CN108226514A

CN108226514A - 一种新城疫病毒抗体快速定量检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN108226514A
Application number: CN201710667083.3A
Authority: CN
Inventors: 王喜亮; 杨帆; 毕丁仁; 刘锡玲; 李越; 翟志雯
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2017-08-07
Filing date: 2017-08-07
Publication date: 2018-06-29

Abstract

本发明属于动物传染病检测技术领域，具体涉及一种新城疫病毒抗体快速定量检测试剂盒及其应用。本发明的试剂盒可对新城疫病毒抗体进行实时、快速动态定量检测，对鸡群健康水平、免疫后的抗体水平监测具有重要意义。该试剂盒由试纸条与测试卡壳和样品稀释液组成，所述的试纸条由样品垫、吸收垫、涂覆有由保藏号为CCTCC M 2017427的大肠杆菌BL21/pSmart‑HN表达的HN蛋白‑胶体金标记物和兔IgG－胶体金标记物的结合垫，包被有新城疫抗原蛋白HN的第一检测线和第二检测线，包被有羊抗兔IgG的质控线的硝酸纤维素膜，依次按吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫的顺序粘贴在不吸水的支撑薄片上构成试纸条。

Description

一种新城疫病毒抗体快速定量检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于动物免疫应用技术领域。具体涉及一种新城疫病毒抗体快速定量检测试剂盒及其应用。本发明的试剂盒可对新城疫病毒抗体进行实时、快速的动态定量检测，对鸡群健康水平、免疫后的抗体水平监测具有重要意义。

背景技术

新城疫(Newcastle disease,ND)感染是目前危害我国养禽业的几种主要呼吸道疾病之一，可导致禽不同程度的死亡和生产性能的下降，给我国养禽业造成极大的经济损失。

由于我国地域广阔，养殖模式多样，在家禽养殖中，各种疾病特别是呼吸道疾病仍时有发生，其中新城疫是非常常见且易发的禽呼吸道疾病。为了避免家禽疾病的发生，疫苗免疫是有效的预防手段，但是免疫后的家禽群体的抗体监测更是不可或缺的，是评价免疫效果，掌握疫情动态最直接、最有效的方法，因此，免疫后的抗体水平监测已成为各地养禽场和诊断室的常规监测项目。

现在家禽抗体检测的方法众多，除传统的沉淀反应、凝集实验、补体结合实验外，标记免疫测定技术如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等已成为主要的免疫测定技术，免疫印迹法也发挥了明显的作用，一些快速检测方法如快速斑点免疫结合实验也被广泛使用不同的检测方法，但是其灵敏度、准确性、重复性并不完全相同，加上试剂盒质量不一，都影响到实验结果。在应用或建立一个方法时，检测系统中所有成分的浓度必须经过严格的滴定，选择最恰当的浓度范围。但这些方法对操作人员、设备等有较高的要求。而且上述方法大多耗时较长(如血凝抑制试验需1～2小时；ELISA试验需2～3小时等)，不便于实时、快速诊断，所以均无法在基层大范围地推广使用。

胶体金免疫层析(Gold-immunochromatography assay GICA)是以胶体金作为示踪物，基于胶体金标记技术应用于抗原抗体反应的一种免疫标记技术。其核心技术是以硝酸纤维素膜为固相载体，因毛细管作用而促使样品溶液在层析条上泳动，并使样品中的待检物与层析膜上针对待检物的受体(如抗原或抗体)在短时间内发生高特异性、高亲和性的免疫反应。它具有简便，快速，特异性强，灵敏度高，费用低的优点。

基于该技术，国内外在人医疾病监测，环境危害监控，食品安全保障及畜禽疾病检测等领域，都已经研制出了多种胶体金免疫层析快速检测测试卡。在鸡疫病诊断和检测方面，鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊及鸡毒霉形体抗体免疫胶体金快速检测试剂盒获得相关专利(专利号：200710169103.0；200710169105.X；200710169104.5；200710169106.4)。

但是上述试剂盒是仅对相关疾病或疫苗免疫后抗体水平的进行定性或者半定量检测，不能定量地监测鸡群抗体水平。定量检测鸡群的免疫水平和评价鸡群的免疫状况对于疾病的控制有着重要的意义。

本发明将新城疫病毒蛋白(NDV-HN)作为检测线上的捕获试剂，研制出新城疫病毒抗体免疫胶体金快速检测试纸条，并与胶体金生物传感检测仪有机整合，建立一种新城疫病毒抗体快速定量检测试剂盒。提供一种监测鸡群NDV抗体水平及评估该疾病免疫效果的快速、易用的抗体定量检测方法。

本发明制备的试剂盒通过双检测线和质控线的信号比值与被检测血清效价(即抗体含量)所呈现的对应关系，实现了实时、定量检测待测血清的效价。为防控新城疫的发生提供一种科学有效的技术支撑，同时也为其他疾病抗体的快速、定量监测提供了一种参考依据。

