CN113366012A - 幽门螺杆菌菌株的鉴定方法及鉴定试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了提供一种检测幽门螺杆菌的方法，同时通过简单的方法获得幽门螺杆菌CagA蛋白基因型信息。该方法包括(i)将来自受试者的血样与源自东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽和/或源自欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽接触的步骤，和(ii)鉴定幽门螺杆菌菌株通过简单的方法使用受试者的血样通过检测幽门螺杆菌的方法进行，确定是否存在针对血样中所含肽的反应阳性抗体的步骤。

Description

幽门螺杆菌菌株的鉴定方法及鉴定试剂盒
技术领域
本申请要求享有2019年1月31日提交的日本专利申请第2019-015399号的优先权和权益，其公开通过引证以其全部内容结合于本文中。
本发明涉及一种幽门螺杆菌菌株的鉴定方法。更具体地，一种通过血液抗体效价测定幽门螺杆菌CagA基因多态性的鉴定方法。本发明的一个方面还涉及一种通过区分幽门螺杆菌菌株来评估胃炎/胃癌风险的方法。
背景技术
幽门螺杆菌(以下也称为“幽门螺杆菌”)是寄生于人类等胃粘膜的螺旋型革兰氏阴性微需氧菌。据报道，幽门螺杆菌是一种参与慢性胃炎和胃癌发展的致病菌。
检测幽门螺杆菌的方法大致分为通过对内窥镜获得的组织进行培养或组织学搜索的检测方法，以及如血液抗体效价测量、尿素呼气试验或粪便抗原测量等不需要使用内窥镜的非侵入性方法。特别是正在日本普及的ABC筛查，将血液中幽门螺杆菌抗体测定和胃蛋白酶原浓度测定相结合，取代了以往作为胃癌风险筛查进行的钡双投影法。
幽门螺杆菌中有许多毒力因子，其中细胞毒性蛋白(CagA)被认为与胃癌的发展最相关，对其进行了各种研究。例如，专利文献1公开了能够与来自感染了CagA+幽门螺杆菌患者的抗体结合的肽。
已知的幽门螺杆菌就CagA蛋白基因大致分为东亚型和欧洲型(也称为西方型)。非专利文献1中记载了使用粪便样本通过数字PCR(ddPCR：Droplet Digital PCR)法检测幽门螺杆菌的16S基因并进行CagA致病基因的基因分型，作为判别CagA蛋白多态性的方法。本方法有利于幽门螺杆菌的地理流行病学研究。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开小册子WO2018/153991
非专利文献
非专利文献1:Talarico et al.,"Quantitative Detection and Genotyping ofHelicobacter pylori from Stool using Droplet Digital PCR Reveals Variation inBacterial Loads that Correlates with cagA Virulence Gene Carriage"Helicobacter 2015；21:325-333
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的之一是提供一种通过简单的方法检测幽门螺杆菌的方法，同时获得幽门螺杆菌CagA蛋白基因型的信息。本发明还提供了一种通过区分和鉴定东亚型幽门螺杆菌菌株和欧洲型幽门螺杆菌菌株来评估受试者患胃炎和/或胃癌风险的方法，也是其目的之一。
解决问题的方案
本发明人发现，通过使用受试者的血液样本的简单方法，利用东亚型菌株和欧洲型菌株各自特异的CagA衍生肽，对感染性幽门螺杆菌菌株进行鉴定和分型，区分东亚型菌株和欧洲型菌株，并更准确地评估胃炎/胃癌的风险。
本发明基于这样的发现，并且包括例如以下方面。
[1]一种检测幽门螺杆菌的方法，其中包含
(i)将来自受试者的血液样本与源自东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽和/或源自欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽接触的步骤，和
(ii)确定血液样本中是否存在针对所含肽的阳性反应抗体的步骤。
[2]根据[1]的方法，针对在步骤(i)将血样与至少源自东亚幽门螺杆菌CagA蛋白肽的接触中，其中存在源自东亚幽门螺杆菌CagA蛋白肽的阳性反应抗体为受试者患胃炎和/或胃癌较高风险的指标。
[3]一种评估胃部炎症/胃癌风险的指标方法，其包含
(i)将来自受试者的血液样本与源自东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白肽和/或源自欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白肽接触的步骤，和
(ii)确定血液样本中是否存在针对所含肽的阳性反应抗体的步骤，
以是否存在针对源自幽门螺杆菌CagA蛋白肽的阳性反应抗体为受试者患胃部炎症和/或胃癌的风险指标。
[4]根据[3]的方法，针对在步骤(i)将血样与至少源自东亚幽门螺杆菌CagA蛋白肽的接触中，其中存在源自东亚幽门螺杆菌CagA蛋白肽的阳性反应抗体为受试者患胃炎和/或胃癌的风险指标。
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的方法，其中东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白来源的肽和欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白来源的肽分别含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其片段和SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段。
[6]根据[1]至[5]中任一项所述的方法，其中东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白来源的肽和欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白来源的肽分别含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其片段和SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段。
