selected from peptides comprising the amino acid sequence a) HX-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Ile-Gln-Gly- Gln-Met-Val-His- -Gln-Ala-Ile-Ser-Pro-Arg-Thr-Leu-Asn-Ala-Trp-Val-Lys- -Val-Val-Glu-Glu-Lys-Ala-Phe- Ser-Pro-Glu-Val-Ile-Pro- -Met-Phe-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp- -Leu-Asn-Thr-Met-Leu- As n-Thr-Val-Gly-Gly-XZ b) HX-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp-Leu- -Asn-Thr-Met-Leu-Asn- Thr-Val-Gly-Gly-His-Gln-Ala-Ala- -Met-Gln-Met-Leu-Lys-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-G1u-Ala-Ala- -Glu-Trp-Asp- Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-Ile- -Ala-Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-XZ c) HX-Glu-Thr- Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala-Glu-Trp-Asp-Arg- -Val-His-Pro-Val-XZ d) HX-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala- Gly-Pro-Ile-Ala- -Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-Ser-Asp-Ile-Ala- -Gly-Thr-Thr-Ser-Thr-Leu-Gln- Glu-Gln-Ile-Gly-Trp-Met- -Thr-Asn-Asn-Pro-Pro-Ile-Pro-Val-Gly-Glu-Ile-Tyr-Lys- -Arg-Trp-Ile-Ile-Leu- GlyPLeü3Asn-Lys-Ile-XZ e) HX-Glu-Ile-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn- -Lys-Ile-Val-Arg-Met-XZ f) HX -Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys-Ile- -Val-Arg-Met-Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Ile-Leu-Asp-Ile- Arg- -Gln-Gly-Pro-Lys-Glu-Pro-Phe-Arg-Asp-Tyr-Val-Asp-Arg- -Phe-Tyr-Lys-Thr-Leu-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala- Ser-Gln-Glu- -Val-Lys-Asn-Trp-Met-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn- -Ala-Asn-Pro-Asp-Cys-L ys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly- -xz 468 168 26 g) HX-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn-Ala-Asn-Pro-Asp- - Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr- -Leu-Glu-Glu-Met-Met-Thr-Ala-Cys-Gln-Gly-Val-Gly -G1y- -Pro-Gly-His-Lys-Ala-Arg-Va1-Leu-A1a-G1u-Ala-Met-Ser- -Gln-Val-Thr-Asn-Thr-Ala-Thr-Ile-Met-Met -XZ, in both oxidized and non-oxidized form, wherein in the oxidized form a bridge is formed between the two cysteine compounds in the peptide, and I h) HX-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-A1a-Ala-Thr- Leu-Glu-Glu-Met- -Met-Thr-Ala-Cys-Gln-XZ where one X represents a chemical bond and the other represents a chemical bond or a linker facilitating amino acid sequence, and Z represents -NH 2 or -OH. 4. Förfarande för särskiljande mellan ett falskt och sant diagnostiserat HIV-1-positivt serumprov, vilket först har diagnostiserats vara positivt vid ett standardmässigt HIV-1-antikroppscreening-EIA-test och därefter uppvisat ett p24-mönster av serologisk aktivitet vid en elektro- foretisk immunblottinganalys, k ä n n e t e c k n a t därav, att en kombination av flera peptider som är valda fràn den grupp som består av a) H-X-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Ile-Gln-Gly-Gln-Met-Val-His- -Gln-Ala-I1e-Ser-Pro-Arg-Thr-Leu-Asn-Ala-Trp-Val-Lys- -Val-Val-Glu-Glu-Lys-Ala-Phe-Ser-Pro-Glu-Val-Ile-Pro- -Met-Phe-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp- -Leu-Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly-X-Z, b) H-X-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp-Leu- -Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly-Gly-His-Gln-Ala-Ala- -Met-Gln-Met-Leu-Lys-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala- -Glu-Trp-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-Ile- -Ala-Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-X-Z 468 168 27 c) H-X-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala-Glu-Trp-Asp-Arg- -Val-His-Pro-Val-X-Z