CN111796090B

CN111796090B - 牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法

Info

Publication number: CN111796090B
Application number: CN202010318161.0A
Authority: CN
Inventors: 陈启军; 杨娜; 姜宁; 丁莹莹; 桑晓宇; 冯颖; 陈冉; 王新一
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2020-04-21
Filing date: 2020-04-21
Publication date: 2023-02-07
Anticipated expiration: 2040-04-21
Also published as: CN111796090A

Abstract

本发明实施例公开了一种牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法，属于生物检测技术领域。所述试纸条的结合垫上包被有时间分辨荧光微球标记的小鼠IgG抗体和Kazal‑type serine protease inhibitor domain‑containing protein抗原，所述检测线上包被有Kunitz protease inhibitor protein抗原，所述质控线上包被有山羊抗小鼠IgG二抗。本发明的试纸条操作简便，有很好的敏感性和准确性，可以替代ELISA、胶体金等诊断方法无法在现场操作且准确性低的弊端，同时还具有良好的特异性，为牛细粒棘球蚴病的流行病学调查和该疾病的诊断提供了一种快速的诊断方法。

Description

牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法

技术领域

本发明实施例涉及生物检测技术领域，具体涉及一种牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法。

背景技术

细粒棘球蚴病(包虫病)为一种严重的全球性的人畜共患病，人或反刍动物主要通过误食了细粒棘球绦虫排出的虫卵而发病，被称为“虫癌”。截止到现在，我国依旧将该病列为重点防控和主要防护的动物疫病之一。

目前，关于细粒棘球蚴病诊断技术的研究投入较少，最常用的诊断方法是解剖查看虫体。随着分子技术和免疫技术的发展，现在有分子诊断，比如LAMP，免疫学诊断，如ELISA试剂盒法、胶体金等，但从临床应用发现，这些检测方法的准确性不高、方便性不强，无法便于基层工作者操作检测。

虽然，细粒棘球蚴病在人类诊断方面已有很多研究，但在诊断动物方面的研究甚少，且动物在自然感染该病时，抗体反应不明显，易导致诊断错误。因此建立一种高效、准确、特异性好且简便的动物细粒棘球蚴的免疫诊断技术至关重要。

层析技术结合了免疫标记和免疫层析的特点，以时间分辨荧光微球作为示踪物，制备免疫层析试纸条，克服了胶体金免疫层析(胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种免疫标记技术)灵敏度相对偏低，且只能用于定性或半定量检测的缺点；也克服了其他免疫学方法(如ELISA法)的不方便性、不准确性。

发明内容

为此，本发明提供一种牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法，以解决现有技术检测方法存在的准确性不高、方便性不强等问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，本发明实施例提供了一种牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条，包括PVC底板、以及依次设置在所述PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫上包被有时间分辨荧光微球标记的小鼠IgG抗体和Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein抗原，所述硝酸纤维素膜上设有间隔开的检测线和质控线，检测线上包被有Kunitzproteaseinhibitorprotein抗原，质控线上包被有山羊抗小鼠IgG二抗。

进一步地，所述Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein抗原是如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，编码所述Kazal-type serine proteaseinhibitor domain-containing protein抗原的基因是如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

进一步地，所述Kunitz protease inhibitorprotein抗原是如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，编码所述Kunitz protease inhibitor protein抗原的基因是如SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。

进一步地，所述Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein抗原和Kunitz protease inhibitorprotein抗原的制备方法：

分别构建重组表达载体pGEX-4T-1-Kazal-type serine protease inhibitordomain-containing protein和pGEX-4T-1-Kunitz protease inhibitor protein，转入BL21(DE3)表达感受态中，进行蛋白小量诱导表达确定培养条件后，进行蛋白大量诱导表达，利用20mM还原性谷胱甘肽洗脱与蛋白结合后的Gluthathione-Sephgrose-4B，进而获得高纯度的重组抗原。

根据本发明实施例的第二方面，本发明实施例提供了一种上述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

S1结合垫的制备：用标记量为1mg/mL的小鼠IgG抗体和25μg/mL的Kazal-typeserine protease inhibitor domain-containing protein抗原对时间分辨荧光微球进行标记，然后添加2倍体积的荧光工作液进行稀释，混合均匀，喷涂在结合垫中，烘干；

S2硝酸纤维素膜的制备：将2mg/mL的Kunitz protease inhibitor protein抗原喷涂于检测线所在位置，2mg/mL的山羊抗小鼠IgG二抗喷涂于质控线所在位置，烘干；

S3试纸条的组装：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸从左到右顺次搭接安装在PVC底板上。

进一步地，所述荧光工作液是0.01M磷酸盐缓冲液。

进一步地，S1和S2的喷涂步骤中，包被参数均为0.75μL/cm。

进一步地，采用0.1M Na₂B₄O₇·10H₂O、1％PVP、0.2％Casein-Na、1％Triton-X100、1％Tetronic 1307、0.2％NaN₃，调至pH＝9.3的样品垫处理液对样品垫进行处理。

