CN101923091A

CN101923091A - 一种高敏感性的结核分枝杆菌的检测方法

Info

Publication number: CN101923091A
Application number: CN2010101750967A
Authority: CN
Inventors: 宋厚辉; 李然栋; 许成钢; 郑东霞
Original assignee: QINGDAO RUIJIE BIO-TECH Co Ltd
Current assignee: Qingdao batfi Technology Development Co.,Ltd.
Priority date: 2010-05-18
Filing date: 2010-05-18
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2030-05-18
Also published as: CN101923091B

Abstract

本发明公开了一种高敏感性的结核分枝杆菌的检测方法，其内容为：用纯化的三种结核分枝杆菌外膜蛋白Rv0899、Rv1973和Mce4B的重组蛋白作为抗原，制备酶联免疫吸附实验和免疫胶体金试剂盒的试剂，利用所述试剂盒检测结核病人或患病动物体内的结核抗体。本发明利用纯化的重组蛋白作为抗原，制备的酶联免疫吸附实验和免疫胶体金试剂，可用来检测结核病人或患病动物体内结核抗体。带有相应试剂的酶联免疫吸附实验试剂盒可以在2小时内给出检测结果，可以借助酶标仪判定结果。而带有相应试剂的免疫胶体金试剂盒则可以在5-15分钟内给出检测结果，无需任何仪器。

Description

一种高敏感性的结核分枝杆菌的检测方法

技术领域

本发明涉及一种高敏感性的结核分枝杆菌的检测方法，具体地讲是一种利用纯化的三种结核分枝杆菌外膜蛋白的重组蛋白作为抗原，制备酶联免疫吸附实验(ELISA)和免疫胶体金试剂盒中的试剂，用于检测结核病人或患病动物体内结核抗体的方法。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是引发肺结核的一种致病菌，在全球范围内每年大约新发920万病例，其中有170万人死于该病(世界卫生组织，2008)。据世界卫生组织(WHO)统计，全世界目前有1/3人口感染结核，其中我国结核阳性率居世界第二位。目前对该病的治疗主要依赖异烟肼、利福平等五种副作用非常强的抗结核药物，且疗程要半年之久。近10年来，随着多重耐药性结核杆菌的出现以及结核与HIV的混合感染，原有的抗生素药物对多重耐药性结核杆菌已经无效。为此，WHO制定了新的六点控制结核战略，目标是到2015年使全球结核负担大幅降低，在2050年之前根除结核。根据WHO最新统计数据，我国每年新发结核病例为94万例，病例总数约265万(WHO，2008)，其发病率和死亡率均居所有传染性疾病之首。由于结核为人兽共患，许多家养和野生动物均能感染和传播此病，为彻底根绝此病带来了很大的挑战。因此如何建立一种结核分枝杆菌的快速诊断方法至关重要。

目前对结核的检测，无论对动物体还是在人体上，都采用经典的结核菌素PPD(Purifiedprotein derivative)皮试法，接种结核菌素3-4天后根据皮肤肿胀(红斑)的程度判断是否感染。由于这一“金标准”(Gold standard)经常导致错误的结果，地域环境、物种类型等因素均有可能干扰判读，而且不能区分自然感染和接种疫苗引起的抗体，在国际上已受到质疑(Ameni et al.，2008；Kunst，2006；Singh，2006)。为此各国政府和科研人员都在努力寻找一种快速、灵敏、准确的结核检测方法。其中，通过检测血样中是否含有γ干扰素区分感染牛体内是否曾接种过卡介苗Mycobacterium bovis BCG(Baccille Calmette Guérin)已经在英国和局部地区得到使用(Sopp et al.，2008)。但是由于动物感染其它病毒也能诱导产生干扰素，因此检测γ干扰素的方法也只是初诊，不能作为唯一依据，还必须借助皮试才能判读动物是否感染。哈尔滨兽医研究所(Liu et al.，2007)采用间接ELSIA，利用重组抗原rM70-83-E6检测PPD阳性样本中的结核抗体，检出率仅为68.7％；西班牙学者采用PCR方法从确诊病例中检测结核(Parra et al.，2008)，检出率仅为80.64％。但是该方法对样品的前期处理非常苛刻，而且从样品中提取到分枝杆菌DNA非常困难；此外，分枝杆菌基因组GC含量高达66％，扩增目的片段本身，也具有一定难度。因此，诊断抗原的选择一直是结核诊断中的关键环节。

