CN111995666A - 用于检测微生物的干扰肽和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新的干扰肽，其具有长度为7至12个氨基酸的肽序列S，所述肽序列S来源于微生物M的抗原蛋白的肽序列，所述序列S与长度为7至12个氨基酸的肽序列S’匹配，所述肽序列S’来源于不同于微生物M的微生物M’的靶蛋白的肽序列，条件是：在它们7至12个氨基酸的长度上序列S和S’具有至少50％的相同性，以及至少4个相同的或类似的连续氨基酸，它们的长度是相同的，或者它们在所述序列的一端和/或另一端有1或2个氨基酸的差异。本发明还涉及所述干扰肽在基于免疫测定法的体外检测生物学样品中微生物M’或M的存在的方法中的使用，以改进特异性。
Description
本申请是申请日为2013年3月11日，申请号为201380024636.3，题目为“用于检测微生物的干扰肽和方法”的专利申请的分案申请。
本发明涉及诊断领域。特别地，本发明涉及新的肽，其对于消除在基于免疫学分析体外检测生物学样品中微生物的存在时的干扰问题特别有用，所述干扰问题跟所测试的样品有关。
基于免疫学分析的检测方法广泛用于诊断领域。这些方法可以检测包括蛋白质(抗原/抗体)、肽和半抗原(例如，类固醇或维生素)形式的分析物。免疫学分析，也称为免疫测定法法或免疫酶测试，是本领域技术人员熟知的方法，涉及待测分析物和一种或多种与该分析物结合的伴侣之间的免疫学反应。举例来说，可能提及的这样的免疫测定法方法包括可按照“三明治”的原理或者按照“竞争”原理进行操作的方法，诸如ELISA、ELFA、CLIA、ECLIA、IRMA和RIA，以及免疫检测方法，例如免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫荧光、Western印迹和点印迹。
这些免疫学分析的结果，接下来由实验室提供给医生，医生会解释这些结果以诊断病理状态，随后给病人提供适当的治疗。因此，对于这些分析尤其重要的是：高度敏感性，在这个意义上，它们不产生假阴性结果；以及高度特异性，在这个意义上，它们不产生假阳性结果。
一个损害这些分析的灵敏度以及尤其是特异性的原因是与所测试的样品相关的干扰的存在。每次待测试样品产生改变测试信号的反应时发生干扰，从而改变结果的正确值，例如通过提供不能与所述分析物区分开的信号，从而产生假阳性，或通过使信号减弱，从而当信号低于所用的试剂盒的检测阈值时，可能产生假阴性结果，(Tate and Ward,2004)。
在免疫学分析时，假阳性反应经常与非特异性抗原抗体反应相关，所述非特异性抗原抗体反应是由于测试样品中存在一些干扰分析的物质，诸如与用于所述分析的结合伴侣结合的抗体。例如，某些病人的血清中含有针对动物蛋白的人抗体，例如是在接种疫苗后产生的，所述抗体能够与作为所用的分析试剂盒的成分的动物免疫球蛋白反应，从而可以产生异常的分析结果。内源性的干扰物质既可能存在于获得自健康个体的样品，也可能存在于获得自具有病理性状况的或具有感染的个体的样品。这种干扰现象不依赖于患者的临床状态。
已对各种用于减少与所测试的样品相关的干扰反应的方法进行了描述。比如，已知的实践使用碳水化合物、蛋白质化合物、蛋白质混合物或水解产物(EP 0 260 903，US 4931 385)。还描述了使用修饰的蛋白质，尤其是琥珀酰化和乙酰化的蛋白质(EP 0 525916)，或者具有相对于天然序列进行了必要修饰的氨基酸序列的肽，比如基本上由D-氨基酸组成的肽(US 6 153 393)。然而，这些办法都不能完全的消除所述分析中的假阳性的存在，并且加入这些物质有时甚至导致其它的干扰，降低检测的敏感性。
其他假阳性可能不是因为所测试的样品，而是因为测试所用的结合伴侣本身，比如要检测同一样品里的抗原和抗体时，如专利申请WO 2008/027942中描述的那样。然而，这些结合伴侣相关的干扰与所分析的样品相关的干扰不同，并且用来降低这类干扰的方法与用来降低所分析的样品相关的干扰的方法不同。
因为并非所有的干扰都被消除，实验室有时不得不进行替代分析或额外的测量，以验证他们的诊断测试的结果。因此，减少，甚或是消除实验中的干扰特别重要，特别是当存在假阳性的问题时，因为患者会接受他们并不需要的药物治疗。
申请人证明，对于所有预期，即在用免疫学分析体外检测微生物的存在时，可以用来源自这个微生物特异性的肽，和来源自与所检测微生物不同的微生物显示与所述肽至少50％相同性的其它肽，以消除所测试的样品中的假阳性检测而不降低该测试的敏感性，所述假阳性检测是因为与这些所测试的样品相关的干扰。
事实上，申请人已经证明假阳性和针对于微生物M1的抗体的存在相关，所述微生物M1不同于待测微生物M2，所述微生物M1是造成干扰以及想要中和的检测的原因，其某一种肽显示出与微生物M2的肽在有限长度上的相同性，并且添加相应的特定的属于微生物M1或M2的肽，可以消除假阳性而不损害测试的敏感性。
因此，本发明涉及干扰肽，其特征在于，它们的序列选自：
(i)长度为7至12个氨基酸的肽序列S1，其来源于微生物M1抗原蛋白，和
(ii)长度为7至12个氨基酸的肽序列S2，其来源于与M1不同的微生物M2的靶蛋白的肽序列，
其中所述序列S1和S2相匹配，在其7至12个氨基酸的长度上，它们显示至少50％的相同性，以及至少4个相同的或类似的连续氨基酸，它们的长度是相同的，或者它们在序列一端和/或另一端显示出1或2个氨基酸的差异。
一个主题涉及基于免疫测定法体外检测生物学样品中微生物M2存在的方法，所述方法通过检测至少一种针对待测微生物M2的靶蛋白的抗体AbM2而进行，其特征在于包括以下步骤：
a)提供免疫测定法所需的、至少一种待测抗体AbM2的至少一种结合伴侣，所述至少一种结合伴侣来源于靶蛋白或者是靶蛋白本身，所述抗体针对所述靶蛋白，