根据本发明实施例的第三方面，本发明实施例提供一种上述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的使用方法，血清与样品缓冲液按体积比1:2稀释后得到血清待检样本，取75μL血清待检样本，滴加在样品垫上，15min后，用紫外灯照射试纸条观察结果，如果检测线和质控线均显色，证明该样品为阳性；如果检测线不显色，质控线显色，证明该样品为阴性。

进一步地，所述样品缓冲液为pH＝7.8的0.05MTris-HCl、0.9％NaCl、1.5％BSA、0.01％Tween-20、0.1％NaN₃。

本发明的试纸条基于双抗原夹心免疫层析法，根据抗原抗体的特异性反应及免疫层析分析技术，检测牛包虫病抗体。在结合垫(玻璃纤维膜)中包被荧光微球标记的Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein抗原和小鼠IgG抗体，同时在硝酸纤维素膜上的T线(检测线)包被Kunitz protease inhibitorprotein抗原，C(质控线)线包被山羊抗小鼠IgG二抗。检测时，如果样品内含有牛包虫病IgG抗体时，样品中的IgG抗体与试纸条前端结合垫中的“荧光-抗原”结合，由于虹吸作用沿试纸条侧向流动，在检测区被另一抗原捕获，形成荧光-抗原-抗体-抗原免疫复合物，利用荧光免疫分析仪，测定复合物中的稀土离子发射的荧光强度。在紫外灯(365nm)投射下，试纸条的测试区和控制区域，激发附着的荧光微球偶联物，发射光被聚集并转变为电信号，电信号的强弱和荧光分子数目密切相关，待测样本中被分析物的含量可由荧光分析仪自动分析。

本发明实施例具有如下优点：

本发明的试纸条操作简便，有很好的敏感性和准确性，可以替代ELISA、胶体金等诊断方法无法在现场操作且准确性低的弊端，同时还具有良好的特异性，为牛细粒棘球蚴病的流行病学调查和疾病的诊断提供了一种快速的诊断方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明的细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的结构示意图，其中，1、PVC底板；2、样品垫；3、结合垫；4、硝酸纤维素膜；5、吸水垫；6、检测线；7、质控线。

图2为本发明的Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein的跨膜区(左)和信号肽(右)的预测结果。

图3为本发明的Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein的抗原性和亲水性分析。

图4为本发明的Kunitzprotease inhibitorprotein的跨膜区(左)和信号肽(右)的预测结果。

图5为本发明的Kunitzprotease inhibitorprotein的抗原性和亲水性分析。

图6为本发明的pGEX-4T-1-Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein重组表达质粒双酶切验证。

图7为本发明的pGEX-4T-1-Kunitz protease inhibitorprotein重组表达质粒双酶切验证。

图8为本发明的Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein-GST重组蛋白质的SDS-PAGE(左)和Western-blot(右)验证。

图9为本发明的Kunitz protease inhibitor protein-GST重组蛋白质的SDS-PAGE(左)和Western-blot(右)验证。

图10为本发明的试纸条的特异性检测结果，其中，1、牛细粒棘球蚴病阳性血清；2、牛肝片吸虫病阳性血清；3、牛脑包虫病阳性血清；4、猪旋毛虫病阳性血清。

图11为本发明的试纸条的灵敏度检测结果，其中，1-5：血清依次按1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600稀释；6：样品稀释液。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中的方法中如无特别说明，所用的生化试剂均为市售试剂，所有的方法均为常规方法。

实施例1

寄生虫所分泌的蛋白统称为ES蛋白，它可以在机体内循环或在细胞表面停留。除此之外，分泌蛋白在胞外可以局部自由扩散，甚至在细胞崩解后仍在体内循环。并且分泌蛋白在机体内发挥了许多功能，例如促进细胞外的消化酶的产生、神经递质的传递和促进抗菌肽的形成等。而在寄生虫体内，分泌蛋白不仅在免疫应答中起着重要作用，并且它也可以作为诊断抗原。

生物信息学是一门结合生物学、统计学等多门学科对生物学数据进行研究的方法和技术。由于它简便、快速的特点，而被普遍应用于预测蛋白质功能、构像等其他生物学特性。因此本发明基于生物信息学方法挑取了Kazal-type serine protease inhibitordomain-containing protein和Kunitz protease inhibitor protein作为诊断抗原。

不仅如此，Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein隶属于SPI(serine proteinase inhibitor)家族，该蛋白在机体内起到调节炎症反应、先天性免疫和抗菌防御系统的作用。

Kunitz protease inhibitorprotein含有Kunitz的结构域的蛋白都具有典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用，丝氨酸蛋白酶抑制剂被认为是寄生虫分泌物的关键成分，并且通过调控抑制宿主体内由免疫细胞分泌的酶得以在宿主体内生存。并且Kunitz typeinhibitor蛋白在肝片吸虫的成虫的肠道和被膜中均被发现，并且这种蛋白似乎与宿主的免疫防护系统有着密切的联系，可以调控树突状细胞的成熟来调节炎症反应。更重要的是，在肝片吸虫中有一个由许多分泌蛋白调节的系统，这些蛋白被类似于外泌体的囊泡包裹着，其中就包括Kunitz type inhibitor和其他六种Kunitz的肽段。而在细粒棘球绦虫体内，Kunitz-type inhibitors不仅可以高效的阻断宿主蛋白(丝氨酸蛋白酶、阳离子通路)，并且在感染宿时，产生与宿主体内相似的免疫分子来适应机体的免疫系统的识别。

