CN113985026A - 一种检测羊副结核分枝杆菌的elisa试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测羊副结核分枝杆菌的elisa试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于羊养殖技术领域，具体涉及一种检测羊副结核分枝杆菌的ELISA试剂盒及其应用。所述ELISA试剂盒包括混合包被抗原，所述混合包被抗原包括氨基酸序列如SequenceNO：1、Sequence NO：2、Sequence NO：3和Sequence NO：4所示的抗原，按照ELISA方法进行检测，若检测结果为阳性时，则待检测样品携带羊副结核分枝杆菌。该ELISA试剂盒及检测方法适用于6月龄左右的羊进行羊副结核分枝杆菌，而且对处于亚临床阶段的MAP感染检测灵敏度高于IDVET副结核间接检测试剂盒。

Description

一种检测羊副结核分枝杆菌的ELISA试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于羊养殖技术领域，具体涉及一种检测羊副结核分枝杆菌的ELISA试剂盒及其应用。
背景技术
副结核病是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium aviumsubsp.Paratuberculosis，MAP，又称禽分枝杆菌副结核亚种)引起的反刍动物慢性肠道传染病，以顽固性腹泻、渐进性消瘦和肠黏膜增厚形成皱襞、慢性肉芽肿性肠炎为特征，被OIE列为B类疫病，被我国列为Ⅱ类传染病。我国每年从国外进口大量种羊，尽管实施副结核病国外预检制度，但从多批种羊中均检出该病。
羊通常在幼年期经口感染MAP，经历12个月以上的亚临床期后部分患羊出现持续性腹泻，病情严重的羊会死亡。在这个极长的亚临床阶段，病原菌随感染动物粪便不断或间歇性地排出，出现临床症状时排菌量明显增加，成为传染源。大多数感染羊呈隐性感染或慢性感染，表现为渐进性消瘦、不耐运动、排软性粪便，其中部分患羊因极度瘦弱、生长缓慢只能作淘汰处理，造成养殖投入的浪费和经济损失。副结核病没有有效的预防和治疗方法，实施监测、隔离、淘汰等综合防治措施是防控该病的主要方法。
目前，用于副结核病诊断的产品有检测MAP抗体的间接ELISA检测试剂盒。该产品使用MAP提取物作为包被抗原，同时产品依赖于进口。MAP与其他常见的分枝杆菌有共同抗原，需要繁琐的预吸收步骤来去除提取物中的共同抗原，以确保试剂盒的特异性。但预吸附降低了试剂盒检测和诊断敏感性，导致处于亚临床期的MAP感染动物阳性检出率降低。需要更敏感、高通量的筛选分析来识别在MAP感染亚临床早期阶段的动物。
自从第一个完整的MAP基因组序列发表以来，许多MAP蛋白被研究，以确定潜在候选抗原，用于鉴别轻度或早期MAP感染的动物。这些研究筛选出一些在牛源MAP感染期间具有免疫原性的候选抗原。MAP主要有牛型和羊型2个亚型，牛型菌株易感动物较多，毒力较强；羊型菌株对羊以外的其他宿主的致病性较弱。牛型和羊型MAP有一定的抗原差异，Souriau等(2017)从Mon等(2012)研究的牛型MAP的54抗原中选择16个抗原用于羊副结核分枝杆菌病的诊断，发现只有3个抗原能作为诊断用候选抗原。目前在感染羊只副结核分枝杆菌的抗体应答方面的认识不系统，在羊副结核病有诊断价值的抗原筛选上，应该明确哪些抗原在数月龄羊体内产生抗体应答，以提高羊副结核病早期感染和潜伏期感染的检测敏感性。基于本发明的对比研究结果显示，此3个抗原不适用于数月龄羊体内的抗体应答。
发明内容
有鉴于此，本发明在于提供一种检测羊副结核分枝杆菌(Mycobacterium aviumsubsp.Paratuberculosis)的ELISA试剂盒及ELISA检测方法，该ELISA试剂盒适用于检测6月龄左右的羊是否携带羊副结核分枝杆菌，而且检准率高。
所述ELISA试剂盒包括混合包被抗原，所述混合包被抗原包括氨基酸序列如Sequence NO：1、Sequence NO：2、Sequence NO：3和Sequence NO：4所示的抗原。
具体地，本发明利用有临床症状的6月龄绵羊副结核病阳性血清对已报道的45个重组蛋白抗原进行筛选，筛选到16个重组蛋白与绵羊副结核病阳性血清有反应的抗原，表明这16个抗原在早期阶段有抗体应答。分别用以这16个重组蛋白作为包被抗原制备的间接ELISA方法，检测疫区有副结核病典型病理学特征的绵羊羊群，筛选出4个对绵羊副结核病MAP抗体有高检出率的重组蛋白。以这4个重组蛋白为包被抗原制备的绵羊间接ELISA方法,其检测结果与有严重腹泻的临床症状符合率较高，表明这4个抗原有高诊断价值。结合检测绵羊粪便中针对MAP核酸的PCR结果，以此4个抗原作为混合包被抗原的ELISA试剂盒，除了对严重腹泻绵羊副结核病有高检出率，还对处于亚临床症状的绵羊副结核病有较高检出率。