b)提供至少一种干扰肽，其具有选自如下的序列：
-(i)长度为7至12个氨基酸的肽序列S1，其来源于与所述微生物M2不同的微生物M1的抗原蛋白的肽序列，以及
-(ii)长度为7至12的氨基酸的肽序列S2，其来源于所述微生物M2的靶蛋白的肽序列，而且包含在所述至少一种结合伴侣的肽序列中，
-其中所述序列S1和S2相匹配，在其7至12个氨基酸的长度上显示至少50％的相同性，以及至少4个相同的或类似的连续氨基酸，它们的长度是相同的，或者它们在序列的一端和/或另一端显示出1或2个氨基酸的差异，
c)在所述至少一种干扰肽存在的条件下实施免疫测定法，以及
d)通过测量抗体AbM2和结合伴侣之间形成的复合物检测微生物M2的存在。
另一主题涉及基于免疫测定法体外检测生物学样品中微生物M2的方法，所述方法通过检测待测微生物M2的至少一种靶蛋白而进行，其特征在于包括以下步骤：
a)提供免疫测定法所需的、至少一种待测抗体AbM2的至少一种结合伴侣，
b)提供至少一种具有选自如下的序列的干扰肽：
-(i)长度为7至12个氨基酸的肽序列S1，其来源于与所述微生物M2不同的微生物M1的抗原蛋白的肽序列，以及
-(ii)长度为7至12的氨基酸的肽序列S2，其来源于上述微生物M2的靶蛋白中的肽序列，而且包含在所述至少一种靶蛋白的肽序列中，
-其中所述序列S1和S2相匹配，在其7至12个氨基酸的长度上显示50％的相同性，以及至少4个相同的或类似的连续氨基酸，它们的长度是相同的，或者它们在序列一端和/或另一端显示出1或2个氨基酸的差异。
c)在所述至少一种干扰肽存在的条件下实施免疫测定法，以及
d)通过测量靶蛋白和结合伴侣之间形成的复合物检测微生物M2的存在。
另一主题涉及干扰肽的使用，所述干扰肽具有选自如下的序列：
(i)长度为7至12个氨基酸的肽序列S1，其来源于微生物M1抗原蛋白，和
(ii)微生物M2的靶蛋白肽序列的长度为7至12个氨基酸的肽S2，其来源于与所述微生物M1不同，
其中在基于免疫测定法体外检测生物学样品中代表待测微生物M2的性分析物的方法中，所述序列S1和S2互相匹配，在其7至12个氨基酸的长度上显示至少50％的相同性，以及至少4个相同的或类似的连续氨基酸，它们的长度是相同的，或者它们在序列的一端和/或另一端显示出1或2个氨基酸的差异。
另一主题涉及改进生物学样品中基于免疫测定法体外检测代表待测微生物M2的分析物的方法的特异性的方法，其特征在于，在免疫测定法实施过程中，其包括使用至少一种具有如下序列的干扰肽：
(i)长度为7至12个氨基酸的肽序列S1，其来源于与所述微生物M2不同的微生物M1的抗原蛋白的肽序列，以及
(ii)长度为7至12的氨基酸长度的肽序列S2，其来源于所述微生物M2的靶蛋白中的肽序列，
其中所述序列S1和S2相匹配，在其7至12个氨基酸的长度上显示至少50％的相同性，以及至少4个相同的或类似的连续氨基酸，它们的长度是相同的，或者它们在序列的一端和/或另一端显示出1或2个氨基酸的差异。
申请人已经表明，针对所有预期，通过使用特定的肽，在实施用于检测微生物M2的免疫测定法的过程中可以减少甚至消除与所测试样品相关的假阳性检测，这些肽具有以下特点：
-它们具有长度为7至12个氨基酸的肽序列，其来源于与所述微生物M2不同的微生物M1的抗原蛋白的肽序列，或者具有长度为7至12的氨基酸的肽序列，其来源于待测微生物M2的靶蛋白的肽序列，
-序列S1和S2相匹配，
-在其7至12个氨基酸的长度上，序列S1和S2显示至少50％的相同性，以及至少有4个相同的或类似的连续的氨基酸，
-序列S1和S2具有相同的长度，或者它们在序列的一端和/或另一端显示出1或2个氨基酸的差异。
为了清楚，当需要概括时，用于本发明目的的干扰肽称为涉及具有序列S的肽，所述肽具有序列S1或S2，因此，所述肽来源于微生物M1或M2。用于分离具有序列S的肽的肽称为具有序列S’的肽，已知这种选择是完全任意的，因为这两种肽具有序列S1和S2，因此S和S’，可以用作并且已经用作根据本发明的干扰肽，并且因此选择将具有序列S1或S2的肽称为具有S’的肽。
换句话说，用于本发明目的的干扰肽是具有长度为7至12个氨基酸序列S的干扰肽，所述序列S来源于微生物M的抗原蛋白的肽序列。所述S与不同的长度为7至12个氨基酸的肽序列S’匹配，所述肽序列S’来源于与微生物M不同的微生物M’的靶蛋白的肽序列。其中在其7至12个氨基酸的长度上，所述序列S和S’显示至少50％的相同性，以及至少4个相同的或类似的连续氨基酸，它们的长度是相同的，或者它们在序列的一端和/或另一端显示出1或2个氨基酸的差异。
具有序列S的肽对于中和样品中不想检测到的微生物(M或M’)特别重要，所述微生物干扰待测微生物产生(分别是M’和M)。所述不想检测到的微生物可以称为干扰微生物。
换句话说，当待测靶微生物是微生物M时，来源于所述靶微生物的具有序列S的肽用于中和干扰微生物M’。另一方面，当待测靶微生物是微生物M’时，来源于所述干扰微生物的具有序列S的肽用于中和干扰微生物M。
为了澄清，将待检测的微生物称为微生物M2，代表微生物M’或是M，当然，已知这个名字也是任意的，也可以选择称此微生物为M1。
换句话说，如上定义的本发明的具有序列S的干扰肽用于检测微生物M或是M’。
想要检测其存在的微生物M2(M’或M)是任何一种引起病理性状况的微生物，并且有必要对所述微生物进行可靠诊断以实施治疗或随访，或限制其繁殖。所述微生物可能是本领域的技术人员熟知的病毒、细菌或是酵母。
病毒的非限制性实例可以包括肝炎病毒类(如甲、乙、丙、戊和庚型肝炎病毒)、人类免疫缺陷病毒(如HIV-1和HIV-2)、Epstein-Barr病毒(EBV)、流感病毒(如H1N1和H5N1)\巨细胞病毒(CMV)、麻疹病毒、JC病毒等。
