CN112830966B

CN112830966B - 抗h6n1禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体zju61-01及其应用

Info

Publication number: CN112830966B
Application number: CN202110237376.4A
Authority: CN
Inventors: 吴海波; 杨帆; 吴南屏; 姚航平
Original assignee: First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine
Current assignee: First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine
Priority date: 2021-03-03
Filing date: 2021-03-03
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2041-03-03
Also published as: CN112830966A

Abstract

本发明提供抗H6N1禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU61‑01及其应用。单克隆抗体ZJU61‑01抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.2，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。对该单克隆抗体进行进一步的理化性状分析和鉴定，并建立了以该单克隆抗体为探针通过胶体金免疫层析试纸条和酶联免疫吸附法检测H6亚型禽流感病毒的方法。本发明为临床样本中H6亚型禽流感病毒感染的辅助诊断提供了有效的工具，并可推广应用于多种检测技术以及临床和实验研究。

Description

抗H6N1禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU61-01及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及抗H6N1禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU61-01的制备及应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗血凝素蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU61-01，鉴定为IgG1、κ型，再通过亲和纯化、电泳、免疫等技术实现对该抗体的应用。

背景技术

长期流感病毒监测发现，在甲型禽流感病毒中，H6亚型禽流感病毒是最常分离到的，宿主范围更广泛，流行范围也更广。H6N1毒株已跨越种属屏障，直接感染人，表明H6N1禽流感病毒的进化和重组在不断发生，给人类公共卫生安全造成潜在威胁。H6禽流感病毒参与了高致病性H5N1流感病毒的重配，说明H6亚型禽流感病毒与其他亚型禽流感病毒的高重配率提高了病毒感染人的可能性。虽然H6亚型禽流感病毒目前为低致病性禽流感病毒，但其在禽类广泛流行，有反复感染猪和人并发生变异进而演变成感染人类的新型流感病毒的潜能。

目前H6亚型禽流感病毒感染的诊断方法主要包括病毒分离鉴定、血清学方法和分子生物学方法，如逆转录酶聚合酶链反应和实时定量聚合酶链反应。但是上述方法都需要特殊设备和条件，开发一种快速、灵敏、廉价的H6亚型病毒检测产品势在必行，有利于促进更早更广泛的发现H6病毒感染，控制疫情扩散。

基于以上背景，本项目选定H6亚型禽流感病毒血凝素蛋白为靶抗原，采用融合杂交瘤技术建立稳定分泌抗血凝素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并大量制备、纯化和鉴定这些单克隆抗体。该单克隆抗体的成功获得，为建立新型的H6亚型禽流感病毒诊断方法——基于免疫学技术的诊断奠定物质基础。同时对疾病发病机理、预后及疗效判定等方面的研究起到重要作用。

本发明用到杂交瘤细胞技术。该技术将免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以建立分泌均质抗体的杂交瘤细胞系，也称为单克隆抗体技术。该技术涉及到动物免疫、细胞培养、细胞融合、细胞克隆培养和免疫测定等一系列方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗H6N1禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体，能识别H6N1禽流感病毒。该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，命名为ZJU61-01，能特异性识别禽流感病毒的血凝素蛋白。

抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.2(DNA序列如SEQ ID No.1)，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.4(DNA 序列如SEQ ID No.3)。

SEQ ID No.1

Heavy chain:DNA sequence(354bp)

Signal sequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

GAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTAACACTCTCCTGT GAAGCCTCTGGATTCACTGTCAGTAACTTTGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGTTTCCAGAGAAGAGGC TGGAGTGGGTCGCAGAAATTAGTAGTTCTGATACTTACTATGTAGACACAGTGACGGGCCGATTCAC CATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGGAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACAC GGCCATGTATTACTGTGCAAGGGAAGATGGTTATTACGAAGGTCTGTTTGTTTACTGGGGCCAAGGTA CTCTGGTCACTGTCTCTGCA

SEQ ID No.2

Heavy chain:Amino acid sequence(118AA)

Signal peptide-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

EVQLVESGGGLVKPGGSLTLSCEASGFTVSNFAMSWVRQFPEKRLEWVAEISSSDTYYVDTVTGRFTISR DNAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCAREDGYYEGLFVYWGQGTLVTVSA