目前已经从结核分枝杆菌中鉴定了80余种外膜蛋白(Song et al.，2008)，并通过蛋白酶K实验、全细胞酶联免疫吸附实验和Western blot分析证明了Rv0899(OmpA)、Rv1973不仅暴露在细胞表面，而且1ng的重组蛋白即可与体内的抗体反应。Mce4B也是已鉴定的80余种膜蛋白之一，该蛋白仅在感染的后期或者活动期才得以表达(Kumar et al.，2003；Shimonoet al.，2003)。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题是，提供一种高敏感性的结核分枝杆菌的检测方法，以便快速、灵敏、准确的进行结核检测。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是，一种高敏感性的结核分枝杆菌的检测方法，其内容为：用纯化的三种结核分枝杆菌外膜蛋白Rv0899(OmpA)、Rv1973和Mce4B的重组蛋白作为抗原，制备酶联免疫吸附实验(ELISA)和免疫胶体金试剂盒的试剂，利用所述试剂盒检测结核病人或患病动物体内的结核抗体。

上述的结核分枝杆菌外膜蛋白Rv0899(OmpA)的重组蛋白命名为HHS01，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

上述的结核分枝杆菌外膜蛋白Rv1973的重组蛋白命名为HHS02，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

上述的结核分枝杆菌外膜蛋白Mce4B的重组蛋白命名为HHS03，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

一种酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒试剂，用上述纯化的HHS01、HHS02或HHS03重组蛋白经下列步骤制备：

a.将纯化的重组蛋白HHS01、HHS02或HHS03用碳酸盐缓冲液稀释，浓度为1ng-10μg/μL，用重组蛋白稀释液包被酶标板；

b.用特选蛋白水解物封闭酶标板；然后用磷酸盐缓冲液洗涤；

c.将酶标板真空无菌干燥后包装。该试剂可低温冷藏保存，保存期为半年以上；使用时按照试剂盒提供的说明书操作。

一种胶体金试纸条，用上述纯化的HHS01、HHS02或HHS03重组蛋白经下列步骤制备：

a.用柠檬酸钠将氯金酸还原成10-40nm的颗粒；

b.制备重组葡萄球菌蛋白A/G与胶体金标记物；

c.制备空白PVC背衬胶体金检测用试纸条，该试纸条PVC背衬的一端依次粘附样品垫(Sample pad)、结合垫(Conjugate pad)；PVC背衬的中间粘附硝酸纤维素膜或PVDF膜；PVC背衬另一端粘附吸水垫(Absorbent pad)；其中硝酸纤维素膜或PVDF膜上有两条线，分别为检测线(Test line)和控制线(Control line)；

d.用点膜机将蛋白A与胶体金标记物喷在PVC背衬胶体金检测用试纸条的结合垫上；将纯化的重组蛋白HHS01、HHS02或HHS03片段喷在硝酸纤维素膜或PVDF膜的检测线上；将鸡抗蛋白A抗体或相应的二抗喷在膜的控制线上；