发明内容

本发明的目的在于克服现有胶体金快速检测技术只能进行定性检测或半定量检测的缺陷，提供一种适用于新城疫病毒抗体检测的快速定量检测试剂盒及应用，本发明的试剂盒特异性强、灵敏度高、操作简单、耗时短，能对新城疫病毒抗体水平进行定量检测。本发明的应用能减少由人为眼观判定引起的错误率，既提高了检测的时效，又提升了检测结果的客观性、准确性。

本发明涉及重组载体pSmart-NDV-HN的构建与开发利用。

图1是本发明的技术路线图。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人筛选得到一种新城疫病毒抗体的抗原蛋白的靶蛋白，其蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

申请人将上述重组蛋白抗原HN构建到的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pSmart-HN中，得到一种如上所述的重组蛋白抗原HN的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pSmart-HN，申请人将该重组大肠杆菌命名为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pSmart-HN，于2017年07月17日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2017427。

申请人通过制备，得到一种检测新城疫病毒抗体的试纸条，该试纸条包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫，PVC背衬和测试卡壳；在PVC背衬(9)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、第一金标垫(2)，第二金标垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸收垫(5)；将试纸条装入测试卡壳(10)中构成测试卡；所述的金标垫(3)上包被有胶体金与序列表SEQ ID NO：2所示蛋白序列的重组蛋白抗原HN的胶体金标记物(所述的重组蛋白抗原HN的溶液含有NDV-HN－胶体金标记物)；在所述的硝酸纤维素膜(4)上包被有重组蛋白抗原HN构成的第一检测线(6)，又称T1)和第二检测线(7，又称T2)，以及含有羊抗兔IgG的质控线(8，又称C线)。

本发明的重组蛋白抗原HN可以应用于制备新城疫病毒抗体定量检测试纸条中。

本发明的试纸条可以应用于在体外检测新城疫病毒抗体定量分析中。

申请人提供一种适用于新城疫病毒抗体的在体外快速、定量检测的方法，其具体步骤如下：

1)鸡新城疫病毒重组血凝素HN蛋白(简称NDV-HN)的表达制备。通过对新城疫病毒HN基因的序列克隆，连接相应载体构建重组蛋白表达载体pSmart-HN；

2)NDV-HN蛋白的纯化，包涵体的纯化与复性，得到抗原(NDV-HN)；

3)用柠檬酸三钠与氯金酸(购自sigma公司)反应制备胶体金；

4)将步骤2)制备的抗原(NDV-HN)，与兔IgG分别加入步骤3)制备的胶体金中，得到两种胶体金标记物(NDV-HN-胶体金和兔IgG-胶体金)按一定体积混合浓缩之后构成金标混合物；

5)将金标混合物包被在第一金标垫(2)和第二金标垫(3)上；

6)将步骤2)制备的抗原(NDV-HN)包被在硝酸纤维素膜(4)上分别构成第一检测线(6)，即为T1；第二检测线(7)，即T2；并将羊抗兔IgG包被在硝酸纤维素膜(4)上构成质控线(8)；

7)在所述的PVC背衬(9)上按顺序依次粘附所述的样品垫(1)、第一金标垫(2)、第二金标垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸收垫(5)，得到检测新城疫病毒抗体胶体金试纸条。

8)将步骤7)中所述试纸条装入测试卡壳(10)中构成测试卡。

本发明的原理是采用双抗原夹心法，金标垫上包被有金标混合物，硝酸纤维素膜上包被有新城疫病毒抗体(NDV-HN)抗原(构成双检测线区)和羊抗兔IgG(构成质控线区)。当待检样品中含有新城疫病毒抗体时，样本中的新城疫病毒抗体会在金标垫的位置与金标抗原HN发生反应，反应复合物层析到检测线位置时，包被在检测线T上的抗原会和复合物中的抗体发生反应，从而在检测线位置形成“金标抗原-抗体-包被抗原”双抗原夹心复合物。由于在复合物中有一种抗原是用胶体金标记的，所以在检测线位置就会出现肉眼可见的红色条带。如果样本中抗体含量越高，硝酸纤维素膜上测试反应区的红色条带颜色就越深；反之则越浅。本发明利用免疫定量速测仪，以胶体金免疫层析检测卡作为一级传感器，即待测物(抗体)与检测卡上的捕获抗原和胶体金标记抗原的结合产生颜色变化，显色的强度变化与待测物含量相关，而后测量系统运用光电扫描测试反应区，获得光电信号，然后对光电信号的强弱进行分析处理，即可以定量分析出待测物的含量。

本发明试剂盒中的试纸条的结构图如图2所示，分别由样品垫(1)、第一金标垫(2)、第二金标垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸收垫(5)构成；按图2所示的顺序依次粘附在PVC背衬(9)上组装而成的，最后将试纸条装入测试卡壳(10)中即构成测试卡。

与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：

1、本发明将新城疫病毒抗体快速检测卡与免疫定量速测仪结合使用，组成新城疫病毒抗体快速定量检测试剂盒，实现了对新城疫病毒抗体实时、快速、定量的监测。本发明的应用能减少由人为眼观判定引起的错误率，既提高了检测的时效，又提升了检测结果的客观性、准确性。