因此，依据对上述两种蛋白进行了生物信息学分析和这两种蛋白在虫体内发挥着重要的调节作用。本发明选择了Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein和Kunitz protease inhibitorprotein两个蛋白作为诊断抗原。

本实施例中，采用的Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein(GenBank：EUB64872.1)的氨基酸序列为：

MLAAKSMVGLFLLVLFALSSRESNAEEAGETPLDVCASCDESKCPPVTMCPVGEVKDYCGCCSVCGLEQGHRCNTRQELHDMLSGRRRHGYYGACGKNLECQPRTDVDEQSLGEENICVCTKPGRFCASNGETYSACELEAVQAKSFGEVFLISYDDCKSEPKIVAASESQRVPEGNRTTFWCEIKGYPLPTVTWYYFAPGGSYEAILLPGDSDEMSVSLRGAPPGRRIISHLQIRRFDIKYEGIYQCYVENDLGSDRHNITAIYAPPEPRPRDL(SEQ ID NO.1)。

上述蛋白的基因序列为：

ATGCTAGCCGCCAAGTCGATGGTTGGCCTCTTCCTCCTCGTCCTCTTCGCTCTGAGTAGTCGTGAGTCTAACGCAGAGGAGGCTGGTGAAACACCGCTGGATGTCTGCGCGTCCTGCGATGAGTCAAAGTGTCCCCCCGTGACCATGTGTCCCGTGGGAGAGGTAAAAGACTATTGTGGCTGTTGCTCGGTCTGCGGCTTAGAGCAGGGACATCGATGCAATACGAGACAGGAATTACATGACATGCTCTCGGGCAGACGACGTCACGGCTACTACGGCGCCTGCGGCAAGAACCTTGAATGTCAGCCTCGCACTGACGTTGATGAGCAGTCACTGGGTGAGGAGAACATTTGCGTGTGCACCAAGCCCGGTCGTTTCTGCGCCAGCAACGGAGAAACCTACTCGGCTTGTGAGTTGGAGGCCGTGCAGGCCAAGTCGTTTGGTGAGGTATTCCTCATCTCCTATGACGATTGTAAATCAGAGCCGAAGATTGTAGCCGCATCGGAGTCGCAGCGAGTTCCCGAAGGAAACAGGACAACCTTCTGGTGCGAAATCAAGGGTTATCCCCTTCCAACAGTCACCTGGTATTACTTTGCTCCCGGTGGATCATATGAGGCCATTCTACTCCCGGGGGACTCTGATGAAATGAGTGTGAGTCTGCGTGGTGCGCCACCGGGACGTCGCATAATCTCCCACCTGCAGATCCGGAGATTCGACATCAAATACGAGGGCATCTACCAGTGCTACGTAGAGAACGATCTCGGAAGTGACCGCCACAATATCACCGCCATCTACGCTCCACCGGAGCCTCGGCCTCGAGATCTCTAG(SEQ ID NO.2)。

用TMHMM、SignaIP在线网址预测了Kazal-type serine protease inhibitordomain-containingprotein的信号肽和跨膜区，如图2所示，发现该蛋白无跨膜区，有一个信号肽，因此该蛋白可能是分泌蛋白。用DNAStar软件分析了该蛋白的抗原性和亲水性，如图3所示，Hydrophilicity Plot(红色方框标注)图示中轴线以上表示亲水性，轴线以下表示疏水性；Antigenic(红色方框标注)图示中轴线以上区域越多表示抗原性越好，相反在轴线以下区域越多表示抗原性较差。由此表明该抗原的亲水性较差，但抗原性指数较好，推测该蛋白有较好的抗原性。

采用的Kunitz protease inhibitor(GenBank：CDS23863.1)的氨基酸序列为：

MPVQMSHWLLCLLFIGFAFSFNNFEVPPLCRPQLQTANCWYYRPNYVYNHLLDRCIWSGWSSCNSKLNSFKTRRECELICLGGRRRSSPRLQESDEYYSQGFYGEVPQKRRYWPYEVHPID(SEQ ID NO.3)。

上述蛋白的基因序列为：

ATGCCTGTCCAAATGAGTCATTGGCTTCTCTGTCTTCTCTTCATTGGTTTTGCATTTTCTTTTAACAATTTTGAGGTTCCGCCACTATGTAGACCGCAGCTACAGACTGCAAACTGCTGGTACTACCGTCCAAACTATGTCTACAATCACCTCCTCGATCGGTGCATCTGGAGTGGATGGAGCTCGTGCAATTCGAAGCTGAACAGTTTCAAGACCCGTAGGGAATGCGAGCTAATCTGCCTCGGTGGTCGTCGACGGAGCAGTCCGCGACTGCAAGAGAGCGACGAGTACTACTCTCAAGGCTTCTATGGTGAGGTGCCGCAGAAGAGGAGGTACTGGCCCTACGAAGTCCATCCAATTGACTAA(SEQ IDNO.4)。