SEQ ID No.3

Light chain:DNA sequence(321bp)

Signal sequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

CAAATTCTTCTCACCCAGTCTCCATCCTATCTTGCTGCATCTCCTGGAGAAACCATTACTATTAATTGCAGGCCAAATAAGAGAATTAGCAATTATTTAGCCTGGTATCAAGAGAAACCTGGGAAAACTAAGAAAC TTCTTATCTACTCTGGATCCGCTTTGCAATCTGGAACTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGT ACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAACAGCA TAATGAATTCCCGCTCACGTTCGGTGTTGGGACCAAGCTGGAACTGAAA

SEQ ID No.4

Light chain:Amino acid sequence(107AA)

Signal peptide-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

QILLTQSPSYLAASPGETITINCRPNKRISNYLAWYQEKPGKTKKLLIYSGSALQSGTPSRFSGSGSGTDFT LTISSLEPEDFAMYYCQQHNEFPLTFGVGTKLELK

本发明提供产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是由免疫的BALB/C小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的小鼠杂交瘤细胞系ZJU61-01，能稳定分泌抗H6N1禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU61-01。

本发明抗H6N1禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备方法，通过以下步骤和技术方案实现：

(1)动物的免疫：选择6周龄的BALB/C小鼠，以纯化的H6N1禽流感病毒血凝素蛋白对小鼠进行免疫。

(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使之保持良好的生长状态用于细胞融合。

(3)细胞融合：采用聚乙二醇融合法。以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种 BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20％牛血清的次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶培养基培养一天。将(1)中备好的小鼠处死，获取脾脏淋巴细胞。收集(2)中的小鼠骨髓瘤细胞。将上述两种细胞混合离心，然后以聚乙二醇介导细胞融合。融合后的细胞适当稀释，接种至饲养细胞培养板，适当条件培养。

(4)杂交瘤细胞的筛选：将上述培养物在次黄嘌呤-磷酸核糖转移酶选择性培养基中培养。在细胞集落长到大小合适时，吸取细胞培养上清液做抗体鉴定，筛选阳性克隆。

(5)杂交瘤细胞的克隆化：以有限稀释法克隆杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的细胞接种至96孔板，使每孔只有一个细胞生长。形成细胞集落的孔取培养上清液做酶联免疫吸附实验，鉴定阳性克隆。重复有限稀释克隆若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％。将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养做抗体鉴定及理化性状分析。

(6)单抗腹水的诱导：在接种杂交瘤细胞前一周，给BALB/C小鼠腹腔注射石蜡油每只0.5毫升，然后每只接种5×10⁶个阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，测定抗体效价，并纯化单克隆抗体。

(7)单克隆抗体的纯化：利用Protein G亲和纯化法纯化腹水中的单克隆抗体。

(8)本发明得到一个产生抗H6N1禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体杂交瘤系，即ZJU61-01，ZJU61-01 杂交瘤细胞系经4次克隆化，持续培养六月余，分泌抗体稳定。该细胞株经液氮冻存，复苏后生长良好，抗体分泌未见衰退。酶联免疫吸附间接法实验测得ZJU61-01培养上清效价为1:32，腹水效价为1:2048。经单克隆抗体免疫球蛋白亚型分析显示该杂交瘤细胞产生的抗体类型为IgG1。

本发明的另一个目的是提供该单克隆抗体ZJU61-01在含有H6亚型禽流感病毒的体液、尿囊液或其他环境样本中的检测(非诊断目的)，通过制备胶体金免疫层析试纸条和酶联免疫吸附法实现。

另外本发明提供了另一种胶体金免疫层析试纸条，包含抗H6N1禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体 ZJU61-01，用于检测H6亚型禽流感病毒。

本发明的优点在于提供了一种抗H6N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体。制备方法简单易行，更为重要的是该方法制备的单克隆抗体可以有多种用途，如对临床和实验室的H6亚型禽流感样本进行定性诊断。