e.将喷有样品的PVC背衬胶体金检测用试纸条干燥密封保存，冷藏备用。使用时按照试剂盒提供的说明书操作。

由于Rv1973仅存在于强毒结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中，在卡介苗(疫苗株，Mycobacterium bovis BCG)中不存在，因此可以将HHS02用作鉴别抗原区别宿主体内的抗体是由于接种了疫苗还是自然感染引起。Mce4B蛋白仅在感染的后期或者活动期才得以表达，因此可以将HHS03用作对患者分期。根据对Rv0899(OmpA)、Rv1973和Mce4B跨膜螺旋和抗原表位的分析结果，本发明中的重组蛋白，去除了各自冗长的非必需氨基酸序列，并将其抗原表位拼接而成，且在每个蛋白的C末端添加了6xHis标签并对密码子进行了优化。本发明利用纯化的重组蛋白作为抗原，制备的酶联免疫吸附实验(ELISA)和免疫胶体金试剂，可用来检测结核病人或患病动物体内结核抗体。带有相应试剂的酶联免疫吸附实验试剂盒可以在2小时内给出检测结果，主要用于实验室诊断，可以借助酶标仪判定结果。而带有相应试剂的免疫胶体金试剂盒则可以在5-15分钟内给出检测结果，无需任何仪器，主要用于临床大面积使用和筛选。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步详细说明。下列实施例仅供本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

检测结核抗体的酶联免疫吸附(ELISA)试剂的制备

1.将纯化的重组蛋白HHS01或HHS02或HHS03用碳酸盐缓冲液稀释成浓度为1ng-10μg/μL，包被96孔酶标板，每孔100μL；37℃反应1小时；所述碳酸盐缓冲液为10mM Na₂CO₃与NaHCO_3溶液，pH9.5；

2.采用3-5％酪蛋白、牛血清白蛋白、明胶或者脱脂奶粉封闭酶标板，每孔250μL；37℃反应1小时；

3.用PBST洗涤3次，所述PBST为80mM Na₂HPO₄，20mM NaH₂PO₄，100mM NaCl，0.1％Tween-20的混合液，其pH7.2-7.5；

4.将酶标板真空无菌、干燥包装。低温冷藏保存，保存期为半年以上；使用时按照说明书操作，如步骤5-9所述。该试剂盒可以检测人、牛、羊、兔、鼠、人等哺乳动物体内的结核抗体。

5.使用前将酶标板拿到室温，打开包装。将待检测样品用PBST稀释或者不经过稀释，加入酶标板中，所述样品为结核病人或动物的血清。阴性对照血清为正常健康动物血清，阳性血清为免疫HHS01或HHS02或HHS03蛋白得到的兔子或者小鼠血清；每孔100μL；37℃反应1小时；应在8SL3以上级别实验室或者生物安全柜中进行与结核病人或动物血清有关的诊断实验；

6.用PBST洗涤酶标板3-6次；

7.加入PBST稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的重组葡萄球菌蛋白A/G抗体，该抗体可以与牛、羊、兔、鼠、人等哺乳动物体内的IgG反应。也可以根据需要检测的结核动物抗体，选择利用HRP标记的羊抗人、羊抗牛、兔抗羊、羊抗兔、羊抗鼠等抗体作为二抗；每孔100μL；37℃反应30分钟；

8.用PBST洗涤酶标板3-6次；

9.加入邻苯二胺或者TMB显色液体；根据颜色反应判定结果。也可利用1M硫酸终止反应，利用酶标仪读取492nm吸收值。如果酶标板阴性血清孔内颜色为无色，而样阳性孔和待检血清孔内液体变黄，说明待检血清为结核抗体阳性。通过酶标仪492nm的数值判读依据如下：如果阳性血清的吸收值除以阴性血清的吸收值大于或者等于4，且待检样品血清的吸收值除以阴性性血清的吸收值也大于或者等于4，则判定为待检血清样品结核抗体为阳性。如果待检血清和重组蛋白HHS01反应，说明体内存在结核抗体。如果待检血清和重组蛋白HHS01、HHS02反应，说明体内的抗体是由于自然感染引起。如果待检血清和重组蛋白HHS01、HHS02、HHS03均反应，提示该样品对应的病人或者患病动物可能处于结核活动期或者晚期。