细菌的非限制性实例可以包括葡萄球菌(如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus))、链球菌类(如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))和芽孢杆菌。
酵母的非限制性实例可以包括假丝酵母。
术语“微生物M2的靶蛋白”是指所述微生物基因组编码的在所述微生物感染的过程中产生的蛋白质，其可以通过免疫测定法方法进行检测，或是其在所感染的宿主的部分中产生抗体应答，所述抗体应答也可以通过免疫测定法方法进行检测。因此，比如说，在丙型肝炎病毒(HCV)的情况下，所述靶蛋白可以是，例如，核心、NS3、NS4和NS5蛋白。至于HIV-1病毒，所述靶蛋白可以包括，例如，Env(gp160、gp120、gp41)、Gag(P55及其成熟加工形式：p24衣壳、p17基质等)、Pol(逆转录酶和整合酶)、Tat、Nef和Rev蛋白。另一个例子，所述靶蛋白可以包括金黄色葡萄球菌的Emp(细胞外基质蛋白结合蛋白)或PVL(Panton-Valentineleukocydin)蛋白，或核糖体小亚基甲基转移酶H、延伸因子P或肺炎链球菌DnaK伴侣蛋白。当然，本领域技术人员完全知道他们希望检测的微生物的各种靶蛋白。
表述“与待检测的微生物M2(分别为M’或M)不同的微生物M1(M或M’)”是指非微生物M2本身的任何微生物。微生物M1和M2可以是性质相同的微生物(病毒、细菌、酵母)，属于同一科(例如，待测微生物M2可以是HCV病毒而另一种微生物是HBV病毒)，或属于不同科(例如，待测病毒是HCV病毒而另一种微生物是HIV-1病毒)。微生物M1和M2可能是不同性质的微生物(病毒/细菌、病毒/酵母、细菌/酵母)。这些微生物是每个患者可能遇到的微生物，并且所述患者会针对所述微生物产生抗体应答。
根据一个实施方案，所述微生物M2是病毒或细菌。根据另一个实施方案，所述微生物M2是病毒而所述微生物M1是细菌，或者所述微生物M2是细菌而所述微生物M1是病毒。
根据一个实施方案，所述病毒是丙型肝炎病毒，HCV，而不同于该病毒的微生物是细菌，尤其是选自金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、Pseudomonas entomophila和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)(GB-1菌株)中选择的。
根据另一个实施方案，所述病毒是人类免疫缺陷病毒，HIV-1，并且与该病毒不同的微生物是肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)。
表述“与待测微生物M2不同的微生物M1(或干扰微生物)的抗原蛋白”是指所述微生物M1的蛋白质，其诱导所感染的宿主部分中的抗体应答，所述宿主是从其获取生物学样品的病人。再一次，本领域技术人员知道待测的对应于上述靶蛋白的所述微生物M1的抗原蛋白，并且他们能够容易地区分微生物的抗原蛋白或称为靶蛋白和非抗原蛋白或称为非靶蛋白。
如前面所指出的，本领域技术人员还知道，表述“抗原蛋白”与表述“靶蛋白”仅需要参照检测方法中的微生物来进行区分，即是关于哪个是想要检测的(称为靶蛋白)或哪个是想要中和的(称为抗原蛋白)。因此，这两个术语不区别使用并且被理解为在不考虑其用途的情况下，对于具有序列S的干扰肽是相同的。
根据本发明，具有序列S和S’，并因此具有序列S1或S2的肽具有7-12个氨基酸，所述肽对应抗体的抗体决定簇识别的氨基酸长度。根据一个实施方案，序列S1和S2具有8至10个氨基酸。
根据另一个实施方案，所述干扰肽具有序列S，所述序列S选自：
-具有序列SEQ ID NO:1的Y7E-1，具有序列S’的肽是具有序列SEQ ID NO:2的肽V7E，
-具有序列SEQ ID NO:2的V7E，具有序列S’的肽是具有序列SEQ ID NO:1的肽Y7E-1，
-具有序列SEQ ID NO:3的A8E，具有序列S’的肽是具有序列SEQ ID NO:4的肽E8E，
-具有序列SEQ ID NO:5的Y7E-2，具有序列S’的肽是具有序列SEQ ID NO:4的肽E8E，具有序列SEQ ID NO:6的D8E，具有序列S’的肽是具有序列SEQ ID NO:4的肽E8E，
-具有序列SEQ ID NO:4的E8E，具有序列S’的肽是具有序列SEQ ID NO:3的肽A8E，或具有序列SEQ ID NO:5的Y7E-2，或具有序列SEQ ID NO:6的D8E，
-具有序列SEQ ID NO:7的E8L-1，具有序列S’的肽是具有序列SEQ ID NO:8的肽E8L-2，和
-具有序列SEQ ID NO:8的E8L-2，具有序列S’的肽是具有序列SEQ ID NO:7的肽E8L-1。
在这些各种各样的肽中，具有序列SEQ ID NO:2的HCV肽V7E已经在专利申请EP 0582 243A中描述过。但是，此肽还没有被描述为免疫原。它从未被描述为用于消除与所测试样品相关的假阳性的干扰肽。其他的肽是新的，并构成了本发明的一个主题。
因此，本发明中涉及具有选自如下的序列的干扰肽：
(i)长度为7至12个氨基酸的肽序列S1，其来源于微生物M1抗原蛋白，和
(ii)长度为7至12个氨基酸的肽序列S2，其来源于与微生物M1不同的微生物M2的靶蛋白，
其中所述序列S1和S2相匹配，在其7至12个氨基酸的长度上显示至少50％的相同性，以及至少4个相同的或类似的连续氨基酸，它们的长度是相同的，或者它们在序列的一端和/或另一端显示出1或2个氨基酸的差异，但不包括具有序列SEQ ID NO:2的肽V7E。