附图说明

图1为单克隆抗体ZJU61-01的免疫球蛋白亚型分析。

图2为胶体金试纸条检测H6亚型禽流感病毒的灵敏度。

图3为胶体金试纸条检测H6亚型禽流感病毒的特异性。

图4为酶联免疫吸附法检测H6亚型禽流感病毒的灵敏度。

图5为酶联免疫吸附法检测H6亚型禽流感病毒的特异性。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.抗H6N1禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体的制备方法

(1)小鼠的免疫：首次免疫，将H6N1禽流感病毒血凝素全蛋白与佐剂按等体积混合均匀，总体积600 微升。每只BALB/C小鼠0.1毫升(含H6N1禽流感病毒血凝素全蛋白抗原30微克)，大腿内侧肌肉注射。第 21天按同样方式加强免疫一针。第35天采微量尾血进行酶联免疫吸附实验测定，抗体滴度达到1:16000,随即尾静脉注射加强免疫一次，于3天后进行细胞融合。

(2)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把来自BALB/C小鼠的SP2/0骨髓瘤细胞株以含10％牛血清DMEM培养基培养传代，在含5％二氧化碳饱和37℃孵箱中培养。融合前一天传代以保证融合时细胞进入对数生长期。

(3)细胞融合：以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20％牛血清的次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶培养基培养一天。次日取(1)中小鼠脾脏，采用压力注水法分离脾细胞，离心洗涤细胞2次后用培养液重悬。收集(2)中SP2/0细胞，离心，洗涤2次后用培养液重悬，作为待融合的SP2/0细胞。以1×10⁸个免疫小鼠脾淋巴细胞与2×10⁷个小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合，在聚乙二醇作用下融合。两种细胞混合后洗涤一次，离心弃上清，轻弹管壁悬开细胞，用 37℃预温的聚乙二醇0.9毫升于90秒内逐滴加入细胞沉淀中，其间轻轻振摇离心管，但勿吹打，静置1分钟，然后按先慢后快的原则，于第1分钟内加完1毫升无血清DMEM，于第2分钟内加完2毫升无血清DMEM，于第 3分钟内加完7毫升无血清DMEM，以后1分钟内逐渐加入37℃预温的无血清DMEM培养基40毫升。1000转每分钟低速离心10分钟。然后加入培养基，分别接种到加有饲养细胞的96孔培养板，一般每次融合的细胞铺2 块板，置细胞孵箱中培养。

(4)杂交瘤细胞的筛选：每隔4天换一半培养液(含次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶)一次，10天后改用含次黄嘌呤-磷酸核糖转移酶培养液。融合后的杂交瘤细胞在含次黄嘌呤-磷酸核糖转移酶的选择性培养液中大约持续培养两周。吸取培养上清做酶联免疫吸附实验，筛选阳性克隆。采用酶联免疫吸附实验间接法筛选阳性杂交瘤克隆。主要步骤：①0.01摩尔每升pH9.6碳酸盐缓冲液稀释H6N1血凝素蛋白，浓度20纳克/孔，分别于96孔酶标板加入0.1毫升每孔，4℃过夜；②0.01摩尔每升pH7.4磷酸盐缓冲液(含吐温20)洗板三次；③用5％牛血清白蛋白0.01摩尔每升pH 7.4的磷酸盐缓冲液封闭2小时；④同上洗板；⑤加入杂交瘤培养上清，0.1毫升每孔，同时设阳性对照(免疫小鼠血清)、阴性对照(SP2/0培养上清液)和空白对照，室温反应2小时；⑥洗板；⑦加1:6000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，0.1毫升每孔，室温反应1 小时；⑧洗板；⑨加入底物室温避光反应5分钟；⑩2摩尔每升硫酸终止反应；450纳米测定其光密度值，以测定值除以阴性≥2.1为阳性。

(5)杂交瘤细胞的克隆化：杂交瘤细胞的克隆化培养按有限稀释法进行，选择抗体检测阳性的杂交瘤孔细胞作适当增殖后，准确计数细胞。用完全DMEM培养基稀释成10个每毫升的细胞悬液接种到已有饲养细胞的 96孔培养板中，每孔0.1毫升，10天后观察细胞生长情况，并检测上清液中抗体水平，选择5个抗体滴度最高的，呈单个克隆细胞生长的培养孔，作再次有限稀释。此方法可重复多次，直至单克隆孔抗体检测阳性率为 100％。

