CN114957456B

CN114957456B - 甲型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体zju-a1a3及其在检测中的应用

Info

Publication number: CN114957456B
Application number: CN202210595322.XA
Authority: CN
Inventors: 吴海波; 肖一鑫; 杨帆; 吴南屏; 姚航平; 黄灵童
Original assignee: First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine
Current assignee: First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine
Priority date: 2022-05-28
Filing date: 2022-05-28
Publication date: 2024-03-12
Anticipated expiration: 2042-05-28
Also published as: CN114957456A

Abstract

本发明提供抗甲型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU‑A1A3及其应用。经纯化的H1N1和H3N2流感病毒血凝素蛋白序贯免疫BALB/C小鼠，收集致敏的BALB/C小鼠B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，利用酶联免疫吸附试验判定阳性克隆，建立分泌抗甲型流感(H1N1和H3N2)病毒血凝素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系ZJU‑A1A3，把阳性的细胞扩增培养并注射至同品系的小鼠腹腔诱导产生含抗体的腹水，经过收集腹水与抗体亲和纯化，获得抗甲型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU‑A1A3。本发明为临床样本中甲型季节性流感(H1N1和H3N2)病毒感染的辅助诊断提供了有效的工具。

Description

甲型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU-A1A3及其在检测中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及抗甲型流感(H1N1和H3N2)病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗血凝素蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU-A1A3，鉴定为IgG1、κ型，再通过亲和纯化、电泳、免疫等技术实现对该抗体的应用。

背景技术

流行性感冒具有季节性和高传染性，由流感病毒引起，是人类健康的重大威胁。感染人类的流感病毒主要包括甲型(A)和乙型(B)流感病毒。在全世界范围内，每年约有5％-15％的人群感染流感病毒，并且已导致多次致命的大流行，造成了数百万人的生命损失。突变毒株、新型重组毒株和耐药性毒株的不断出现对现有疫苗和小分子药物的应用造成威胁。当前与人类季节性流感感染密切相关的流感病毒主要有四种，包括两种甲型流感病毒(H1N1和 H3N2)和两种谱系的乙型流感病毒，而甲型流感在全球范围内引起的传染性更强，病死率更高。当前流感疫苗接种仍然是预防流感病毒感染的最佳方法。但是由于流感疫苗与流行病毒株的不匹配等原因，2004年至2015年期间流感疫苗针对H3N2亚型流感病毒感染的有效性仅为33％。2009年6月，世界卫生组织宣布甲型H1N1流感大流行正在进行。甲型H1N1流感的早期症状与普通流感相似，易被轻视，但病情可迅速进展，突然高热、肺炎，重者可以出现呼吸衰竭、多器官损伤，甚至死亡，病死率可达6％。因此快速明确实验室诊断、对流感病毒准确分型，可以加深临床对流感流行和致病力的认识，提高流感病例的诊疗效果。

当前甲型流感病毒感染的诊断方法主要包括病毒分离鉴定、血清学方法和分子生物学方法，如逆转录酶聚合酶链反应和实时定量聚合酶链反应。但是上述方法都需要特殊设备和条件，对于某些条件落后的地区并不适合。已有许多研究开发了针对不同亚型的特异性单克隆抗体，并试图将其用于临床检测。但是由于流感病毒的高频率抗原漂移或转移，经常会造成抗体逃逸，因此，能够结合多种病毒亚型，并能够弥补病毒高突变率的广谱抗体就具有重要的价值。因此，本发明旨在说明一株能同时结合H1N1和H3N2甲型流感病毒血凝素蛋白的特异性单克隆抗体，并将其与免疫荧光技术结合，可以对样本中甲型季节性流感(H1N1和H3N2)病毒株进行检测。

综上所述，开发能同时结合H1N1和H3N2亚型流感病毒的单克隆抗体，用于快速灵敏检测方法的建立迫在眉睫。基于以上背景，本项目选定血凝素蛋白为靶抗原，采用融合杂交瘤技术建立稳定分泌抗血凝素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并大量制备、纯化和鉴定这些单克隆抗体。该单克隆抗体的成功获得，为建立甲型季节性流感病毒诊断方法——基于免疫学技术的诊断奠定物质基础。同时对疾病发病机理、预后及疗效判定等方面的研究起到重要作用。

