CN102854316A - 一种甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体胶体金法检测试剂盒 - Google Patents
一种甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体胶体金法检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体胶体金法检测试剂盒,包括:盒体、样品稀释液和检测试纸,所述检测试纸由塑料支撑板、上样垫、标记甲型肝炎病毒特异性的抗原VP1的胶体金垫、硝酸纤维素NC膜、检测线T1、T2、质控C线和吸样垫,且位于盒体内。本试剂盒检测样品血清中IgM和IgG同时为阳性的样本结果和ELISA试剂完全一致,无显著性差异,适合用于临床检测;但成本低廉,制备工艺简单,具有实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及甲型肝炎病毒的检测,具体是一种甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体胶体金法检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
甲型肝炎(hepatitis A,简称HA)的病原体是甲型肝炎病毒(HAV),为直径27nm的小RNA病毒(picornavirus)。病毒存在于病人的粪便、血清、胆汁与肝细胞浆中,在体外抵抗力强,60℃加热4小时不死;能耐受pH 3.0的环境;在低温下能长期存活。实验证明,HAV对乙醚、60℃加热1小时及pH3的作用均有相对的抵抗力(在4℃可存活数月)。但加热100℃5分钟呈用甲醛溶液、氯等处理,可使之灭活。非离子型去垢剂不破坏病毒的传染性。
甲型肝炎病毒主要通过粪-口途径传播,传染源多为病人。甲型肝炎的潜伏期为15~45天,病毒常在患者转氨酸升高前的5~6天就存在于患者的血液和粪便中。发病2~3周后,随着血清中特异性抗体的产生,血液和粪便的传染性也逐渐消失。HAV随患者粪便排出体外,通过污染水源、食物、海产品(如毛蚶等)、食具等的传播可造成散发性流行或大流行。也可通过输血或注射方式传播。感染后血清中抗-HAV IGM抗体很快出现,在两周左右达高峰,然后逐渐下降,在8周之内消失,是HAV急性感染和近期感染的血清学证据;抗-HAV IgG抗体产生较晚,在急性期后期和恢复期早期出现(IgM开始下降时,IgG逐渐上升)属保护性抗体,在恢复期达高峰,可持久存在,可保护人体不再次感染,对甲肝流行病学调查、健康体检、了解易感人群有重要意义。
目前对甲型肝炎病毒检测的主要方法是甲型肝炎病毒特异性抗体检测。检测甲型肝炎病毒IGM判定是否为现症感染,检测IgG判定是否曾经感染过,免于再次感染。检测两种抗体有利于对被检对象的进行全面的判定。目前甲型肝炎病毒抗体的检测方法主要是RIA、ELISA等检测方法。在胶体金的检测方法中,有单独检测甲型肝炎病毒IgM或IgG的报道,但用胶体金类免疫层析技术同时检测甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体的检测试剂盒未见报道。和用两种试剂分别检测IgM和IgG抗体相比,同时检测IgM和IgG抗体能减少检测人员的工作量,节约成本;同时减少采血量,减少患者的痛苦。
免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术,在抗体检测方面己得到较为广泛运用,基本原理如下:利用胶体金标记一种抗原或抗体,在试剂的NC膜上包被相应的配对抗原或抗体,检测时当样品中含相应的特异性抗体或抗原时,胶体金标记颗粒和样品中配体相结合形成复合物,然后在NC膜上层析,再被包被抗原或抗体捕获,形成肉眼可见的检测T线,通过检测线的有无实现对结果的判定。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题和缺陷,本发明的目的是提供一种甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体胶体金法检测试剂盒,以实现快速定性检测血清样本中的甲型肝炎病毒。
为实现上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
一种甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体胶体金法检测试剂盒,包括:盒体、样品稀释液和检测试纸,所述检测试纸由塑料支撑板、上样垫、标记甲型肝炎病毒特异性的抗原VP1的胶体金垫、硝酸纤维素NC膜、检测线T1、T2、质控C线和吸样垫,且位于盒体内;其中:
所述塑料支撑板一端粘贴所述上样垫,所述上样垫的一端紧密压接含有标记甲型肝炎病毒特异性的抗原VP1的胶体金垫,胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜,硝酸纤维素NC膜包被有相互分离的检测线T1、检测线T2和质控C线,所述检测线T1为包被在硝酸纤维素NC膜上的抗人IgM抗体,检测线为包被在硝酸纤维素NC膜上的抗人IgG抗体,所述质控C线为包被在硝酸纤维素NC膜上的抗甲型肝炎病毒VP1抗体,硝酸纤维素NC膜的另一端连接吸样垫形成试纸;其中所述的IgM和IgG抗体浓度为10~15ug/mL;
所述标本稀释液为含磷酸钠、磷酸氢钠及氯化钠的混合水溶液。
作为一种优选方案,所述的抗原甲型肝炎病毒特异性的主要抗原中VP1抗原,所述VP1抗原可以利用基因工程重组表达或在培养病毒中纯化。
作为一种优选方案,所述上样垫为玻璃纤维膜或无纺布,所述吸样垫由吸水滤纸组成。
作为一种优选方案,所述的VP1抗原的包被方法为:以0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液(PBS)将抗人IgM抗体配制成l~2mg/mL的溶液,以0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)将抗人IgG抗体配制成l~2mg/mL的溶液,用喷膜仪在NC膜下部以1~1.5ul/cm的参数进行划线,包被检测线Tl和T2,同时在硝酸纤维素NC膜上部包被抗甲型肝炎病毒VP1抗体作为质控C线,划线后将NC膜在干燥间,温度20-25℃,湿度小于30%,干燥2-7小时。
作为一种优选方案,所述标记甲型肝炎病毒特异性的抗原VP1的胶体金垫的制备方法为:以氯金酸一柠檬酸三钠还原法制备直径为30~50nm的胶体金溶液,制备完成后取l00mL胶体金液放在烧杯内,用0.2M K2C03调至pH8.5,按l00mL胶体金溶液加入0.5~2mg甲型肝炎病毒VP1抗原,室温搅拌2小时,加入1%牛血清白蛋白BSA,1%聚乙二醇PEG20000封闭20min,12000r/m离心30分钟,弃上清,用胶体金工作液复溶至l00mL,按1mL溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上,再置干燥间,温度20~25℃,湿度小于30%,干燥2~7小时,制成胶体金垫。
作为一种优选方案,所述检测试纸的装配方法为:在干燥室内,温度20~25℃,湿度小于40%,取塑料支撑板板,将己包被的硝酸纤维素NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴,在硝酸纤维素NC膜检测T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴,在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫,搭胶体金垫的l/5;在硝酸纤维素NC膜质检C线一侧搭接吸样垫,搭吸样垫的1/10;最后用裁剪机将贴好塑料板切成2~5mm宽的试纸条,切好的试纸条再装入盒体内,形成检测试剂盒。
作为一种优选方案,上述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体胶体金法检测试剂盒的检测方法为:将被检血清或血浆平衡至室温,将试纸条平放,在上样垫上加入5~20uL被检样品,再加入50~l00uL的样品稀释液,使胶体金溶解并在NC膜上层析,然后用肉眼直接观察在15分钟内C、T1、T2线的出现情况,并判定检测结果。
与现有技术相比,本发明提供的利用免疫层析胶体金技术检测甲型肝炎病毒IgM为和IgG抗体的新型试剂盒,采用胶体金标记甲型肝炎病毒特异性抗原,包被抗人IgM和IgG抗体实现对血液中抗甲型肝炎病毒抗体的检测,一次检测获得两种检测指标,节约时间和成本,减轻患者的痛苦;实验结果表明,本发明提供的试剂盒与ELISA检测试剂产品结果一致(p>0.05),具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
具体实施方式
以下结合具体实施例,进一步阐明本发明。应理解,下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量,除非特别说明。
实施例
l主要材料
1.1甲型肝炎病毒特异性VP1抗原、VP1抗体:深圳市菲鹏生物股份有限公司产品,为重组抗原,VP1抗原用于胶体金标记,VP1抗体用于NC膜质控线包被;
鼠抗人IgM和IgG抗体:Arista公司产品,用于NC膜包被;
氯金酸:Sigma公司产品;
硝酸纤维素(NC)膜:Millipore公司产品;
牛血清白蛋白(BSA),聚乙二醇PEG20000,水解酪蛋白:Sigma产品。
其它常用试剂均为分析纯试剂。
1.2临床血清由公司在相关医院获得,其中甲型肝炎病毒IgG抗体阳性样本50份,IgM抗体阳性样本15份,其中包括两种抗体均阳性样本8份。两种抗体全为阴性正常人样本60份。
1.3甲型肝炎病毒IgM抗体检测试剂盒(ELISA法),甲型肝炎病毒IgG抗体检测试剂盒(ELISA法):国内己注册的商用产品。