优选地，所述ELISA试剂盒的检测样品为羊血清，更优选为5-7月龄羊血清，更优先为5-7月龄绵羊血清。
具体地，所述ELISA试剂盒的使用方法是将Sequence NO：1、Sequence NO：2、Sequence NO：3和Sequence NO：4所示的抗原分别稀释成一定浓度后进行混合，优选为等体积混合。
进一步，所述检测羊副结核分枝杆菌的ELISA试剂盒还包括ELISA试剂盒常规的试剂或装置，如孔板、加热器、封闭液、PBST洗涤液、稀释液、酶标二抗、显色液、酶标仪等。
优选地，所述酶标二抗为HRP标记的兔抗绵羊IgG抗体，所述显色液为四甲基联苯胺。
本发明还提供一种检测羊副结核分枝杆菌的ELISA方法，所述ELISA方法包括：使用混合抗原作为包被抗原进行检测；所述混合抗原包括氨基酸序列如Sequence NO：1、Sequence NO：2、Sequence NO：3和Sequence NO：4所示的抗原；当检测的结果为阳性时，则待检测样品携带羊副结核分枝杆菌。
进一步，所述混合抗原作为包被抗原时，将4种抗原进行混合，所述4种抗原的浓度均为7.5-8.5μg/mL，优选浓度为8μg/mL，更优选为浓度为8μg/mL的4种抗原等体积混合。
进一步，所述检测样品可以是羊血清或者羊粪便或者其他携带羊副结核分枝杆菌的样品。
优选地，所述待检测样品为羊血清。
更优选为，所述待检测样品为绵羊血清。
更优选地，所述待检测样品为5-7月龄羊血清，更优选为6月龄羊血清。
更优选地，所述待检测样品为5-7月龄绵羊血清，更优先为6月龄绵羊血清。
进一步，所述羊血清为1:80-120稀释的羊血清。优选为1:100稀释的羊血清为待检测样品。其中所述羊血清包含5-7月龄羊血清或5-7月龄绵羊血清或绵羊血清。优选为6月龄羊血清。
在某些具体实施例中，所述检测羊副结核分枝杆菌的ELISA方法包括：
(1)将Sequence NO：1、Sequence NO：2、Sequence NO：3、Sequence NO：4所示的抗原等体积混合做为包被蛋白包被96孔板，4℃包被过夜；
(2)用2％明胶封闭液于37℃封闭2h；
(3)加入待检测羊血清1:100稀释，37℃反应30min；
(4)用PBST洗涤3次，加入稀释的HRP标记的兔抗绵羊IgG抗体，37℃反应60min；
(5)使用四甲基联苯胺显色10min，用酶标仪测定OD450nm值。
本发明目的在于还提供一种多种抗原联合在检测羊副结核分枝杆菌中的应用，所述混合抗原包括氨基酸序列如Sequence NO：1、Sequence NO：2、Sequence NO：3和SequenceNO：4所示的抗原。混合抗原ELISA对处于亚临床阶段的MAP感染检测灵敏度高于IDVET副结核间接检测试剂盒。
本发明目的在于还提供一种混合抗原在制备检测羊副结核分枝杆菌试剂/试剂盒中的应用，所述混合抗原包括氨基酸序列如Sequence NO：1、Sequence NO：2、Sequence NO：3和Sequence NO：4所示的抗原。试剂盒或者试剂的使用方法一般包括但不限于ELISA试剂或试剂盒。
本发明有益效果在于
本发明提供的ELISA试剂盒及检测羊副结核分枝杆菌的方法适用于6月龄左右的羊进行羊副结核分枝杆菌，可以在早期确定羊是否携带羊副结核分枝杆菌，而且混合抗原的ELISA试剂盒或试剂对处于亚临床阶段的MAP感染检测灵敏度高于IDVET副结核间接检测试剂盒。
本发明提供的ELISA试剂盒及检测羊副结核分枝杆菌的方法，与携带羊副结核分枝杆菌的羊有严重腹泻的临床症状符合率较高，即检准率高。
附图说明
图1为IS900 PCR(IS900F1/IS900R1)结果。
图2为套式PCR(L/AV)结果。
图3为ISMap02 PCR(ISMap02F1/ISMap02R1)结果。
图4为肠道组织(×100)光镜图。
图5为肠系膜淋巴结(×400)光镜图。
图6为重组蛋白与绵羊副结核阳性血清的识别反应(免疫印迹)。
图7为重组蛋白纯化结果。
其中，图1中，M.DL为2 000Marker；1为肠道组织；2为阴性对照。
图2中，A为第一轮PCR；B.为第二轮PCR；M.DL为2 000Marker；1为肠系膜淋巴结；2为阴性对照。
图3中，M.DL为2 000Marker；1为肠系膜淋巴结；2为阴性对照。