实施例2

检测结核抗体的胶体金试纸条试剂的制备

1.将0.5-2％的柠檬酸钠加入0.01％氯金酸(HAuCl₄)中，边加边搅拌，90℃煮15分钟，得到10-40nm颗粒的胶体金溶液；

2.制备重组葡萄球菌蛋白A/G与胶体金标记物：用0.01-0.1M碳酸钾将冷却到室温的胶体金溶液调到pH6.5左右，将重组葡萄球菌蛋白A/G缓缓加入胶体金溶液中混匀，室温反应0.5-1h。然后向反应液中加入终浓度1％的牛血清白蛋白作为稳定剂，4℃高速离心30分钟浓缩。用1％的BSA洗涤3-6次得到纯化的重组葡萄球菌蛋白A/G与胶体金标记物。将标记物悬浮于1-10mM的1％BSA和0.01％叠氮钠中；

3.制备空白PVC背衬胶体金检测用试纸条：该试纸条PVC背衬的一端依次粘附样品垫、结合垫；PVC背衬的中间粘附硝酸纤维素膜或PVDF膜；PVC背衬另一端粘附吸水垫；其中硝酸纤维素膜或者PVDF膜有两条线，分别为检测线和控制线；

4.用点膜机将蛋白A与胶体金标记物喷在PVC背衬胶体金检测用试纸条的结合垫上；将纯化的重组蛋白HHS01或者HHS02或者HHS03片段喷在硝酸纤维素膜或PVDF膜的检测线上；将鸡抗蛋白A抗体喷在膜的控制线上，也可以根据需要检测的人、牛、羊、兔、鼠等抗体，选择羊抗人、羊抗牛、兔抗羊、羊抗兔、羊抗鼠抗体喷在膜的控制线上；利用2-5％的脱脂奶粉、明胶等将膜上未结合的位点封闭；用PBST洗膜3-6次，真空干燥。

5.其中步骤3和4不分先后顺序，可以先粘附后喷样，也可以先喷样后粘附；

6.将喷有样品的PVC背衬胶体金检测用试纸条干燥密封保存，冷藏备用。

使用前将试纸条拿到室温打开包装。往加样孔中加入待检血清，根据检测线和控制线的颜色判定结果。如果检测线和控制线均出现紫红色，说明结核抗体阳性；如果检测线无色，而控制线出现紫红色，说明结核抗体阴性；如果控制线无色，说明试纸条无效。如果待检血清和重组蛋白HHS01试纸条反应，说明体内存在结核抗体。如果待检血清分别和重组蛋白HHS01、HHS02试纸条反应，说明体内的抗体是由于自然感染引起。如果待检血清和重组蛋白HHS01、HHS02、HHS03试纸条均反应，提示该样品对应的病人或者患病动物可能处于结核活动期或者晚期。

序列表

<110>青岛瑞杰生物科技有限公司

<120>一种高敏感性的结核分枝杆菌的检测方法

<141>2009-05-01

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>870

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Synthetic construct

<400>1

atgattggct atggcgcgtt tgaacgcccg cagagcgtga ccggcccgac cggcgtgctg 60

ccgaccctga ccccgaccag cacccgcggc gcgagcgcgc tgagcctgag cctgctgagc 120

attagccgca gcggcaacac cgtgaccctg attggcgatt ttccggatga agcggcgaaa 180

gcggcgctga tgaccgcgct gaacggcctg ctggcgccgg gcgtgaacgt gattgatcag 240

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ccggatatga aaattgtgaa caacattgaa gtgaccggcc aggcgccgcc gggcccgccg 480

gcgagcggcc cgtgcgcgga tctgcagagc gcgattaacg cggtgaccgg cggcccgatt 540

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gcggataaac tgaaagcgtg cccggatgcg cgcgtgacca ttaacggcta taccgataac 660

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tatctggtgg cgcgcggcgt ggcgggcgat catattgcga ccgtgggcct gggcagcgtg 780

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gtggtgaacc atcatcatca tcatcattaa 870