[7]根据[5]或[6]的方法，其中东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白来源的肽和欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白来的源肽分别含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列和SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
[8]根据[1]至[7]中任一项所述的方法，其中所述血样为血浆或血清。
[9]根据[1]至[8]中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
[10]根据[1]至[9]中任一项所述的方法，其中确定阳性反应抗体的存在或不存在的步骤，是由通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、纸免疫层析法或乳胶凝集法进行。
[11]一种检测幽门螺杆菌的试剂盒，包括源自东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽和/或源自欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽。
[12]根据[11]的试剂盒，用于评估受试者的胃炎和/或胃癌的风险。
[13]根据[11]或[12]的试剂盒，其中所述肽固定在固相载体上。
[14]一种评估胃部炎症/胃癌风险的指标方法，其包含
(i)将来自受试者的血液样本与源自东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽SEQ ID NO：1和/或源自欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽SEQ ID NO：2接触的步骤，和
(ii)确定血液样本中是否存在针对所含肽的阳性反应抗体的步骤，
以在受试者中是否存在针对源自幽门螺杆菌CagA蛋白肽的阳性反应抗体，为发生胃部炎症和/或胃癌风险较高的指标。
[15]一种检测幽门螺杆菌的试剂盒，其包含选自SEQ ID NO：1、3和5-18的序列来源于欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽和选自SEQ ID NO：2、4和19-29的序列源自东亚幽门螺杆菌CagA蛋白的肽。
附图说明
图1显示了本发明实施例的方法对血液中幽门螺杆菌抗体效价的测定结果。
图2示出了根据本发明实施例的方法区分感染幽门螺杆菌的东亚型株和欧洲型株的结果。
图3显示了使用本发明实施例的方法对日本胃癌患者和美国胃癌患者的血清进行分析的结果。
图4示出了通过分析胃黏膜，比较日本胃癌患者血清测定值和美国胃癌患者血清测定值的结果。
具体实施方式
如以上描述的，本发明人通过利用东亚型菌株和欧洲型菌株各自特异的CagA衍生肽，使用受试者的血液样本，以简单的方式识别和分型感染的幽门螺杆菌菌株，并且可以通过区分东亚型菌株和欧洲型菌株来更精确地评估胃炎/胃癌的风险。根据本发明实施例的用于鉴定感染的幽门螺杆菌的方法(检测方法)包括使用受试者的血液样本，测量针对具有特定氨基酸序列的CagA肽的阳性反应抗体的存在或不存在的步骤。
<CagA肽>
以下对本发明的方法中使用的CagA肽进行说明。
如上所述，在幽门螺杆菌所具有的毒力因子中，CagA蛋白是被认为与胃炎和胃癌具有最高关联的效应分子。在CagA蛋白的羧基末端区域，有分别含有EPIYA基序称为A序列、B序列、C序列和D序列的区域，A序列、B序列和C序列高概率存在于主要感染西方人的幽门螺杆菌(以下也称“欧洲型毒株”)，A序列、B序列、D序列高概率存在于主要感染东亚人的幽门螺杆菌(以下也称“东亚型毒株”)。
当感染胃上皮细胞的幽门螺杆菌细胞内产生CagA蛋白时，它通过细菌所具有的显微注射针状机制(IV型分泌机制)注入细胞内。据认为，侵入细胞的CagA蛋白通过EPIYA基序的酪氨酸残基的磷酸化修饰与人蛋白SHP-2结合，引起SHP-2的异常活化，发挥致癌活性。在此，据报道SHP-2与上述C和D序列结合，并且D序列与SHP-2的结合比C序列更强。这被认为是感染东亚人的幽门螺杆菌致癌风险高的原因之一。
因此，通过利用CagA蛋白C端区域的多态性，可以识别感染的幽门螺杆菌菌株，特别是区分东亚型菌株和欧洲型菌株在胃炎/胃癌风险中的不同，认为可以更准确地评估胃炎/胃癌的风险。
在一个实施方案中，根据本发明的方法中使用的CagA肽是源自东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽和/或源自欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽。进一步地，在一个实施方案中，根据本发明的方法中使用的CagA肽具有东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白特异性序列和/或欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白特异性序列的肽的优选是具有例如，由以下表1中所示的SEQ IDNO：1的氨基酸序列组成的47个氨基酸长度的肽或其片段，或SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的34个氨基酸长度的肽或其片段。这些肽是可以以特异性分别检测东亚型菌株和欧洲型菌株的幽门螺杆菌产生的抗体。本发明的检测方法还可用于幽门螺杆菌的鉴定、定量、半定量或测定。