用TMHMM、SignaIP在线网址分析了Kunitz protease inhibitor protein的信号肽和跨膜区，如图4所示，发现该蛋白无跨膜区，有一个信号肽，因此该蛋白可能是分泌蛋白。用DNAStar软件分析了该蛋白的抗原性和亲水性，如图5所示，Hydrophilicity Plot(红色方框标注)图示中轴线以上表示亲水性，轴线以下表示疏水性；Antigenic(红色方框标注)图示中轴线以上区域越多表示抗原性越好，相反在轴线以下区域越多表示抗原性较差。由此表明该抗原的亲水性一般，但抗原性指数较好，推测该蛋白有较好的抗原性。

上海生工生物工程股份有限公司分别构建含有上述SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的目的基因的重组表达载体pGEX-4T-1-Kazal-type serine proteaseinhibitor domain-containing protein和pGEX-4T-1-Kunitz proteaseinhibitorprotein，经双酶切和测序正确后，转化BL21(DE3)表达感受态细胞，经诱导、表达获得重组蛋白Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein和Kunitzprotease inhibitorprotein。具体步骤如下：

一、双酶切验证

(1)将插入目的基因的重组表达载体冻干粉的离心管3000rpm/常温离心1min；

(2)用50μL无菌ddH₂O溶解冻干粉，之后用涡旋仪轻轻混匀，掌上离心机瞬离30s；

(3)用NANODROP测浓度；

(4)用限制性内切酶双酶切重组表达质粒pGEX-4T-1-Kazal-type serineprotease inhibitor domain-containing protein或pGEX-4T-1-Kunitz proteaseinhibitorprotein，反应体系如表1所示，反应条件为37℃/10min。

表1表达质粒双酶切体系

本实施例的pGEX-4T-1-Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein重组表达质粒，目的基因为756bp，用BamHI/XhoI限制性内切酶，其双酶切验证结果如图6所示。

pGEX-4T-1-Kunitzprotease inhibitorprotein重组表达质粒，目的基因为309bp，用BamHI/XhoI限制性内切酶，其双酶切验证结果如图7所示。

二、蛋白质的表达纯化

1、双酶切验证过后，将重组表达质粒转化表达感受态

(1)取50μL冰浴完毕的BL21(DE3)放入1.5mL无菌离心管中，置于冰盒中融化(切勿用手搓化)，用移液器吸取5μL表达质粒加入其中，在冰上静置30min；

(2)冰浴后，用浮漂将离心管放入水浴锅42℃热激45s，然后，将管转移到冰上，冰浴2min；

(3)在无菌超净台内，在每个离心管中加400-500μL无菌液体LB培养基，220rpm，在37℃摇床培养1h；

(4)先将对应抗性的LB固体平皿置于37℃预热，待平皿内的水蒸气完全挥发后取出备用；

(5)根据实验需求，吸取适量转化之后的感受态细胞，呈散点似的滴加在预热好的平皿中，均匀涂布感受态细胞，放入37℃培养箱；

(6)在37℃恒温培养箱中过夜培养。

2、GST标签重组蛋白质的小量诱导表达

(1)用无菌白枪头挑取转化后BL21(DE3)的单个菌落，PCR鉴定正确后，接种于10mL含有相应抗性的液体LB培养基，200rpm/37℃恒温培养箱，过夜培养；

(2)次日，在无菌操作台中保菌后，用移液器吸取100μL的菌液接种于10mL含有相对抗性的液体LB培养基中，200rpm/37℃条件下培养，当菌液OD600nm＝0.6-0.8时，可加入IPTG诱导；

(3)加蛋白诱导剂前，在无菌操作台中，吸100μL未诱导全菌，作为阴性对照。之后，加入0.1M IPTG诱导剂，使IPTG终浓度为0.1mM、0.3mM、0.6mM，在不同的温度进行诱导(16℃、22℃、32℃)；

(4)吸取16℃低温培养22h、22℃低温培养18h、32℃恒温培养8h的菌液，收集好的菌液置于15mL除酶管中，在4℃离心机4000rpm离心15min，弃掉上清，菌体沉淀用1mL磷酸盐缓冲液重悬后，取50μL菌液作为诱导后全菌样品，余下的菌液用小型超声破碎仪破碎，仪器的破碎功率为25w，超声2s，停歇3s，观察菌体清澈即可(部分菌液在破碎时，清澈度越来越低，可能该蛋白为包涵体，属正常现象)，破碎后的菌液置于1.5mL EP管中，在4℃离心机中5000rpm离心10min，取100μL上清(诱导后上清)后，弃掉上清，沉淀用1mL磷酸盐缓冲液重悬后，取100μL作为诱导后沉淀；

(5)将不同温度和不同IPTG浓度下的上清、沉淀、全菌，分别加入20μL1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，在100℃沸水中煮10min后，取出备用；

(6)将制备好的不同温度和不同IPTG浓度的全菌、上清、沉淀的蛋白样品，各取10μL(同一温度不同的IPTG浓度的蛋白样品依次上样，以便后续观察)加样于10％SDS-PAGE蛋白胶电泳中，蛋白电泳槽的设置功率为：电压150V，时间50min；

(6)将切好的蛋白胶放入预先倒入G250-考马斯亮蓝染色液的蛋白染色盒中，在水平摇床上摇晃20min；

(7)将染色完毕的蛋白胶，放入脱色液中，过夜脱色后，用照胶仪观察重组蛋白的表达情况，同时确定转入表达感受态目的基因是否表达、表达量以及表达形式为可溶性存在于上清中还是包涵体存在于沉淀中。

3、GST标签重组蛋白质的大量表达与纯化

甘油保菌交叉划线于带有Amp抗性的培养皿上，37℃恒温培养箱，过夜培养，参照GST标签小量诱导表达步骤。

(1)提前半小时将冷却机设置为3℃预冷，启动高压破碎仪，等待气压缓冲完毕后，用75％酒精、ddH₂O、PBS依次通过破碎管，两遍后，排气、排废液；

(2)根据菌体沉淀量，加入适量的PBS，用涡旋器将菌体沉淀完全重悬，倒入高压破碎管中反复破碎3-4次后，用超高速4℃离心机，12000rpm离心5min，留取上清备用；

(3)将空纯化柱，先用PBS润洗两遍，留有少量的PBS，根据上清液的量，吸取适量的Glutathione SepHarose 4B，缓缓加入纯化柱中，待Glutathione SepHarose 4B完全下沉到底部时，打开底部开关，排出废液后，在使用5倍柱体积PBS过柱洗涤填料，共洗涤3遍；

(4)将步骤(2)收集的上清加入处理完毕后的Glutathione SepHarose 4B填料中，置于水平旋转仪上，4℃缓慢感作2h；

(5)将结合完毕后的上清与Glutathione SepHarose 4B的混合物倒入纯化柱中，待Glutathione SepHarose 4B完全沉淀后，打开底部开关，调整流速，待GlutathioneSepHarose 4B完全在纯化柱内时，过柱完毕；

(6)用无菌的PBS洗去未结合的杂蛋白，每次加入5ml，将Glutathione SepHarose4B轻轻用移液器吹起来，纯化柱稍倾斜旋转1-2min后，待Glutathione SepHarose 4B完全在纯化柱底部时，打开开关使PBS流尽，洗6遍；

(7)首先加入1mL的GST洗脱液，将Glutathione SepHarose 4B轻轻用移液器吹起来，纯化柱稍倾斜旋转1-2min后，收集洗脱液。其次在加入2mL的GST洗脱液，重复前面的步骤，收集洗脱液。Nanodrop测最后一次洗脱液浓度后，决定是否要进行第三遍洗脱；

(8)将纯化完成的目的蛋白质、洗杂液、洗脱后的Glutathione SepHarose4B进行SDS-PAGE蛋白电泳。

4、GST标签重组蛋白质的Western-blot鉴定

(1)SDS-PAGE电泳跑胶；

(2)根据蛋白胶的大小，裁剪适当大小的PVDF膜，并用甲醇激活2min，将定性滤纸(3层为一个)剪成合适大小，浸泡在转膜液中，赶出滤纸与滤纸间的气泡，转膜时，夹子的黑面水平放在下面，上面依次为吸水网-3层定性滤纸-蛋白胶-PVDF膜-3层定性滤纸-吸水网，确保无气泡后，将夹子合上，放入转膜槽内，并且夹子的黑面对转膜槽的黑面，夹子的透明面对转膜槽的红面，检查好正负极，开始转膜，设置的功率为：电流200mA，时间为85min；

(3)转膜后，将PVDF膜放入提前配制完毕的含有封闭液(5％脱脂奶)的塑料盒中，放入37℃培养箱中，摇床上摇动封闭1h；

(4)用含有GST-tag单抗(1：10000)的5％脱脂奶封闭，4℃孵育过夜；

(5)PBST洗膜，每次5min，洗4次；

(6)用PBST稀释AP山羊抗小鼠IgG二抗1:15,000稀释，37℃孵育50min；

(7)重复步骤(5)；

(8)配取适量的BCIP/NET显色试剂，进行避光显色2-3min，观察结果并扫描。

三、重组蛋白质的验证

纯化的Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein重组蛋白质经SDS-PAGE和免疫印迹验证，结果见图8，和预期蛋白大小相同，其重组蛋白质大小为56KDa，且该蛋白以可溶性上清形式表达。

纯化的Kunitzprotease inhibitorprotein重组蛋白质经SDS-PAGE和免疫印迹验证，结果见图9，和预期蛋白大小相同，其重组蛋白质大小为38KDa，且该蛋白以可溶性上清形式表达。

实施例2

如图1所示，本实施例的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条，包括PVC底板1、以及依次设置在所述PVC底板上的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，结合垫2上包被有时间分辨荧光微球标记的小鼠IgG抗体和实施例1制得的Kazal-typeserine protease inhibitor domain-containingprotein抗原，硝酸纤维素膜4上设有间隔开的检测线6和质控线7，检测线6上包被有实施例1制得的Kunitz proteaseinhibitorprotein抗原，质控线7上包被有山羊抗小鼠IgG二抗。