换句话说，本发明涉及具有7至12个氨基酸的序列S的干扰肽，所述序列S来源于微生物M的抗原蛋白的肽序列，所述序列S可以与7至12个氨基酸的肽序列S’匹配，所述序列S’来源于与所述微生物M不同的微生物M’的靶蛋白。其中所述序列S和S’相匹配，在其7至12个氨基酸的长度上显示至少50％的相同性，以及至少4个相同的或类似的连续氨基酸，它们的长度是相同的，或者它们在序列的一端和/或另一端显示出1或2个氨基酸的差异，但不包括具有序列SEQ ID NO:2的肽V7E。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及以下的肽：具有序列SEQ ID NO:1的Y7E-1、具有序列SEQ ID NO:3的A8E、具有序列SEQ ID NO:4的E8E、具有序列SEQ ID NO:5的Y7E-2、具有序列SEQ ID NO:6的D8E、具有序列SEQ ID NO:7的E8L-1以及具有序列SEQ ID NO:8的E8L-2。
术语“至少50％的相同性”是指各序列至少有一半的氨基酸是相同的或类似的，其中这两个序列至少有4个相同的或类似的连续氨基酸。
通常，术语“氨基酸类似物”是指一种氨基酸，当它取代了序列中的天然氨基酸时，或当它不存在时，不引起任何所述序列抗原反应性的破坏。
特别优选的类似物包括性质保守的替代物，即发生在氨基酸家族内的替换。如本领域技术人员所熟知的,有一些根据家族的氨基酸分类。因此，根据一个分类实例，例如，氨基酸可以分为4个家族，即：(1)酸性氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性氨基酸，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(3)非极性氨基酸，如亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸；以及(4)不带电荷的极性氨基酸，例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时分类为芳香族氨基酸。例如，可合理地预期，分别进行用异亮氨酸或是缬氨酸取代亮氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，用丝氨酸取代苏氨酸，或用另一种具有类似结构关系的氨基酸保守取代一个氨基酸，不会对生物学活性有重要影响。用于预测氨基酸替换对于生物学活性影响的另一个例子由Ng和Henikoff，2001进行了描述。
序列S和S’(S1和S2)在相同长度或显示分布在所述序列的一个和/或另一个末端的一两个氨基酸的差异的条件下相匹配。换句话说，通过如前所述的保守替换或是删除，序列S和S’(S1和S2)具有至少7个氨基酸的共同序列，所述共同序列的氨基酸是相同或相似的，当它们长度不同时，相对于共同序列的额外的氨基酸在一端(1或2个氨基酸)或另一端(1或2个氨基酸)或两端(每侧1个或是2个氨基酸均可)。因此，如果X是共同序列，An是置于末端的氨基酸差异，n是1到4的整数，本发明中肽的匹配可以如下表示：
因此，氨基酸最大差异是4。
参考本领域技术人员所熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolite图，本领域技术人员会容易地确定序列的耐受改变对生物活性无重要影响的区域。
根据一个实施方案，序列S和S’(S1和S2)的共同序列的氨基酸符合以下特征中的至少一个：
-它们是相同的，
-如果它们显示是类似物，它们显示至多1或2个类似物，
-它们显示至多3个保守替换的类似物，
-它们显示至多1或2个缺失的类似物。
根据另一个实施方案，所述至少4个连续氨基酸符合以下特征中的至少一个：
-它们是相同的或保守替换的类似物，
-当它们显示类似物时，有至多1或2个类似物。
根据本发明的另一案例，在预定的肽分子长度上，所述两个序列S和S’(S1和S2)显示至少50％，优选至少55-60％，更优选至少70％，更优选至少80-90％的序列同一性，在50％以上直到100％的任何值也都可以。
本发明中的干扰肽对于在减少甚或消除在确定生物学样品中能够产生假阳性的微生物M2(M’或M)存在的过程中的免疫学分析方法的假阳性特别有用，这些假阳性是由针对微生物M1(M或M”)的抗体产生，所述微生物M1不同于待测微生物M2(M’或是M)，所述抗体称为AbM1或分别称为AbM或AbM’。
为了实施对待测微生物M2(M或M’)的存在的检测，可以实施对针对待测微生物M2的靶蛋白的至少一种抗体(此抗体称为AbM2或分别称为AbM’或AbM)的检测，或实施对至少一种如前文所述的靶蛋白的检测，或是实施两者。在后一种情况下，涉及组合方法或联合(combo)方法。
当基于免疫测定法体外检测生物学样品中微生物M2(M’或M)的存在的方法包括检测针对待测微生物M2的靶蛋白的至少一种抗体AbM2或由所述检测组成时，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：
a)提供所述免疫测定法所需的、所述至少一种待测抗体AbM2的至少一种结合伴侣，所述至少一种结合伴侣来源于所述抗体所针对的靶蛋白，或者是靶蛋白本身，
b)提供如上文所定义的至少一种干扰肽，其中序列S1属于与待测微生物M2不同的微生物M1，而序列S2包括在所述至少一种结合伴侣的肽序列中，
c)在存在所述至少一种干扰肽的条件下实施免疫测定法，以及
d)通过测量所述抗体AbM2与所述结合伴侣之间形成的复合物检测微生物M2的存在。
当待测微生物M2是具有序列S的肽所属于的微生物(因此是微生物M)时，基于免疫测定法体外检测生物学样品中微生物M的存在的方法包括检测针对微生物M靶蛋白的至少一种抗体AbM或由所述检测组成，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：