在一个实施方案中，根据本发明的方法中使用的CagA肽是由下表1所示的SEQ IDNO：1的氨基酸序列组成的肽或其片段，或由以下组成的肽的片段SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段。在一些实施例中，该片段其长度为例如，15％或更多，20％或更多，30％或更多，40％或更多，50％或更多，60％或更多，70％或更多，80％或更多，90％或更多，或95％或更多。从每个菌株的特异性的观点来看，这些片段的优选分别包含SEQ ID NO：3的EPIYA-D序列或SEQ ID NO：4的EPIYA-C序列。从特异性的观点来看，优选肽的氨基酸长度为6以上，优选8以上，更优选10以上。另一方面，从肽合成的容易性的观点来看，优选的氨基酸长度为80或更小，例如60或更小或50或更小。在一个实施方案中，使用由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的肽和/或由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的肽。
[表1]
Figure BDA0003187633420000061
进一步地，在一个实施方案中，根据本发明的方法中使用的CagA肽可以是由SEQID NO：1或2的氨基酸序列或其变体组成的肽。如本文所用，变体是指在定义的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的突变(缺失、取代、插入和/或添加)的肽。如本文所用，变体是指与确定的氨基酸序列具有80％或更多，优选90％或更多，更优选95％或更多，还更优选97％或更多的同一性(％)的肽。例如，对于同一性的确定，可以使用BLAST程序。变体保留其作为目标抗体的抗原表位的功能。为此，氨基酸突变的优选通常基本上是不改变原始序列的结构特征的突变。此类突变包括用具有相似物理化学特征的残基替换特定氨基酸残基的保守替换(例如，Ile、Val、Leu或Ala等含脂肪族基团的氨基酸残基的相互替换，例如，Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn等极性残基之间的相互替换)以及考虑氨基酸的亲水性指数和亲水性的非保守替换。
可用于一些实施方案的肽片段的序列在下表2中说明。
[表2]
序列号 序列(N端→C端)
序列号5 NRKIDRINKIASAGKGVGGFSGAGRSASPEPIYATIDFDEANQAG
序列号6 KIDRINKIASAGKGVGGFSGAGRSASPEPIYATIDFDEANQAG
序列号7 DRINKIASAGKGVGGFSGAGRSASPEPIYATIDFDEANQAG
序列号8 INKIASAGKGVGGFSGAGRSASPEPIYATIDFDEANQAG
序列号9 KIASAGKGVGGFSGAGRSASPEPIYATIDFDEANQAG
序列号10 AGKGVGGFSGAGRSASPEPIYATIDFDEANQAG
序列号11 KGVGGFSGAGRSASPEPIYATIDFDEANQAG
序列号12 VGGFSGAGRSASPEPIYATIDFDEANQAG
序列号13 GFSGAGRSASPEPIYATIDFDEANQAG
序列号14 SGAGRSASPEPIYATIDFDEANQAG
序列号15 AGRSASPEPIYATIDFDEANQAG
序列号16 RSASPEPIYATIDFDEANQAG
序列号17 ASPEPIYATIDFDEANQAG
序列号18 PEPIYATIDFDEANQAG
序列号19 PLKRHDKVDDLSKVGRSVSPEPIYATIDDLGG
序列号20 KRHDKVDDLSKVGRSVSPEPIYATIDDLGG
序列号21 HDKVDDLSKVGRSVSPEPIYAHDDLGG
序列号22 KVDDLSKVGRSVSPEPIYATIDDLGG
序列号23 DDLSKVGRSVSPEPIYATIDDLGG
序列号24 LSKVGRSVSPEPIYATIDDLGG
序列号25 KVGRSVSPEPIYATIDDLGG
序列号26 GRSVSPEPIYATIDDLGG
序列号27 SVSPEPIYATIDDLGG
序列号28 SPEPIYATIDDLGG
序列号29 PEPIYATlDDLGG
在一个实施方案中，根据本发明的方法中使用的CagA肽是具有SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列或其片段的肽，也可以是在其变体的N-末端和/或C-末端具有添加序列的肽。附加序列可以是功能序列或非功能序列。附加序列的非限制性实例包括用于稍后描述的固相形成的标签序列，用作对照或标准的序列等。从肽合成的特异性和容易性的观点来看，附加序列的优选为50个氨基酸或以下，更优选为40个氨基酸或以下，还更优选为30个氨基酸或以下。
本发明的方法中使用的CagA肽的制造方法没有特别限定，例如，即使在所需的宿主细胞表达系统或无细胞表达系统中表达，也可以通过化学合成，例如，固相合成或液相合成来表达制造。表达系统的非限制性实例包括使用哺乳动物细胞或昆虫细胞、酵母、大肠杆菌、植物、枯草芽孢杆菌等的表达系统，或源自小麦胚芽、昆虫细胞、大肠杆菌等无细胞表达系统。由于本发明的方法中使用的CagA肽是分子量相对较低的肽，因此还具有适合于纯化工序，容易且收率高的固相合成的优点。
此外，在一个实施方案中，CagA肽可以用酶、放射性同位素、染料、荧光物质等标记并用作为标记抗原。此外，可以向上述的CagA肽添加用于固定化的标签。
<鉴定(检测)/判别幽门螺杆菌菌株的方法>
本发明的方法包括将上述CagA肽与来自受试者的血样接触以确定阳性反应CagA肽抗体的存在或不存在的方法。通过该步骤，可以用特异性检测东亚型毒株或欧洲型毒株产生的抗体，鉴定感染的幽门螺杆菌株。根据本发明的方法具有以下优点：与使用PCR方法分析粪便样本的方法相比，从受试者收集和分析样本的过程非常简单。
CagA肽阳性抗体的检测和测量可以使用多种免疫测定法进行。可用于本发明的方法中的免疫测定的非限制性实例包括，例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶联免疫吸附测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)其例子包括化学发光测量法、免疫印迹法、乳胶凝集法、金胶体凝集法、纸免疫层析法、侧向流动测定(LFA)、免疫沉淀法、比浊法、钎焊法和比色法。从应用于血清学检查的观点来看，可以优选使用ELISA、纸免疫层析法、横向流动测定(LFA)(使用例如金纳米粒子)、胶乳凝集法等。
作为典型方法的实例，将CagA肽固定在固定载体上，使来自受试者的血液样本与固定的CagA肽接触，并且将CagA肽和血液样本中存在的抗体组合。其实例包括通过形成CagA肽-抗体复合物并使用识别结合抗体的二抗等间接检测复合物的方法。