其制备方法包括以下步骤：

S1结合垫的制备：用标记量为1mg/mL的小鼠IgG抗体和25μg/mL的Kazal-typeserine protease inhibitor domain-containing protein抗原对时间分辨荧光微球进行标记，然后按体积1:2的比例添加荧光工作液(0.01M磷酸盐缓冲液)进行稀释，即添加2倍体积的荧光工作液，混合均匀，以0.75μL/cm的包被量喷涂在结合垫上，放入温度45±1℃湿度≤35％烘箱烘干8h备用；

S2硝酸纤维素膜的制备：将2mg/mL的Kunitz protease inhibitor protein抗原，以0.75μL/cm的包被量喷涂于检测线所在位置，2mg/mL的山羊抗小鼠IgG二抗，以0.75μL/cm的包被量喷涂于质控线所在位置，放入温度45±1℃湿度≤35％烘箱烘干16h备用；

其中，小鼠IgG抗体和Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein抗原标记时间分辨荧光微球的步骤：

取100μL荧光微球，按照8g/L的浓度添加碳二亚胺(EDC)，放置于涡旋振荡仪振荡混匀后，室温孵育30min。所需用量的小鼠IgG抗体和Kazal-type serine proteaseinhibitor domain-containingprotein抗原，用0.01M磷酸盐缓冲液定容至500μL，混合均匀后加入处理好的荧光微球中，立即振荡混匀，置于旋转混合仪，室温避光孵育1h，上述反应完成后，加入2％BSA，置于旋转混合仪，室温避光孵育1h，12000rpm离心20min，去除上清，得到的浓缩的小鼠IgG抗体和Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein抗原，加入适量的荧光微球工作液，放入4℃密封避光保存。

本实施例的试纸条的使用方法：血清与样品缓冲液按体积比1:2稀释后得到血清待检样本，取75μL血清待检样本，滴加在样品垫上，15min后，用紫外灯照射试纸条观察结果，如果检测线和质控线均显色，证明该样品为阳性；如果检测线不显色，质控线显色，证明该样品为阴性，其中，样品缓冲液为pH＝7.8的0.05MTris-HCl、0.9％NaCl、1.5％BSA、0.01％Tween-20、0.1％NaN₃。

实施例3

本发明为了提高牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条检测时的准确性，摸索了以下条件：

优化时间分辨荧微球免疫层析试纸条的前提条件：其他条件不变，每次只改变其中一个变量。反应条件为：阳性样本和阴性样本(均采集于若尔盖县屠宰场)的加样量均为75μL(血清与稀释液的比例为1:2)，其反应时间均为15min。以0.75μL/cm的包被参数在硝酸纤维素膜上进行抗原或者抗体的包被，形成检测线(T)和质控线(C)。

T线包被抗原浓度的确定：将Kunitz protease inhibitor protein抗原1.0mg/mL，2.0mg/mL，3.0mg/mL制备成三种工作浓度进行包被，C线山羊抗小鼠IgG二抗以2.0mg/mL浓度包被。放入温度45±1℃湿度≤35％烘箱烘干16h。搭配荧光垫和样品垫，制备小样。在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，已确定最佳的包被抗原浓度。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

结果见表1，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现当Kunitzprotease inhibitorprotein抗原浓度为2.0mg/mL时，是最适包被量。

表1 T线包被抗原浓度的检测结果

标记抗原浓度的确定：以相同标记方法，用处理好的荧光微球分别标记不同量的Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein抗原，标记量分别为：25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml。同以2倍的稀释浓度对其稀释制备小样，搭配包被片材和样品垫，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最佳的标记抗原浓度。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

结果见表2，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现当标记抗原Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein浓度为25μg/ml时，是最适的结合垫标记浓度。

表2标记抗原浓度的检测结果

荧光工作液稀释比例的确定：将标记好的荧光微球分别作2倍、4倍、8倍，3种稀释度稀释。制备小样，搭配包被片材和样品垫，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最佳的荧光工作液稀释比例。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

结果见表3，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现当荧光标记溶液稀释比例为2倍时，为最佳的荧光工作液最适稀释比例。

表3荧光标记溶液稀释比例的检测结果

荧光工作液的确定：按确定的荧光标记溶液稀释比例，选取合适的荧光微球悬浮液，其分为三组：第一组为：0.05MTris-HCl、0.9％NaCl、0.05％BSA、0.05％Tween20，调至pH＝7.9；第二组为：0.01M磷酸盐缓冲溶液；第三组为：0.1MTris-HCl、0.1％BSA(5ml)、10％S9、10％Tween20、10％PEG12000、3g海藻糖。制备小样，搭配包被片材和样品垫，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的荧光工作液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

结果见表4，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现使用第二组荧光工作液时，为最佳的荧光工作液。

表4荧光工作液检测结果

样品垫处理液的确定：为了是使样品中的抗体能更好的与结合垫中荧光微球标记的抗原结合，配制了三种样品垫处理液，分为三组。第一组为：1％BSA、0.1％Triton-100的0.02mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液；第二组为：0.1M Na₂B₄O₇·10H₂O、1％PVP、0.2％Casein-Na、1％Triton-X100、1％Tetronic 1307、0.2％NaN₃，调至pH＝9.3；第三组为：0.5M硼酸缓冲液、1％TritonX-100、1％PVP、2％NaCl，调至pH＝9.0。制备小样，搭配包被片材和荧光垫，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的样品垫处理液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

