CN101788562A

CN101788562A - 甲型h1n1流感病毒总抗体快速检测试纸

Info

Publication number: CN101788562A
Application number: CN201010133187A
Authority: CN
Inventors: 李洲; 杨发青
Original assignee: NEWSCEN COAST BIO-PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: NEWSCEN COAST BIO-PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2010-03-26
Publication date: 2010-07-28

Abstract

本发明是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，采用双抗原夹心法实现对总抗体的检测。采用胶体金标记甲型H1N1流感病毒抗原，包被甲型H1N1流感病毒抗原实现对血液中抗甲型H1N1流感病毒总抗体的检测。可同时检测IgG和IgM。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

Description

甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸

技术领域

本发明是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种以胶体金免疫层析法快速检测甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸。

背景技术

甲型H1N1流感病毒是一种新型的流感病毒，2009年在世界范围内大流行，严重危害人类的健康。其“Ha”指的是血球凝集素(Hemagglutinin)、“Na”指的是神经氨酸酶(Neuraminidase)，甲型流感病毒H有1～15型，有1～9型。H1N1是甲型流感病毒的一种，也是危害最大的病毒之一。在历史上曾造成数次大流行。

目前对甲型H1N1流感检测的主要方法是PCR基因扩增诊断方法，鼻咽试纸抗原诊断方法等。在抗体检测方面，有ELISA等检测方法，但用胶体金类免疫层析技术对甲型H1N1总抗体进行检测尚未有相关报道。对H1N1总抗体检测主要有已下作用：1：对H1N1流感进行辅助诊断。根据“甲型H1N1流感诊疗方案”第三版，甲型H1N1流感病原学检测方法之一为：动态检测双份血清甲型H1N1流感病毒特异性抗体水平呈4倍或4倍以上升高，是感染H1N1流感病毒的指标。2：对是否已感染H1N1进行鉴别，隐性感染或感染过该病毒的人体内抗H1N1病毒总抗体将长期存在。3：对免疫接种的效果进行评价，从数据上看，目前H1N1接种的有效率约为90％，尚有10％的人需要筛选出来重新接种或用其它方式进行该病的预防。考虑到感染和接种的人群巨大，运用一种快速、简便、有效的抗体检测方法非常必要。

免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术，在抗体检测方面已得到较为广泛运用，基本原理如下：利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试剂的NC膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测时当样品中含相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗粒和样品中配体相结合形成复合物，然后在NC膜上层析，再被包被抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的检测T线，通过检测线的有无实现对结果的判定。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，采用双抗原夹心法制备，具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

本发明提供一种甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于塑料支撑板7一端连接上样垫1，上样垫1的一端紧密压接含有标记H1N1特异性的血球凝集素Ha或H1N1特异性的血球凝集素Ha和神经氨酸酶Na抗原的胶体金垫2，胶体金垫2一端紧密压接硝酸纤维素NC膜3，硝酸纤维素NC膜3包被有相互分离的检测T线5和质控C线6，T线为包被在NC膜上的的H1N1特异性的血球凝集素Ha或H1N1特异性的血球凝集素Ha和神经氨酸酶Na抗原，C线为包被在NC膜上的抗H1N1抗体，硝酸纤维素NC膜3的另一端连接吸样垫4形成试纸。

所述的甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于所述的抗原为H1N1特异性的血球凝集素(Ha)和神经氨酸酶(Na)抗原，抗原可以从H1N1病毒中纯化提取或利用基因工程重组表达。

所述的甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于所述的上样垫1为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成4。

所述的甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于，所述的抗原的包被方法为：以0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液(PBS)将H1N1特异性的血球凝集素(Ha)和(或)神经氨酸酶(Na)抗原配制成0.5-2mg/ml的溶液，用喷膜仪在NC膜下部以1ul/cm的参数进行划线，包被T线，同时在NC膜上部包被抗H1N1抗体作为C线，划线后将NC膜在干燥间，温度20-25℃，湿度小于30％，干燥2-5小时。