固定化载体的非限制性实例包括疏水性塑料如聚苯乙烯，金属如纤维素、硝酸纤维素、琼脂糖和金，无机材料如二氧化硅，以及蛋白质如玻璃和白蛋白。固相载体的形状的实例包括但不限于板、胶乳、纳米颗粒、微珠、多孔珠和膜。
二抗的实例包括标记的IgG抗体和抗-Fc抗体。标记的非限制性实例包括酶标记(过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、荧光素酶等)、荧光标记(荧光染料如荧光素和罗丹明、荧光蛋白如GFP(绿色荧光蛋白)等)，其实例包括同位素标记(硫(35S)、碳(14C)、碘(125I、121I)、氚(3H等)、生物素标记等。
本发明的方法可以通过上述免疫测定进行定性、半定量或定量。
在本发明的方法中，可以使用东亚型CagA肽或欧洲型CagA肽来鉴定幽门螺杆菌菌株，也可以同时使用东亚型CagA肽和欧洲型CagA肽。
特别是东亚型菌株的感染被认为与胃炎和胃癌的高风险有关，但目前尚未建立了一种通过非侵入性方法来识别感染的幽门螺杆菌菌株的简单方法，使用ABC筛查时考虑到感染的幽门螺杆菌菌株的风险诊断也尚未建立。由于对东亚型CagA肽呈阳性的抗体的存在可以是受试者胃炎和/或胃癌较高风险的指标，在本发明的方法中至少应使用东亚型CagA肽。但是，从无遗漏地鉴定幽门螺杆菌感染和幽门螺杆菌分类的观点来看，优选是同时使用东亚型CagA肽和欧洲型CagA肽。这些东亚型CagA肽和欧洲型CagA肽可以分别固定在不同的固相载体上，也可以固定在同一个固相载体上，但从类型区分的角度来看，它们可以固定在同一个固相载体上。优选是固定在不同的固相载体上。进一步地，从无遗漏地鉴定幽门螺杆菌感染的观点来看，本发明的方法可以与现有的幽门螺杆菌检测方法结合使用。
此外，在一个实施方案中，使用东亚型CagA肽和欧洲型CagA肽两者测量血液抗体效价，测量每个受试者中针对欧洲型CagA肽的抗体效价和针对东亚型CagA肽的抗体效价，并且将测量值转换为相对值和进行评价。因此，可以更准确地区分东亚型菌株和欧洲型菌株，并且可以更准确地进行胃炎/胃癌的风险评估。
相对值的定义、阈值和背景值的设定可以考虑所采用的免疫测定的特性而适当设定。将在实施例中稍后描述的ELISA作为示例进行描述。使用东亚型CagA肽和欧洲型CagA肽在相同条件下测量血液抗体效价，并计算每个受试者的欧洲型CagA肽抗体效价“C”和东亚型CagA肽抗体效价“D”的比值。如果“C/D”小于0.7，优选0.5或更小，更优选0.2或更小，则它是东亚型菌株。如果“D/C”小于0.7，优选0.5或更小，更优选0.2或更少，它则可以被视为欧洲型菌株。
本发明的一个实施方案是一种评估胃部炎症/胃癌风险的方法，其包括(i)将源自受试者的血样与源自东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽和/或源自欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽接触，并且(ii)确定血样中是否存在针对所含肽的阳性反应抗体，受试者中是否存在针对源自幽门螺杆菌CagA蛋白的肽的阳性反应抗体为胃部炎症和/或胃癌风险的指标。此外，在一个关于胃炎/胃癌风险的评价方法的实施方案中，包括(i)将源自受试者的血液样本与源自至少东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽接触的步骤，和(ii)确定血液样本中阳性反应抗体存在与否的步骤，存在针对源自东亚幽门螺杆菌CagA蛋白的肽的阳性反应抗体是一个与胃炎和/或胃癌相关的较高风险指标。针对被评估为胃炎和/或胃癌高风险的受试者，都可以进行内窥镜检查、活组织检查、根除幽门螺杆菌、胃炎和/或胃癌的预防措施、或胃炎和/或胃癌的治疗。因此，本发明的一些实施例涉及包括这些步骤的预防或治疗方法。
<对象>
由于幽门螺杆菌能广泛感染哺乳动物，因此对象包括人、兔、豚鼠、大鼠、小鼠、牛、绵羊、山羊、猪、马等哺乳动物。特别地，由于推测幽门螺杆菌CagA蛋白多态性与疾病风险之间的关系，包括胃炎如浅表性胃炎、慢性活动性胃炎、萎缩性胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡以及胃癌，本发明的方法对有患病风险的人有效。
作为本发明的方法中使用的血样，可以使用来自受检者的血液，例如全血、血浆、血清或从受检者获得的其他预处理血液，优选是分离的血浆或血清。本发明的一些实施方案还可包括从受试者采集血液的步骤和/或处理来自受试者的血液以分离血浆或血清的步骤。
<幽门螺杆菌检测试剂盒>
本发明的另一方面涉及一种包含上述CagA肽的试剂盒，用于鉴定或检测受试者中的幽门螺杆菌菌株，或用于胃炎和/或胃癌的风险评估。该实施方案的试剂盒优选用于血液样本。除CagA肽外，该试剂盒还可包括样本前处理试剂、样本稀释剂、封闭剂、显色剂(包括基质等)、反应终止试剂、说明书和容器。试剂盒中包含的CagA肽可以预先固定在固相载体上，例如平板或珠子。
实施例
将通过以下实施例具体描述本发明，但是，本发明不应解释为限于此。
实施例1
1.人类样本的制备
用含有0.2％Tween 80的PBS稀释1:50用于测量抗体效价的人血浆。在这项研究中，使用了2名已知感染幽门螺杆菌的人和2名未感染幽门螺杆菌的人的血浆。
2.Helicobacter pylori CagA肽
在抗体效价测量中用作固定抗原的合成肽是要求Eurofin Genomics Co.,Ltd.生产的。用于合成的序列是用于鉴定欧洲型CagA的NH2-GFPLKRHDKVDDLSKVGRSVSPEPIYATDDLGG-COOH(EPIYA-C型肽；SEQ ID NO：2)和用于鉴定东亚型CagA的NH2-AINRKIDRINKIASAGKGVGGFSGAGRSASPEPIYATIDFDEANQAG-COOH(EPIYA-D型肽；SEQ ID NO：1)。
3.针对幽门螺杆菌CagA肽的抗体效价的测定