2、本发明的检测卡采用双检测线模式代替了常用的单检测线模式，双检测线模式的采用能够有效平衡整个检测卡测试区域抗原抗体的反应，降低定量检测结果的的偏差度。

3、本发明通过双检测线与质控线信号比值与血清效价所呈现的对应关系，制定标准曲线，实现定量检测，检测结果直接以血清效价的形式呈现。

4、本发明的新城疫病毒抗体胶体金试剂盒，具有特异性强，灵敏度高，直接读取数值，检测时间短(10-15分钟)，判断直观准确等优点。

5、本发明的试剂盒操作简便，储存方便，对储存温度要求不高，在4℃下的保质期至少为90天。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是鸡新城疫HN基因的部分片段的核苷酸序列，序列长度为2024bp。

序列表SEQ ID NO：2是鸡新城疫HN基因编码的蛋白质的序列，编码571个氨基酸。

图1：本发明的技术路线图。

图2：本发明检测试纸条原理示意图。

图3：本发明检测试纸条的组装示意图。附图标记说明：

图中1-样品垫，2-第一金标垫，3-第二金标垫，4-硝酸纤维素膜，5-吸收垫，6-第一检测线，7-第二检测线，8-质控线，9-PVC背衬，10-测试卡壳。

图4：本发明检测试卡结果判定示意图。附图标记说明：

在图4中：1：表示检测NDV为阳性结果；2：表示检测NDV为阴性结果；3、4：表示测试卡失效。

图5：本发明检测试纸条定量标准曲线图(例)。

图6：本发明表达载体pSmart-HN的构建示意图。其中：图6中的上图是本发明的原始载体pSmart载体的图谱；图6中的下图是本发明构建的表达载体pSmart-HN的图谱

实施例1

1.新城疫病毒(NDV-HN)蛋白的制备

1.1新城疫HN基因的克隆与测序及表达载体pSmart-HN的构建

本发明涉及的新城疫HN基因的序列及克隆方法及表达载体pSmart-HN的构建方法参考萨姆布鲁克J，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯T主编；金冬雁，黎孟枫等译，《分子克隆实验指南》，第二版，1992版报道的方法。具体实施方法如下：从常规报道的新城疫毒株(菌株不限)于尿囊腔接种NDV于9-11日龄健康SPF(无特定病原体)鸡胚(购自国家计划生育与卫生委员会武汉生物制品研究所)，弃24小时前死胚，收集24-96小时的鸡胚尿囊液；4℃条件下4,000rpm离心30min，取上清；4℃条件下30,000rpm离心60min浓缩病毒。用pH 7.2的磷酸盐缓冲液即PBS(用DEPC处理水配制，为常规缓冲液)溶解沉淀，分装后-80℃保存备用。根据GenBank收录的NDV La Sota系分离株HN基因序列(登录号:A03663.1)设计并合成引物，扩增HN基因。引物序列如下：

上游引物P1：CCG GGATCC ACA AGG CTT AAT CTG ATC GCA TGA G；

下游引物P2：CGG CTCGAG CAC CGA CAA CAG TCC TCA ATC ATG。

其中：上游引物P1位于启动子上游，加有BamHI位点，下游引物P2加入了XhoI位点并包含有终止密码子，两酶切位点用下划线标出。按宝生物工程大连有限公司的RNA PCRKit(AMV)试剂盒(Ver.2.1说明书)中提供的使用方法，取适量病毒悬液提取RNA，通过反转录扩增出DNA，采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(购自E.Z.N.A Gel Extraction Kit)回收纯化RT-PCR扩增产物，将回收的RT-PCR产物1734bp左右的片段与pSmart载体进行连接反应，构建得到表达载体。用该表达载体转化至DH5α感受态细胞，并将转化菌涂布含Kan的LB琼脂平板37℃培养过夜。挑数个单菌落培养过夜后用TIANGEN质粒抽提试剂盒(购自天根北京生化科技有限公司)提取质粒，进行酶切分析和PCR扩增鉴定，将鉴定成功的样品分装冻存于-20℃。

1.2新城疫病毒蛋白的表达

用重组质粒pSmart-HN及表达载体pSmart分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂含Kan(25ug/ml)的LB平板(1％(W/V)Tryptone，0.5％(W/V)Yeast Extract，0.5％(W/V)NaCl，0.025mg/mL Kan和 1.5％(W/V)琼脂)，置37℃恒温箱培养，挑取单菌落，接种于2.0mL含Kan的液体LB培养基内，37℃300r/min振荡培养，当OD600nm达到0.6-1.0时，分别接种0.05mL菌液到5.0mL含Kan的液体LB培养基内，37℃300r/min振荡培养3h，加入终浓度为0.6mg/mL的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，诱导4小时，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，并将得到的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pSmart-HN于2017年07月17日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2017427。