图6中，A为MAP1138c；B为MAP2154c；C为MAP2751；D为MAP1693c；E为MAP2020；F为MAP1272c；G为MAP0209c；H为MAP1595c；I为MAP2121c；J为MAP0150c；K为MAP0630c；L为MAP1345；M为MAP2963；N为MAP0471；O为MAP0196c；P为MAP2942c。A-P中，M为蛋白质相对分子质量标准；1为A-P重组蛋白。
图7中，M为蛋白质相对分子质量标准；1-4为纯化的重组蛋白，依次为1为MAP0630c；2为MAP0150c；3为MAP2121c；4为MAP1138c。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例中，样品采集对象为：内蒙古某地绵羊群，一年四季存在间歇性腹泻，发病率约为全群的30％，药物治疗无效；将发病的羊剖检可见，真胃水肿、肠系膜淋巴结炎，初步诊断为副结核病。
本发明实施例中，样品采集对象为有间歇性腹泻症状的约6月龄的绵羊。样品采集方法为：在无菌环境下，采集绵羊的肠系膜淋巴结等组织和粪便，用于PCR检测；采集绵羊的肠道等组织用于组织病理学观察；采集羊群血液分离血清，用于间接ELISA检测。
本发明实施例中，组织DNA提取的方法为：称取组织样品约20mg，组织研磨后加入消化液消化，然后采用Qiagen公司的组织基因组DNA提取试剂盒提取DNA，其他步骤按试剂盒说明进行。粪便DNA提取的方法为：称取粪便样品180-220mg，按Qiagen公司的粪便基因组DNA提取试剂盒说明书要求提取DNA。
本发明实施例中，选择副结核分枝杆菌特异片段IS900和ISMap02作为PCR检测靶标；针对靶标IS900的是PCR(IS900F1/IS900R1)和套式PCR(L/AV)，针对靶标ISMap02的是PCR(ISMap02F1/ISMap02R1)。
本发明实施例中，选用引物序列及扩增片段大小见表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1引物信息
Figure BDA0003287293060000051
本发明实施例中，PCR扩增的条件为：PCR扩增反应体系为20μL，具体见表2；PCR扩增的反应程序为：94℃2min；94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，30循环；72℃3min；室温保存。
表2 PCR反应体系
组份 用量(μL)
2×PCR Mix 10
上游引物(10μmol/L) 0.5
下游引物(10μmol/L) 0.5
DNA 0.5
去离子水 8.5
本发明实施例中，PCR扩增产物电泳的方法为：取5μL PCR扩增产物加入加样孔，用1×TAE缓冲液作为电泳液，在恒压120V下进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，电泳25min后将凝胶置于凝胶成像仪中拍照以观察PCR结果。
本发明实施例中，菌株诱导表达的方法为：菌种分别接种至含卡那霉素的LB培养物中，37℃下空气浴振摇培养至菌体浓度达到OD600nm为0.6左右时，加入终浓度为0.1mmol/LIPTG，37℃下诱导表达3h。
本发明实施例中，免疫印迹试验的方法为：向提取的重组蛋白质溶液加入SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴10min。样本经SDS-PAGE后转印至硝酸纤维素膜上，采用5％脱脂奶粉封闭2h，TBST洗3次后与阳性血清(1:100稀释)孵育，TBST洗3次后与碱性磷酸酶标记的驴抗绵羊IgG(1:2 000稀释)孵育，最后置BCTP/NBT中显色。
实施例1基因序列验证
(1)以剖检腹泻羊肠系膜淋巴结组织提取DNA；
(2)将提取的的DNA模板使用表1中的引物进行PCR扩增，阴性对照为超纯水。在套式PCR的第二轮PCR中，取10×稀释的第一轮的PCR产物作为模板，其他体系和反应参数按第一轮操作进行；
(3)将PCR扩增产物进行电泳。电泳结果结果如图1、2、3所示，针对靶标IS900的PCR(IS900F1/IS900R1)、套式PCR(L/AV)及针对靶标ISMap02的PCR(ISMap02F1/ISMap02R1)所扩增的片段大小与预期大小相符。
(4)回收上述PCR扩增的目的条带，将其克隆至pMD18-T，转化如DH5α，挑选阳性克隆对重组质粒中的插入片段进行双向序列测定，在NCBI上进行BLST搜索以进行同源性比对。结果显示，所有引物对所扩增出的目的条带序列与副结核分枝杆菌基因组对应部分同源性高于98％，同源性高于其他生物，这表明所扩增条带是副结核分枝杆菌基因组序列。
实施例2病理学观察验证
将肠道等组织用10％福尔马林固定，制备石蜡切片，HE染色，在光镜下进行病理学观察。