针对幽门螺杆菌CagA的各肽的抗体效价的测定是通过ELISA进行。将平底96孔板(NUNC,475994)作为ELISA板使用。将所述EPIYA-C肽和EPIYA-D肽在PBS调整为1微克/毫升，每孔分配50微升，于固定在室温下反应2小时。洗涤之后，每孔分配50微升的1:50稀释人血浆，并使其在37℃下反应90分钟。洗涤后，用0.2％Tween-PBS稀释1:4000生物素化山羊抗人IgG抗体作为二抗(ThermoFisher Co.，A24480)，每孔分配50微升，室温反应30分钟。洗涤后，用0.2％Tween-PBS稀释1:5000HRP标记的链霉亲和素(DAKO Corporation,P0397)，每孔分配50微升，并允许在室温下反应30分钟。洗涤后，将0.3％邻苯二胺二盐酸盐，0.04％H 2O2的柠檬酸盐磷酸盐缓冲液加入(pH为5.4)，在光屏蔽下每孔添加50微升，在室温下显色15分钟。然后，每孔加入25微升l 2N-HCl以停止显色反应。然后，用酶标仪测量490nm处的吸光度。每次反应之间用0.2％Tween-PBS，每孔250微升进行5次洗涤。
4.结果
针对EPIYA-C和EPIYA-D的肽的抗体效价是使用各2名的血浆样本测量的，存在或不存在幽门螺杆菌感染是已知的(图1)。同时测量的EPIYA-C和EPIYA-D肽的抗体效价比分析结果(图2)。所有幽门螺杆菌感染者都对EPIYA-D的肽有反应，而对EPIYA-C的肽没有反应。在两个未感染幽门螺杆菌的人中，没有观察到对任何肽有任何反应。
实施例2
使用与实施例1相同的方法，分析了390名日本胃癌患者和32名美国胃癌患者的血清。日本胃癌患者的血清来自东京医科齿科大学生物资源中心。美国胃癌患者的血清来自BioIVT(美国)。结果示于图1。
因此，在日本胃癌患者中，针对EPIYA-D肽的抗体效价高于针对EPIYA-C肽的抗体效价(即大部分为D>C)，主要发生东亚型幽门螺杆菌感染。美国胃癌患者D<C的病例数多于D>C的病例，说明欧洲型幽门螺杆菌感染占优势。这些结果进一步支持了实施例1的结果，可以说证明了这种分析方法的有效性。
实施例3
接着，如图4所示，将血清测定值的D/C比分为“A2”、“A1”、“？”和“W”四组，对每组的胃粘膜感染菌株进行PCR分析。每个样本的组织样本均从东京医科齿科大学生物资源中心获得。PCR引子和探针用于检测Western菌株的序列为EPIYA-CF(5'-TCAGTTAGCCCTGAACC-3'；SEQ ID NO:30)、EPIYA-CR(5'-GCCCTACCTTACTGAGAT-3'；SEQ ID NO:31)、EPIYA-C-PB(5'[HEX]-TCCGCCGAGAATCATCAATCGTAGC-[BHQ1]3'；SEQ ID NO:32)、EPIYA-DF(5-TCAACTAGCCCTGAACC-3'；SEQ ID NO:33)，用于检测东亚型菌株的序列为EPIYA-D-R(5'-GAAAGCCTACTTTACTGAG-3'；SEQ ID NO:34)和EPIYA-D-PB(5'[FAM]-AAGCCTGCTTGATTTGCCCTCATCAAA-[BHQ1]3'；SEQ ID NO:35)。PCR分析的程序如下。首先，将PCR混合物加入到用无菌蒸馏水稀释2倍的TaqMan Universal PCR Master Mix(ABgene，UK)中，使每个引子的终浓度为200nmol/L，探针的终浓度为80nmol/L。此外，向其中加入5μl样本以制成最终50μl。然后，将混合物在95℃下加热5分钟，PCR反应在95℃下进行5秒，在60℃下进行60秒进行50个循环。用ABI PRISM 7900HT序列检测系统于分析。结果示于下表3中。
[表3]
Figure BDA0003187633420000131
在表2中，最左边的列显示了样本编号。第二列显示了通过针对该细菌LPS的抗体效价确认幽门螺杆菌感染的结果。第三列显示了对EPIYA-D肽的抗体效价与对EPIYA-C肽的抗体效价的比率。第四列显示了基于D/C比率的分类判断结果。第五列和第六列分别显示了使用PCR对胃粘膜感染菌株的分析结果。
结果发现，根据本发明的血清抗体效价的分析结果与内窥镜通过PCR方法收集的胃粘膜感染菌株的分析结果是一致的。使用EPIYA确定为Western菌株的W组有1例PCR-W阳性，使用EPIYA确定为东亚型的A1组和A2组大多数情况下为PCR-A阳性，通过EPIYA肽判断的精度明显是高的。可以说，这些结果证明了这种分析方法的实用性和可靠性。
工业实用性
如上所述，根据本发明，可以鉴定被感染的幽门螺杆菌菌株，这用传统的非侵入性方法是困难的。特别是本发明中使用的CagA肽对东亚型株和欧洲型株都具有高特异性，因此可以准确地区分两种株，可以准确地做到评价胃炎和胃癌的风险。此外，由于本发明的方法使用两种菌株特异性肽，因此具有假阳性/假阴性确定概率低于检测幽门螺杆菌的常规方法的优点。此外，本发明的方法比使用基因分析的方法如PCR简单，并且由于它使用受试者的血液样本，因此可以广泛应用于血清学检查。由于这些特点，本发明的方法可广泛用于评估有胃炎/胃癌风险的受试者、幽门螺杆菌治疗后受试者的随访调查、流行病学研究等。
序列表
<110> 国立大学法人东京医科齿科大学
<120> 幽门螺杆菌菌株的鉴定方法及鉴定试剂盒
<130> P18-056P
<150> JP2019-015399
<151> 2019-01-31
<160> 35
<170> Patent In version 3.5
<210> 1
<211> 47
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 1
Ala Ile Asn Arg Lys Ile Asp Arg Ile Asn Lys Ile Ala Ser Ala Gly
1 5 10 15
Lys Gly Val Gly Gly Phe Ser Gly Ala Gly Arg Ser Ala Ser Pro Glu
20 25 30
Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Phe Asp Glu Ala Asn Gln Ala Gly
35 40 45
<210> 2
<211> 34
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 2
Gly Phe Pro Leu Lys Arg His Asp Lys Val Asp Asp Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Gly Arg Ser Val Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Asp Leu
20 25 30
Gly Gly