1.3新城疫病毒(NDV-HN)蛋白的纯化

(1)包涵体的纯化与复性

按照上述1.2中的条件大量诱导表达，将诱导后的细菌培养物于4℃、8,000r/min离心10min，沉淀用约为原菌液体积的l/10的PBS(pH7.4，140mM NaCl，2.4mM KCl，10mMNa₂HPO₄.12H₂O，1.8mM KH₂PO₄)重悬，加DTT(二硫苏糖醇)至终浓度为10mmol/L，用压力破碎仪破碎至液体变为透明，4℃，12,000r/min离心10min，将破碎离心后的沉淀用PBS(pH7.4)洗2次，加19.7mL缓冲液A(50mM Tris-Cl，0.5mM EDTA，50mM NaCl，5％(W/V)Glycerol)及0.3mL 20％(W/V)SKL(十二烷基肌氨酸钠)贮存液，剧烈搅动，使其溶解，静置2h，于4℃12000r/min离心10min，弃沉淀，取上清，加20％(W/V)PEG-4000(聚乙二醇4000)至终浓度为0.2％，加50mmol/L的氧化型谷胱苷肽至终浓度为1mmol/L，加100mmol/L的还原型谷胱苷肽至终浓度为2mmol/L，静置2h，以PBS(pH7.4)透析2～3天，-80℃保存备用。

(2)蛋白浓度的测定及鉴定

用核酸蛋白测定仪(THERMO)分别测定蛋白质溶液在280nm和260nm波长下的光吸收值为A280、A260。依据公式计算出蛋白浓度，将达到要求浓度的蛋白溶液分装成100μL/管，取50μL进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定和Western-blot分析，其余置-80℃条件下保存备用。

SDS-PAGE检测：取上述收集的菌体，用40.0μL ddH₂O充分重悬菌体，加入等体积的加样缓冲液(250mM Tris-HCl，10％(W/V)SDS，0.5％(W/V)溴酚蓝，50％(V/V)甘油，5％(V/V)β-巯基乙醇)，水浴煮沸10min，然后冰浴等待加样电泳。按萨姆布鲁克J，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯T主编；金冬雁，黎孟枫等译，《分子克隆实验指南》，第二版，1992版报道的方法制备分离胶和积层胶，加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(25mM Tris-base，0.1％(W/V)SDS，0.25M Glycine)，取处理的样品点样，电泳2h，取下凝胶，考马斯亮蓝R250染色液(0.1％(W/V)考马斯亮蓝R250，25％(V/V)异丙醇，10％(V/V)冰醋酸)染色2h，然后用SDS-PAGE脱色液(5％(V/V)乙醇，10％(V/V)冰醋酸)脱色，观察照相。并通过凝胶薄层扫描分析所表达的外源蛋白含量。

Western-blot分析：为了分析所表达的带SUMO标签的融合蛋白NDV-HN的免疫学活性，按如上所述方法进行SDS-PAGE电泳，电泳后的凝胶，不经染色，直接用转印装置将蛋白带电转印到NC膜上，以15V电压转印1.5h。转印结束后，将NC膜于TBST溶液(150mM NaCl,20mM Tris-HCl,0.05％Tween20)中漂洗一下，再将NC膜转入可加热密封的加样槽，按0.1mL-0.15mL/cm²(NC膜面积)加入封闭液(含1％(W/V)牛血清白蛋白的TBST)，尽可能避免气泡后，于37℃2h或4℃过夜。然后弃去封闭液，将NC膜取出，用PBST溶液漂洗2-3次，按0.1mL-0.15mL/cm²的量加入经TBST稀释(体积比为1:150)的NDV标准阳性血清，同上排除气泡，在摇床上室温作用1h，用TBST洗6次，每次5mim，将膜置于加样槽中，按0.1mL-0.15mL/cm²加入经TBST稀释(1:5000)的羊抗兔IgG(购自博士德公司)，在室温反应1h，用TBST溶液洗6次，每次5min，最后再用TBS溶液漂洗2次，加入以0.01mol/L Tris-Cl(pH7.6)配制的底物溶液(DAB-H₂O₂)显色，一旦出现蛋白带，立即用ddH₂O终止，即可观察结果及扫描保存。

根据公式计算蛋白质浓度(mg/mL)＝l.45×A280-0.74×A260获得纯化的目标蛋白浓度为：HN-1.0mg/mL。利用Western-blot分析结果表明本发明重组的NDV-HN蛋白，与相应的阳性血清发生了特异性的反应，证实这表达产物具有较好的抗原性。

2.抗原－胶体金标记物的制备

(1)胶体金的制备：

用超纯水将1％氯金酸稀释成0.01％，置磁力加热搅拌器上搅拌煮沸，按每100mL0.01％氯金酸加入1.5mL 1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈橙红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀或漂浮物，置4℃保存。

