CN104098692B - 识别流感病毒血凝素蛋白ha1结构域的广谱单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及识别流感病毒血凝素蛋白HA1结构域上的表位的抗体，产生所述抗体的细胞株，以及它们的用途。本发明的抗体能够跨HA亚型特异性结合H1亚型（含季节性H1N1和新甲型H1N1）和H5亚型流感病毒的血凝素（HA）蛋白的HA1结构域。因此，本发明还涉及可用于预防和/或治疗H1亚型和H5亚型流感病毒的感染和/或由所述感染引起的疾病（例如流感）的疫苗或药物组合物，其包含本发明的抗体。
Description
技术领域
本发明涉及分子病毒学领域，特别是流感病毒的疫苗预防领域。具体而言，本发明涉及识别流感病毒血凝素蛋白HA1结构域上的表位的抗体，产生所述抗体的细胞株，以及它们的用途。本发明的抗体能够跨HA亚型特异性结合H1亚型（含季节性H1N1和新甲型H1N1）和H5亚型流感病毒的血凝素（HA）蛋白的HA1结构域。因此，本发明还涉及可用于预防和/或治疗H1亚型和H5亚型流感病毒的感染和/或由所述感染引起的疾病（例如流感）的疫苗或药物组合物，其包含本发明的抗体。
背景技术
流行性感冒（Influenza）简称流感，是由流感病毒引起的呼吸道传染病，其临床特点是引起发热、乏力、全身酸痛及伴随一定程度上的呼吸道症状。流感病毒是人类健康的一大威胁，持续快速的抗原性漂移使得季节性流感在人群中广泛传播，据WHO统计，季节性流感造成每年至少250,000–500,000人死亡(Peter D.C.等人,J Clin Invest.2008,118:3273-3275)。此外，流感大暴发仍是人类面临的一个重大威胁，自从流感病毒被发现以来，人类历史上共出现了五次世界范围内的流感大流行，共计造成了数千万人的死亡，其中1918年的西班牙流感（H1N1）大暴发造成全球约2000-5000万人死亡。20世纪暴发的其它流感大暴发还有1957年的亚洲流感（H2N2）大暴发及1968年的香港流感（H3N2）大暴发，均造成了较为严重的公共卫生威胁及人类社会大恐慌（Xu R.等人，Science.2010,328:357-360）。进入21世纪，流感大暴发仍没有停下脚步，2009年在墨西哥暴发并迅速蔓延全球的新甲流（H1N1）大流行又一次给人类社会敲响警钟，据WHO统计，截至2010年8月6日，全球共有200多个国家和地区报导确诊死亡病例共计18449例（WHO Pandemic(h1n1)2009-update112.6Aug,2010）。除此以外，人类还面临着高致病性禽流感的威胁，高致病性H5N1禽流感病毒已成为继2003年“非典”疫情之后，人类面临的最大传染病威胁之一。2003年至今，全球共报告600例人感染禽流感H5N1病例，其中死亡353例，死亡率接近60%（WHO：http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/H5N1_cumul ative_table_archives/en/index.html)。如此高的死亡率不禁使人们担心一旦病毒在人群中传播，将给人类社会带在致命打击。
流感病毒属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae），流感病毒属，有包膜的单链负义RNA病毒。其基因组由8条分节段的RNA组成，编码十种以上病毒蛋白。根据病毒核蛋白（NP）及基质蛋白（M）抗原性及其基因特性的差异，将流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型（Horimoto T.等人,Nat Rev Microbiol,2005,3(8):591-600）。其中甲型流感病毒（Influenza A Virus,简称Flu A）变异快，致病力强，能引起世界范围内的大流行。乙型流感病毒（Influenza B Virus,简称Flu B）变异较慢，只能引起局部范围内的小流行。丙型流感病毒（Influenza C Virus,简称Flu C）变异最慢，致病力弱，通常只能感染抵抗力较低的孕妇和小孩。在自然界中Flu A的宿主范围广，除了其天然宿主水禽以外，还能够引起人、马、猪等多种动物的感染。Flu A亚型多，变异大，已成为流感防控及疫苗研究的重点。
Flu A病毒根据表面抗原血凝素蛋白（HA）及神经氨酸酶（NA）抗原性及基因特性的不同又可以分成多种亚型，目前已发现了十七种HA亚型（H1-H17）和十种NA亚型（N1-N10）（Tong S.X.等人,PNAS.2012,109(11):4269-74）。人群中流行的Flu A亚型主要有两种HA亚型（H1、H3）和两种NA亚型（N1、N2），同时高致病性禽流感病毒H5N1也有偶发的感染人疫情发生，因其导致的较高致死率而广受关注。