如图4所示，肠黏膜层增厚，固有层中分布着大量炎性细胞。
如图5所示，肠系膜淋巴结内部分淋巴细胞坏死，并散在分布大小不等的肉芽肿，肉芽肿内可见上皮样细胞和淋巴细胞。
这些病理变化是副结核病的特征性病变。
实施例3间接ELISA检测临床样品验证
使用IDVET副结核间接ELISA检测试剂盒测试采集自发生副结核病羊场的绵羊血清。该试剂盒的使用方法获得OIE收录推荐，检测结果与临床症状符合率高，测试步骤按说明书要求进行。
测试结果显示，羊场绵羊副结核阳性率为34.88％(60/172)。临床症状表现出持续性腹泻、有典型病理学特征、且肠道组织和粪便PCR结果为阳性的病羊血清的间接ELISA读值超过酶标仪的读值范围，选用其中3份血清作为阳性血清，用于副结核诊断用候选重组抗原筛选。
实施例4候选抗原及其表达系统构建
根据牛源副结核分枝杆菌抗原的研究成果，筛选了45个牛源副结核分枝杆菌(GenBank NO.AE016958)抗原作为羊源副结核分枝杆菌的诊断用候选抗原(表3)。在绵羊副结核分枝杆菌基因组(GenBank NO.CP033688)中搜索与这43个抗原同源的注释基因编码的蛋白，其中MAP2154c在绵羊源副结核分枝杆菌基因组中能被找到对应DNA序列，但未进行基因注释；MAP1730c在绵羊源副结核分枝杆菌基因组中无对应DNA序列。根据牛源副结核分枝杆菌(GenBank NO.AE016958)抗原的氨基酸序列，按大肠杆菌的密码子偏好性对这将45个候选抗原的编码基因进行序列优化，采用化学合成方法合成优化后的编码基因，将其克隆到质粒pET28a中构建重组质粒，将重组质粒转化至BL21(DE3)中构建表达羊副结核分枝杆菌候选抗原基因的表达工程菌。
表3候选抗原相关信息
Figure BDA0003287293060000071
Figure BDA0003287293060000081
实施例5诊断用候选重组抗原筛选
将实施例4中的45个菌株分别进行诱导表达，收集诱导表达工程菌，采用SDS-PAGE对目的蛋白进行诱导表达情况分析，结果显示所有蛋白均有表达。采用Ni-NTA介质从诱导表达工程菌中提取重组蛋白，然后将提取的重组蛋白进行免疫印迹试验。免疫印迹结果显示，45个牛源副结核分枝杆菌(GenBank NO.AE016958)重组蛋白中的16个重组蛋白能被阳性血清识别，呈现与预期大小相同的特异条带(如图6所示)。
实施例6诊断用抗原筛选
抗原筛选用血清：74份约6月龄绵羊血清，其中34份为IDVET副结核间接ELISA检测试剂盒检测为阳性。74份血清中有6份血清采自严重腹泻羊只，其中5只为IDVET副结核间接ELISA检测试剂盒检测为阳性，1只为阴性；但这6只羊的粪便套式PCR(L/AV)检测结果均为阳性。以实施例3中的阳性血清作为阳性对照，以IDVET副结核间接ELISA检测试剂盒检测为阴性且多次粪便采样PCR结果为阴性的羊只血清为阴性对照。阳性对照的平均OD(ODPC)大于0.35，阳性对照与阴性对照平均OD(ODNC)比值大于3，则检测结果有效。样品OD(ODS)/ODPC％≤75％时判为阴性，ODS/ODPC％≥85％时判为阳性，75％<ODS/ODPCP％<85％时判为可疑。
用实施例5中筛选的16个与阳性血清反应的重组蛋白(表3中1-16号蛋白)做为包被蛋白，使用Bradford法测定蛋白质浓度，将蛋白质浓度稀释成8μg/mL，包被96孔板，4℃包被过夜；用2％明胶封闭液于37℃封闭2h；加入发生副结核病羊场的绵羊血清(1:100稀释)，37℃反应30min；用PBST洗涤3次，加入稀释的HRP标记的兔抗绵羊IgG抗体，37℃反应60min；四甲基联苯胺显色10min，用酶标仪测定OD450nm值。
对74份血清的检测结果得出，由单一重组抗原MAP0150c(Sequence NO：1)、MAP1138c(Sequence NO：2)、MAP2121c(Sequence NO：3)、MAP0630c(Sequence NO：4)制备成的ELISA检测方法的阳性检测出率较高。具体为：MAP0150c(Sequence NO：1)ELISA阳性检测率为21.62％(16/74)，与IDVET副结核间接检测试剂盒检测结果的阳性符合率为35.29％(17/74)，与6份出现严重腹泻的临床症状符合率为83.33％(5/6)；MAP1138c(Sequence NO：2)ELISA阳性检测率为22.97％，与IDVET副结核间接检测试剂盒的阳性符合率为47.06％，与出现严重腹泻的临床症状符合率为83.33％(5/6)；MAP2121c(Sequence NO：3)ELISA阳性检测率为45.95％(34/74)，与IDVET副结核间接检测试剂盒的阳性符合率为58.82％，与6份出现严重腹泻的临床症状符合率为66.66％(4/6)；MAP0630c(Sequence NO：4)ELISA阳性检测率为28.38％(21/74)，与IDVET副结核间接检测试剂盒的阳性符合率为47.06％，与出现严重腹泻的临床症状符合率为66.66％(4/6)(如下表4所示)。