(2)抗原－胶体金标记物的制备：

将所得的pSmart-HN标记胶体金颗粒。具体步骤如下：于磁力搅拌下，用0.1M碳酸钾溶液调胶体金的pH值至10.0，按6.6μg抗体/mL胶体金加入上述蛋白，继续搅拌混匀30min，加入10％BSA(牛血清白蛋白)至终浓度为1％，静置30min。12000rpm，4℃离心30min，弃上清，沉淀用0.02M pH9.0的硼酸盐缓冲液(配方：硼酸0.1237g，PEG-200001g，用超纯水定容至1000mL，调pH至9.0)洗涤两次，用二十分之一初始胶体金体积的0.02M pH9.0的硼酸盐缓冲液(配方：硼酸0.1237g，PEG-20000 1g，用超纯水定容至1000mL，调pH至9.0)将沉淀重悬，置4℃备用，保质期为60天。

(3)金标垫的包被

将金标垫浸泡于封闭液(配方：1％BSA，2％蔗糖，0.3％PVP K-30，0.02％NaN3，0.5％Teewn-20，0.5％PEG-2000，0.29％Na₂HPO₄.12H₂O和0.02％KH₂PO₄pH7.6)中40min后，于37℃烘干。取等体积的上述制备的pSmart-HN的抗原金标物充分混合后浓缩，用XYZ三维划膜喷金仪HM3035(上海金标)将制备好的抗原－胶体金标记物均匀包被在金标垫上，每厘米金标垫包被7μL抗原－胶体金标记物，真空干燥(按常规方法)，真空封装(按常规方法)，置4℃备用。

(4)样品垫的处理

将样品垫用封闭液(含2％BSA，2％蔗糖，0.3％PVP K-30，0.02％NaN₃，0.5％Teewn-20，0.5％PEG-2000，0.29％Na₂HPO₄.12H₂O和0.02％KH₂PO₄pH6.0)进行处理，40min37℃烘干，真空封装，置4℃备用。

(5)硝酸纤维素膜的包被

用包被液(含3％甲醇，1％蔗糖的0.01M pH 7.4PBS缓冲液)将pSmart-HN抗原稀释至1、0.8μg/mL，用上海金标点膜仪将其依次包被于硝酸纤维素膜上作为检测线(检测线依次为T1，T2，包被量为0.9μL/cm，该检测线靠近金标垫端，距金标垫垫端约5mm；用包被液将羊抗兔IgG抗体稀释到200μg/mL，用点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜作为质控线，包被量为1μL/cm，该质控线靠近吸收垫，距吸收垫约5mm，质控线或检测线两两之间距离为3～4mm。37℃烘干30-40min，备用。

(6)试剂盒的组装

将样品垫(1)、金标垫(2、3)、硝酸纤维索膜(4)、吸收垫(5)按图2所示的顺序依次粘附在PVC背衬(9)上，切成4mm宽的小条，封装于测试卡壳(10)中组成测试卡，制备完成后将该试剂盒内的测试卡与干燥剂封装于铝箔袋中。于4℃保存，保质期至少为90天。

实施例2

1.定量标准曲线的建立

1)标准曲线的确立：以标准阳性血清的血清效价为纵坐标，双检测线与质控线信号比值的数值为横坐标，确立标准曲线(见图5)，将标准曲线信息植入检免疫定量速测仪中。

2)检测范围的确立：将效价为2¹⁰标准阳性血清进行倍比稀释，在稀释至血清效价(HI测定)为2¹时，加样至检测卡中，重复10次，将检测卡放入免疫定量速测仪读取双检测线与质控线信号比值，当血清效价在2²与2³之间时信号比值出现明显差异，表明该检测卡的检测下限(或灵敏度)为2²；而血清效价在2⁹与2¹⁰之间时信号比值基本一致，表明该检测卡的检测上限为2⁹，因此本发明的检测定量检测范围为2²-2⁹即1:4-1:512。

2.样品的制备

本发明检测的样品为鸡的血清，制备过程：翼根静脉采血，固定动物，左手将家禽双翼提起，露出翼静脉的采血位置，把覆盖血管的羽毛拨开，即可见到明显一条较粗的静脉血管。采血时用左手大拇指夹住覆盖静脉的羽毛，食指协调大拇指夹住双翼，中指、无名指和手掌轻轻提起或轻按背部保定鸡只，待其安静方可刺针。针头在据静脉血管0.3-0.5cm一旁斜刺入皮肤，再与血管平行进针0.2-0.4cm后刺入血管，见有少量回血即可采集血液，采血完成后立刻压迫伤口止血。将血样37℃自然凝固，待血清开始出现后，放置4℃12或24小时，离心分离血清，3000rpm 5-10min，得到的上清即为血清，小心将上清吸出，注意切勿吸出细胞成分。检测前将血清样品与蒸馏水以体积比为1:1稀释，待检。

3.结果检测

取出试剂盒，室温下平衡20分钟；打开包装袋，取出测试卡，取50μL制备好的样品滴入测试卡的加样孔中，10分钟后放入免疫定量速测仪，直接读取检测结果，即样品血清效价。