<210>2

<211>289

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Synthetic construct

<400>2

Met Ile Gly Tyr Gly Ala Phe Glu Arg Pro Gln Ser Val Thr Gly Pro

1 5 10 15

Thr Gly Val Leu Pro Thr Leu Thr Pro Thr Ser Thr Arg Gly Ala Ser

20 25 30

Ala Leu Ser Leu Ser Leu Leu Ser Ile Ser Arg Ser Gly Asn Thr Val

35 40 45

Thr Leu Ile Gly Asp Phe Pro Asp Glu Ala Ala Lys Ala Ala Leu Met

50 55 60

Thr Ala Leu Asn Gly Leu Leu Ala Pro Gly Val Asn Val Ile Asp Gln

65 70 75 80

Ile His Val Asp Pro Val Val Arg Ser Leu Asp Phe Ser Ser Ala Glu

85 90 95

Pro Val Phe Thr Ala Ser Val Pro Ile Pro Asp Phe Gly Leu Lys Val

100 105 110

Glu Arg Asp Thr Val Thr Leu Thr Gly Thr Ala Pro Ser Ser Glu His

115 120 125

Lys Asp Ala Val Lys Arg Ala Ala Thr Ser Thr Trp Pro Asp Met Lys

130 135 140

Ile Val Asn Asn Ile Glu Val Thr Gly Gln Ala Pro Pro Gly Pro Pro

145 150 155 160

Ala Ser Gly Pro Cys Ala Asp Leu Gln Ser Ala Ile Asn Ala Val Thr

165 170 175

Gly Gly Pro Ile Ala Phe Gly Asn Asp Gly Ala Ser Leu Ile Pro Ala

180 185 190

Asp Tyr Glu Ile Leu Asn Arg Val Ala Asp Lys Leu Lys Ala Cys Pro

195 200 205

Asp Ala Arg Val Thr Ile Asn Gly Tyr Thr Asp Asn Thr Gly Ser Glu

210 215 220

Gly Ile Asn Ile Pro Leu Ser Ala Gln Arg Ala Lys Ile Val Ala Asp

225 230 235 240

Tyr Leu Val Ala Arg Gly Val Ala Gly Asp His Ile Ala Thr Val Gly

245 250 255

Leu Gly Ser Val Asn Pro Ile Ala Ser Asn Ala Thr Pro Glu Gly Arg

260 265 270

Ala Lys Asn Arg Arg Val Glu Ile Val Val Asn His His His His His

275 280 285

His

<210>3

<211>1221

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>synthetic construct

<400>3

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ctgtgcgtgc agtatctggc gccgattgtg aaaaaccgcc agtataacta tccgccgctg 720