d) H-X-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-I1e-Ala- -Pro-Gly-Gln-Met-Arg-G1u-Pro-Arg-Gly-Ser-Asp-Ile-Ala- -Gly-Thr-Thr-Ser-Thr-Leu-Gln-Glu-Gln-Ile-Gly-Trp-Met- -Thr-Asn-Asn-Pro-Pro-I1e-Pro-Va1-Gly-G1u-Ile-Tyr-Lys- -Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys-Ile-X-Z e) H-X-Glu-Ile-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn- -Lys-Ile-Val-Arg-Met-X-Z f) H-X-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys-Ile- -Val-Arg-Met-Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Ile-Leu-Asp-Ile-Arg- -Gln-Gly-Pro-Lys-Glu-Pro-Phe-Arg-Asp-Tyr-Val-Asp-Arg- -Phe-Tyr-Lys-Thr-Leu-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala-Ser-Gln-G1u- -Val-Lys-Asn-Trp-Met-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn- -Ala-Asn-Pro-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly- -X-Z g) H-X-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn-Ala-Asn-Pro-Asp- -Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr- -Leu-Glu-Glu-Met-Met-Thr-Ala-Cys-Gln-Gly-Val-Gly-Gly- -Pro-Gly-His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala-Met-Ser- -Gln-Val-Thr-Asn-Thr-Ala-Thr-Ile-Met-Met-X-Z, i både oxiderad och ej oxiderad form, varvid i den oxiderade for- men en brygga bildats mellan de tvà cysteinföreningarna i peptiden, och h) H-X-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-G1u-Met- -Met-Thr-Ala-Cys-Gln-X-Z där ett X representerar en kemisk bindning och det andra representerar en kemisk bindning eller en kopplingsunder- lättande aminosyrasekvens, och Z representerer -NH2 eller -OH, 468 168 28 varvid peptiderna har förmåga att binda till antikroppar med bindningsaffinitet för föreningar innehållande en aminosyrasekvens motsvarande en epitop eller samling av epitoper hos HIV-l p24 och eventuellt är kopplade till en bärare, sätts såsom antigener till serumprovet, och att eventuella bildade antigen/antikroppkomplex detekteras genom användning av en immunanalys, varvid särskiljandet åstadkoms med basis på att serumprovet är falskt HIV-1- positivt om komplexen detekteras och sant HIV-1-positivt om komplexen inte detekteras.A method for distinguishing between a false and true diagnosed HIV-1-positive serum sample, which has first been diagnosed to be positive in a standard HIV-1 antibody screening EIA test and then showed a p24 pattern of serological activity at an electrophysiological Foret immunoblotting assay, characterized in that a combination of several peptides selected from the group consisting of a) HX-Pro-Ile-Val-Gln-Asn-Ile-Gln-Gly-Gln-Met-Val-His --Gln-Ala-I1e-Ser-Pro-Arg-Thr-Leu-Asn-Ala-Trp-Val-Lys- -Val-Val-Glu-Glu-Lys-Ala-Phe-Ser-Pro-Glu-Val -Ile-Pro- -Met-Phe-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp- -Leu-Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly -Gly-XZ, b) HX-Ser-Ala-Leu-Ser-Glu-Gly-Ala-Thr-Pro-Gln-Asp-Leu- -Asn-Thr-Met-Leu-Asn-Thr-Val-Gly- Gly-His-Gln-Ala-Ala- -Met-Gln-Met-Leu-Lys-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala- -Glu-Trp-Asp-Arg-Val-His- Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-Ile- -Ala-Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-XZ 468 168 27 c) HX-Glu-Thr-Ile-Asn -Glu-Glu-Ala-Ala-G lu-Trp-Asp-Arg- -Val-His-Pro-Val-XZ d) HX-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-I1e-Ala- -Pro-Gly -Gln-Met-Arg-G1u-Pro-Arg-Gly-Ser-Asp-Ile-Ala- -Gly-Thr-Thr-Ser-Thr-Leu-Gln-Glu-Gln-Ile-Gly-Trp-Met- -Thr-Asn-Asn-Pro-Pro-I1e-Pro-Va1-Gly-G1u-Ile-Tyr-Lys- -Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys-Ile-XZ e ) HX-Glu-Ile-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn- -Lys-Ile-Val-Arg-Met-XZ f) HX-Tyr-Lys-Arg-Trp -Ile-Ile-Leu-Gly-Leu-Asn-Lys-Ile- -Val-Arg-Met-Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Ile-Leu-Asp-Ile-Arg- -Gln-Gly-Pro -Lys-Glu-Pro-Phe-Arg-Asp-Tyr-Val-Asp-Arg- -Phe-Tyr-Lys-Thr-Leu-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala-Ser-Gln-G1u- -Val -Lys-Asn-Trp-Met-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn- -Ala-Asn-Pro-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu- Gly- -XZ g) HX-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn-Ala-Asn-Pro-Asp- -Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Gly -Pro-Ala-Ala-Thr- -Leu-Glu-Glu-Met-Met-Thr-Ala-Cys-Gln-Gly-Val-Gly-Gly- -Pro-Gly-His-Lys-Ala-Arg-Val -Leu-Ala-Glu-Ala-Met-Ser- -Gln-Val-Thr-Asn-Thr-Ala-Thr-Ile-Met-Met-XZ, in both oxidized and non-oxidized oxidized form, wherein in the oxidized form a bridge is formed between the two cysteine compounds in the peptide, and h) HX-Lys-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-G1u-Met- Met-Thr-Ala-Cys-Gln-XZ where one X represents a chemical bond and the other represents a chemical bond or a linker facilitating amino acid sequence, and Z represents -NH 2 or -OH, wherein the peptides are capable of binding to antibodies with binding affinity for compounds containing an amino acid sequence corresponding to an epitope or collection of epitopes of HIV-1 p24 and optionally linked to a carrier, are added as antigens to the serum sample, and any antigen / antibody complexes formed are detected using an immunoassay, the distinction is made on the basis that the serum sample is false HIV-1 positive if the complexes are detected and true HIV-1 positive if the complexes are not detected. 5. Förfarande enligt kravet 4, k ä n n e t e c k - n a t därav, att en enzymimmunanalys (EIA), en radio- immunanalys (RIA), en immunanalys som involverar märkning med metall, en fluorescensimmunanalys (FIA) eller en immunanalys vid vilken peptiden är löslig och inhiberar en annan reaktion används som immunanalys för detektion av antikropp/antigenkomplexet.5. A method according to claim 4, characterized in that an enzyme immunoassay (EIA), a radioimmunoassay (RIA), an immunoassay involving metal labeling, a fluorescence immunoassay (FIA) or an immunoassay in which the peptide is soluble and inhibits another reaction is used as an immunoassay to detect the antibody / antigen complex. 6. Förfarande enligt kravet 4, k ä n n e t e c k - n a t därav, att var och en av peptiderna enligt kravet 1 sätts till serumprovet kopplade till en bärare i form av ett harts, en mikroplatta, en plastyta, en gel eller en matris.A method according to claim 4, characterized in that each of the peptides according to claim 1 is added to the serum sample coupled to a carrier in the form of a resin, a microplate, a plastic surface, a gel or a matrix.
SE9000595A 1990-02-20 1990-02-20 HIV-1, P24 PEPTIDES, DIAGNOSTIC ANTIGENS AND PROCEDURES FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSTICS OF PRELIMINARY HIV-1 POSITIVE SERUM TESTS SE468168B (en)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9000595A SE468168B (en) 1990-02-20 1990-02-20 HIV-1, P24 PEPTIDES, DIAGNOSTIC ANTIGENS AND PROCEDURES FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSTICS OF PRELIMINARY HIV-1 POSITIVE SERUM TESTS
AU74448/91A AU7444891A (en) 1990-02-20 1991-02-18 New hiv p24 peptides, diagnostic antigens and discriminative immunoassay method
PCT/SE1991/000114 WO1991013360A1 (en) 1990-02-20 1991-02-18 NEW HIV p24 PEPTIDES, DIAGNOSTIC ANTIGENS AND DISCRIMINATIVE IMMUNOASSAY METHOD