防止流感的第一道防线是中和性抗体。疫苗诱导的中和抗体的主要靶点是位于病毒表面的膜蛋白血凝素（HA）蛋白。病毒表面的HA蛋白呈三聚体结构，每个单体由HA1和HA2两个结构域组成。HA1位于三聚体的头部，构成球状结构，含有受体结合位点，是病毒感染宿主细胞的关键区域，HA1还含有重要的抗原性位点，可诱导机体产生保护性中和抗体，是疫苗设计的关键靶点（Wang T.T.等人,Nat Struct Mol Biol.2009,16:233-234）。HA2位于三聚体的基部，呈柄状结构，含有融合肽，可介导病毒包膜与宿主胞膜的融合，一些针对HA2的单抗能够通过抑制流感病毒的膜融合从而起到中和病毒的效果（Wang T.T.等人,NatStruct Mol Biol.2009,16:233-234）。
流感病毒具有高度变异性，其中尤其以HA变异最迅速。目前传统流感疫苗主要针对HA蛋白，容易因HA基因变异引发病毒抗原性漂移而使流感疫苗失效。为保持流感疫苗持续有效，WHO每年均要根据上一年度流行的流感病毒株的变异监测情况，选择沿用或是确立新的流感病毒疫苗株用作下一年度流行季节的流感疫苗候选株，通过每年接种新疫苗来确保对现有流行的流感病毒株保持有效保护性。因此研制不受病毒变异影响的“广谱疫苗”逐渐成为新型疫苗研究的热点。流感病毒表面糖蛋白“血凝素（HA）”是研制流感病毒广谱疫苗和免疫治疗药物的最主要靶点。所谓的“广谱疫苗”应含有不同病毒变异株共有的“广谱中和表位”，可直接诱生“广谱中和抗体”以抵御不同病毒变异株的感染。因此，寻找HA上的广谱中和表位成了流感广谱疫苗及免疫治疗药物研究的重要途径。
此外，在小鼠动物模型中，对H1N1和H5N1特异的人源HA单抗已被证明能有效地治疗被流感病毒感染的实验小鼠（Corti D.等人,J Clin Invest.2010,120:1663-1673）。在临床上，多克隆及单克隆抗体可有效地用于预防甲肝、乙肝、狂犬、呼吸道合胞等病毒的感染(Sawyer L.A.等人,Antiviral Res.2000,47:57-77）。在1918年西班牙流感期间亦有用人恢复期血清治疗的报道（Luke T.C.等人,Ann Intern Med.2006,145:599-609）。这些信息都提示了抗体可作为抗病毒治疗的替代方法和工具。
目前已有多篇文献报导HA广谱单抗及广谱表位。其中针对更保守的HA2的广谱单抗及广谱表位研究成为研究的主要热点（Throsby M.等人,PLoS One.2009,3:e3942;SuiJ.等人,Nat Struct Mol Biol.2009,16:265-273;Corti D.等人,J Clin Invest.2010,120:1663-1673;Corti D.等人,Science.2011,333:850-856）。早在2009年，Throsby等人首次报导了一株识别HA2的广谱中和人源性单抗CR6261,可中和所有属于Group1（包含H1,H2,H5,H6,H8及H9等亚型）的流感病毒(Throsby M.等人,PLoS One.2009,3:e3942)。2011年，Corti D.等人应用类似技术也获得了一株针对HA2的人源性广谱中和单抗，能够中和16种H亚型流感病毒(Corti D.等人,Science.2011,333:850-856)，成为目前报导的最广谱的流感广谱中和单抗之一。这些广谱单抗的发现为研制流感病毒的广谱治疗性单抗及广谱疫苗带来新的希望。上述研究所获得的单抗的识别表位均被定位于HA2上融合肽附近的一个保守区域，其主要功能是介导流感病毒膜融合，而不是识别具有免疫优势性的HA1结构域，这使得这类抗体及所识别的保守表位在预防和治疗中的应用前景增加了不确定性。有研究表明，识别HA2的中和单抗对天然病毒的中和活性比假病毒的降低了100-1000倍，原因可能与天然病毒的HA2表位不易暴露而较难接近有关(Sui J.等人,Nat Struct Mol Biol.2009,16:265-273;Corti D.等人,J Clin Invest.2010,120:1663-1673)。