(6)诱生腹水：在接种杂交瘤细胞前一周，给BALB/C小鼠腹腔注射石蜡油每只0.5毫升，然后每只接种 5×10⁶个阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水测定抗体效价。

(7)单克隆抗体的纯化：采用亲和纯化法(Protein G交联的Sepharose)纯化腹水中单克隆抗体。①腹水用冷结合缓冲液稀释3倍后，于4℃10000转每分钟离心15分钟去除沉淀物。②将预装有Sepharose-Protein G的亲和纯化柱用10倍柱床体积的结合缓冲液充分流洗。③将稀释的腹水上柱，控制流速10滴每分钟。④将流穿的腹水重复上柱一次。⑤用20倍柱床体积的结合缓冲液充分洗涤，直至流穿液280纳米吸光值小于0.01。⑥用洗脱缓冲液洗脱结合的单克隆抗体，控制流速10滴每分钟，收集洗脱液于预加有0.1毫升的磷酸钾缓冲液(PH7.9)的收集管中，每管收集0.5毫升含抗体的洗脱液，共收集20管以上。⑦于280纳米检测每管洗脱液的吸光度，并收集吸光值大于0.2的洗脱液。⑧将收集的洗脱液置于透析卡中，并于0.1摩尔每升PH7.4的磷酸盐缓冲液中透析。每隔6小时换液一次，共透析24小时。⑨将透析后的抗体溶液稀释后，于280纳米测蛋白含量。⑩将纯化的抗体分装于小管中，置于低温冰箱备用。

(8)单克隆抗体的亚型鉴定:采用Bio-Rad公司的小鼠单克隆抗体免疫球蛋白分型试剂盒分析。将纯化的单抗作适当稀释后进行检测，操作严格按试剂盒说明书进行。试验结果为ZJU61-01杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体为IgG1、κ型。

结果见附图1。

实施例2.用该单克隆抗体进行H6亚型禽流感病毒的定性检测

本发明制备的抗H6N1禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体可以用来定性检测H6亚型禽流感病毒，鉴定方法可以通过下述方法实现：

H6免疫层析胶体金检测试纸条：

(1)胶体金溶液制备：取200毫升玻璃瓶1个，加入超纯水49.5毫升，而后加入1％氯金酸0.5毫升，配制成50毫升0.01％氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的条件下一次性加入1％柠檬酸三钠溶液1.8毫升，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5分钟后停止加热，补水至原体积，冷却至室温， 4℃避光保存备用；

(2)抗体的预处理：将纯化得到的ZJU61-01抗体用0.01摩尔每升磷酸盐缓冲液稀释成1毫克每毫升和0.1 毫克每毫升，过0.22微米滤膜；

(3)胶体金标记物条件优化：取9个离心管，每个离心管中加入步骤(1)中的胶体金溶液1毫升，依次加入 0微升、5微升、10微升、15微升、20微升、25微升、30微升、40微升、50微升的0.1摩尔每升碳酸钾溶液，混匀，室温静置1小时；依次从每个离心管中取100微升液体置于96孔板中，再分别加入3微升的1毫克每毫升的ZJU61-01抗体，混匀，室温静置15分钟；每孔中加入20微升10％的氯化钠溶液，混匀，室温下静置2小时，观察胶体金颜色，保持红色的最低pH即为胶体金溶液的最佳pH。取最佳pH值胶体金溶液600 微升，分别加至离心管，每管100微升；依次加2微升、4微升、6微升、8微升、10微升、12微升的0.1毫克每毫升抗体，混匀，静置15分钟；再加入20微升10％的氯化钠溶液，混匀，室温下静置2小时，观察胶体金颜色，保持红色的最小蛋白量为该抗体最低稳定蛋白量，将此基础上增加20％，即为金标抗体最适蛋白量；

(4)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液20毫升，根据步骤(3)中选定的最优条件，电磁搅拌器250转每分钟搅拌，逐滴加入2毫升的1毫克每毫升抗体，反应10分钟；逐滴加入2毫升10％牛血清白蛋白，继续搅拌反应10分钟；金标抗体溶液4℃，12000转每分钟离心30分钟，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至2毫升，制备成ZJU61-01抗体胶体金标记物；