结果见表5，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现使用第二组样品垫处理液时，为最佳的样品垫处理液。

表5样品垫处理液检测结果

反应时间的确定：用移液器吸取75μL样本加入到150μL样本缓冲液内，充分混匀30s-1min，用移液器吸取75μL混合后的样本，滴加到检测卡的加样孔内，待反应10min，15min，20min后分别进行读数。在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，已确定最佳反应时间。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

结果见表6，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现层析试纸条最佳反应时间为15min。

表6反应时间的检测结果

样品缓冲液的确定：为了确保抗原抗体充分反应，摸索了三种样品稀释液，分成三组，分别为：第一组：pH＝7.8的0.02MTris-HCl、0.9％NaCl、0.1％BSA、0.5％Tween-20、0.1％NaN₃；第二组：pH＝7.8的0.05MTris-HCl、0.9％NaCl、1.5％BSA、0.01％Tween-20、0.1％NaN₃；第三组：pH＝7.8的PBS缓冲液。在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的样品稀释液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

结果见表7，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现第二组样品缓冲液为最佳的样品稀释液。

表7样品缓冲液的检测结果

样品稀释比例的确定：样本与样品缓冲液，分别按照下表8的比例，进行混合，混合后的样本，滴加至检测卡加样孔中，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的样本稀释比例。

表8样本与样品缓冲液稀释比例

结果见表9，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现最适的稀释比例为1:2(样品体积：样品缓冲液体积)

表9样品稀释液的检测结果

时间分辨荧光微球层析试纸条特异性的评定：对猪旋毛虫病阳性血清、牛肝片吸虫病阳性血清、牛脑包虫病阳性血清样本进行检测，除牛细粒棘球蚴病的阳性血清外，在荧光免疫分析仪下，其他非牛细粒棘球蚴病原体的血清在T线均没有检测到信号，只有C线有出现一条带，即为阴性，结果如图10。

时间分辨荧光微球层析试纸条灵敏度的评定：阳性血清倍比稀释后，分别将稀释好的样本滴加到样品垫中，15min后在荧光免疫层析下观测T线的荧光强度。结果显示当阳性血清稀释比例为1:800时，可以清晰的看见T、C线，当阳性血清稀释比例为1:1600时，T线的亮度很微弱，但C线依旧亮度明显，证明检测结果有效。结果如图11。

时间分辨荧光层析试纸条准确性的评定：为了进一步验证时间分辨荧光免疫层析法检测的有效性，用两种商品化ELISA试剂盒和该方法分别检测了50份牛细粒棘球蚴病的阳性血清和和50份健康牛血清，结果如表10，发现基于时间分辨荧光免疫层析试纸条的检出准确率更高。

表10时间分辨荧光免疫层析试纸条与两种商业化ELISA试剂盒的比较结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> 牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法

<130> 2020

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 275

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Leu Ala Ala Lys Ser Met Val Gly Leu Phe Leu Leu Val Leu Phe

1 5 10 15

Ala Leu Ser Ser Arg Glu Ser Asn Ala Glu Glu Ala Gly Glu Thr Pro

20 25 30

Leu Asp Val Cys Ala Ser Cys Asp Glu Ser Lys Cys Pro Pro Val Thr

35 40 45

Met Cys Pro Val Gly Glu Val Lys Asp Tyr Cys Gly Cys Cys Ser Val

50 55 60

Cys Gly Leu Glu Gln Gly His Arg Cys Asn Thr Arg Gln Glu Leu His

65 70 75 80

Asp Met Leu Ser Gly Arg Arg Arg His Gly Tyr Tyr Gly Ala Cys Gly

85 90 95

Lys Asn Leu Glu Cys Gln Pro Arg Thr Asp Val Asp Glu Gln Ser Leu

100 105 110

Gly Glu Glu Asn Ile Cys Val Cys Thr Lys Pro Gly Arg Phe Cys Ala

115 120 125

Ser Asn Gly Glu Thr Tyr Ser Ala Cys Glu Leu Glu Ala Val Gln Ala

130 135 140

Lys Ser Phe Gly Glu Val Phe Leu Ile Ser Tyr Asp Asp Cys Lys Ser

145 150 155 160

Glu Pro Lys Ile Val Ala Ala Ser Glu Ser Gln Arg Val Pro Glu Gly

165 170 175

Asn Arg Thr Thr Phe Trp Cys Glu Ile Lys Gly Tyr Pro Leu Pro Thr

180 185 190

Val Thr Trp Tyr Tyr Phe Ala Pro Gly Gly Ser Tyr Glu Ala Ile Leu

195 200 205

Leu Pro Gly Asp Ser Asp Glu Met Ser Val Ser Leu Arg Gly Ala Pro

210 215 220

Pro Gly Arg Arg Ile Ile Ser His Leu Gln Ile Arg Arg Phe Asp Ile

225 230 235 240

Lys Tyr Glu Gly Ile Tyr Gln Cys Tyr Val Glu Asn Asp Leu Gly Ser

245 250 255

Asp Arg His Asn Ile Thr Ala Ile Tyr Ala Pro Pro Glu Pro Arg Pro

260 265 270

Arg Asp Leu

275

<210> 2

<211> 828

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgctagccg ccaagtcgat ggttggcctc ttcctcctcg tcctcttcgc tctgagtagt 60