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9000595A SE468168B (en) 1990-02-20 1990-02-20 HIV-1, P24 PEPTIDES, DIAGNOSTIC ANTIGENS AND PROCEDURES FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSTICS OF PRELIMINARY HIV-1 POSITIVE SERUM TESTS

Publications (3)

Publication Number Publication Date
SE9000595D0 SE9000595D0 (en) 1990-02-20
SE9000595L SE9000595L (en) 1991-08-21
SE468168B true SE468168B (en) 1992-11-16

Family

ID=20378616

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE9000595A SE468168B (en) 1990-02-20 1990-02-20 HIV-1, P24 PEPTIDES, DIAGNOSTIC ANTIGENS AND PROCEDURES FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSTICS OF PRELIMINARY HIV-1 POSITIVE SERUM TESTS

Country Status (3)

Country Link
AU (1) AU7444891A (en)
SE (1) SE468168B (en)
WO (1) WO1991013360A1 (en)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4039925A1 (en) * 1990-12-14 1992-06-17 Behringwerke Ag SELECTED PEPTIDES OF THE GROUP-SPECIFIC ANTIGEN (GAG) OF HUMANEM IMMUNE DEFICIENCY VIRUS (HIV), THEIR PRODUCTION AND USE
SE9101863D0 (en) * 1991-06-13 1991-06-13 Replico Medical Ab PEPTIDES, DIAGNOSTIC ANTIGEN, VACCINE COMPOSITION AND PROCEDURES FOR SELECTING HIV STARMS
CA2358915C (en) 1998-12-31 2010-06-01 Chiron Corporation Modified hiv env polypeptides
CA2358385C (en) 1998-12-31 2013-08-06 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
NO311807B1 (en) 1999-03-04 2002-01-28 Bionor Immuno As HIV peptides, antigens, vaccine preparations, immunoassay test kits and a method for detecting antibodies induced by HIV
JP2004503205A (en) * 2000-02-04 2004-02-05 デューク・ユニバーシティー Human immunodeficiency virus vaccine
NO314588B1 (en) 2000-09-04 2003-04-14 Bionor Immuno As HIV peptides, antigens, vaccine composition, immunoassay test kits and a method for detecting antibodies induced by HIV
JP5033303B2 (en) 2001-07-05 2012-09-26 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド Polynucleotides encoding polypeptides with antigenic type C HIV, polypeptides and uses thereof
US20030170614A1 (en) 2001-08-31 2003-09-11 Megede Jan Zur Polynucleotides encoding antigenic HIV type B polypeptides, polypeptides and uses thereof
US20150174235A1 (en) 2012-06-06 2015-06-25 Bionor Immuno As Vaccine
CA2951616A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 Bionor Immuno As Method for reducing and/or delaying pathological effects of human immunodeficiency virus i (hiv) or for reducing the risk of developing acquired immunodeficiency syndrome (aids)
US20180140694A1 (en) 2015-05-04 2018-05-24 Bionor Immuno As Dosage regimen for hiv vaccine

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE64006B1 (en) * 1984-10-18 1995-06-28 Pasteur Institut Antigens particulary envelope antigens of the virus of lymphadenopathies and of the acquired immune-deficiency syndrome and virus process for producing virus envelope antigens use of said antigens in the preparation of immunogenic compositions or for the diagnosis of the presence of antibodies against this virus
DE3650011T2 (en) * 1985-04-08 1994-11-17 Genetic Systems Corp EXPRESSION AND DIAGNOSIS WITH GAG-CODED PEPTIDES THAT ARE IMMUNOLOGICALLY REACTIVE WITH ANTIBODIES AGAINST LAV.
DE3650175T3 (en) * 1985-04-29 2007-09-06 Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules SYNTHETIC ANTIGENIC TO IDENTIFY AIDS.
US4808536A (en) * 1986-02-27 1989-02-28 Centocor, Inc. Immunochemical method for detection of antibody against HTLV-III core protein based upon recombinant HTLV-III gag gene encoded protein
NZ221440A (en) * 1986-08-20 1991-11-26 Genetic Systems Corp Composition containing monoclonal antibodies/peptides useful in treating and diagnosing hiv infections
CA1339363C (en) * 1987-05-01 1997-08-26 Alan Ray Flesher Monoclonal antibodies to specific antigenic regions of the human immunodeficiency virus and methods for use
EP0330359A3 (en) * 1988-02-25 1991-06-05 Bio-Rad Laboratories, Inc. Composition useful in the diagnosis and treating of hiv-1 infection
DE68925909T2 (en) * 1988-12-20 1996-11-14 Clarity Technologies Inc SYNTHETIC HIV-LIKE PEPTIDES, THEIR COMPOSITIONS AND USES

