CN105759037A - 一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法 - Google Patents

一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，包括如下步骤：取待检样品和金标抗体混合，将混合后的样品通过副结核分歧杆菌抗原所在的区域，观察副结核分歧杆菌抗原所在区域的显色情况，所述检测方法在胶体金试纸条上进行，且所述胶体金试纸条上依次设有用于放置待检样品的样品垫、设有金标抗体的胶体金结合垫和设有副结核分歧杆菌抗原的检测线，该检测方法具有较强的特异性与灵敏度，且检测成本低，方法便捷，适合在畜牧业（养牛）进行大力推广。

Description

一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法
技术领域
本发明涉及生物抗体检测领域，具体涉及一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法。
背景技术
副结核分歧杆菌是一种放线菌，它主要能引起家畜，尤其是牛（特别是乳牛）感染产生副结核病，它主要在牛肠道中繁殖，导致牛肠粘膜下层产生大量类上皮样细胞，使组织增生，增厚，形成皱褶，同时肠粘膜腺体受到压迫而致萎缩，从而使病畜消瘦，眼窝下陷，经常躺卧，营养高度不良，皮肤粗糙，被毛松乱，下颌及垂皮可见水肿，最后因全身衰弱死亡。
因其有以上致病机理，副结核分歧杆菌对畜牧业发展有较大影响，而现有技术对该菌的检测手段有限。
因此，开发出一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法具有较好的应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，包括如下步骤：取待检样品和金标抗体混合，将混合后的样品通过副结核分歧杆菌抗原所在的区域，观察副结核分歧杆菌抗原所在区域的显色情况。
采用上述方案，当样品里面含有副结核分歧杆菌抗体时，它会作为抗原与金标抗体发生特异性结合，形成副结核分歧杆菌抗体-二抗-金颗粒复合物A，当复合物A在通过副结核分歧杆菌抗原所在的区域时，这种复合物A中的副结核分歧杆菌抗体会与副结核分歧杆菌抗原发生特异性结合，形成副结核分歧杆菌抗原-副结核分歧杆菌抗体-二抗-金颗粒复合物B，当复合物B在副结核分歧杆菌抗原所在区域越聚越多时，该区域的金颗粒就会越聚越多从而使该区域变成肉眼可见的红色；若样品里面不含有副结核分歧杆菌抗体，则副结核分歧杆菌抗原所在的区域不会形成复合物B，该区域就不会发生金颗粒聚集的情况从而不会发生颜色变化；因此，可根据副结核分歧杆菌抗原所在的区域的颜色变化来定性检测出待检样品中是否含有副结核分歧杆菌抗体。
作为优选，所述检测方法在胶体金试纸条上进行，且所述胶体金试纸条上依次设有用于放置待检样品的样品垫、设有金标抗体的胶体金结合垫和设有副结核分歧杆菌抗原的检测线。
采用上述方案，胶体金试纸条可按恒定的标准来批量生产，其质量可控且稳定，从而减少试验过程中试验变量（如检测人员、环境或设备等）对检测结果的影响；其次，由于胶体金试纸条的批量生产，检测人员无须现配现做，从而降低检测劳动力和成本；另外，其小巧轻便，方便检测人员携带和使用。
作为优选，所述胶体金试纸条由如下步骤制备得到：
（1）制备样品垫：采用纤维素滤纸作为样品垫；
（2）制备胶体金结合垫：将金标抗体喷在玻璃纤维上，室温烘干；
（3）制备检测线：将偶联副结核分歧杆菌MAP1588C抗原-BSA用pH=7.4且浓度为0.01mol/L的PBS溶液稀释至0.4mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，室温烘干；
（4）组装：将按步骤（1）制备得到的样品垫、步骤（2）制备得到的胶体金结合垫和步骤（3）制备得到的硝酸纤维膜按顺序放置并固定在聚氯乙烯板上；
（5）切片，将按步骤（4）组装好的聚氯乙烯板切割，即得。