表4腹泻腹泻羊只MAP检测结果
Figure BDA0003287293060000091
注：表4中，I：IDVET副结核间接检测试剂盒；S:单一抗原ELISA，包被96孔板；M：混合抗原ELISA，包被96孔板；P：阳性结果，N：阴性结果。
实施例7混合抗原ELISA样品检测
采用SDS-PAGE检测重组MAP0150c、MAP1138c、MAP2121c和MAP0630c，电泳结果如图7。将这4种重组蛋白稀释成8μg/mL，等体积混合作为包被抗原，如实施例6方法制备混合抗原包被酶标板。按实施例6方法检测上述74绵羊血清。
结果显示，混合抗原ELISA阳性检测率为51.35％(38/74)，与IDVET副结核间接检测试剂盒检测结果的阳性符合率为67.64％(23/74)，与6份出现严重腹泻的临床症状符合率为100％(6/6)。
实施例8混合抗原ELISA检测选定样本
从有副结核病的绵羊场筛选10只5-7月龄绵羊进行编号登记，其中2只为IDVET副结核间接ELISA检测试剂盒检测阳性羊，8只为阴性羊。每2个月定期对这10只羊进行粪便和血液采集，共采集3次。粪便用于提取DNA，采用套式PCR检测其中MAP。血液用于分离血清，检测其中MAP抗体。采用混合抗原ELISA方法、IDVET副结核间接ELISA检测试剂盒，检测血清样品，采用套式PCR方法检测粪便样品。
由检测数据如下表5所示，可见，PCR的检测灵敏度高于间接ELISA，但副结核分枝杆菌随粪便的排出状况会影响检测结果；混合抗原ELISA对处于亚临床阶段的MAP感染检测灵敏度高于IDVET副结核间接检测试剂盒。
表5标记羊只MAP检测结果
Figure BDA0003287293060000101
注：表5中，I：IDVET副结核间接检测试剂盒；M：混合抗原ELISA，包被96孔板；P：阳性结果，N：阴性结果。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 重庆市畜牧科学院、乌拉特后旗动物疫病预防控制中心
<120> 一种检测羊副结核分枝杆菌的ELISA试剂盒及其应用
<130> 2021-8-3
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 403
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Thr Phe Ser Leu Gln Leu Ser Asp Asp Val Ile Glu Val Arg Asp
1 5 10 15
Trp Val His Gln Phe Ala Ala Asp Val Val Arg Pro Ala Ala Ala Glu
20 25 30
Trp Asp Glu Arg Glu Glu Thr Pro Trp Pro Val Ile Gln Glu Ala Ala
35 40 45
Lys Val Gly Leu Tyr Ser Pro Asp Leu Phe Ala Gln Gln Ala Ala Glu
50 55 60
Pro Thr Gly Leu Gly Met Leu Thr Val Phe Glu Glu Leu Phe Trp Gly
65 70 75 80
Asp Ala Gly Ile Ala Leu Ser Ile Met Gly Thr Gly Leu Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Leu Ala Gly Asn Gly Thr Pro Glu Gln Leu Gly Arg Trp Leu Pro
100 105 110
Glu Met Phe Gly Thr Ala Asp Glu Pro Lys Leu Gly Ala Phe Cys Ser
115 120 125
Ser Glu Pro Asp Ala Gly Ser Asp Val Gly Ala Ile Arg Thr Arg Ala
130 135 140
Arg Tyr Asp Glu Ala Thr Gly Glu Trp Val Leu Asn Gly Thr Lys Thr
145 150 155 160
Trp Ala Thr Asn Gly Gly Ile Ala Asn Val His Ile Val Val Ala Ser
