CN111562365A - 一种新型冠状病毒IgG/IgA抗体检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型冠状病毒IgG/IgA抗体检测试剂盒，属于生物检测技术领域，该试剂盒包括胶体金检测试剂卡和缓冲液；所述胶体金检测试剂卡包括塑料底板，在所述塑料底板一端粘贴有缓冲液垫，所述缓冲液垫的一端紧密压接金标垫，所述金标垫一端紧密压接样品垫，所述样品垫一端紧密压接金标鼠IgG抗体垫，所述金标鼠IgG抗体垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜，所述硝酸纤维素NC膜上依次包被有相互分离的检测线A、检测线G和质控线C，所述硝酸纤维素NC膜的另一端连接吸水垫；该试剂盒成本低、使用方便、检测灵敏度高、抗干扰能力强、检测时间短，可供临床医生快速判断是否确诊新型冠状病毒。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种新型冠状病毒IgG/IgA抗体检测试剂盒。
背景技术
普通实时定量荧光PCR核酸检测试剂的迅速上市和临床应用在患者临床诊断和疑似患者排查中发挥了重要作用，但其受操作繁琐、耗时长、需要集中送检等限制，仍不能满足当前快速增长的大量疑似患者、无症状感染者等的诊断需求。胶体金标记的免疫学检测依赖于特异性的抗体，可实现对2019-nCoV肺炎的快速诊断。因此研制符合当前疫情流行趋势的商品化检测试剂盒具有重要意义。
免疫层析胶体金技术作为POCT快速诊断技术之一，主要利用胶体金标记抗原或抗体反应实现可视化的联合检测放方式。现今，胶体金技术主要是用IgG 和IgM的联合检测，IgM会随着时间的延长逐渐消失。其往往存在灵敏度低、抗干扰能力弱的缺点，时常出现试剂诊断假阴性、假阳性的困扰，这不仅困扰着诊断环节，也存在于康复环节，没有准确的诊断难以有精准的治疗，因此如何精准地批量筛查疑似病例，供临床医生准确判断是否为新型冠状病毒肺炎，以便于快速隔离免于传染给更多的人，是亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型冠状病毒IgG/IgA抗体检测试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种新型冠状病毒IgG/IgA抗体检测试剂盒，包括胶体金检测试剂卡和缓冲液；
所述胶体金检测试剂卡包括塑料底板，在所述塑料底板一端粘贴有缓冲液垫，所述缓冲液垫的一端紧密压接金标垫，所述金标垫一端紧密压接样品垫，所述样品垫一端紧密压接金标鼠IgG抗体垫，所述金标鼠IgG抗体垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜，所述样品垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜，所述硝酸纤维素NC膜上依次包被有相互分离的检测线A、检测线G和质控线C，所述硝酸纤维素NC膜的另一端连接吸水垫；
所述金标垫上含有标记抗新型冠状病毒特异性抗原；
所述检测线A上含有鼠抗人IgA抗体；
所述检测线G上含有鼠抗人IgG抗体。
进一步地，所述检测线A、检测线G和质控线C相互平行且间隔等宽。
进一步地，所述质控线C上包被有羊抗鼠二抗。
进一步地，所述检测线A、检测线G和质控线C之间的间隔为2mm。
进一步地，所述硝酸纤维素NC膜的孔径为0.22μm。
进一步地，所述缓冲液为含3wt％的牛血清蛋白的Tris缓冲液。
本发明公开了以下技术效果：
正常人血清中的IgA是机体粘膜局部抗感染免疫的主要抗体，其并不会伴随着时间减弱。为此，本发明建立了一种新型冠状病毒IgG/IgA抗体检测试剂盒，使用的胶体金标记抗原为新冠病毒特异性N+S抗原，与新冠病毒抗体特异性结合，能方便快速的检测血液中是否存在抗新型冠状病毒IgA抗体和/或IgG 抗体，同时本发明成本低、使用方便、检测灵敏度高、抗干扰能力强、检测时间短，以供临床医生快速判断是否确诊新型冠状病毒，以及同时检测IgA与IgG 抗体可动态监测患者感染的过程，同时本发明检测时间短、检测灵敏度高、抗干扰能力强、成本低、使用简便，适用于大规模快速筛查新型冠状病毒疑似患者以及动态监测患者感染的过程。
本发明一种新型冠状病毒IgG/IgA抗体检测试剂盒，制备工艺简单，产品使用简便，成本低廉，适合推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明胶体金检测试剂卡的结构示意图；
其中，1-塑料底板，2-缓冲液垫，3-金标垫，4-样品垫，5-金标鼠抗6-硝酸纤维素NC膜，7-检测线A，8-检测线G，9-质控线C，10-吸水垫。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
1、引物设计、测序、蛋白纯化
(1)质粒构建和蛋白原核表达