采用上述方案，纤维素滤纸可快速将样品完全吸收后向后面金标抗体所在的玻璃纤维进行扩散，带动金标抗体经过硝酸纤维膜上的检测线，硝酸纤维膜对MAP1588C抗原蛋白有很好的包被固定作用，抗原蛋白不会在硝酸纤维膜上发生移动，从而使显色反应范围固定成一条直线，便于观察，同时将包被的副结核分歧杆菌MAP1588C抗原-BSA浓度控制为0.4mg/ml，可以使检测线不会因为包被蛋白过多而出现“堵金”现象，也不会因为包被蛋白过少，而出现检测线结果较淡的情况。此外聚氯乙烯板可对整个试纸条起到支撑作用。同时由于胶体金试纸条是由不同构件组成，可将不同构件批量生产后组装，可确保检测效果批间稳定。
作为优选，所述检测线上远离胶体金结合垫的一侧设有吸水纸，所述吸水纸设在胶体金试纸条上。
采用上述方案，吸水纸与待检样品之间具有一定的吸力，其可促进待检样品向着吸水纸方向运动并依次通过胶体金结合垫和硝酸纤维膜，保证样品能完全经过检测线。
作为优选，所述金标抗体由如下方法制备得到：
（1）胶体金溶液的制备：取质量浓度为0.008-0.010%的氯金酸水溶液，加热至沸腾，立即加入质量浓度为0.08-0.1%的柠檬酸三钠水溶液；至溶液的颜色完全变为透明的酒红色时，停止加热并冷却至室温，低温贮存；其中所述氯金酸和柠檬酸三钠的质量用量比为1：3-4；
（2）鼠抗牛IgG的制备：取牛血清IgG抗原混合弗氏不完全佐剂后免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠SP2/0骨髓瘤细胞和脾细胞进行融合；筛选出稳定分泌抗牛血清IgG单克隆抗体的阳性细胞株，然后注射细胞进小鼠体内诱生腹水；取2ml鼠抗牛IgG腹水加入4ml浓度为0.06mol/LpH5.0的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，于室温搅拌下逐滴缓慢加入辛酸；按每毫升稀释前的腹水加入33μl并搅拌，低温静置后低温离心，取上清液，上清液经过滤后加入1/10体积的PBS(pH7.4)，冰浴下加入0.277g/ml的硫酸铵，静置后低温离心，弃上清，沉淀溶于0.01mol/LPBS中进行透析；
（3）金标抗体的制备：取步骤（1）制备的胶体金溶液，加入K2CO3调节其pH为8.2，搅拌均匀，缓慢滴加步骤（2）制备的鼠抗牛IgG溶液，搅拌条件下依次加入1%PEG和10%BSA溶液；搅拌均匀，低温低速离心取上清液低温高速离心，吸去上清后用缓冲液重悬沉淀；其中，所述胶体金和鼠抗牛IgG体积的比例为100:2-3。
采用上述方案，在胶体金溶液的制备中，将氯金酸和柠檬酸三钠的质量用量比控制为1：3-4，可保证胶体金粒直径在40nm左右，形成均匀一致的胶体金溶液，从而可保证最终在试纸条上能产生足够的显色信号供检测人员辨认；在金标抗体的制备过程中，将胶体金和鼠抗牛IgG体积的比例控制为100:2-3，可保证与之结合的鼠抗牛IgG均匀包被，确保金标抗体的稳定性和特异性。
作为优选，所述副结核分歧杆菌MAP1588C抗原由如下方法制备得到：从副结核分歧杆菌基因组中扩增出MAP1588C基因片段，插入原核表达载体pET-28b（＋），转化至大肠杆菌BL21（DE3），在0.5mmol/L的IPTG诱导下进行表达；利用融合蛋白的组氨酸标签进行亲和层析纯化重组蛋白。
采用上述方案，PCR扩增的手段制作副结核分歧杆菌MAP1588C抗原蛋白，相比采用常规的细胞裂解法从副结核分歧杆菌分离出菌体蛋白，具有更高的特异性及灵敏度，可最大程度保证其抗原性。
作为优选，所述待检样品的制备过程为：取待检牛血液1ml，于室温下自然凝集，然后分离血凝块并离心,取上层血清加入生理盐水即得所述待检样品，其中所述上层血清和生理盐水的体积比为1：4-5。
采用上述方案，上层血清和生理盐水的体积比为1：4-5，可使血清稀释，可减弱血清中其他抗体与金标抗体之间的特异性反应，从而使检测线处的阳性反应更明显。
作为优选，所述胶体金试纸条硝酸纤维膜上检测线和吸水纸之间设有用于放置兔抗鼠IgG抗体的质控线，所述质控线和检测线之间的距离为3mm。
采用上述方案，当待检样品带动金标抗体经过质控线时，在质控线处会形成兔抗鼠IgG-鼠抗牛IgG-金颗粒复合物，金颗粒越积越多会使质控线变红，从而根据质控线是否变红可判断待检样品是否经过检测线，进一步确保了检测结果的可靠性。