4.特异性实验

分别将的新城疫标准阳性、传染性支气管炎、传染性法氏囊炎、减蛋综合征、禽流感H5、H7、H9阳性血清(新城疫标准阳性购自中国兽医药品监察所，其他标准血清均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)。将上述血清用蒸馏水以体积比为1:1稀释进行稀释待测，分别加入50μL待测液检测，读取检测结果。当反应10分钟，眼观检测卡测试反应区，检测传染性支气管炎、传染性法氏囊炎、减蛋综合征、禽流感H5、H7、H9标准血清时，质控线出现明显的紫红色条带，检测线则不显紫红色条带或显色极浅；当检测新城疫标准阳性血清，质控线、检测线均出现紫红色条带。将检测卡放入免疫定量速测仪读取检测结果，检测传染性支气管炎、传染性法氏囊炎、减蛋综合征、禽流感H5、H7、H9标准血清，检测结果为其新城疫抗体的血清效价均小于2²；检测新城疫标准阳性血清，检测结果与实际HI测试的血清效价基本一致。这表明本发明试剂盒中的测试卡特异性高，表明与禽的其它重要疾病病毒的抗体无交叉反应。

实施例3

本发明的试剂盒对送检样品的检测及其与血凝抑制试验方法的比较

用本发明的试剂盒对湖北省荆州市周边养鸡场共采集216份血清样品进行了检测(样品的制备参见实施例2)，以血凝抑制(HI)检测为对照，二者之间结果判定后定性复核的比对结果见表1，以HI效价大于2⁴判为阳性，两者阴性符合率100％，阳性符合率为91.8％，两种方法总符合率92.6％。定量结果判定依据以相差1.5个效价为符合的判定标准，216份样品中有180份，其检测卡与HI的检测结果一致，两者符合率83.33％。结果表明本发明的试剂盒与HI检测方法的检测结果基本一致，符合率较好。见表1和表2。

表1检测卡与HI检测临床血清样品的定性复核结果

表2部分临床样品的定量复核结果(加粗数据为不符合数据)

表2的备注：表2中相差1.5个效价为符合的判定标准，检测结果一致的样品

实施例4

本发明的新城疫病毒抗体快速定量检测试剂盒稳定性的考核

将分别在4℃和37℃放置的真空封装的本发明的试剂盒测试卡，在第7、14、35、56、70、90天取出，用效价为2¹⁰鸡新城疫标准阳性血清用蒸馏水以体积比为1:1稀释后检测，每次检测重复5组。结果如表3。

表3试剂盒不同贮存条件下的保存期试验结果

本发明的试剂盒在4℃的保存期至少为90天。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种新城疫病毒抗体快速定量检测试剂盒及其应用

<130>

<141> 2017-08-06

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 2024

<212> DNA

<213> 新城疫病毒

<220>

<221> gene

<222> (1)..(2024)

<223>

<220>

<221> CDS

<222> (123)..(1838)

<223>

<400> 1

ttattgggaa caagcaacca aagagcaata cacgggtaga acggtcagag gagccaccct 60

tcaatcggaa attaggcttc acaacatccg ttctaccgca tcaccaacaa caggagtcaa 120

tc atg gac cgc gcg gtt aac aga gtc gtg cta gag aat gag gaa aga 167

Met Asp Arg Ala Val Asn Arg Val Val Leu Glu Asn Glu Glu Arg

1 5 10 15

gaa gca aag aac aca tgg cgc ctg gtt ttc cgg atc gca gtc tta ctt 215

Glu Ala Lys Asn Thr Trp Arg Leu Val Phe Arg Ile Ala Val Leu Leu

20 25 30

ttg atg gta atg act cta gct atc tct tca gct gcc ctg gca tac agc 263

Leu Met Val Met Thr Leu Ala Ile Ser Ser Ala Ala Leu Ala Tyr Ser

35 40 45

acg ggg gcc agt acg ccc cac gac ctc gca ggc ata tcg act gtg atc 311

Thr Gly Ala Ser Thr Pro His Asp Leu Ala Gly Ile Ser Thr Val Ile

50 55 60

tcc aag aca gaa gat aag gtt acg tct tta ctc agt tca agt caa gac 359

Ser Lys Thr Glu Asp Lys Val Thr Ser Leu Leu Ser Ser Ser Gln Asp

65 70 75

gtg ata gat agg ata tat aag cag gtg gct ctt gaa tcc cca cta gcg 407

Val Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Ala

80 85 90 95

cta cta aac act gaa tct ata att atg aat gca ata acc tct ctt tct 455

Leu Leu Asn Thr Glu Ser Ile Ile Met Asn Ala Ile Thr Ser Leu Ser

100 105 110

tat caa atc aac ggg gct gcg aac aac agc ggg tgt ggg gcg cct gtt 503

Tyr Gln Ile Asn Gly Ala Ala Asn Asn Ser Gly Cys Gly Ala Pro Val

115 120 125

cat gac cca gac tac ttc ggg ggg ata ggc aaa gaa ctc ata gtg gac 551

His Asp Pro Asp Tyr Phe Gly Gly Ile Gly Lys Glu Leu Ile Val Asp

130 135 140

gac att agt gat gtc aca tca ttt tat cct tct gcg tat caa gaa cac 599

Asp Ile Ser Asp Val Thr Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Tyr Gln Glu His