上述的甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于，所述的抗原标记胶体金颗粒的方法为：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2MK₂CO₃调至pH8.0，按100ml胶体金溶液加入0.5-2mgH1N1血球凝集素(Ha)和神经氨酸酶(Na)抗原，室温搅拌2小时，加入1％牛血清白蛋白BSA，0.1％聚乙二醇PEG20000封闭20min，12000r/m离心30分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至100ml，按1ml溶液铺22cm²的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间，温度20-25℃，湿度小于30％，干燥2-5小时，制成胶体金垫。

上述的甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于所述的试纸的装配方法为：在干燥室内，温度20-25℃，湿度小于30％，取塑料支撑板板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/5；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10；最后用裁剪机将贴好塑料板切成2-5mm宽的试纸条，切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成检测卡。

所述的甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于，检测方法为：将被检血清或血浆平衡至温室，将试纸条或试剂卡平放，在上样垫上加入50-100ul被检样品，样品溶解胶体金并在NC膜上层析，然后用肉眼直接观察在20分钟内C、T线的出现情况，并判定检测结果。

本发明的有益效果是：提供一种利用免疫层析胶体金技术检测甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸。采用双抗原夹心法实现对总抗体的检测。采用胶体金标记甲型H1N1流感病毒抗原，包被甲型H1N1流感病青抗原实现对血液中抗甲型H1N1流感病毒总抗体的检测。可同时检测IgG和IgM。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

附图说明：

图1甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸结构示意图。

附图符号说明：

1：上样垫；2：胶体金垫；3：NC膜；4：吸样垫

5：检测(T)线；6：质控(C)线；7：塑料支撑板

具体实施方式

实施例：制备甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸

1主要材料

1.1特异性甲型H1N1流感病毒Ha抗原：Sino Biological Inc.公司产品，为重组抗原，用于胶体金标记和NC膜T线包被；抗Ha抗体，用Ha免疫山羊自制，用于NC膜包被；氯金酸：Sigma公司产品；硝酸纤维素(NC)膜：Millipore公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白：Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。

1.2临床血清由公司在相关医院获得，其中在近期接种H1N1疫苗样本80份，未接种疫苗样本120份。

1.3甲型H1N1流感病毒IgG ELISA试剂盒，Sino Biological Inc.产品。

2方法

2.1甲型H1N1流感病毒Ha重组抗原的胶体金标记氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0.2M K₂CO₃将溶液调到pH7.0、pH8.0和pH9.0。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液加入0.5mg、1mg、1.5mg将重组抗原将蛋白缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再滴加入到终浓度为0.1％的PEG2000和1％的BSA进行封闭20min，标记结束后以12000r/m离心，弃上清，沉淀按原体积复溶至不同配比的胶体金工作液硼酸盐缓冲液，pH8.0，含BSA、羊血清，蔗糖和表面活性剂中。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺22cm²的比例加样于无纺布上，在温度20-25℃，相对湿度在＜30％的干燥间干燥2-4小时，制成胶体金垫。

2.2H1N1流感病毒Ha重组抗原的包被用0.01M pH7.2PBS将H1N1流感病毒Ha重组抗原分别稀释成0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜下部按1ul/cm进行划线包被，同时在NC膜上部包被抗Ha抗体，用于产品的质控，包被完成后将NC膜在在温度20-25℃，相对湿度在＜30％的干燥间干燥2-5小时。

2.3甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸的组装在干燥室内(温度20-25℃，相对湿度＜30％)取塑料支撑板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫(搭胶体金垫的1/5)；在NC膜C线一侧搭接吸样垫(搭吸样垫的1/10)；然后用裁剪机将贴好塑料板切成3mm或4mm宽的试纸条。切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成甲型H1N1流感病毒总抗体检测试剂卡。

2.4检测方法将被检血清或血浆平衡至温室，将制备好的试纸条或试剂卡平放，在上样垫上加入50-100ul被检样品，若样品中含抗甲型H1N1流感病毒总抗体，则和样品垫上的标记甲型H1N1流感病毒抗原的胶体金结合，形成复合物，并扩散到NC膜上进一步层析，当遇到包被在NC膜上T线处的H1N1流感病毒Ha重组抗原时，复合物则又和包被抗抗原结合，被捕获在包被处，当被捕获的胶体金复合物达到一定数量时，则形成一条肉眼可见的T线；若血清中不含特异性抗体，则不能形成免疫复合物，亦不能形成T线，C线作为试剂的质控标准，阳性和阴性样品检测时均会出现。用肉眼直接观察在5、10、15、20、30和45分钟内C、T线的出现情况，并判定检测结果。