作为优选，所述兔抗鼠IgG抗体的制备过程为：取BALB/c小鼠血清IgG抗原与佐剂混合乳化后，取1ml对新西兰大白兔进行多点皮内、皮下和肌肉注射，免疫3-4次，间隔1-3周；然后对大白兔进行颈动脉采血，血液凝固，血清析出后，及时离心收集血清，即可得到兔抗鼠IgG抗体。
采用上述方案，操作简单，能一次性收集大量的特异性强、亲和力高和效价高的兔抗鼠IgG抗体。
作为优选，所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，取配好的待检样品，滴加在胶体金试纸条上的样品垫上，在胶体金试纸条和吸水纸的作用下，待检样依次通过金标抗体、检测线和质控线。
采用上述方案，当样品里面含有副结核分歧杆菌抗体时，它会作为抗原与金标抗体发生特异性结合，形成副结核分歧杆菌抗体-鼠抗牛IgG-金颗粒复合物A，当复合物A在通过副结核分歧杆菌抗原所在的区域时，这种复合物A中的副结核分歧杆菌抗体会与副结核分歧杆菌抗原发生特异性结合，形成副结核分歧杆菌抗原-副结核分歧杆菌抗体-鼠抗牛IgG-金颗粒复合物B，当复合物B在副结核分歧杆菌抗原所在区域越聚越多时，该区域的金颗粒就会越聚越多从而使该区域变成肉眼可见的红色，同时待检样品带动金标抗体经过质控线时，在质控线处会形成兔抗鼠IgG-鼠抗牛IgG-金颗粒复合物，金颗粒越积越多会使质控线变红，故当检测线和质控线都变红时，检测结果为阳性；若样品里面不含有副结核分歧杆菌抗体，则副结核分歧杆菌抗原所在的区域不会形成复合物B，该区域就不会发生金颗粒聚集的情况从而不会发生颜色变化，同时待检样品带动金标抗体经过质控线时，在质控线处会形成兔抗鼠IgG-鼠抗牛IgG-金颗粒复合物，金颗粒越积越多会使质控线变红，故当检测线不变色，质控线变为红色时，检测结果为阴性；若质控线不变色，不管检测线是否变红，实验无效。
综上所述，该副结核分歧杆菌抗体的检测方法具有如下优点：
（1）灵敏度高，灵敏度能达到5ng/ml；
（2）特异性强,只对牛副结核病阳性血清样本起阳性反应；
（3）性质稳定，4℃保存1年仍能正常使用；
（4）成本低、操作简便，无需专业人员操作，5-10分钟便可得到实验结果，相比用牛副结核分歧杆菌抗体ELISA试剂盒检测费时、昂贵、且需专业人员借助实验仪器操作的特点更具优势。
故该副结核分歧杆菌抗体的检测方法具有较好的实用性及可操作性，适合在畜牧业（养牛）进行大力推广。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1：
一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，包括如下步骤：
步骤1.胶体金溶液的制备：取5ml1%氯金酸溶液加入495ml超纯水，再转移到烧瓶中进行加热，煮沸后立即加入15ml1%柠檬酸三钠溶液，溶液的颜色由黑色→紫色→深蓝→酒红色，当溶液的颜色完全变为透明的酒红色时，继续回流3min后停止加热，冷却至室温，冰箱4℃贮存。
步骤2.鼠抗牛IgG的制备：取牛血清IgG抗原混合弗氏不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠SP2/0骨髓瘤细胞和脾细胞进行融合，筛选出稳定分泌抗牛血清IgG单克隆抗体的阳性细胞株，然后注射细胞进小鼠体内诱生腹水，取2ml鼠抗牛IgG腹水加入4ml浓度为0.06mol/LpH5.0的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5。于室温搅拌下逐滴缓慢加入辛酸，按每毫升稀释前的腹水加33μl搅拌30min，4℃静置2h。4℃10000r/min离心30min，取上清液。上清液经砂芯漏斗过滤，加入1/10体积的PBS(pH7.4)，在4℃冰浴下加入0.277g/ml的硫酸铵，静置2h，4℃10000r/min，离心15min，弃上清，沉淀溶于0.01mol/LPBS中进行透析。
步骤3.金标抗体的制备：取10ml胶体金，用0.2mol/LK2CO3调pH为8.2，用磁力搅拌器均匀搅拌，同时缓慢滴加0.3ml步骤2所得溶液，继续搅拌30min。加入适量1%PEG,继续搅拌15min，加入10%BSA溶液，使终浓度为1%，继续搅拌15min。4℃1500r/min离心10min，取上清。4℃6000r/min离心30min，小心吸去上清，缓冲液重悬沉淀。