165 170 175
Val Tyr Pro Glu Leu Gly Ala Arg Gly Gln Ala Thr Phe Val Val Pro
180 185 190
Ala Gly Val Lys Gly Leu Ala Gln Gly Gln Lys Phe Lys Lys His Gly
195 200 205
Ile Arg Ala Ser His Thr Ala Glu Val Val Leu Asp Asp Val Arg Leu
210 215 220
Pro Ala Asp His Ile Leu Gly Gly Arg Glu Lys Phe Glu Glu Arg Ile
225 230 235 240
Ala Arg Val Lys Ser Gly Ala Ser Ala Arg Gly Gln Ala Ala Leu Lys
245 250 255
Thr Phe Glu Arg Thr Arg Pro Thr Val Gly Ala Met Ala Val Gly Val
260 265 270
Ala Arg Ala Ala Tyr Glu Tyr Ala Leu Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Glu
275 280 285
Gln Phe Gly Arg Lys Ile Gly Glu Phe Gln Ala Val Ala Phe Lys Leu
290 295 300
Ala Asp Met Lys Cys Arg Ile Asp Ala Ala Arg Met Leu Val Trp Arg
305 310 315 320
Ala Gly Trp Met Ala Arg Asn Asn Gln Ala Phe Asp Ala Ala Glu Gly
325 330 335
Ser Met Ala Lys Leu Val Ala Ser Glu Thr Ala Val Tyr Val Thr Asp
340 345 350
Glu Ala Ile Gln Ile Leu Gly Gly Asn Gly Tyr Thr Arg Asp Tyr Pro
355 360 365
Val Glu Arg Met His Arg Asp Ala Lys Ile Phe Thr Ile Phe Glu Gly
370 375 380
Thr Ser Glu Ile Gln Arg Leu Val Ile Ser Arg Ala Leu Thr Gly Leu
385 390 395 400
Pro Ile Arg
<210> 2
<211> 209
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Ser Lys Gln Ser Gly Ala Pro Leu Pro Asp Pro Thr Ser Leu Val
1 5 10 15
Lys Gln Ser Ala Asp Ala Thr Lys Asn Val Lys Ser Val His Leu Val
20 25 30
Leu Ser Ile Gln Gly Lys Ile Ser Gly Leu Pro Ile Lys Thr Leu Thr
35 40 45
Gly Asp Leu Thr Thr Thr Pro Ala Thr Ala Ala Lys Gly Asn Ala Thr
50 55 60
Ile Thr Leu Gly Gly Ser Asp Ile Asp Ala Asn Phe Val Val Val Asp
65 70 75 80
Gly Thr Leu Tyr Ala Thr Leu Thr Pro Asn Lys Trp Ser Asp Phe Gly
85 90 95
Lys Ala Ser Asp Ile Tyr Asp Val Ser Val Leu Leu Asn Pro Asp Asn
100 105 110
Gly Leu Gly Asn Ala Leu Ala Asn Phe Ser Asn Ala Lys Ala Glu Gly
115 120 125
Arg Glu Thr Ile Asn Gly Gln Ser Thr Ile Arg Ile Ser Gly Asn Val
130 135 140
Ser Ala Asp Ala Val Asn Lys Ile Met Pro Gln Phe Asn Ala Thr Gln
145 150 155 160
Pro Val Pro Ser Thr Val Trp Val Gln Glu Thr Gly Asp His Gln Leu