a)提供至少一种具有如前文所定义的序列S的干扰肽，
b)提供所述免疫测定法所需的、所述至少一种待测抗体AbM的至少一种结合伴侣，所述至少一种结合伴侣来源于所述抗体所针对的靶蛋白，或者是靶蛋白本身，并包括所述肽序列S，
c)在存在所述至少一种具有序列S的干扰肽的条件下实施免疫测定法，以及
d)通过测量所述抗体AbM和所述结合伴侣之间形成的复合物检测微生物M的存在。
当待测微生物M2不是具有序列S的肽所属于的微生物，而是序列S’所属于的微生物(因此是微生物M’)时，基于免疫测定法体外检测生物学样品中微生物M’的方法包括检测针对待测微生物M’靶蛋白的至少一种抗体AbM’或由所述检测组成，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：
a)提供至少一种具有如前文所定义的序列S的干扰肽，
b)提供所述免疫测定法所需的、所述至少一种待测抗体AbM’的至少一种结合伴侣，所述至少一种结合伴侣来源于所述抗体所针对的靶蛋白，或者是靶蛋白本身，并包括如前文所定义的肽序列S’，
c)在存在所述至少一种具有序列S的干扰肽的条件下实施免疫测定法，以及
d)通过测量所述抗体AbM’和所述结合伴侣之间形成的复合物检测微生物M’的存在。
表述“所述至少一种结合伴侣，其来自于所述抗体所针对的所述靶蛋白，或是靶蛋白本身”是指所述结合伴侣是如前文描述的靶蛋白或其能够和待分析样品中抗体结合的片段。
当基于免疫测定法体外检测生物学样品中微生物M2(M’或M)的存在的方法包括检测待测微生物M2的至少一种靶蛋白或由所述检测组成时，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：
a)提供免疫测定法所需的、所述微生物M2的所述至少一种靶蛋白的至少一种结合伴侣，
b)提供至少一种如前文所定义的干扰肽，其中序列S1属于与待测微生物M2不同的微生物M1，并且所述序列S2包括于所述至少一种靶蛋白的肽序列中，
c)在所述至少一种干扰肽存在的条件下实施免疫测定法，以及
d)通过测量所述靶蛋白和所述结合伴侣之间形成的复合物检测微生物M2的存在。
当待测微生物M2是具有序列S的肽所属于的微生物(因此是微生物M)时，基于免疫测定法体外检测生物学样品中微生物M的方法包括检测待测微生物M的至少一种靶蛋白或由所述检测组成，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：
a)提供所述免疫测定法所需的、所述微生物M的至少一种靶蛋白的至少一种结合伴侣，
b)提供至少一种具有如前文所定义的序列S的干扰肽，所述序列S包括于所述至少一种靶蛋白的肽序列中，
c)在存在所述至少一种含有序列S的干扰肽的条件下实施免疫测定法，以及
d)通过测量所述靶蛋白和所述结合伴侣之间形成的复合物检测微生物M的存在。
当待测微生物M2不是具有序列S的肽所属于的微生物，而是序列S’所属于的微生物(因此它是微生物M’)时，基于免疫测定法体外检测生物学样品中微生物M’的存在的方法包括检测待测微生物M’的至少一种靶蛋白或由所述检测组成，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：
a)提供所述免疫测定法所需的、所述微生物M’的所述至少一种靶蛋白的至少一种结合伴侣，
b)提供至少一种具有如前文所定义的序列S的干扰肽，其中对应的序列S’包括于所述至少一种靶蛋白的肽序列中，
c)在存在所述至少一种含有序列S的干扰肽的条件下实施免疫测定法，以及
d)通过测量所述靶蛋白和所述结合伴侣之间形成的复合物检测微生物M’的存在。
所寻找的靶蛋白的结合伴侣可以是抗体、抗体片段、人工抗体、抗原受体或是任何其他的已知与所寻找的靶蛋白有相互作用的蛋白质。
所述结合伴侣抗体是指，例如，多克隆抗体或单克隆抗体。
所述多克隆抗体可以免疫动物获得，所述免疫用靶蛋白；或如果微生物M2(M’或M)是病毒，用灭活的病毒和/或分离的病毒颗粒；或如果微生物M2(M’或M)是细菌，用细菌裂解物或细菌蛋白提取物进行，然后回收纯化形式的想要的抗体，所述回收是通过从所述动物中提取的血清样品，并从其他血清成分中分离的所述抗体进行的，特别地，所述分离是通过吸附有所述抗体特异性识别的抗原(尤其是所述靶蛋白)柱上的亲和层析进行的。
所述单克隆抗体可以通过杂交瘤技术获得，下文概括了主要原理。
首先，用感兴趣的靶蛋白；或如果微生物M2(M’或M)是病毒，用灭活的病毒和/或分离的病毒颗粒；或如果微生物M2(M’或M)是细菌，用细菌裂解物或细菌蛋白提取物免疫动物，通常是小鼠。然后所述动物的B淋巴细胞能够产生针对此抗原的抗体。然后这些产生抗体的淋巴细胞跟“永生”的骨髓瘤细胞(实施例中是鼠的)融合产生杂交瘤细胞。然后，使用如此获得的异质的细胞混合物选择能够产生特定抗体的又能无限增殖的细胞。各杂交瘤以克隆的形式增殖，可以测试各杂交瘤产生的单克隆抗体识别所述靶蛋白的性质，所述测试通过例如ELISA、一维或二维的免疫转移(蛋白质印迹)、免疫荧光或使用生物传感器进行。然后将如此选择的单克隆抗体进行纯化，尤其是根据上述的亲和层析技术。
所述单克隆抗体也可以是使用本领域技术人员所熟知的技术通过基因工程获得的重组抗体。
抗体片段的例子可以是Fab、Fab’和F(ab’)2片段以及有scFv(单链可变片段)和dsFv链(双链可变片段)。特别地，这些功能片段可以通过基因工程得到。
Nanofitin(商品名)是小分子蛋白质，如抗体，其能够与生物学靶标结合，从而可以对其进行检测、捕获或在生物体中非常简单的靶向。