步骤4.副结核分歧杆菌MAP1588C抗原的制备：
（1）引物设计：从GenBank上选取MAP的相关基因序列，用DNAStar分析MAP1588C基因表达产物的亲水性状和抗原性，该基因产物全长均有很好的亲水性和抗原性，因而设计引物扩增基因全长，引物序列1588-F：5'-catGGATCCgagcgtcgagaatctcaagg-3'和1588-R：5'-gacGAATTCgtctgggaggcgacgatc-3'，大写部分为限制性内切酶位点BamHI和EcoRI；
（2）MAP1588C基因的扩增与克隆：提取MAPK-10的基因组DNA，进行PCR扩增，反应程序为：2×PCRMix25μL，引物（20μmol/L）各1μL，DNA模板2μL，加灭菌ddH2O至50μL，反应程序为：94℃预变性1min，每次循环中94℃变性30s，57.5℃退火30s，72℃延伸45s，共循环30次，最后72℃延伸10min，扩增产物经电泳、纯化、双酶切、电泳，回收特异性目的片段，与同样酶切处理的原核表达载体pET-28b（＋）连接，转化E.coliDH5α感受态细胞，筛选含重组质粒p28b-MAP8的阳性克隆，经PCR和双酶切鉴定后，转化子送华大基因公司对重组质粒的插入片段进行测序，进一步验证重组质粒序列的正确性；
（3）重组蛋白的表达及纯化：构建好的重组转化E.coliBL21（DE3）感受态细胞，挑取单克隆，接种于含卡那霉素抗生素的LB培养基，37℃振摇培养过夜，将过夜培养物转接至新鲜的LB抗性培养基，培养至对数生长期（A600为0.6-0.8），加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，22℃诱导16h后离心收集菌体，菌体沉淀用含5mmol/L咪唑的20mmol/LTris缓冲液重悬，超声裂解，裂解产物13000×g离心20min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，按照Novagen的Ni-NTAHis-BindResin亲和柱纯化的操作步骤，从裂解液中纯化重组蛋白，既得。
步骤5.兔抗鼠IgG抗体的制备：取BALB/c小鼠血清IgG抗原与佐剂混合乳化后，取1ml对新西兰大白兔进行多点皮内、皮下和肌肉注射，免疫3-4次，间隔1-3周；然后对大白兔进行颈动脉采血，血液凝固，血清析出后，及时离心收集血清，即可得到兔抗鼠IgG抗体。
步骤6.喷金及胶体金试纸条的组装：将步骤3所得的副结核分歧杆菌抗原蛋白标记的胶体金溶液按5-10μl/cm的喷量喷在玻璃纤维（胶体金结合垫）上，室温干燥2h。偶联步骤4所得的抗原副结核分歧杆菌MAP1588C抗原-BSA用0.01mol/LPBS(pH7.4)稀释至0.4mg/ml，喷于硝酸纤维膜(NC膜)上，室温干燥2h，此为检测线（T线）。在离检测线3mm处喷上步骤5所得兔抗鼠IgG(0.5mg/ml)，此为质控线（C线）。在聚氯乙烯板上依次将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜（T线在靠近胶体金结合垫的一端）和吸水纸进行组装，再切割成4mm宽的试纸条，得到用于检测副结核分歧杆菌抗体的胶体金试纸条。
步骤7.胶体金试纸条使用方法：用移液管吸取待检样品100-150μl滴入到胶体金试纸条的样品垫上，滴加样品后开始计时，3分钟时开始观察，15分钟后终止观察，若T线C线都显红色，则测试结果为阳性，若T线不显色，C线显红色，则测试结果为阴性，若C不显色，无论T是否显色，测试结果都为无效。
步骤8.胶体金试纸条灵敏度检测：分别用所制胶体金试纸条及于上海岚派生物科技有限公司购买的牛副结核分歧杆菌抗体（M.ptAb）ELISA试剂盒对购于中国兽药监察所的牛副结核病标准阳性血清做对比试验，测得试纸条的灵敏度可达到5ng/ml，且相比用牛副结核分歧杆菌抗体ELISA试剂盒检测方法，胶体金试纸条具有操作简单、检测快捷及无需其他仪器辅助的优势。
实施例2：