165 170 175
Val Gln Ala Asn Leu Gln Lys Ser Ser Gly Asn Ser Val Gln Val Thr
180 185 190
Leu Ser Asn Trp Gly Glu Gln Val Gln Val Thr Lys Pro Pro Val Ser
195 200 205
Ser
<210> 3
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Thr Ser Ala Gln Asn Glu Ser Gln Ala Leu Gly Asp Leu Ala Ala
1 5 10 15
Arg Gln Leu Ala Asn Ala Thr Lys Thr Val Pro Gln Leu Ser Thr Ile
20 25 30
Thr Pro Arg Trp Leu Leu His Leu Leu Asn Trp Val Pro Val Glu Ala
35 40 45
Gly Ile Tyr Arg Val Asn Arg Val Val Asn Pro Glu Gln Val Ala Ile
50 55 60
Lys Ala Glu Ala Gly Ala Gly Ser Glu Glu Pro Leu Pro Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Val Asp Tyr Glu Thr Ser Pro Arg Glu Tyr Thr Leu Arg Ser Ile Ser
85 90 95
Thr Leu Val Asp Ile His Thr Arg Val Ser Asp Leu Tyr Ser Ser Pro
100 105 110
His Asp Gln Ile Ala Gln Gln Leu Arg Leu Thr Ile Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Glu Arg Gln Glu Leu Glu Leu Ile Asn Ser Pro Glu Tyr Gly Leu Leu
130 135 140
Ala Gln Ala Thr Pro Glu Gln Thr Ile Gln Thr Leu Ala Gly Ala Pro
145 150 155 160
Thr Pro Asp Asp Leu Asp Ala Leu Ile Thr Lys Val Trp Lys Thr Pro
165 170 175
Ser Phe Phe Leu Thr His Pro Leu Gly Ile Ala Ala Phe Gly Arg Glu
180 185 190
Ala Thr Tyr Arg Gly Val Pro Pro Pro Val Val Ser Leu Phe Gly Ala
195 200 205
Gln Phe Ile Thr Trp Arg Gly Ile Pro Leu Ile Pro Ser Asp Lys Val
210 215 220
Pro Val Glu Asp Gly Lys Thr Lys Phe Ile Leu Val Arg Thr Gly Glu
225 230 235 240
Glu Arg Gln Gly Val Val Gly Leu Phe Gln Pro Gly Leu Val Gly Glu
245 250 255
Gln Ala Pro Gly Leu Ser Val Arg Phe Thr Gly Ile Asn Gln Ser Ala
260 265 270
Ile Ala Thr Tyr Leu Val Thr Leu Tyr Thr Ser Leu Ala Val Leu Thr
275 280 285
Asp Asp Ala Leu Ala Val Leu Asp Asp Val Ala Val Asp Gln Phe His
290 295 300
Glu Tyr Lys
305
<210> 4
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Asn Asn Leu Tyr Arg Asp Leu Ala Pro Val Thr Glu Ala Ala Trp
1 5 10 15
Gly Glu Ile Glu Leu Glu Ala Ser Arg Thr Phe Lys Arg His Val Ala
20 25 30
Gly Arg Arg Val Val Asp Val Ser Glu Pro Gly Gly Pro Ala Ala Ala