本发明用到杂交瘤细胞技术。该技术将免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以建立分泌均质抗体的杂交瘤细胞系，也称为单克隆抗体技术。该技术涉及到动物免疫、细胞培养、细胞融合、细胞克隆培养和免疫测定等一系列方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗甲型流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体，能识别H1N1和/或H3N2流感病毒。该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，命名为ZJU-A1A3，能特异性识别流感病毒的血凝素蛋白，序列如下：

SEQ ID No.1

重链:DNA序列(351bp)

Signal sequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAGGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTACTGGCTACACAATCAGTAGCTAC TGGATAGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGTGGTAATACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTACTACTGT GCAAGGCCACGGGTCTATGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID No.2

重链:氨基酸序列(117AA)

Signal peptide-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

QVQLQQSGAELMRPGASVKISCKATGYTISSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGNTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYC ARPRVYGLDYWGQGTSVTVSS

SEQ ID No.3

轻链:DNA序列(333bp)

Signal sequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTTTGAT GGTGATAGTTTTATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAAT GAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA

SEQ ID No.4

轻链:氨基酸序列(111AA)

Signal peptide-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSFMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSN EDPWTFGGGTKLEIK

本发明的第二个目的提供抗甲型流感(H1N1和/或H3N2)流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备方法，通过以下步骤和技术方案实现：

(1)动物的免疫：选择6周龄的BALB/C小鼠，以纯化的H1N1和H3N2流感病毒血凝素蛋白对小鼠进行序贯免疫。血凝素蛋白由H1N1流感病毒疫苗株(A/Michigan/45/2015)和H3N2流感病毒疫苗株(A/Texas/50/2012) 分别接种鸡胚，培养并收获病毒液，经甲醛灭活、纯化、裂解及再纯化等方法，以磷酸缓冲液稀释制备获得。

(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使之保持良好的生长状态用于细胞融合。

(3)细胞融合：采用聚乙二醇融合法。以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种 BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20％牛血清的次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶培养基培养一天。将(1)中备好的小鼠处死，获取脾脏淋巴细胞。收集(2)中的小鼠骨髓瘤细胞。将上述两种细胞混合离心，然后以聚乙二醇介导细胞融合。融合后的细胞适当稀释，接种至饲养细胞培养板，适当条件培养。

(4)杂交瘤细胞的筛选：将上述培养物在次黄嘌呤-磷酸核糖转移酶选择性培养基中培养。在细胞集落长到大小合适时，吸取细胞培养上清液做抗体鉴定，筛选阳性克隆。

(5)杂交瘤细胞的克隆化：以有限稀释法克隆杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的细胞接种至96孔板，使每孔只有一个细胞生长。形成细胞集落的孔取培养上清液做酶联免疫吸附实验，鉴定阳性克隆。重复有限稀释克隆若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％。将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养做抗体鉴定及理化性状分析。

(6)单抗腹水的诱导：在接种杂交瘤细胞前一周，给BALB/C小鼠腹腔注射石蜡油每只0.5毫升，然后每只接种5×10⁶个阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，测定抗体效价，并纯化单克隆抗体。

(7)单克隆抗体的纯化：利用Protein G亲和纯化法纯化腹水中的单克隆抗体。

(8)本发明得到一个产生抗甲型流感(H1N1和H3N2)病毒血凝素蛋白单克隆抗体杂交瘤系，即ZJU-A1A3， ZJU-A1A3杂交瘤细胞系经4次克隆化，持续培养六月余，分泌抗体稳定。该细胞株经液氮冻存，复苏后生长良好，抗体分泌未见衰退。酶联免疫吸附间接法实验测得ZJU-A1A3培养上清的抗H1血凝素蛋白效价为1:64，抗 H3血凝素蛋白效价为1:16；腹水的抗H1血凝素蛋白效价为1:2048，抗H3血凝素蛋白效价为1:1024。经单克隆抗体免疫球蛋白亚型分析显示该杂交瘤细胞产生的抗体类型为IgG1。