一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，包括如下步骤：
步骤1.胶体金溶液的制备：取5ml1%氯金酸溶液加入495ml超纯水，再转移到烧瓶中进行加热，煮沸后立即加入15ml1%柠檬酸三钠溶液，溶液的颜色由黑色→紫色→深蓝→酒红色，当溶液的颜色完全变为透明的酒红色时，继续回流3min后停止加热，冷却至室温，冰箱4℃贮存。
步骤2.鼠抗牛IgG的制备：取牛血清IgG抗原混合弗氏不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠SP2/0骨髓瘤细胞和脾细胞进行融合，筛选出稳定分泌抗牛血清IgG单克隆抗体的阳性细胞株，然后注射细胞进小鼠体内诱生腹水，取2ml鼠抗牛IgG腹水加入4ml浓度为0.06mol/LpH5.0的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5。于室温搅拌下逐滴缓慢加入辛酸，按每毫升稀释前的腹水加33μl搅拌30min，4℃静置2h。4℃10000r/min离心30min，取上清液。上清液经砂芯漏斗过滤，加入1/10体积的PBS(pH7.4)，在4℃冰浴下加入0.277g/ml的硫酸铵，静置2h，4℃10000r/min，离心15min，弃上清，沉淀溶于0.01mol/LPBS中进行透析。
步骤3.金标抗体的制备：取10ml胶体金，用0.2mol/LK2CO3调pH为8.2，用磁力搅拌器均匀搅拌，同时缓慢滴加0.2ml步骤2所得溶液，继续搅拌30min。加入适量1%PEG,继续搅拌15min，加入10%BSA溶液，使终浓度为1%，继续搅拌15min。4℃1500r/min离心10min，取上清。4℃6000r/min离心30min，小心吸去上清，缓冲液重悬沉淀。
步骤4.副结核分歧杆菌MAP1588C抗原的制备：
（1）引物设计：从GenBank上选取MAP的相关基因序列，用DNAStar分析MAP1588C基因表达产物的亲水性状和抗原性，该基因产物全长均有很好的亲水性和抗原性，因而设计引物扩增基因全长，引物序列1588-F：5'-catGGATCCgagcgtcgagaatctcaagg-3'和1588-R：5'-gacGAATTCgtctgggaggcgacgatc-3'，大写部分为限制性内切酶位点BamHI和EcoRI；
（2）MAP1588C基因的扩增与克隆：提取MAPK-10的基因组DNA，进行PCR扩增，反应程序为：2×PCRMix25μL，引物（20μmol/L）各1μL，DNA模板2μL，加灭菌ddH2O至50μL，反应程序为：94℃预变性1min，每次循环中94℃变性30s，57.5℃退火30s，72℃延伸45s，共循环30次，最后72℃延伸10min，扩增产物经电泳、纯化、双酶切、电泳，回收特异性目的片段，与同样酶切处理的原核表达载体pET-28b（＋）连接，转化E.coliDH5α感受态细胞，筛选含重组质粒p28b-MAP8的阳性克隆，经PCR和双酶切鉴定后，转化子送华大基因公司对重组质粒的插入片段进行测序，进一步验证重组质粒序列的正确性；
（3）重组蛋白的表达及纯化：构建好的重组转化E.coliBL21（DE3）感受态细胞，挑取单克隆，接种于含卡那霉素抗生素的LB培养基，37℃振摇培养过夜，将过夜培养物转接至新鲜的LB抗性培养基，培养至对数生长期（A600为0.6-0.8），加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，22℃诱导16h后离心收集菌体，菌体沉淀用含5mmol/L咪唑的20mmol/LTris缓冲液重悬，超声裂解，裂解产物13000×g离心20min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，按照Novagen的Ni-NTAHis-BindResin亲和柱纯化的操作步骤，从裂解液中纯化重组蛋白，既得。
步骤5.兔抗鼠IgG抗体的制备：取BALB/c小鼠血清IgG抗原与佐剂混合乳化后，取1ml对新西兰大白兔进行多点皮内、皮下和肌肉注射，免疫3-4次，间隔1-3周；然后对大白兔进行颈动脉采血，血液凝固，血清析出后，及时离心收集血清，即可得到兔抗鼠IgG抗体。