(5)胶体金膜的制备：将载体玻璃纤维素膜浸泡在步骤(4)中的胶体金标记物溶液中，室温自然晾干或者 37℃烘干3小时，备用；

(6)包被膜的制备：将羊抗鼠IgG抗体、抗H6N1禽流感病毒的另一株单抗稀释成1毫克每毫升，分别划在硝酸纤维素膜的质控线和检测线上，制备成包被膜，37℃包被2小时后，室温自然晾干或者37℃烘干；

(7)样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60％的条件下，室温自然晾干；

(8)检测卡的组装：塑料胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水纸，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，备用；

(9)确定胶体金试纸条检测H6亚型禽流感病毒的灵敏度：将H6N1禽流感病毒稀释至2⁷、2⁶、2⁵、2⁴、2³、 2²、2¹、2⁰、2^-1血凝素单位，将100微升的待检样品滴加到试纸条样品垫区，观察质控线和检测线是否出现红色条带。结果判定：质控线出现红色条带说明试纸条有效，否则无效。检测线出现红色条带说明样品中含有 H6亚型禽流感病毒，否则不含有H6亚型禽流感病毒。检测结果表明，胶体金试纸条检测H6亚型禽流感病毒的灵敏度为1个血凝素单位。

结果见附图2。

(10)确定胶体金试纸条检测H6亚型禽流感病毒的特异性：用胶体金试纸条对17份已知的病毒尿囊液样本进行检测，包括H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10、H11亚型、B型禽流感病毒(B)以及新城疫病毒 (NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽副粘病毒(APMV-4)。检测结果表明，胶体金试纸条对H6亚型禽流感病毒具有较好的特异性。

结果见附图3。

(11)胶体金试纸条与其他检测方法的对比实验：采用本实验室已建立的H6亚型流感病毒荧光定量聚合酶链式反应检测方法进行对比分析，对临床样本进行检测分析，胶体金试纸条的特异性达到了99.25％，胶体金试纸条检测方法具有快速、特异、便捷等优点，具有了良好的临床应用前景。

H6酶联免疫吸附法：

(1)抗体的预处理：将纯化得到的ZJU61-01抗体用0.01摩尔每升磷酸盐缓冲液稀释成4微克每毫升，过 0.22微米滤膜，备用；将识别H6亚型禽流感病毒的抗体1D7用0.01摩尔每升磷酸盐缓冲液稀释成2毫克每毫升，备用；

(2)准备辣根过氧化物酶标记的检测抗体：采用辣根过氧化酶标记试剂盒标记步骤(1)中的抗体1D7,在 100微升、2毫克每毫升的抗体1D7溶液中加入10微升反应启动液，轻轻混匀；再加入100微克辣根过氧化物酶，轻轻混匀，室温下静置2小时；加入10微升反应终止液，轻轻混匀，室温下静置1小时；4℃避光保存，备用；

(3)包被：在10毫升0.01摩尔每升pH9.6的碳酸盐缓冲液中加入10微升步骤(1)中4微克每毫升的 ZJU61-01抗体，混匀；取一块96孔酶标板，在每孔中加入100微升抗体-包被液，4℃过夜；

(4)洗涤：包被结束后弃掉抗体-包被液，用磷酸盐吐温缓冲液进行洗涤，在每孔中加入400微升磷酸盐吐温缓冲液，静置5分钟，弃掉洗液，再加入400微升磷酸盐吐温缓冲液，重复洗涤5次，最后拍干酶标板备用；

(5)封闭：在100毫升磷酸盐吐温缓冲液中加入5克牛血清白蛋白，混匀；在步骤(4)的酶标板中加入 200微升5％牛血清白蛋白溶液，室温下静置2小时；

(6)洗涤：将封闭结束的酶标板进行洗涤，步骤参照步骤(4)；

(7)样本孵育：在步骤(6)的酶标板孔中加入100微升待检样本，室温下孵育2小时；

(8)洗涤：将孵育结束的酶标板进行洗涤，步骤参照步骤(4)；

(9)二抗孵育：用磷酸盐吐温缓冲液将步骤(2)中的辣根过氧化酶标记抗体1D7稀释500倍至4微克每毫升；在步骤(8)的酶标板孔中加入100微升辣根过氧化酶标记抗体1D7溶液，室温下孵育1小时；