本发明提供抗甲型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU-A1A3及其应用。经纯化的H1N1和H3N2流感病毒血凝素蛋白序贯免疫BALB/C小鼠，收集致敏的BALB/C小鼠B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，利用酶联免疫吸附试验判定阳性克隆，建立分泌抗甲型流感(H1N1和H3N2)病毒血凝素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系ZJU-A1A3，把阳性的细胞扩增培养并注射至同品系的小鼠腹腔诱导产生含抗体的腹水，经过收集腹水与抗体亲和纯化，获得抗甲型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU-A1A3。抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.2，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。对该单克隆抗体进行进一步的理化性状分析和鉴定，并建立了以该单克隆抗体为探针通过免疫荧光技术检测H1N1和H3N2流感病毒的方法。本发明为临床样本中甲型季节性流感(H1N1和 H3N2)病毒感染的辅助诊断提供了有效的工具，并可推广应用于多种检测技术以及临床和实验研究。

本发明提供产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是由免疫的BALB/C小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的小鼠杂交瘤细胞系ZJU-A1A3，能稳定分泌抗甲型流感(H1N1 和H3N2)病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU-A1A3。

本发明的另一个目的是提供该单克隆抗体ZJU-A1A3在含有甲型流感(H1N1和H3N2)病毒的体液、尿囊液或其他环境样本中的检测，通过免疫荧光技术实现。

本发明的优点在于提供了一种抗甲型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体。制备方法简单易行，更为重要的是该方法制备的单克隆抗体可以有多种用途，如对临床和实验室的甲型流感(H1N1和H3N2)样本进行定性诊断。

说明书附图

图1为单克隆抗体ZJU-A1A3的免疫球蛋白亚型分析。

图2为免疫荧光法检测甲型季节性流感(H1N1和H3N2)病毒的特异性。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.抗甲型流感(H1N1和H3N2)病毒血凝素蛋白的单克隆抗体的制备方法

(1)小鼠的免疫：首次免疫，将H1N1流感病毒血凝素全蛋白与佐剂按等体积混合均匀，总体积600微升。每只BALB/C小鼠0.1毫升(含H1N1流感病毒血凝素全蛋白抗原30微克)，大腿内侧肌肉注射。第21天予二次免疫，将H3N2流感病毒血凝素全蛋白与佐剂按等体积混合均匀，总体积600微升。每只BALB/C小鼠予100微升(含H3N2流感病毒血凝素全蛋白抗原30微克)大腿内侧肌肉注射。第35天采微量尾静脉血进行酶联免疫吸附实验测定，抗H1N1抗体滴度达到1:32000,抗H3N2抗体滴度达到1:8000，随即尾静脉注射H1N1流感病毒血凝素全蛋白抗原加强免疫一次，于3天后进行细胞融合。

(2)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把来自BALB/C小鼠的SP2/0骨髓瘤细胞株以含10％牛血清DMEM培养基培养传代，在含5％二氧化碳饱和37℃孵箱中培养。融合前一天传代以保证融合时细胞进入对数生长期。

(3)细胞融合：以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20％牛血清的次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶培养基培养一天。次日取(1)中小鼠脾脏，采用压力注水法分离脾细胞，离心洗涤细胞2次后用培养液重悬。收集(2)中SP2/0细胞，离心，洗涤2 次后用培养液重悬，作为待融合的SP2/0细胞。以1×10⁸个免疫小鼠脾淋巴细胞与2×10⁷个小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0混合，在聚乙二醇作用下融合。两种细胞混合后洗涤一次，离心弃上清，轻弹管壁悬开细胞，用37℃预温的聚乙二醇0.9毫升于90秒内逐滴加入细胞沉淀中，其间轻轻振摇离心管，但勿吹打，静置1分钟，然后按先慢后快的原则，于第1分钟内加完1毫升无血清DMEM，于第2分钟内加完2毫升无血清DMEM，于第3分钟内加完7毫升无血清DMEM，以后1分钟内逐渐加入37℃预温的无血清DMEM培养基40毫升。1000转每分钟低速离心10分钟。然后加入培养基，分别接种到加有饲养细胞的96孔培养板，一般每次融合的细胞铺2块板，置细胞孵箱中培养。