cgtgagtcta acgcagagga ggctggtgaa acaccgctgg atgtctgcgc gtcctgcgat 120

gagtcaaagt gtccccccgt gaccatgtgt cccgtgggag aggtaaaaga ctattgtggc 180

tgttgctcgg tctgcggctt agagcaggga catcgatgca atacgagaca ggaattacat 240

gacatgctct cgggcagacg acgtcacggc tactacggcg cctgcggcaa gaaccttgaa 300

tgtcagcctc gcactgacgt tgatgagcag tcactgggtg aggagaacat ttgcgtgtgc 360

accaagcccg gtcgtttctg cgccagcaac ggagaaacct actcggcttg tgagttggag 420

gccgtgcagg ccaagtcgtt tggtgaggta ttcctcatct cctatgacga ttgtaaatca 480

gagccgaaga ttgtagccgc atcggagtcg cagcgagttc ccgaaggaaa caggacaacc 540

ttctggtgcg aaatcaaggg ttatcccctt ccaacagtca cctggtatta ctttgctccc 600

ggtggatcat atgaggccat tctactcccg ggggactctg atgaaatgag tgtgagtctg 660

cgtggtgcgc caccgggacg tcgcataatc tcccacctgc agatccggag attcgacatc 720

aaatacgagg gcatctacca gtgctacgta gagaacgatc tcggaagtga ccgccacaat 780

atcaccgcca tctacgctcc accggagcct cggcctcgag atctctag 828

<210> 3

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Pro Val Gln Met Ser His Trp Leu Leu Cys Leu Leu Phe Ile Gly

1 5 10 15

Phe Ala Phe Ser Phe Asn Asn Phe Glu Val Pro Pro Leu Cys Arg Pro

20 25 30

Gln Leu Gln Thr Ala Asn Cys Trp Tyr Tyr Arg Pro Asn Tyr Val Tyr

35 40 45

Asn His Leu Leu Asp Arg Cys Ile Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Asn

50 55 60

Ser Lys Leu Asn Ser Phe Lys Thr Arg Arg Glu Cys Glu Leu Ile Cys

65 70 75 80

Leu Gly Gly Arg Arg Arg Ser Ser Pro Arg Leu Gln Glu Ser Asp Glu

85 90 95

Tyr Tyr Ser Gln Gly Phe Tyr Gly Glu Val Pro Gln Lys Arg Arg Tyr

100 105 110

Trp Pro Tyr Glu Val His Pro Ile Asp

115 120

<210> 4

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

atgcctgtcc aaatgagtca ttggcttctc tgtcttctct tcattggttt tgcattttct 60

tttaacaatt ttgaggttcc gccactatgt agaccgcagc tacagactgc aaactgctgg 120

tactaccgtc caaactatgt ctacaatcac ctcctcgatc ggtgcatctg gagtggatgg 180

agctcgtgca attcgaagct gaacagtttc aagacccgta gggaatgcga gctaatctgc 240

ctcggtggtc gtcgacggag cagtccgcga ctgcaagaga gcgacgagta ctactctcaa 300

ggcttctatg gtgaggtgcc gcagaagagg aggtactggc cctacgaagt ccatccaatt 360

gactaa 366

Claims

1.一种牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条，其特征在于，包括PVC底板(1)、以及依次设置在所述PVC底板上的样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)，所述结合垫上包被有时间分辨荧光微球标记的小鼠IgG抗体和Kazal-type serineprotease inhibitor domain-containing protein抗原，所述硝酸纤维素膜上设有间隔开的检测线(6)和质控线(7)，检测线上包被有Kunitz protease inhibitor protein抗原，质控线上包被有山羊抗小鼠IgG二抗；所述Kazal-type serine protease inhibitordomain-containing protein抗原是如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，编码所述Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein抗原的基因是如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列；所述Kunitz protease inhibitor protein抗原是如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，编码所述Kunitz protease inhibitor protein抗原的基因是如SEQID NO.4所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein抗原和Kunitz protease inhibitor protein抗原的制备方法：

3.一种权利要求1所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1结合垫的制备：用标记量为1mg/mL的小鼠IgG抗体和25μg/mL的Kazal-type serineprotease inhibitor domain-containing protein抗原对时间分辨荧光微球进行标记，然后添加2倍体积的荧光工作液进行稀释，混合均匀，喷涂在结合垫中，烘干；

4.根据权利要求3所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述荧光工作液是0.01M磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求3所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于，S1和S2的喷涂步骤中，包被参数均为0.75μL/cm。

6.根据权利要求3所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于，采用0.1M Na₂B₄O₇·10H₂O、1％PVP、0.2％Casein-Na、1％Triton-X100、1％Tetronic 1307、0.2％NaN₃，调至pH＝9.3的样品垫处理液对样品垫进行处理。