无论是否对蛋白质和/或抗体(也称为代表待测微生物M2(M’或M)的分析物)进行检测，共同之处在于所述结合伴侣对于待测分析物可以是特异性或非特异性的。当它们能专一或是几乎专一地于这些分析物结合时，称其为特异性的。当与这些分析物结合的选择性弱，然后还能够与其他配体结合，如其它蛋白质或抗体时，称其为非特异性的。根据一个优选的实施方案，优选特异性结合配体。
这些对于本发明方法中的分析物具有特异性或非特异性的结合伴侣可以在实施所述免疫测定法时用作捕捉试剂、检测试剂，或作为捕获和检测试剂。
当然，在本申请中，例如，不应该认为“免疫测定法”中的术语“免疫”严格表明所述结合伴侣是免疫学的伴侣，例如抗体。的确，在结合伴侣，也称为配体，不是免疫学的伴侣而是，例如，一种设计的用于分析的分析物的受体时，本领域技术人员也宽泛地使用该术语。因此，通常的做法是，尽管在缩写ELISA中包括术语“免疫”，但ELISA测定法(酶联免疫吸附测定)也指使用非免疫学结合伴侣的测定法，也广泛地称为“配体结合测定法”。为清楚起见，在整个申请中，对于任何使用结合伴侣的分析，申请人使用术语“免疫”，即使所述结合伴侣不是免疫学伴侣。
免疫测定法的实施是本领域技术人员众所周知的步骤，他们根据待测微生物M2(M’或M)以及所使用的结合伴侣来进行测试。
在该方法中，添加本发明的一种或多种肽将，而本领域技术人员将相应地调整测试的条件。优选地，免疫测定法方法包括使用本发明中的一种、两种、三种或四种干扰肽。
在免疫测定法之前或在任一抗原-抗体反应步骤中将所述干扰肽加入到待分析生物学样品中。在一步法免疫测定法的情况下，当所述生物学样品和捕获相反应时，存在或者添加所述干扰肽。在两步免疫测定法的情况下，干扰肽将在捕获的过程中或在呈现的过程中添加，或两者都添加。不管怎样，干扰肽将在呈现步骤(加入底物然并使信号可视化或检测信号)之前添加。
通过测量分析物和结合伴侣之间形成的复合物检测微生物M2(M’或M)的存在可以用本领域技术人员已知的免疫测定法的任何可视化方法实施，例如直接或间接的方式。
在直接检测的情况下，即检测不通过标记的手段进行时，通过，例如，表面等离子体共振或带有导电性聚合物的电极上的循环伏安法观察免疫学反应。
间接检测是通过标记称为检测试剂的结合伴侣，或靶蛋白本身或其一个或多个片段而实施。
术语“标记”是指附着能够直接或间接产生可检测信号的标记试剂。这些标记试剂的非限制性列表包括：
·产生可(通过，例如，比色法、荧光或发光法)检测的信号的酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，
·发色团，例如荧光、发光或染料化合物，
·放射性分子，例如32P、35S或125I，以及
·荧光分子，如Alexas或藻青蛋白。
间接检测系统也可以使用，例如，能够与抗配体反应的配体。配体/抗配体对为本领域技术人员所熟知，例如如下的对就是这种情况：生物素/链霉亲和素、半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体、糖/凝集素、多核苷酸/序列互补的多核苷酸。在这种情况下，其是携带结合伴侣的配体。使用在前面的段落中所描述的标记试剂可以直接检测抗配体，或所述抗配体本身是可以使用的配体/抗配体检测的。
在某些情况下，这些间接检测系统可以导致信号的放大。这个信号放大技术为本领域技术人员所熟知，并且可以参照申请人的在先专利申请FR98/10084或WO-A-95/08000，或Chevalier等人1997年的文章。
根据所用标记的类型，本领域的技术人员会添加使得信号的标记或发射可视化的试剂，所述信号可使用任何类型的测量装置检测，所述装置例如分光光度计、荧光分光光度计或其他高清晰度照相机。
可以实施本发明的方法的生物学样品是任何可以实施免疫测定法的含有代表微生物(抗原、抗体)的分析物的生物学样品。这些样品为本领域技术人员所熟知。这些样品例子可以是生物学液体，如血清、血浆、血液、全血、尿液或脑脊髓液，也可以是组织、粪便等等。所述生物学样品来自于任何必须检测病原微生物存在的任何动物，如哺乳动物(包括人类)、绵羊种族、牛、山羊家族的成员、犬科成员、鱼和鸟类。申请人说明，出乎意料地，这些样品也都含有针对与待测微生物M2不同的微生物的抗体AbM1，并且就是这些抗体产生测试的假阳性结果。
可以在先前的步骤中处理所述生物学样品。例如，可以使用酸性条件，其能促进待测抗原暴露。可以使用离子型或非离子型的洗涤剂，例如triton X100或SDS(十二烷基硫酸钠)或聚(氧乙烯)衍生物，例如NP40。
因此，使用本发明的肽在任何免疫测定法方法中尤其有用。因此，本发明的另一个主题涉及具有如上定义的序列S的干扰肽，以基于免疫测定法体外检测生物学样品中代表待测微生物的分析物的方法中的用途。
因为本发明的肽的作用在于消除假阳性，从而提高测试的特异性，所以另一主题涉及一种用于提高基于免疫测定法体外检测生物学样品中代表待测微生物的分析物的方法的特异性的方法，其特征在于在免疫测定法的执行过程中，使用至少一种具有如上述所定义的序列S的干扰肽。
通过下列实施例和图1-4，会更清楚地理解本发明，所述实施例通过非限制性说明的方式给出，其中：
-图1显示HCV肽V7E-1和金黄色葡萄球菌的肽Y7E-1的匹配，
-图2显示HCV肽E8E和肺炎链球菌肽A8E(图2A)、枯草芽孢杆菌肽Y7E-2(图2B)和Pseudomonas entomophila或恶臭假单胞菌(GB-1菌株)的肽D8E(图2C)之间的匹配，
-图3显示HIV-1肽E8L-2和肺炎支原体肽E8L-1之间的匹配，以及
-图4显示HCV肽E8E和肺炎链球菌肽A6M之间的匹配。
在图中，“.”表示相对于存在于上面位置的氨基酸具有相同性，而“-°”表示给定的位置的删除。
实施例1：干扰肽Y7E-1(金黄色葡萄球菌)和V7E(HCV)