(4)杂交瘤细胞的筛选：每隔4天换一半培养液(含次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶)一次，10天后改用含次黄嘌呤-磷酸核糖转移酶培养液。融合后的杂交瘤细胞在含次黄嘌呤-磷酸核糖转移酶的选择性培养液中大约持续培养两周。吸取培养上清做酶联免疫吸附实验，筛选阳性克隆。采用酶联免疫吸附实验间接法筛选阳性杂交瘤克隆。主要步骤：①0.01摩尔每升pH9.6碳酸盐缓冲液稀释H1N1血凝素蛋白或H3N2血凝素蛋白，浓度20纳克/孔，分别于96孔酶标板加入0.1毫升每孔，4℃过夜；②0.01摩尔每升pH7.4磷酸盐缓冲液(含吐温20)洗板三次；③用5％牛血清白蛋白0.01摩尔每升pH 7.4的磷酸盐缓冲液封闭2小时；④同上洗板；⑤加入杂交瘤培养上清，0.1毫升每孔，同时设阳性对照(免疫小鼠血清)、阴性对照(SP2/0培养上清液)和空白对照，室温反应2小时；⑥洗板；⑦加1:6000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，0.1毫升每孔，室温反应1小时；⑧洗板；⑨加入底物室温避光反应5分钟；⑩2摩尔每升硫酸终止反应；450纳米测定其光密度值，以测定值除以阴性≥2.1为阳性。

(5)杂交瘤细胞的克隆化：杂交瘤细胞的克隆化培养按有限稀释法进行，选择抗体检测双阳性的杂交瘤孔细胞作适当增殖后，准确计数细胞。用完全DMEM培养基稀释成10个每毫升的细胞悬液接种到已有饲养细胞的 96孔培养板中，每孔0.1毫升，10天后观察细胞生长情况，并检测上清液中抗体水平，选择5个抗体滴度最高的，呈单个克隆细胞生长的培养孔，作再次有限稀释。此方法可重复多次，直至单克隆孔抗体检测阳性率为100％。

(6)诱生腹水：在接种杂交瘤细胞前一周，给BALB/C小鼠腹腔注射石蜡油每只0.5毫升，然后每只接种 5×10⁶个阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水测定抗体效价。

(7)单克隆抗体的纯化：采用亲和纯化法(Protein G交联的Sepharose)纯化腹水中单克隆抗体。①腹水用冷结合缓冲液稀释3倍后，于4℃10000转每分钟离心15分钟去除沉淀物。②将预装有Sepharose-Protein G的亲和纯化柱用10倍柱床体积的结合缓冲液充分流洗。③将稀释的腹水上柱，控制流速10滴每分钟。④将流穿的腹水重复上柱一次。⑤用20倍柱床体积的结合缓冲液充分洗涤，直至流穿液280纳米吸光值小于0.01。⑥用洗脱缓冲液洗脱结合的单克隆抗体，控制流速10滴每分钟，收集洗脱液于预加有0.1毫升的磷酸钾缓冲液 (PH7.9)的收集管中，每管收集0.5毫升含抗体的洗脱液，共收集20管以上。⑦于280纳米检测每管洗脱液的吸光度，并收集吸光值大于0.2的洗脱液。⑧将收集的洗脱液置于透析卡中，并于0.1摩尔每升PH7.4的磷酸盐缓冲液中透析。每隔6小时换液一次，共透析24小时。⑨将透析后的抗体溶液稀释后，于280纳米测蛋白含量。⑩将纯化的抗体分装于小管中，置于低温冰箱备用。

(8)单克隆抗体的亚型鉴定:采用Bio-Rad公司的小鼠单克隆抗体免疫球蛋白分型试剂盒分析。将纯化的单抗作适当稀释后进行检测，操作严格按试剂盒说明书进行。试验结果为ZJU-A1A3杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体为IgG1、κ型。

结果见附图1。

实施例2.用该单克隆抗体进行甲型流感(H1N1和H3N2)病毒的定性检测

本发明制备的抗甲型流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体可以用来定性检测人甲型流感(H1N1和H3N2)病毒，鉴定方法可以通过下述方法实现：