根据CenBank中报道的SARS-COV-2的N和S蛋白基因序列，设计特异性引物，分别用于上述两种基因的扩增。通过目的片段扩增、酶切、连接和转化，得到最终含有N和S蛋白基因序列的质粒。将构建好的质粒测序分析其氨基酸序列，测序结果如SEQ ID No.1，N蛋白基因全长1257bp，编码419个氨基酸， S蛋白基因全长1479bp，编码493个氨基酸。将N蛋白基因+甘氨酸柔性肽+S蛋白基因+His基因插入到PET-28a载体中构建成原核表达载体，然后通过转化和诱导，SDS-PAGE凝胶电泳检测表明，获得了重组蛋白。通过薄层扫描表明得到了核蛋白的高效表达。
(2)蛋白纯化
首先，将NTA树脂装入合适的层析柱，将目标蛋白加到NTA层析柱中并用 10倍NTA体积的NTA-0Buffer洗，流速控制在15ml/h左右，收集穿透部分，然后分别用5倍NTA体积NTA-20，NTA-40，NTA-60，NTA-100，NTA-500洗脱，流速控制在15ml/h左右，收集洗脱液，确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是SDS/PAGE分析蛋白质的分布。目标蛋白质的进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定；纯化的目标蛋白质需要复性，根据蛋白质的特性。
本实施例直接将蛋白置于Tris溶液与PBS缓冲液中透析复兴均产生沉淀，直接将菌体超声后，取沉淀用50mMTris+2M尿素ph＝12进行过夜溶解后，离心，取上清透析至ph＝9.5的Tris溶液中。
2、装配试剂盒
如图1所示，在干燥室内，温度22-25℃，湿度小于45％，在塑料底板1一端粘贴缓冲液垫2，缓冲液垫2的一端紧密压接含有标记抗新型冠状病毒 (2019-nCoV)特异性抗原的金标垫3，金标垫3的一端紧密压接样品垫4，样品垫4的一端紧密压接硝酸纤维素NC膜5，硝酸纤维素NC膜上包被有相互分离的检测线A 6、检测线G 7和质控线C 8，硝酸纤维素NC膜的另一端连接吸水垫9形成胶体金检测试剂卡，包装得到试剂盒。
3、试剂盒检测
检测方法：
1)将检测试剂及样本放至室温下，取出试剂盒，平放；
2)用滴管取适量新鲜的血液样本；
3)在洁净的离心管中加入1ml样本缓冲液，将血样加入样品稀释管，充分搅拌混匀后，静置；
4)用移液枪吸取80ul稀释后的样品加入到样品孔中，5-15分钟内判定结果。
新型冠状病毒(2019-nCoV)IgG/IgA抗体的检测结果如表1所示。
共检测110例患者血浆样本，并将检测结果与临床上新型冠状病毒感染的肺炎诊断标准及疾病进程的判定结果进行对比，选择评价诊断试剂一致性的 Kappa一致性检验为统计工具。
对52例确诊病例血浆样本和58例排除病例血清样本，试剂的IgA的总符合率为61.80％，Kappa＝0.2056；
对52例确诊病例血浆样本和58例排除病例血清样本，试剂的IgG的总符合率为92.70％，Kappa＝0.8538；
对52例确诊病例血浆样本和58例排除病例血清样本，试剂的IgA联合IgG 的总符合率为92.70％，Kappa＝0.8538；
表1
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 浙江省人民医院
<120> 一种新型冠状病毒IgG/IgA抗体检测试剂盒
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2826
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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ggtggcggct ctggcggcgg tggttctggc ggcggtggct ccatgttcgt tttcctggtt 1320
ctgctgccgc tggttagcag ccaatgcgtg aatctgacca cccgcaccca actgccgccg 1380
gcgtacacca acagcttcac ccgtggtgtt tactatccgg acaaagtttt tcgtagcagc 1440
gtgctgcaca gcacccagga cctgttcctg ccgttcttta gcaacgttac ctggttccac 1500
gcgatccacg tgagcggcac caacggcacc aagcgtttcg acaacccggt gctgccgttt 1560
aacgatggtg tttacttcgc gagcaccgag aagagcaaca tcattcgtgg ttggattttt 1620
ggcaccaccc tggacagcaa aacccagagc ctgctgatcg ttaacaacgc gaccaacgtg 1680
gttattaagg tgtgcgagtt ccaattttgc aacgatccgt tcctgggcgt ttactatcac 1740
aagaacaaca aaagctggat ggagagcgaa tttcgtgttt atagcagcgc gaacaactgc 1800
acctttgagt acgtgagcca gccgttcctg atggacctgg aaggcaagca aggcaacttc 1860
aaaaacctgc gtgagttcgt gttcaagaac attgatggtt acttcaaaat ctacagcaag 1920