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 3
Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Phe Asp Glu Ala Asn Gln Ala Gly
1 5 10 15
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 4
Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Asp Leu Gly
1 5 10
<210> 5
<211> 45
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 5
Asn Arg Lys Ile Asp Arg Ile Asn Lys Ile Ala Ser Ala Gly Lys Gly
1 5 10 15
Val Gly Gly Phe Ser Gly Ala Gly Arg Ser Ala Ser Pro Glu Pro Ile
20 25 30
Tyr Ala Thr Ile Asp Phe Asp Glu Ala Asn Gln Ala Gly
35 40 45
<210> 6
<211> 43
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 6
Lys Ile Asp Arg Ile Asn Lys Ile Ala Ser Ala Gly Lys Gly Val Gly
1 5 10 15
Gly Phe Ser Gly Ala Gly Arg Ser Ala Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala
20 25 30
Thr Ile Asp Phe Asp Glu Ala Asn Gln Ala Gly
35 40
<210> 7
<211> 41
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 7
Asp Arg Ile Asn Lys Ile Ala Ser Ala Gly Lys Gly Val Gly Gly Phe
1 5 10 15
Ser Gly Ala Gly Arg Ser Ala Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile
20 25 30
Asp Phe Asp Glu Ala Asn Gln Ala Gly
35 40
<210> 8
<211> 39
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 8
Ile Asn Lys Ile Ala Ser Ala Gly Lys Gly Val Gly Gly Phe Ser Gly
1 5 10 15
Ala Gly Arg Ser Ala Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Phe
20 25 30
Asp Glu Ala Asn Gln Ala Gly
35
<210> 9
<211> 37
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 9
Lys Ile Ala Ser Ala Gly Lys Gly Val Gly Gly Phe Ser Gly Ala Gly
1 5 10 15
Arg Ser Ala Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Phe Asp Glu
20 25 30
Ala Asn Gln Ala Gly
35
<210> 10
<211> 33
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 10
Ala Gly Lys Gly Val Gly Gly Phe Ser Gly Ala Gly Arg Ser Ala Ser
1 5 10 15
Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Phe Asp Glu Ala Asn Gln Ala
20 25 30
Gly
<210> 11
<211> 31
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 11
Lys Gly Val Gly Gly Phe Ser Gly Ala Gly Arg Ser Ala Ser Pro Glu
1 5 10 15
Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Phe Asp Glu Ala Asn Gln Ala Gly
20 25 30
<210> 12
<211> 29
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 12
Val Gly Gly Phe Ser Gly Ala Gly Arg Ser Ala Ser Pro Glu Pro Ile
1 5 10 15
Tyr Ala Thr Ile Asp Phe Asp Glu Ala Asn Gln Ala Gly
20 25
<210> 13
<211> 27
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 13
Gly Phe Ser Gly Ala Gly Arg Ser Ala Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala
1 5 10 15
Thr Ile Asp Phe Asp Glu Ala Asn Gln Ala Gly
20 25
<210> 14
<211> 25
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 14
Ser Gly Ala Gly Arg Ser Ala Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile
1 5 10 15