145 150 155

ttg aat ttc atc ccg gcg ccc act aca gga tcc ggt tgc act cgg ata 647

Leu Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Ser Gly Cys Thr Arg Ile

160 165 170 175

ccc tca ttt gac atg agc acc act cac tac tgt tat act cac aat gtg 695

Pro Ser Phe Asp Met Ser Thr Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val

180 185 190

ata tta tct ggt tgc aga gat cac tca cac tca cat caa tac tta gca 743

Ile Leu Ser Gly Cys Arg Asp His Ser His Ser His Gln Tyr Leu Ala

195 200 205

ctt ggt gtg ctg cgg aca tct gca aca ggg agg gta ttc ttt tct act 791

Leu Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe Phe Ser Thr

210 215 220

ctg cgc tcc atc aat tta gat gac acc caa aat cgg aag tct tgc agt 839

Leu Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Thr Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser

225 230 235

gtg agt gca act ccc tta ggt tgc gat atg ttg tgc tct aaa gtc acg 887

Val Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser Lys Val Thr

240 245 250 255

gaa act gag gaa gaa gat tat aat tca gtt atc ccc aca cca atg gta 935

Glu Thr Glu Glu Glu Asp Tyr Asn Ser Val Ile Pro Thr Pro Met Val

260 265 270

cat ggg agg ctg ggg ttt gac ggc caa tac cat gag aag gac ctg gat 983

His Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp

275 280 285

gtc gca aca tta ttt ggg gac tgg gtg gca aat tac cct ggg gtg gga 1031

Val Ala Thr Leu Phe Gly Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Gly Val Gly

290 295 300

gga ggg tct ttt att gac aac cgc gta tgg ttc cca gtc tat gga ggg 1079

Gly Gly Ser Phe Ile Asp Asn Arg Val Trp Phe Pro Val Tyr Gly Gly

305 310 315

cta aaa ccc aat tcg cct agt gac act gca caa gag ggg aga tat gta 1127

Leu Lys Pro Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ala Gln Glu Gly Arg Tyr Val

320 325 330 335

ata tac aag cgg tac aat gac aca tgc cca gat gag caa gac tac cag 1175

Ile Tyr Lys Arg Tyr Asn Asp Thr Cys Pro Asp Glu Gln Asp Tyr Gln

340 345 350

att cgg atg gct aag tct tca tat aag cct ggg cgg ttt ggt ggg aaa 1223

Ile Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Arg Phe Gly Gly Lys

355 360 365

cgc gta cag cag gcc atc cta tcc atc aag gta tca aca tcc ttg ggt 1271

Arg Val Gln Gln Ala Ile Leu Ser Ile Lys Val Ser Thr Ser Leu Gly

370 375 380

gag gac ccg gtg ctg act gta ccg ccc aac aca atc aca ctt atg ggg 1319

Glu Asp Pro Val Leu Thr Val Pro Pro Asn Thr Ile Thr Leu Met Gly

385 390 395

gcc gaa ggc aga gtt ctc aca gta ggg aca tct cat ttc ttt tac cag 1367

Ala Glu Gly Arg Val Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe Phe Tyr Gln