ggcgcgaacc tgtttgtggg cgcgcaggcg cgcccgaacg aagtgaccta tagcgaagat 780

tggctgcgcc cggattatgt ggcgccggtg gcggataccc cgccggatcc ggcggcggcg 840

gtgaccgtgg atccggcgac cggcctgcgc ggcatgatga tgccgccggg cggcggcagc 900

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<210>4

<211>406

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Synthetic construct

<400>4

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20 25 30

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35 40 45

Gly Thr Phe Leu Asp Ala Tyr Thr Gln Leu Thr His Asp Val Val Ile

50 55 60

Pro Gly Ala Gln Gln Lys Gln Ile Ser Ala Val Ala Thr Val Ala Ala

65 70 75 80

Ala Ala Ser Val Ser Thr Ser Ala Asp Arg Ala Val Val Leu Leu Phe

85 90 95

Val Asn Gln Thr Ile Thr Val Gly Lys Asp Ala Pro Thr Thr Ala Ala

100 105 110

Ser Ser Val Arg Val Thr Leu Asp Asn Ile Asn Gly Arg Trp Ser Arg

115 120 125

Ala Arg Leu Ser Ala Gly Ala Val Leu His Ser Lys Asn Val Ser Thr

130 135 140

Glu Ile Asn Thr Val Phe Glu Asn Val Val Asp Leu Leu Asn Met Ile

145 150 155 160

Asp Pro Leu Lys Leu Asn Ala Val Leu Thr Ala Val Ala Asp Ala Val

165 170 175

Arg Gly Gln Gly Glu Arg Ile Gly Gln Ala Thr Thr Asp Leu Asn Glu

180 185 190

Val Leu Glu Ala Leu Asn Ala Arg Gly Asp Thr Ile Gly Gly Asn Trp

195 200 205

Arg Ser Ser Arg Leu Gly Gly Glu Gln Ala Ala Lys Leu Cys Val Gln

210 215 220

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Gly Ala Asn Leu Phe Val Gly Ala Gln Ala Arg Pro Asn Glu Val Thr

245 250 255

Tyr Ser Glu Asp Trp Leu Arg Pro Asp Tyr Val Ala Pro Val Ala Asp

260 265 270

Thr Pro Pro Asp Pro Ala Ala Ala Val Thr Val Asp Pro Ala Thr Gly

275 280 285

Leu Arg Gly Met Met Met Pro Pro Gly Gly Gly Ser Ala Gln Gln Arg

290 295 300

Arg Ile Pro Thr Phe Glu Asp Tyr Pro Asp Arg Pro Ala Gly Asp Leu

305 310 315 320

Tyr Cys Arg Val Pro Gln Asp Ser Pro Phe Asn Val Arg Gly Ala Arg

325 330 335

Asn Ile Pro Cys Glu Thr Val Pro Gly Lys Arg Ala Pro Thr Val Lys

340 345 350

Leu Cys Glu Ser Asp Ala Pro Tyr Leu Pro Leu Asn Asp Gly Tyr Asn

355 360 365

Trp Lys Gly Asp Pro Asn Ala Thr Val Pro Gly Leu Gly Ser Gly Gln

370 375 380

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385 390 395 400

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405

<210>5

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<220>

<223>Synthetic construct

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<210>6

<211>544

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Synthetic construct

<400>6

Met Ala Ser Arg Leu Lys Ala Gly Gln Lys Val Arg Ile Ala Gly Val

1 5 10 15

Pro Val Gly Ser Val Lys Ala Val Lys Leu Asn Pro Asp His Ser Ile

20 25 30

Asp Val Ala Phe Ala Ile Asp Arg Ser Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Thr

35 40 45

Arg Ala Val Ile Arg Tyr Glu Asn Leu Val Gly Asp Arg Phe Leu Glu

50 55 60

Ile Thr Ser Gly Pro Gly Glu Leu Arg Lys Leu Pro Pro Gly Gly Thr

65 70 75 80

Ile Asn Val Ala His Thr Gln Pro Ala Leu Asp Leu Asp Ala Leu Leu

85 90 95

Gly Gly Leu Arg Pro Val Leu Lys Gly Phe Asp Ala Asp Lys Ile Asn

100 105 110

Thr Ile Thr Ser Ala Val Ile Glu Leu Leu Gln Gly Gln Gly Gly Pro

115 120 125

Leu Ala Asn Val Leu Ala Asp Thr Gly Ala Phe Ser Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Ala Arg Asp Gln Leu Ile Gly Glu Val Ile Thr Asn Leu Asn Ala Val