2.5试纸工艺参数调试将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备小样，利用质控血清对试剂进行测试，发现最佳组合。

2.6临床血清检测用本试剂按检测方法对所有临床血清进行检测，同时用Sino Biological Inc.甲型H1N1 ELISA抗体检测试剂进行对照检测。

3结果：3.1试纸参数确定根据小样的检测结果，确定了试纸的最佳标记pH值为8.0；重组混合抗原的最佳标记量为1mg/100ml胶体金溶液；最佳的胶体金工作液为10mM硼酸酸盐缓冲液，pH8.0，含0.5％BSA、10％羊血清，2％蔗糖，0.2％Tween 20；最佳H1N1流感病毒Ha重组抗原包被浓度为1mg/ml。检测结果的最佳判定时间为5-20分钟。但以上参数在制备不同批次产品时可能需要适当调整。

3.2临床血清检测以ELISA试剂为对照，80份近期接种甲型H1N1流感病毒疫苗人员的样本中，检测出阳性70份，ELISA检测出阳性血清72份，灵敏度＝70/72＝97.2％；本试剂对120份未接种H1N1疫苗人员样本中检出阴性为110份，ELISA试剂的检测阴性为112分，相对特异性为110/112＝98.2％。P＞0.05。试剂性能和ELISA试剂相比无显著性差异，适合临床检测需要。

Claims

1.一种甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于塑料支撑板(7)一端连接上样垫(1)，上样垫(1)的一端紧密压接含有标记H1N1特异性的血球凝集素Ha或H1N1特异性的血球凝集素Ha和神经氨酸酶Na抗原的胶体金垫(2)，胶体金垫(2)一端紧密压接硝酸纤维素(NC)膜(3)，硝酸纤维素(NC)膜(3)包被有相互分离的检测(T)线(5)和质控(C)线(6)，T线为包被在NC膜上的的H1N1特异性的血球凝集素Ha或H1N1特异性的血球凝集素Ha和神经氨酸酶Na抗原，C线为包被在NC膜上的抗H1N1抗体，硝酸纤维素(NC)膜(3)的另一端连接吸样垫(4)形成试纸。

2.根据权利要求1所述的甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于所述的抗原为H1N1特异性的血球凝集素(Ha)和神经氨酸酶(Na)抗原，抗原可以从H1N1病毒中纯化提取或利用基因工程重组表达。

3.根据权利要求1所述的甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于所述的上样垫(1)为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成(4)。

4.根据权利要求1和2所述的甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于，所述的抗原的包被方法为：以0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液(PBS)将H1N1特异性的血球凝集素(Ha)和(或)神经氨酸酶(Na)抗原配制成0.5-2mg/ml的溶液，用喷膜仪在NC膜下部以1ul/cm的参数进行划线，包被T线，同时在NC膜上部包被抗H1N1抗体作为C线，划线后将NC膜在干燥间，温度20-25℃，湿度小于30％，干燥2-5小时。

5.根据权利要求1和2所述的甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于，所述的抗原标记胶体金颗粒的方法为：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K₂CO₃调至pH8.0，按100ml胶体金溶液加入0.5-2mg H1N1血球凝集素(Ha)和神经氨酸酶(Na)抗原，室温搅拌2小时，加入1％牛血清白蛋白BSA，0.1％聚乙二醇PEG20000封闭20min，12000r/m离心30分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至100ml，按1ml溶液铺22cm的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间，温度20-25℃，湿度小于30％，干燥2-5小时，制成胶体金垫。

6.根据权利要求1和3所述的甲型H1N1流感病毒总抗体快速检测试纸，其特征在于所述的试纸的装配方法为：在干燥室内，温度20-25℃，湿度小于30％，取塑料支撑板板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/5；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10；最后用裁剪机将贴好塑料板切成2-5mm宽的试纸条，切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成检测卡。