步骤6.喷金及胶体金试纸条的组装：将步骤3所得的副结核分歧杆菌抗原蛋白标记的胶体金溶液按5-10μl/cm的喷量喷在玻璃纤维（胶体金结合垫）上，室温干燥2h。偶联步骤4所得的抗原副结核分歧杆菌MAP1588C抗原-BSA用0.01mol/LPBS(pH7.4)稀释至0.4mg/ml，喷于硝酸纤维膜(NC膜)上，室温干燥2h，此为检测线（T线）。在离检测线3mm处喷上步骤5所得兔抗鼠IgG(0.5mg/ml)，此为质控线（C线）。在聚氯乙烯板上依次将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜（T线在靠近胶体金结合垫的一端）和吸水纸进行组装，再切割成4mm宽的试纸条，得到用于检测副结核分歧杆菌抗体的胶体金试纸条。
步骤7.胶体金试纸条使用方法：用移液管吸取待检样品100-150μl滴入到胶体金试纸条的样品垫上，滴加样品后开始计时，3分钟时开始观察，15分钟后终止观察，若T线C线都显红色，则测试结果为阳性，若T线不显色，C线显红色，则测试结果为阴性，若C不显色，无论T是否显色，测试结果都为无效。
步骤8.试纸条的特异性实验：用牛副结核病标准阳性和阴性血清、牛结核病及牛布鲁氏病的阳性血清按照步骤7的方法对试纸条的特异性进行测试，发现该试纸条对牛副结核病标准阳性血清呈阳性反应，对牛副结核病标准阴性血清、牛结核病及牛布鲁氏病的阳性血清均为阴性。
实施例3：
一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，包括如下步骤：
步骤1.胶体金溶液的制备：取5ml1%氯金酸溶液加入495ml超纯水，再转移到烧瓶中进行加热，煮沸后立即加入20ml1%柠檬酸三钠溶液，溶液的颜色由黑色→紫色→深蓝→酒红色，当溶液的颜色完全变为透明的酒红色时，继续回流3min后停止加热，冷却至室温，冰箱4℃贮存。
步骤2.鼠抗牛IgG的制备：取牛血清IgG抗原混合弗氏不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠SP2/0骨髓瘤细胞和脾细胞进行融合，筛选出稳定分泌抗牛血清IgG单克隆抗体的阳性细胞株，然后注射细胞进小鼠体内诱生腹水，取2ml鼠抗牛IgG腹水加入4ml浓度为0.06mol/LpH5.0的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5。于室温搅拌下逐滴缓慢加入辛酸，按每毫升稀释前的腹水加33μl搅拌30min，4℃静置2h。4℃10000r/min离心30min，取上清液。上清液经砂芯漏斗过滤，加入1/10体积的PBS(pH7.4)，在4℃冰浴下加入0.277g/ml的硫酸铵，静置2h，4℃10000r/min，离心15min，弃上清，沉淀溶于0.01mol/LPBS中进行透析。
步骤3.金标抗体的制备：取10ml胶体金，用0.2mol/LK2CO3调pH为8.2，用磁力搅拌器均匀搅拌，同时缓慢滴加0.3ml步骤2所得溶液，继续搅拌30min。加入适量1%PEG,继续搅拌15min，加入10%BSA溶液，使终浓度为1%，继续搅拌15min。4℃1500r/min离心10min，取上清。4℃6000r/min离心30min，小心吸去上清，缓冲液重悬沉淀。
步骤4.副结核分歧杆菌MAP1588C抗原的制备：
（1）引物设计：从GenBank上选取MAP的相关基因序列，用DNAStar分析MAP1588C基因表达产物的亲水性状和抗原性，该基因产物全长均有很好的亲水性和抗原性，因而设计引物扩增基因全长，引物序列1588-F：5'-catGGATCCgagcgtcgagaatctcaagg-3'和1588-R：5'-gacGAATTCgtctgggaggcgacgatc-3'，大写部分为限制性内切酶位点BamHI和EcoRI；