为了提高用于诊断HCV或金黄色葡萄球菌的感染的免疫测定法的特异性，定义两个根据本发明的干扰肽。
肽Y7E-1具有肽序列YSPTHYVPE(SEQ ID NO:1)，其对应金黄色葡萄球菌的细胞外基质蛋白结合蛋白Emp(UniProtKB数据库登录号Q8NXI8)的322-330位氨基酸。此肽Y7E与HCV的肽V7E匹配，肽V7E的序列是VSPTHYVPE(SEQ ID NO:2)，其对应HCV的NS4B蛋白的218-226位氨基酸(根据在NCBI的RefSeq参考序列编号，登录号为NP_751926)。
肽Y7E-1和V7E的匹配示于图1。肽Y7E-1和V7E有89％的相同性，长度都为9个氨基酸。
实施例2：干扰肽E8E(HCV)和A8E(肺炎链球菌)、Y7E-2(枯草芽孢杆菌)和D8E
(Pseudomonas entomophila或恶臭假单胞菌GB-1菌株)
为了提高诊断HCV、肺炎链球菌、枯草芽孢杆菌或Pseudomonas entomophila或恶臭假单胞菌GB-1菌株感染的免疫测定法的特异性，定义几个根据本发明的干扰肽被。
肽A8E具有肽序列AQKRLAPYIE(SEQ ID NO:3)，其对应肺炎链球菌核糖体小亚基甲基转移酶H蛋白(UniProtKB数据库登录号C1CPL0)的64-73位氨基酸。此肽与HCV的肽E8E匹配，肽E8E的序列是ECSQHLPYIE(SEQ ID NO:4)对应与和HCV的NS4B蛋白(NP_751926)的1-8位氨基酸融合的HCV的NS4A蛋白(NP_751925)的53-54位氨基酸。肽A8E和E8E的匹配示于图2A。肽A8E和E8E有50％的相同性，长度都为10个氨基酸。
除了肺炎链球菌的其他微生物的肽也可以与本发明的HCV肽E8E匹配。肽Y7E-2肽具有序列YFQHIPYLE(SEQ ID NO:5)，其对应枯草芽孢杆菌的蛋氨酸结合脂蛋白metQ(UniProtKB数据库登录号O32167)的84-92位氨基酸。肽Y7E-2和E8E的匹配示于图2B。肽Y7E-2和E8E具有55％的相同性，长度都为9个氨基酸。
肽D8E具有肽序列DIDAVLPYIE(SEQ ID NO:6)，其对应Pseudomonas entomophila和恶臭假单胞菌(GB-1菌株)的延伸因子P蛋白(UniProtKB数据库登录号分别为Q1ID35和B0KUN5)的97-106位氨基酸。D8E和E8E肽的匹配示于图2C。肽D8E和E8E有50％的相同性，长度都为10个氨基酸。
实施例3：干扰肽E8L-1(肺炎支原体)和E8L-2(HIV-1)
为了提高用于诊断HIV-1或肺炎支原体感染的免疫测定法的特异性，定义根据本发明的干扰肽。
肽E8L-1具有肽序列EAYRKEQQLL(SEQ ID NO:7)，其对应肺炎支原体M129的tRNA(鸟嘌呤-N(1)-)-甲基转移酶蛋白(UniProtKB数据库登录号P75132)的200-209位氨基酸。此肽与HIV-1的肽E8L-2匹配，肽E8L-2的肽序列是ERYLKDQQLL(SEQ ID NO:8)，其对应HIV-1的gp160包膜糖蛋白(根据NCBI的RefSeq参考序列编号，登录号为NP_057856)的584-593位氨基酸。考虑到此病毒的遗传多样性肽E8L-2，的精确位置因HIV-1毒株的不同而不同。肽E8L-1和E8L-2的匹配示于图3。肽E8L-1和E8L-2有70％的相同性，长度都为10个氨基酸。
实施例4：通过使用本发明的干扰肽改进抗HCV抗体的免疫测定法的特异性
目前用于实施丙型肝炎病毒感染的诊断的免疫测定法是第三代免疫酶血清学测试，对于某些测试，所述免疫测定法指出针对蛋白核心、NS3、NS4和NS5的抗体。这些所检测的抗HCV的抗体是当前或之前感染的证据。
可以在微孔板中实施免疫酶血清学测试，所述测试可以指出抗病毒抗体，并以自动化方式或手动地或者使用自动化免疫测定法设备，例如
(bioMérieux)实施。在这种情况下，所述测试的所有步骤都由仪器自动实施。各种免疫酶技术，特别是ELISA，是本领域技术人员熟知的，其原理和方案实例在“ELISA指导手册”第二版，John R Crowther著，Humana出版社出版(DOI：10.1007/978-1-60327-254-4)一书中也有描述。
一次性吸液头
既作为固相也作为移液系统。所述吸液头的表面涂覆有用于检测针对HCV核心、NS3和NS4蛋白质的抗体的抗原。在第一步中，将样品稀释，然后在吸液头内上下抽吸。存在于样品中的抗HCV抗体将与存在于吸液头内的抗原结合。实施洗涤步骤除去未结合的化合物。在第二步中，在吸液头内上下抽吸与重组的碱性磷酸酶缀合的(小鼠)抗人免疫球蛋白(抗-IgG)的Fab'形式的单克隆IgG，所述单克隆IgG会与来自待测样品的抗HCV人类Ig结合，所述人类Ig与固相的抗原结合。实施洗涤步骤再次除去未结合的化合物。在最终的呈现步骤中，将底物(4-甲基伞形酮磷酸酯)在吸液头内上下抽吸；缀合的酶催化该底物的水解反应，产生产物(4-甲基伞形酮)，在450nm测量所述产物发出的荧光。荧光信号的值与样品中存在的抗体的浓度成正比。在测试结束时，由仪器以指数形式自动计算结果，所述计算通过将所获得的值除以标准S1的值带回1进行(存储在仪器中的值)。因此，认为所述指数大于或等于1的样品是免疫酶试验阳性的(存在抗HCV抗体)，而认为该指数小于1的样品是阴性的(不存在抗HCV抗体的)。在下面的段落中，将此HCV-抗体分析方法称为“操作模式1”，其对应无干扰肽的抗-HCV抗体的分析。