Asp Phe Asp Glu Ala Asn Gln Ala Gly
20 25
<210> 15
<211> 23
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 15
Ala Gly Arg Ser Ala Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Phe
1 5 10 15
Asp Glu Ala Asn Gln Ala Gly
20
<210> 16
<211> 21
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 16
Arg Ser Ala Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Phe Asp Glu
1 5 10 15
Ala Asn Gln Ala Gly
20
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 17
Ala Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Phe Asp Glu Ala Asn
1 5 10 15
Gln Ala Gly
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 18
Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Phe Asp Glu Ala Asn Gln Ala
1 5 10 15
Gly
<210> 19
<211> 32
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 19
Pro Leu Lys Arg His Asp Lys Val Asp Asp Leu Ser Lys Val Gly Arg
1 5 10 15
Ser Val Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Asp Leu Gly Gly
20 25 30
<210> 20
<211> 30
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 20
Lys Arg His Asp Lys Val Asp Asp Leu Ser Lys Val Gly Arg Ser Val
1 5 10 15
Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Asp Leu Gly Gly
20 25 30
<210> 21
<211> 28
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 21
His Asp Lys Val Asp Asp Leu Ser Lys Val Gly Arg Ser Val Ser Pro
1 5 10 15
Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Asp Leu Gly Gly
20 25
<210> 22
<211> 26
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 22
Lys Val Asp Asp Leu Ser Lys Val Gly Arg Ser Val Ser Pro Glu Pro
1 5 10 15
Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Asp Leu Gly Gly
20 25
<210> 23
<211> 24
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 23
Asp Asp Leu Ser Lys Val Gly Arg Ser Val Ser Pro Glu Pro Ile Tyr
1 5 10 15
Ala Thr Ile Asp Asp Leu Gly Gly
20
<210> 24
<211> 22
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 24
Leu Ser Lys Val Gly Arg Ser Val Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr
1 5 10 15
Ile Asp Asp Leu Gly Gly
20
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 25
Lys Val Gly Arg Ser Val Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp
1 5 10 15
Asp Leu Gly Gly
20
<210> 26
<211> 18
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 26
Gly Arg Ser Val Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Asp Leu
1 5 10 15
Gly Gly
<210> 27
<211> 16
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 27
Ser Val Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Asp Leu Gly Gly
1 5 10 15
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 28
Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Asp Leu Gly Gly
1 5 10
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 29
Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Asp Leu Gly Gly