（2）MAP1588C基因的扩增与克隆：提取MAPK-10的基因组DNA，进行PCR扩增，反应程序为：2×PCRMix25μL，引物（20μmol/L）各1μL，DNA模板2μL，加灭菌ddH2O至50μL，反应程序为：94℃预变性1min，每次循环中94℃变性30s，57.5℃退火30s，72℃延伸45s，共循环30次，最后72℃延伸10min，扩增产物经电泳、纯化、双酶切、电泳，回收特异性目的片段，与同样酶切处理的原核表达载体pET-28b（＋）连接，转化E.coliDH5α感受态细胞，筛选含重组质粒p28b-MAP8的阳性克隆，经PCR和双酶切鉴定后，转化子送华大基因公司对重组质粒的插入片段进行测序，进一步验证重组质粒序列的正确性；
（3）重组蛋白的表达及纯化：构建好的重组转化E.coliBL21（DE3）感受态细胞，挑取单克隆，接种于含卡那霉素抗生素的LB培养基，37℃振摇培养过夜，将过夜培养物转接至新鲜的LB抗性培养基，培养至对数生长期（A600为0.6-0.8），加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，22℃诱导16h后离心收集菌体，菌体沉淀用含5mmol/L咪唑的20mmol/LTris缓冲液重悬，超声裂解，裂解产物13000×g离心20min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，按照Novagen的Ni-NTAHis-BindResin亲和柱纯化的操作步骤，从裂解液中纯化重组蛋白，既得。
步骤5.兔抗鼠IgG抗体的制备：取BALB/c小鼠血清IgG抗原与佐剂混合乳化后，取1ml对新西兰大白兔进行多点皮内、皮下和肌肉注射，免疫3-4次，间隔1-3周；然后对大白兔进行颈动脉采血，血液凝固，血清析出后，及时离心收集血清，即可得到兔抗鼠IgG抗体。
步骤6.喷金及胶体金试纸条的组装：将步骤3所得的副结核分歧杆菌抗原蛋白标记的胶体金溶液按5-10μl/cm的喷量喷在玻璃纤维（胶体金结合垫）上，室温干燥2h。偶联步骤4所得的抗原副结核分歧杆菌MAP1588C抗原-BSA用0.01mol/LPBS(pH7.4)稀释至0.4mg/ml，喷于硝酸纤维膜(NC膜)上，室温干燥2h，此为检测线（T线）。在离检测线3mm处喷上步骤5所得兔抗鼠IgG(0.5mg/ml)，此为质控线（C线）。在聚氯乙烯板上依次将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜（T线在靠近胶体金结合垫的一端）和吸水纸进行组装，再切割成4mm宽的试纸条，得到用于检测副结核分歧杆菌抗体的胶体金试纸条。
步骤7.胶体金试纸条使用方法：用移液管吸取待检样品100-150μl滴入到胶体金试纸条的样品垫上，滴加样品后开始计时，3分钟时开始观察，15分钟后终止观察，若T线C线都显红色，则测试结果为阳性，若T线不显色，C线显红色，则测试结果为阴性，若C不显色，无论T是否显色，测试结果都为无效。
步骤8.胶体金试纸条的稳定性测试：取不同批次的试纸条，分别于4℃保存12个月、25℃保存6个月及37℃保存15天后用牛副结核病标准阳性血清进行检测，仍能出现明显的阳性检测线。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
取待检样品和金标抗体混合，将混合后的样品通过副结核分歧杆菌抗原所在的区域，观察副结核分歧杆菌抗原所在区域的显色情况。
2.根据权利要求1所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述检测方法在胶体金试纸条上进行，且所述胶体金试纸条上依次设有用于放置待检样品的样品垫、设有金标抗体的胶体金结合垫和设有副结核分歧杆菌抗原的检测线。
3.根据权利要求2所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述胶体金试纸条由如下步骤制备得到：
（1）制备样品垫：采用纤维素滤纸条作为样品垫；
（2）制备胶体金结合垫：将金标抗体喷在玻璃纤维上，室温烘干；
（3）制备检测线：将偶联副结核分歧杆菌MAP1588C抗原-BSA用pH=7.4且浓度为0.01mol/L的PBS溶液稀释至0.4mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，室温烘干；