免疫荧光检测法：

(1)将MDCK细胞提前一天以每孔4×10⁴个细胞的密度接种在48孔板中，待细胞长至70％，备用；

(2)取出铺好细胞的细胞板，弃去培养上清，用磷酸盐缓冲液洗一遍，备用；

(3)确定甲型流感(H1N1和H3N2)病毒免疫荧光检测法检测人甲型流感(H1N1和H3N2)病毒的特异性：用磷酸盐缓冲液稀释病毒，包括人H1N1病毒(A/Solomon Islands/3/2006、A/California/7/2009、 A/Michigan/45/2015和A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019)、人H3N2病毒(A/Uruguay/716/2007、A/Wisconsin/15/09、A/Texas/50/2012和A/Victoria/361/2011)、猪H1N2病毒(A/swine/Zhejiang/64/2014)、猪H3N2病毒(A/swine/Zhejiang/19/2019)、禽H1N3病毒(A/chicken/Zhejiang/81213/2017)、禽H3N2病毒 (A/duck/Zhejiang/4613/2013)、禽H2N7病毒(A/duck/Zhejiang/465/2013)、禽H5N1病毒(A/goose/Zhejiang/727098/2014)、禽H6N1病毒(A/chicken/Zhejiang/1664/2017)、人H7N9病毒 (A/Zhejiang/DTID-ZJU01/2013)、禽H9N2病毒(A/chicken/Zhejiang/221/2016)、禽H10N3病毒(A/chicken/Zhejiang/8615/2016)和乙型流感(B/Phuket/3073/2013和B/Victoria/705/2018)稀释后的病毒液感染细胞(感染复数为0.5)，在含5％二氧化碳饱和37℃孵箱中培养2小时；

(4)取出细胞板，弃去病毒液，用磷酸盐缓冲液洗细胞2遍，再在每孔中加入200微升的病毒培养液，在含5％二氧化碳饱和37℃孵箱中培养16小时；

(5)取出细胞板，弃去培养上清，用磷酸盐缓冲液洗细胞1遍；

(6)在细胞板中每孔加入4％多聚甲醛固定细胞，室温下固定30分钟，用磷酸盐缓冲液洗3遍；

(7)用0.5％Triton-X100通透细胞，室温下通透30分钟，用磷酸盐缓冲液洗3遍；

(8)用含3％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭，室温下封闭1小时，弃去牛血清白蛋白溶液；

(9)用磷酸盐缓冲液将单抗稀释至10微克每毫升，每孔加入200微升，在4℃下孵育过夜，用磷酸盐缓冲液洗3遍；

(10)用含1％牛血清白蛋白溶液稀释荧光二抗至5微克每毫升，每孔加入200微升，在37℃孵箱中避光孵育90分钟，用磷酸盐缓冲液洗3遍；

(11)用脱氧核糖核酸荧光染料(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)对细胞核进行染色，室温下避光孵育10分钟，用磷酸盐缓冲液洗3遍；

(12)在荧光显微镜下观察实验结果，观察到绿色荧光即为阳性。检测结果表明，基于本研究开发的抗甲型流感病毒单克隆抗体ZJU-A1A3检测甲型流感(H1N1和H3N2)季节性流感病毒具有较好的特异性。

应理解，本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 浙江大学医学院附属第一医院

<120> 甲型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU-A1A3及其在检测中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaggc ctggggcctc agtgaagata 60

tcctgcaagg ctactggcta cacaatcagt agctactgga tagagtgggt aaagcagagg 120

cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggtaa tactaactac 180

aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct actactgtgc aaggccacgg 300

gtctatggtt tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351

<210> 2

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro Arg Val Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg atagttttat gaactggtac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180

gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtgg 300

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333

<210> 4

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Claims

1.一种抗甲型流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU-A1A3，该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与甲型流感H1N1和/或H3N2病毒血凝素蛋白抗原特异结合，抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.2，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.权利要求1所述的抗甲型流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU-A1A3在制备甲型流感H1N1和/或H3N2病毒检测产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述检测产品通过免疫荧光技术检测样本中甲型流感H1N1和/或H3N2病毒。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述样本为体液。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述体液为尿囊液。