Also Published As

Publication number Publication date
AU7444891A (en) 1991-09-18
SE9000595D0 (en) 1990-02-20
WO1991013360A1 (en) 1991-09-05
SE9000595L (en) 1991-08-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5648209A (en) Specific peptide fragment of the feline immunodeficiency virus (FIV), and its use as a diagnostic reagent
SE468168B (en) HIV-1, P24 PEPTIDES, DIAGNOSTIC ANTIGENS AND PROCEDURES FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSTICS OF PRELIMINARY HIV-1 POSITIVE SERUM TESTS
EP0644950A1 (en) Assay for detection of hiv antigen and hiv antibody
CN111978377A (en) COVID-19 antigen, preparation method and application
AU754309B2 (en) Diagnosis of feline immunodeficiency virus infection using env/gag polypeptide markers
WO1995023973A2 (en) Hiv immunoassay utilizing recombinant protein and synthetic peptide reagents
US7888003B2 (en) Methods for the detection of HIV-1 antibodies employing polypeptides obtained from gag P6 protein
Dawson et al. Reliable detection of individuals seropositive for the human immunodeficiency virus (HIV) by competitive immunoassays using Escherichia coli-expressed HIV structural proteins
Siitari et al. New sensitive and specific assay for human immunodeficiency virus antibodies using labeled recombinant fusion protein and time-resolved fluoroimmunoassay
US5068174A (en) T-cell lymphotrophic virus protein and assay
Kline et al. Diagnosis and differentiation of HIV-1 and HIV-2 infection by two rapid assays in Nigeria
EP2856163A1 (en) Method for diagnosing and differentiating hiv-2 infections
Sibille et al. Comparison of serological tests for the diagnosis of feline immunodeficiency virus infection of cats
Kvinesdal et al. Immunofluorescence assay for detection of antibodies to human immunodeficiency virus type 2
EP0386713A2 (en) Immunoassay for antibodies to HIV
CA1283043C (en) T-cell lymphotrophic virus protein and assay
Levi et al. The use of peptides from glycoproteins G-2 and D-1 for detecting herpes simplex virus type 2 and type-common antibodies
US8980546B2 (en) Method for the detection of HIV-1-specific antibodies utilizing a Vpu polypeptide
Norrby et al. Site-directed enzyme-linked immunosorbent assay with a synthetic simian immunodeficiency virus SIVmac peptide identifying antibodies against the HIV-2 transmembrane glycoprotein
RU2283497C1 (en) IMMUNOENZYMATIC TEST SYSTEM FOR IDENTIFYING THE SPECTRUM OF ANTIBODIES TO HIV 1 AND 2 AND DETECTING ANTIGEN HIV 1 (p24) NAMED &#34;DS-IEA-ANTI-HIV 1 AND 2, HIV 1 GROUP O-SPECTRUM+AG p24 HIV 1&#34;
WO2023242155A1 (en) Compositions and methods for the diagnosis of hiv infection
CN111995666A (en) Interfering peptides and methods for detecting microorganisms
Modrow et al. Carrier bound synthetic oligopeptides in ELISA test systems for distinction between HIV-1 and HIV-2 infection
WO1991019011A1 (en) Immunoassays for anti-hiv-1 antibodies
Gevorkian et al. Serologic reactivity of a synthetic peptide from human immunodeficiency virus type 1 gp41 with sera from a Mexican population

Legal Events

Date Code Title Description
NAL Patent in force

Ref document number: 9000595-0

Format of ref document f/p: F