（4）组装：将按步骤（1）制备得到的样品垫、步骤（2）制备得到的胶体金结合垫和步骤（3）制备得到的硝酸纤维膜按顺序放置并固定在聚氯乙烯板上；
（5）切片，将按步骤（4）组装好的聚氯乙烯板切割，即得所述胶体金试纸条。
4.根据权利要求3所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述检测线上远离胶体金结合垫的一侧设有吸水纸，所述吸水纸设在胶体金试纸条上。
5.根据权利要求3所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述金标抗体由如下方法制备得到：
（1）胶体金溶液的制备：取质量浓度为0.008-0.010%的氯金酸水溶液，加热至沸腾，立即加入质量浓度为0.08-0.1%的柠檬酸三钠水溶液；至溶液的颜色完全变为透明的酒红色时，停止加热并冷却至室温，低温贮存；其中所述氯金酸和柠檬酸三钠的质量用量比为1：3-4；
（2）鼠抗牛IgG的制备：取牛血清IgG抗原混合弗氏不完全佐剂后免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠SP2/0骨髓瘤细胞和脾细胞进行融合；筛选出稳定分泌抗牛血清IgG单克隆抗体的阳性细胞株，然后注射细胞进小鼠体内诱生腹水；取2ml鼠抗牛IgG腹水加入4ml浓度为0.06mol/LpH5.0的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，于室温搅拌下逐滴缓慢加入辛酸；按每毫升稀释前的腹水加入33μl并搅拌，低温静置后低温离心，取上清液，上清液经过滤后加入1/10体积的pH7.4的PBS，冰浴下加入0.277g/ml的硫酸铵，静置后低温离心，弃上清，沉淀溶于0.01mol/LPBS中进行透析；
（3）金标抗体的制备：取步骤（1）制备的胶体金溶液，加入K2CO3调节其pH为8.2，搅拌均匀，缓慢滴加步骤（2）制备的鼠抗牛IgG溶液，搅拌条件下依次加入1%PEG和10%BSA溶液；搅拌均匀，低温低速离心取上清液低温高速离心，吸去上清后用缓冲液重悬沉淀；其中，所述胶体金和鼠抗牛IgG体积的比例为100:2-3。
6.根据权利要求3所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述副结核分歧杆菌MAP1588C抗原由如下方法制备得到：从副结核分歧杆菌基因组中扩增出MAP1588C基因片段，插入原核表达载体pET-28b（＋），转化至大肠杆菌BL21（DE3），在0.5mmol/L的IPTG诱导下进行表达；利用融合蛋白的组氨酸标签进行亲和层析纯化重组蛋白，即得所述副结核分歧杆菌MAP1588C抗原。
7.根据权利要求4所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述待检样品的制备过程为：
取待检牛血液1ml，于室温下自然凝集，然后分离血凝块并离心,取上层血清加入生理盐水即得所述待检样品，其中所述上层血清和生理盐水的体积比为1：4-5，即得待检样品。
8.根据权利要求7所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述胶体金试纸条硝酸纤维膜上检测线和吸水纸之间设有用于放置兔抗鼠IgG抗体的质控线，所述质控线和检测线之间的距离为3mm。
9.根据权利要求8所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述兔抗鼠IgG抗体的制备过程为：取BALB/c小鼠血清IgG抗原与佐剂混合乳化后，取1ml对新西兰大白兔进行多点皮内、皮下和肌肉注射，免疫3-4次，间隔1-3周；然后对大白兔进行颈动脉采血，血液凝固，血清析出后，及时离心收集血清，即可得到兔抗鼠IgG抗体。
10.根据权利要求8所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，取配好的待检样品，滴加在胶体金试纸条上的样品垫，在胶体金试纸条和吸水纸的作用下，待检样依次通过金标抗体、检测线和质控线。
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