35 40 45
Ala Val Ser Thr Gly Arg Leu Ile Asp Val Glu Ala Pro Thr Asn Gly
50 55 60
Val Val Ala His Leu Arg Ala Ser Lys Pro Leu Val Arg Leu Arg Val
65 70 75 80
Pro Phe Thr Leu Ser Arg Tyr Glu Ile Asp Asn Val Glu Arg Gly Ala
85 90 95
Asn Asp Ser Asp Trp Asp Pro Val Lys Glu Ala Ala Lys Lys Leu Ala
100 105 110
Phe Val Glu Asp Arg Ala Ile Phe Glu Gly Tyr Ala Ala Ala Ser Ile
115 120 125
Asp Gly Ile Arg Ser Ala Ser Ser Asn Lys Pro Leu Ala Leu Pro Ala
130 135 140
Asp Pro Arg Glu Ile Pro Asp Val Ile Thr Gln Ala Ile Ser Glu Leu
145 150 155 160
Arg Leu Ala Gly Val Asp Gly Pro Tyr Ser Val Leu Leu Ser Ala Asp
165 170 175
Val Tyr Thr Lys Val Ser Glu Thr Thr Glu His Gly Tyr Pro Ile Leu
180 185 190
Glu His Ile Asp Arg Leu Val Pro Gly Asp Ile Ile Trp Ala Pro Ala
195 200 205
Ile Asp Gly Ala Phe Val Leu Thr Thr Arg Gly Gly Asp Phe Asp Leu
210 215 220
Gln Leu Gly Thr Asp Val Ser Ile Gly Tyr Thr Ser His Asp Ala Asp
225 230 235 240
Thr Val Gln Leu Tyr Leu Gln Glu Thr Leu Thr Phe Leu Cys Tyr Thr
245 250 255
Ala Glu Ala Ala Val Pro Leu Thr Ser
260 265

Claims (10)

1.一种检测羊副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis)的ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒包括混合包被抗原，所述混合包被抗原包括氨基酸序列如Sequence NO：1、Sequence NO：2、Sequence NO：3和Sequence NO：4所示的抗原。
2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，ELISA试剂盒的检测样品为5-7月龄羊血清。
3.一种检测羊副结核分枝杆菌的ELISA方法，其特征在于，所述ELISA方法包括：使用混合抗原作为包被抗原进行检测；所述混合抗原包括氨基酸序列如Sequence NO：1、SequenceNO：2、Sequence NO：3和Sequence NO：4所示的抗原。
4.根据权利要求3所述的ELISA方法，其特征在于，所述混合抗原作为包被抗原时，将4种抗原进行混合，所述4种抗原的浓度均为7.5-8.5μg/mL。
5.根据权利要求3或4所述的ELISA方法，其特征在于，所述待检测样品为羊血清。
6.根据权利要求3或4所述的ELISA方法，其特征在于，所述羊血清为5-7月龄羊血清。
7.根据权利要求3或4所述的ELISA方法，其特征在于，所述羊血清为绵羊血清。
8.根据权利要求5所述的ELISA方法，其特征在于，所述羊血清为1:80-120稀释的羊血清。
9.混合抗原在检测羊副结核分枝杆菌中的应用，其特征在于，所述混合抗原包括氨基酸序列如Sequence NO：1、Sequence NO：2、Sequence NO：3和Sequence NO：4所示的抗原。
10.混合抗原在制备检测羊副结核分枝杆菌试剂/试剂盒中的应用，其特征在于，所述混合抗原包括氨基酸序列如Sequence NO：1、Sequence NO：2、Sequence NO：3和SequenceNO：4所示的抗原。
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