为了减少与用于检测抗NS4抗体的操作模式1的抗原的非特异性识别相关的干扰，由于所测试的样品中包含的元素，使用在实施例1和2中定义的各种干扰肽。它们是属于待测病毒(使用具有本发明的序列S的肽进行微生物M的检测)，或与待测病毒不同的微生物(使用具有本发明的序列S的肽进行微生物M’的检测)的肽。这些肽根据本领域技术人员所熟知的方法通过化学合成产生，所述方法例如由Merrifield于1962年以及Field和Noble于1990年描述的固相肽合成，其使用含有0.1-1.0mmol胺/g聚合物的聚苯乙烯类聚合物。在化学合成的最后，所述肽可以在三氟乙酸-乙二硫醇-三异丙基硅烷-水(94/2.5/1/2.5/V/V/V)的混合物存在的条件下脱保护和裂解两小时。消除了聚合物之后，于0℃通过从乙醚中沉淀提取所述肽。它们可以通过例如高效液相色谱的技术进行纯化。冻干合适的纯化馏分产生均质的肽，其可以用标准的物理化学方法，如质谱、高效液相色谱或氨基酸分析，进行表征。
对几百个HCV感染阴性且源于
“Centres de TransfusionSanguine”[血库]的血清样品进行筛选，以鉴定形成干扰问题的样品。要做到这一点，根据操作模式1使用Vidas自动化设备进行检测。只选择根据操作模式1是阳性(指数>1)的血清。
这种操作模式1的结果和
“Centres de Transfusion Sanguine”[血库]确立的阴性状态的结果之间的差异使选择形成干扰问题的假阳性血清成为可能。
为了说明使用根据本发明的干扰肽不会削弱试验的灵敏度，还分析了来源于商业的血清库(Trina Bioreactives AG)的阳性对照样品C1。
表1给出七个形成干扰问题的血清和阳性对照C1根据“工作模式1”实施的分析的结果，所述分析有或没有肽V7E(SEQ ID NO:2)或肽Y7E(SEQ ID NO:1)的存在。这些肽以5μg/ml的浓度在免疫酶测试方案的第一步中添加，所述第一步对应稀释待测样品及将其与存在于固相上的抗原温育。
表1
在分析期间加入肽Y7E可以完全中和所有血清里的干扰。肽V7E，就其本身而言，可以中和所述血清的4/7中的干扰。此外，使用干扰肽不损害该测试的灵敏度。
同样地，表2给出其他形成干扰问题的两个血清和阳性对照根据检测抗HCV抗体的“工作模式1”实施的分析的结果，所述分析有或没有肽E8E(SEQ ID NO:4)、肽A8E(SEQ IDNO:3)或肽A6M(序列号NO:9)的存在。这些肽以1μg/ml的浓度在免疫酶测试的第一步中添加，所述第一步对应稀释待测样品及将其与存在于固相上的抗原温育。
肽A6M，其肽序列是APYIEKGM(SEQ ID NO:9)，也是肺炎链球肽，其对应菌核糖体小亚基甲基H蛋白(UniProtKB数据库登陆号C1CPL0)的69-76位氨基酸。此肽不是根据本发明的干扰肽，因为它不符合所要求保护的匹配(参见图4)的定义。事实上，即使这种肽和HCV肽E8E具有相同的4个连续的氨基酸，而且长度是8个氨基酸，它的序列与E8E的序列不匹配。因此，肽A6M在表2中所示的实验中用作阴性对照。
表2
在分析过程中加入肽E8E或肽A8E可以完全中和血清的2/2中的干扰。在任何的血清中，肽A6M，其不是根据本发明的肽，不能够中和所述干扰。再次地，没有损害测试的灵敏度。
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1 5
Claims (10)
1.一种具有长度为7至12个氨基酸的肽序列S的干扰肽，所述肽序列S来源于微生物M的抗原蛋白的肽序列，所述序列S与长度为7至12个氨基酸的肽序列S’匹配，所述肽序列S’来源于与微生物M不同的微生物M’的靶蛋白的肽序列，其中所述序列S和S’在其7至12个氨基酸的长度上显示至少50％的相同性，以及至少4个相同的或类似的连续氨基酸，它们的长度是相同的，或者它们在序列的一端和/或另一端显示出1或2个氨基酸的差异，但不包括具有序列SEQ ID NO:2的肽V7E。
2.一种基于免疫测定法体外检测生物学样品中微生物M的存在的方法，其包括检测针对待测微生物M的靶蛋白的至少一种抗体AbM或由所述检测组成，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：
a)提供至少一种如权利要求1所定义的具有肽序列S的干扰肽，
b)提供所述免疫测定法所需要的、所述至少一种待测抗体AbM的至少一种结合伴侣，所述至少一种结合伴侣来源于所述抗体所针对的所述靶蛋白，或者就是所述靶蛋白本身，并且包括肽序列S，
c)在存在所述至少一种具有序列S的干扰肽的条件下实施免疫测定法，和
d)通过测量所述抗体AbM和所述结合伴侣之间形成的复合物检测所述微生物M的存在。
3.一种基于免疫测定法体外检测生物学样品中微生物M’的存在的方法，其包括检测针对待测微生物M’的靶蛋白的至少一种抗体AbM’或由所述检测组成，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：
a)提供至少一种如权利要求1所定义的具有肽序列S的干扰肽，
b)提供所述免疫测定法所需要的、所述至少一种待测抗体AbM’的至少一种结合伴侣，所述至少一种结合伴侣来源于所述抗体所针对的所述靶蛋白，或者就是所述靶蛋白本身，并且包括如前面所定义的肽序列S’，
c)在存在所述至少一种具有序列S的干扰肽的条件下实施免疫测定法，和
d)通过测量所述抗体AbM’和所述结合伴侣之间形成的复合物检测所述微生物的存在。
4.肽Y7E-1，其具有序列SEQ ID NO:1。
5.肽A8E，其具有序列SEQ ID NO:3。
6.肽E8E，其具有序列SEQ ID NO:4。
7.肽Y7E-2，其具有序列SEQ ID NO:5。
8.肽D8E，其具有序列SEQ ID NO:6。
9.肽E8L-1，其具有序列SEQ ID NO:7。
10.肽E8L-2，其具有序列SEQ ID NO:8。
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