cacaccccga tcaacctggt tcgtgacctg ccgcagggtt ttagcgcgct ggagccgctg 1980
gttgacctgc cgatcggtat taacatcacc cgttttcaaa ccctgctggc gctgcaccgt 2040
agctacctga cgccgggtga cagcagcagc ggttggaccg ctggtgctgc ggcgtactat 2100
gttggttacc tgcaaccgcg taccttcctg ctgaaataca acgaaaacgg caccatcacc 2160
gatgcggttg attgcgcgct ggacccgctg agcgaaacca agtgcaccct gaagagcttc 2220
accgtggaga agggtattta tcagaccagc aacttccgtg tgcaaccgac cgaaagcatt 2280
gttcgttttc cgaacatcac caacctgtgc ccgtttggcg aggttttcaa cgcgacccgt 2340
ttcgcgagcg tgtatgcgtg gaaccgtaaa cgtatcagca actgcgttgc ggactatagc 2400
gtgctgtaca acagcgcgag cttcagcacc tttaagtgct atggtgtgag cccgaccaaa 2460
ctgaacgatc tgtgctttac caacgtttac gcggatagct tcgtgattcg tggcgacgag 2520
gttcgtcaga tcgcgccggg tcaaaccggc aagattgcgg actacaacta taaactgccg 2580
gacgatttca ccggctgcgt tatcgcgtgg aacagcaaca acctggatag caaagtgggt 2640
ggcaactaca actatctgta ccgtctgttt cgtaagagca acctgaaacc gttcgagcgt 2700
gacattagca ccgaaatcta ccaggcgggt agcaccccgt gcaacggtgt tgagggcttt 2760
aactgctatt tcccgctgca aagctacggt ttccaaccga ccaacggtgt tggttaccag 2820
ccgtac 2826
Claims (6)
1.一种新型冠状病毒IgG/IgA抗体检测试剂盒，其特征在于，包括胶体金检测试剂卡和缓冲液；
所述胶体金检测试剂卡包括塑料底板，在所述塑料底板一端粘贴有缓冲液垫，所述缓冲液垫的一端紧密压接金标垫，所述金标垫一端紧密压接样品垫，所述样品垫一端紧密压接金标鼠IgG抗体垫，所述金标鼠IgG抗体垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜，所述样品垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜，所述硝酸纤维素NC膜上依次包被有相互分离的检测线A、检测线G和质控线C，所述硝酸纤维素NC膜的另一端连接吸水垫；
所述金标垫上含有标记抗新型冠状病毒特异性抗原，所述标记抗新型冠状病毒特异性抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述检测线A上含有鼠抗人IgA抗体；
所述检测线G上含有鼠抗人IgG抗体。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgG/IgA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述检测线A、检测线G和质控线C相互平行且间隔等宽。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgG/IgA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述质控线C上包被有羊抗鼠二抗。
4.根据权利要求2所述的新型冠状病毒IgG/IgA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述检测线A、检测线G和质控线C之间的间隔为2mm。
5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgG/IgA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素NC膜的孔径为0.22μm。
6.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgG/IgA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为含3wt％的牛血清蛋白的Tris缓冲液。
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