2制备方法
2.1申型肝炎病毒VP1重组抗原的胶体金标记
氯金酸一柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液,制备完成后取三份胶体金,分别用0.2M K2C03将溶液调到pH7.5、pH8.5和pH9.5。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌,按每100mL溶液加入0.5mg、1mg、
1.5mg将重组抗原将蛋白缓慢滴加到胶体金溶液中,继续搅拌2小时,再滴加入到终浓度为0.1%的PEG2000和1%的BSA进行封闭20min,标记结束后以12000r/m离心,弃上清,沉淀按原体积复溶至不同配比的胶体金工作液硼酸盐缓冲液,pH8.5,含BSA、羊血清,蔗糖和表面活性剂中。然后将标记胶体金溶液按1mL溶液铺20cm2的比例加样于无纺布上,在温度20~25℃,相对湿度在<30%的干燥间干燥2-4小时,制成胶体金垫。
2.2 NC膜包被
用0.01M pH7. 2PBS将鼠抗人IgM分别稀释成0.5mg/mL、1mg/mL、1. 5mg/mL、2mg/mL,鼠抗人IgG分别稀释成0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL,然后用喷膜仪在NC膜下部按1uL/cm进行分别划线包被,同时在NC膜上部包被抗VP1抗体,用于产品的质控,包被完成后将NC膜在在温度20-25℃,相对湿度在<30%的干燥间干燥2-5小时。
2.3甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体检测试纸的组装
在干燥室内(温度20-25℃,相对湿度<30%)取塑料支撑板,将己包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴,在NC膜T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴,在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫(搭胶体金垫的1/5);在NC膜C线一侧搭接吸样垫(搭吸样垫的1/10);然后用裁剪机将贴好塑料板切成3mm或4mm宽的试纸条。
2.4检测方法
将被检血清或血浆平衡至温室,将制备好的试纸条或试剂卡平放,在上样垫上加入l0ul被检样品,若样品中含抗甲型肝炎病毒IgM或IgG抗体,则和样品垫上的标记VP1抗原的胶体金结合,形成复合物,并扩散到NC膜上进一步层析,当遇到包被在NC膜上Tl线处的鼠抗人IgM时,复合物则又和包被抗IgM抗体结合,被捕获在包被处;当遇到包被在NC膜上T2线处IgG时,复合物则又和包被抗体结合,被捕获在包被线T2处;当被捕获的胶体金复合物达到一定数量时,则形成一条肉眼可见的Tl或T2线;若血清中不含特异性抗体,则不能形成免疫复合物,亦不能形成T线,C线作为试剂的质控标准,阳性和阴性样品检测时均会出现。用肉眼直接观察在5、10、15、20、和30分钟内C、T线的出现情况,并判定检测结果。
2.5试纸工艺参数调试
将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对,制备小样,利用质控血清对试剂进行测试,发现最佳组合,其中最佳组合为鼠抗人IgM和IgG抗体标记浓度为10~15ug/mL。
2.6临床血清检测用本试剂按检测方法对所有临床血清进行检测,同时用商用检测ELISA试剂进行对照检测。
3结果
3.1试纸参数确定根据小样的检测结果,确定了试纸的最佳标记pH值为8.5;重组混合抗原的最佳标记量为1mg/100mL胶体金溶液;最佳的胶体金工作液为l0mM硼酸酸盐缓冲液,pH8.5,含0.5%BSA、10%羊血清,2%蔗糖,0.2%Tween 20;最佳包鼠抗人IgM和IgG包被浓庋均为1.5mg/mL。检测结果的最佳判定时间为5-15分钟。
3.2临床血清检测
以ELISA试剂为对照,对IgG抗体进行检测,本试剂盒IgG检测出阳性49份,ELISA检测出IgG阳性50份,灵敏度为98%;本试剂对IgG阴性样本检测为阴性样本数58份,相对特异性96. 7%。P>0.05。
以ELISA试剂为对照,对IgM抗体进行检测,本试剂IgM检测出阳性10份,ELISA检测出IGM阳性10份,灵敏度为100.0%;本试剂对IgM阴性样本检测均为阴性,相对特异性100%。P>0.05。
本试剂盒检测样品血清中IgM和IgG同时为阳性的样本本试剂检测和ELISA试剂完全一致。临床检测表明本试剂的性能和ELISA试剂相比无显著性差异,适合用于临床检测;但成本低廉,制备工艺简单,具有实用价值。
最后有必要在此说明的是:以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体胶体金法检测试剂盒,包括:盒体、样品稀释液和检测试纸,所述检测试纸由塑料支撑板、上样垫、标记甲型肝炎病毒特异性的抗原VP1的胶体金垫、硝酸纤维素NC膜、检测线T1、T2、质控C线和吸样垫,且位于盒体内;其特征在于:
所述塑料支撑板一端粘贴所述上样垫,所述上样垫的一端紧密压接含有标记甲型肝炎病毒特异性的抗原VP1的胶体金垫,胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜,硝酸纤维素NC膜包被有相互分离的检测线T1、检测线T2和质控C线,所述检测线T1为包被在硝酸纤维素NC膜上的抗人IgM抗体,检测线为包被在硝酸纤维素NC膜上的抗人IgG抗体,所述质控C线为包被在硝酸纤维素NC膜上的抗甲型肝炎病毒VP1抗体,硝酸纤维素NC膜的另一端连接吸样垫形成试纸;其中所述的IgM和IgG抗体浓度为10~15ug/mL;
所述标本稀释液为含磷酸钠、磷酸氢钠及氯化钠的混合水溶液。
2.根据权利要求1所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体胶体金法检测试剂盒,其特征在于:所述的抗原甲型肝炎病毒特异性的主要抗原中VP1抗原,所述VP1抗原可以利用基因工程重组表达或在培养病毒中纯化。
3.根据权利要求1所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体胶体金法检测试剂盒,其特征在于:所述上样垫为玻璃纤维膜或无纺布,所述吸样垫由吸水滤纸组成。
4.根据权利要求1所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体胶体金法检测试剂盒,其特征在于:所述的VP1抗原的包被方法为:以0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液(PBS)将抗人IgM抗体配制成l~2mg/mL的溶液,以0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)将抗人IgG抗体配制成l~2mg/mL的溶液,用喷膜仪在NC膜下部以1~1.5ul/cm的参数进行划线,包被检测线Tl和T2,同时在硝酸纤维素NC膜上部包被抗甲型肝炎病毒VP1抗体作为质控C线,划线后将NC膜在干燥间,温度20-25℃,湿度小于30%,干燥2-5小时。
5.根据权利要求1所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体胶体金法检测试剂盒,其特征在于:所述标记甲型肝炎病毒特异性的抗原VP1的胶体金垫的制备方法为:以氯金酸一柠檬酸三钠还原法制备直径为30~50nm的胶体金溶液,制备完成后取l00mL胶体金液放在烧杯内,用0.2M K2C03调至pH8.5,按l00mL胶体金溶液加入0.5~2mg甲型肝炎病毒VP1抗原,室温搅拌2小时,加入1%牛血清白蛋白BSA,1%聚乙二醇PEG20000封闭20min,12000r/m离心30分钟,弃上清,用胶体金工作液复溶至l00mL,按1mL溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上,再置干燥间,温度20~25℃,湿度小于30%,干燥2~5小时,制成胶体金垫。
6.根据权利要求1所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体胶体金法检测试剂盒,其特征在于:所述检测试纸的装配方法为:在干燥室内,温度20~25℃,湿度小于40%,取塑料支撑板板,将己包被的硝酸纤维素NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴,在硝酸纤维素NC膜检测T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴,在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫,搭胶体金垫的l/5;在硝酸纤维素NC膜质检C线一侧搭接吸样垫,搭吸样垫的1/10;最后用裁剪机将贴好塑料板切成2~5mm宽的试纸条,切好的试纸条可以再装入盒体内,形成检测试剂盒。
7.根据权利要求1所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体胶体金法检测试剂盒,其特征在于:所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗体胶体金法检测试剂盒的检测方法为:将被检血清或血浆平衡至室温,将试纸条平放,在上样垫上加入5~20uL被检样品,再加入50~l00uL的样品稀释液,使胶体金溶解并在硝酸纤维素NC膜上层析,然后用肉眼直接观察在15分钟内C、T1、T2线的出现情况,并判定检测结果。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130102 |