1 5 10
<210> 30
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PCR primer/probe
<400> 30
tcagttagcc ctgaacc 17
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PCR primer/probe
<400> 31
gccctacctt actgagat 18
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PCR primer/probe
<400> 32
tccgccgaga tcatcaatcg tagc 24
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PCR primer/probe
<400> 33
tcaactagcc ctgaacc 17
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PCR primer/probe
<400> 34
gaaagcccta ctttactgag 20
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PCR primer/probe
<400> 35
aagcctgctt gatttgcctc atcaaa 26

Claims (15)

1.一种检测幽门螺杆菌的方法，其中包含
(i)将来自受试者的血液样本与源自东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽和/或源自欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽接触的步骤，和
(ii)确定血液样本中是否存在针对所含肽的阳性反应抗体的步骤。
2.根据权利要求1的方法，针对在步骤(i)将血液样本与至少源自东亚幽门螺杆菌CagA蛋白肽的接触中，其中存在源自东亚幽门螺杆菌CagA蛋白肽的阳性反应抗体为受试者患胃炎和/或胃癌较高风险的指标。
3.一种评估胃炎/胃癌风险的指标方法，其包含
(i)将来自受试者的血液样本与源自东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽和/或源自欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽接触的步骤，和
(ii)确定血液样本中是否存在针对所含肽的阳性反应抗体的步骤，
以是否存在针对源自幽门螺杆菌CagA蛋白肽的阳性反应抗体为受试者患胃炎和/或胃癌的风险指标。
4.根据权利要求3的方法，针对在步骤(i)将血液样本与至少源自东亚幽门螺杆菌CagA蛋白肽的接触中，其中存在源自东亚幽门螺杆菌CagA蛋白肽的阳性反应抗体为受试者患胃炎和/或胃癌的风险指标。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白来源的肽和欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白来源的肽分别含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其片段和SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白来源的肽和欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白来源的肽分别由SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其片段和SEQID NO：2的氨基酸序列或其片段组成。
7.根据权利要求5或根据6的方法，其中东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白来源的肽和欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白来的源肽分别含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列和SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中所述血液样本为血浆或血清。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中确定阳性反应抗体的存在或不存在的步骤，是由通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、纸免疫层析法或乳胶凝集法进行。
11.一种检测幽门螺杆菌的试剂盒，包括源自东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽和/或源自欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽。
12.根据权利要求11的试剂盒，用于评估受试者的胃炎和/或胃癌的风险。
13.根据权利要求11或12的试剂盒，其中所述肽固定在固相载体上。
14.一种评估胃炎/胃癌风险的方法，其包含
(i)将来自受试者的血液样本与源自东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽SEQ ID NO：1和源自欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽SEQ ID NO：2接触的步骤，和
(ii)确定血液样本中是否存在针对所含肽的阳性反应抗体的步骤，
以在受试者中是否存在针对源自幽门螺杆菌CagA蛋白肽的阳性反应抗体，为发生胃炎和/或胃癌风险较高的指标。
15.一种检测幽门螺杆菌的试剂盒，其包含选自SEQ ID NO：1、3和5-18的序列来源于东亚型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽和选自SEQ ID NO：2、4和19-29的序列源自欧洲型幽门螺杆菌CagA蛋白的肽。
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