(10)洗涤：将孵育结束的酶标板进行洗涤，步骤参照步骤(4)；

(11)显色：在步骤(10)的酶标板孔中加入100微升四甲基联苯胺显色液，室温下避光反应5分钟；

(12)终止：再在酶标板每孔中加入100微升的2摩尔每升硫酸终止反应；

(13)读板：于450纳米测定其光密度值，以测定值除以阴性≥2.1为阳性；

(14)确定H6酶联免疫吸附法检测H6亚型禽流感病毒的灵敏度：将H6N1禽流感病毒依次稀释至2⁷、2⁶、 2⁵、2⁴、2³、2²、2¹、2⁰、2^-1血凝素单位，将100微升的待检样品按步骤(1)-步骤(13)进行检测。结果判定：空白孔和阴性孔未显色提示该酶联免疫吸附法有效，否则无效；以测定值除以阴性≥2.1判定为阳性。检测结果表明，胶体金试纸条检测H6亚型禽流感病毒的灵敏度为0.5个血凝素单位。

结果见附图4

(15)确定H6酶联免疫吸附法检测H6亚型禽流感病毒的特异性：用酶联免疫吸附法对38份已知的病毒尿囊液样本进行检测，包括H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10、H11亚型、B型禽流感病毒(B)以及新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽副粘病毒(APMV-4)。

检测结果表明，胶体金试纸条对H6亚型禽流感病毒具有较好的特异性。

结果见附图5

(16)酶联免疫吸附法与其他检测方法的对比实验：采用本实验室已建立的H6亚型流感病毒荧光定量聚合酶链式反应检测方法进行对比分析，对临床样本进行检测分析，胶体金试纸条的特异性达到了98.87％，胶体金试纸条检测方法具有快速、特异、便捷等优点，具有了良好的临床应用前景。

应理解，本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 浙江大学医学院附属第一医院

<120> 抗H6N1禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU61-01及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaagtgcaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctaacactc 60

tcctgtgaag cctctggatt cactgtcagt aactttgcca tgtcttgggt tcgccagttt 120

ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcagaa attagtagtt ctgatactta ctatgtagac 180

acagtgacgg gccgattcac catctccaga gacaatgcca agaacaccct gtacctggaa 240

atgagcagtc tgaggtctga ggacacggcc atgtattact gtgcaaggga agatggttat 300

tacgaaggtc tgtttgttta ctggggccaa ggtactctgg tcactgtctc tgca 354

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Asn Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Phe Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Ser Ser Ser Asp Thr Tyr Tyr Val Asp Thr Val Thr Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Glu

65 70 75 80

Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Glu Asp Gly Tyr Tyr Glu Gly Leu Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 3

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caaattcttc tcacccagtc tccatcctat cttgctgcat ctcctggaga aaccattact 60

attaattgca ggccaaataa gagaattagc aattatttag cctggtatca agagaaacct 120

gggaaaacta agaaacttct tatctactct ggatccgctt tgcaatctgg aactccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat ttcactctca ccatcagtag cctggagcct 240

gaagattttg caatgtatta ctgtcaacag cataatgaat tcccgctcac gttcggtgtt 300

gggaccaagc tggaactgaa a 321

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Pro Asn Lys Arg Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Lys Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Gly Ser Ala Leu Gln Ser Gly Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Val Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

Claims

1. 一种抗H6N1禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU61-01，该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与禽流感病毒血凝素蛋白抗原特异结合；抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQID No.2，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体ZJU61-01，其特征在于：所述单克隆抗体由杂交瘤细胞产生。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体ZJU61-01，其特征在于：产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的杂交瘤细胞系ZJU61-01，能稳定分泌抗H6N1禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU61-01。

4.权利要求1或2所述的抗H6N1禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU61-01在制备H6亚型禽流感病毒检测产品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：通过胶体金免疫层析试纸条法和酶联免疫吸附法检测样本中H6亚型禽流感病毒。

6.一种胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：包含权利要求1或2所述的抗H6N1禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU61-01。

7.权利要求6所述胶体金免疫层析试纸条在非诊断目的检测H6亚型禽流感病毒中的应用。