400 405 410 415

cga ggg tca tca tac ttc tct ccc gcc tta tta tac cct atg aca gtc 1415

Arg Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val

420 425 430

gac aat aaa aca gcc act ctt cat agt cct tat gca ttc aat gct ttc 1463

Asp Asn Lys Thr Ala Thr Leu His Ser Pro Tyr Ala Phe Asn Ala Phe

435 440 445

act cgg cca ggt agt gtc cct tgc cag gct tca gcc aga tgc cct aac 1511

Thr Arg Pro Gly Ser Val Pro Cys Gln Ala Ser Ala Arg Cys Pro Asn

450 455 460

tcg tgt gtt act gga gtc tac act gat cca tac ccc tta gtc ttc cat 1559

Ser Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Leu Val Phe His

465 470 475

agg aac cac act ttg cga ggg gta ttc ggg aca atg ctt gat gat aaa 1607

Arg Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asp Asp Lys

480 485 490 495

caa gca aga ctc aac cct gta tct gca gta ttt gat aac ata tct cgc 1655

Gln Ala Arg Leu Asn Pro Val Ser Ala Val Phe Asp Asn Ile Ser Arg

500 505 510

agt cgc ata acc cgg gtg agt tca agc agt acc aag gca gca gac acg 1703

Ser Arg Ile Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Asp Thr

515 520 525

aca tca aca tgt ttt aaa gtt gtc aag acc aat aaa acc tat tgc ctc 1751

Thr Ser Thr Cys Phe Lys Val Val Lys Thr Asn Lys Thr Tyr Cys Leu

530 535 540

agc att gca gaa ata tcc aat acc ctc ttc ggg gaa ttc agg att gtc 1799

Ser Ile Ala Glu Ile Ser Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val

545 550 555

cct tta tta gtc gag att ctc aag gat gat ggg att taa gaagccaggt 1848

Pro Leu Leu Val Glu Ile Leu Lys Asp Asp Gly Ile

560 565 570

ctggctggtt gagccagctg tgaaagggcc gggaagatga cactgcgcca cccatccttt 1908

gtagcaccag gaatcaaact gagaaccggc acaggctcaa atcatacgct gccggtcagc 1968

cacaatcagc tatcgccaat gcgattagtc tggatcttgt cgatagtcac ttgatt 2024

<210> 2

<211> 571

<212> PRT

<213> 新城疫病毒

<400> 2

Met Asp Arg Ala Val Asn Arg Val Val Leu Glu Asn Glu Glu Arg Glu

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Trp Arg Leu Val Phe Arg Ile Ala Val Leu Leu Leu

20 25 30

Met Val Met Thr Leu Ala Ile Ser Ser Ala Ala Leu Ala Tyr Ser Thr

35 40 45

Gly Ala Ser Thr Pro His Asp Leu Ala Gly Ile Ser Thr Val Ile Ser

50 55 60

Lys Thr Glu Asp Lys Val Thr Ser Leu Leu Ser Ser Ser Gln Asp Val

65 70 75 80

Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Ala Leu

85 90 95

Leu Asn Thr Glu Ser Ile Ile Met Asn Ala Ile Thr Ser Leu Ser Tyr

100 105 110

Gln Ile Asn Gly Ala Ala Asn Asn Ser Gly Cys Gly Ala Pro Val His

115 120 125

Asp Pro Asp Tyr Phe Gly Gly Ile Gly Lys Glu Leu Ile Val Asp Asp

130 135 140

Ile Ser Asp Val Thr Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Tyr Gln Glu His Leu

145 150 155 160

Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Ser Gly Cys Thr Arg Ile Pro

165 170 175

Ser Phe Asp Met Ser Thr Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val Ile

180 185 190

Leu Ser Gly Cys Arg Asp His Ser His Ser His Gln Tyr Leu Ala Leu

195 200 205

Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe Phe Ser Thr Leu

210 215 220

Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Thr Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val

225 230 235 240

Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser Lys Val Thr Glu

245 250 255

Thr Glu Glu Glu Asp Tyr Asn Ser Val Ile Pro Thr Pro Met Val His

260 265 270

Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp Val

275 280 285

Ala Thr Leu Phe Gly Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Gly Val Gly Gly

290 295 300

Gly Ser Phe Ile Asp Asn Arg Val Trp Phe Pro Val Tyr Gly Gly Leu

305 310 315 320

Lys Pro Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ala Gln Glu Gly Arg Tyr Val Ile

325 330 335

Tyr Lys Arg Tyr Asn Asp Thr Cys Pro Asp Glu Gln Asp Tyr Gln Ile

340 345 350

Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Arg Phe Gly Gly Lys Arg

355 360 365

Val Gln Gln Ala Ile Leu Ser Ile Lys Val Ser Thr Ser Leu Gly Glu

370 375 380

Asp Pro Val Leu Thr Val Pro Pro Asn Thr Ile Thr Leu Met Gly Ala

385 390 395 400

Glu Gly Arg Val Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe Phe Tyr Gln Arg

405 410 415

Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val Asp

420 425 430

Asn Lys Thr Ala Thr Leu His Ser Pro Tyr Ala Phe Asn Ala Phe Thr

435 440 445

Arg Pro Gly Ser Val Pro Cys Gln Ala Ser Ala Arg Cys Pro Asn Ser

450 455 460

Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Leu Val Phe His Arg

465 470 475 480

Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asp Asp Lys Gln

485 490 495

Ala Arg Leu Asn Pro Val Ser Ala Val Phe Asp Asn Ile Ser Arg Ser

500 505 510

Arg Ile Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Asp Thr Thr

515 520 525

Ser Thr Cys Phe Lys Val Val Lys Thr Asn Lys Thr Tyr Cys Leu Ser

530 535 540

Ile Ala Glu Ile Ser Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val Pro

545 550 555 560

Leu Leu Val Glu Ile Leu Lys Asp Asp Gly Ile

565 570

Claims

1.一种表达重组蛋白抗原HN的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pSmart-HN，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017427。

2.一种检测新城疫病毒抗体的试纸条，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫，PVC背衬和测试卡壳，其特征在于：在PVC背衬(9)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、第一金标垫(2)，第二金标垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸收垫(5)；将试纸条装入测试卡壳(10)中构成测试卡；所述的金标垫(3)上包被有胶体金与重组蛋白抗原HN的胶体金标记物，所述的重组蛋白抗原HN的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示；在所述的硝酸纤维素膜(4)上包被有重组蛋白抗原HN构成的第一检测线(6)和第二检测线(7)，以及含有羊抗兔IgG的质控线(8)。

3.权利要求1所述的重组蛋白抗原HN在制备新城疫病毒抗体定量检测试纸条中的应用。

4.权利要求2所述的试纸条在体外检测新城疫病毒抗体定量分析中的应用。