145 150 155 160

Leu Ala Thr Val Asp Ala Lys Ser Ala Gln Phe Ser Ala Ser Val Asp

165 170 175

Gln Leu Gln Gln Leu Val Ser Gly Leu Ala Lys Asn Arg Asp Pro Ile

180 185 190

Ala Gly Ala Ile Ser Pro Leu Ala Ser Thr Thr Thr Asp Leu Thr Glu

195 200 205

Leu Leu Arg Asn Ser Arg Arg Pro Leu Gln Gly Ile Leu Glu Asn Ala

210 215 220

Arg Pro Leu Ala Thr Glu Leu Asp Asn Arg Lys Ala Glu Val Asn Asn

225 230 235 240

Asp Ile Glu Gln Leu Gly Glu Asp Tyr Leu Arg Leu Ser Ser Ala Asn

245 250 255

Leu Asp Gln Thr Leu Gly Thr Leu Asn Gln Ala Leu Ser Asp Ile Arg

260 265 270

Gly Phe Leu Arg Glu Asn Asn Ser Thr Leu Ile Glu Thr Val Asn Gln

275 280 285

Leu Asn Asp Phe Ala Gln Thr Leu Ser Asp Gln Ser Glu Asn Ile Glu

290 295 300

Gln Val Leu His Val Ala Gly Pro Gly Ile Thr Asn Phe Tyr Asn Ile

305 310 315 320

Tyr Asp Pro Ala Gln Gly Thr Leu Asn Gly Leu Leu Ser Ile Pro Asn

325 330 335

Phe Ala Asn Pro Val Gln Phe Ile Cys Gly Gly Ser Phe Asp Thr Ala

340 345 350

Ala Gly Pro Ser Ala Pro Asp Tyr Tyr Arg Arg Ala Glu Ile Cys Arg

355 360 365

Glu Arg Leu Gly Pro Val Leu Arg Arg Leu Thr Val Asn Tyr Pro Pro

370 375 380

Ile Met Phe His Pro Leu Asn Thr Ile Thr Ala Tyr Lys Gly Gln Ile

385 390 395 400

Ile Tyr Asp Thr Pro Ala Thr Glu Ala Lys Ser Glu Thr Pro Val Pro

405 410 415

Glu Leu Thr Trp Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Gln Asp Glu Gly Ala

420 425 430

Lys Leu Asp Phe Lys Ile Asp Leu His Asp Pro Pro Pro Cys Met Thr

435 440 445

Gly Phe Leu Pro Pro Pro Leu Val Arg Ser Pro Ala Asp Glu Ser Val

450 455 460

Arg Glu Ile Pro Arg Asp Met Tyr Cys Lys Thr Ala Gln Asn Asp Pro

465 470 475 480

Ser Thr Val Arg Gly Ala Arg Asn Tyr Pro Cys Gln Glu Phe Pro Gly

485 490 495

Lys Arg Ala Pro Thr Val Gln Leu Cys Arg Asp Pro Arg Gly Tyr Val

500 505 510

Pro Val Gly Thr Asn Pro Trp Arg Gly Pro Pro Ile Pro Tyr Gly Thr

515 520 525

Glu Val Thr Asp Gly Arg Asn Ile Leu His His His His His His His

530 535 540

Claims

1.一种高敏感性的结核分枝杆菌的检测方法，其内容为：用纯化的三种结核分枝杆菌外膜蛋白Rv0899、Rv1973和Mce4B的重组蛋白作为抗原，制备酶联免疫吸附实验和免疫胶体金试剂盒的试剂，利用所述试剂盒检测结核病人或患病动物体内的结核抗体。

2.一种权利要求1中所述的结核分枝杆菌外膜蛋白Rv0899的重组蛋白，命名为HHS01，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种权利要求1中所述的结核分枝杆菌外膜蛋白Rv1973的重组蛋白，命名为HHS02，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

4.一种权利要求1中所述的结核分枝杆菌外膜蛋白Mce4B的重组蛋白，命名为HHS03，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

5.一种酶联免疫吸附实验试剂盒试剂，用纯化的HHS01、HHS02或HHS03经下列步骤制备：

c.将酶标板真空无菌干燥后包装。

6.一种胶体金试纸条，用纯化的HHS01、HHS02或HHS03经下列步骤制备：

a.用柠檬酸钠将氯金酸还原成10-40nm的颗粒；

b.制备重组葡萄球菌蛋白A/G与胶体金标记物；

c.制备空白PVC背衬胶体金检测用试纸条，该试纸条PVC背衬的一端依次粘附样品垫、结合垫；PVC背衬的中间粘附硝酸纤维素膜或PVDF膜；PVC背衬另一端粘附吸水垫；其中硝酸纤维素膜或PVDF膜上有两条线，分别为检测线和控制线；