相比于HA2，流感病毒HA1在结构上处于三聚体的最顶部，呈球状结构，含大量的中和表位且易于接近，因此，寻找HA1上的广谱中和表位更有可能研制出高效的广谱流感疫苗及治疗性抗体。由于流感病毒的亚型划分最早是依据基于多抗的血清型分析，一种亚型的多抗血清对其它亚型的病毒很少有交叉反应，因此，一般认为HA（特别是HA1）的特异性中和单抗，都是型特异性的，对其它亚型的HA没有交叉反应。但是，最近也有一些研究发现，HA1上存在广谱中和表位能够诱导出具有亚型交叉反应性的广谱单抗（Yoshida R.等人,PLoSPathog.2009,5:e1000350;Krause J.C.等人,J Virol.2011,85:10905-10908;WrammertJ.等人,J Exp Med.2011,208:181-193）。由于HA1的高度变异性，目前发现的这些单抗的反应谱相比于HA2单抗相对较窄，一般只能对2-3个亚型的流感病毒有交叉中和活性。Yoshida等人在2008年时报导了一株HA1广谱中和单抗S139/1，能中和H1，H2，H3和H13亚型的流感病毒，但该单抗的中和活性仅限于各亚型的少数几株病毒株（Yoshida R.等人,PLoSPathog.2009,5:e1000350）。2009年暴发新甲型H1N1流行后，已有多篇文献报导了新甲型H1N1与季节性H1N1流感病毒的交叉中和单抗，包括新甲型N1N1与早年1918H1N1交叉单抗（Krause J.C.等人,J Virol.2010,84:3127-3130;Xu K.等人,Viral Immunol.2011,24:45-56），以及新甲型H1N1与近期流行的季节性H1N1的交叉中和单抗（KrauseJ.C.等人,JVirol.2011,85:10905-10908;Wrammert J.等人,JExp Med.2011,208:181-193）。此外，Corti等人在筛选获得HA2广谱中和单抗的同时，也获得了一株HA1交叉中和单抗FE17，能交叉中和季节性H1和H5亚型的流感病毒，其表位定位于Ca2抗原区附近。以上这些研究均说明，在HA1上可能存在保守的中和表位，对研究广谱流感疫苗及免疫治疗药物具有重要意义。因此，寻找识别HA1上更广谱的中和表位的广谱中和单抗，并进行表位的精确定位研究，对流感广谱治疗性抗体及广谱疫苗开发具有重要指导意义。
发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“H3编号（H3numbering）”是指，以H1N1病毒的HA氨基酸序列与H3N2病毒株A/Hong Kong/1/1968(H3N2)（genebank:AAK51718.1）的HA（去除信号肽以后）的氨基酸序列比对后获得的HA的氨基酸序列的序号来编号。因此，如本文中所使用的，血凝素蛋白的第N位(例如第142位)氨基酸残基是指，与上述经比对的HA的氨基酸序列的第N位(例如第142位)氨基酸残基相对应的氨基酸残基。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链（每对具有一条“轻”（L）链和一条“重”（H）链）组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区（FR）的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体（例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段;术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature341:544-546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab')2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,Bird等人,Science242:423-426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure2:1121-1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术（例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法）从给定的抗体（例如本发明提供的单克隆抗体E6F6）获得抗体的抗原结合片段（例如，上述抗体片段），并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得（Nature,256:495,1975），但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P4,816,567)。
例如，可以如下来制备单克隆抗体。首先用免疫原（必要时候添加佐剂）免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。可将免疫原预先偶联到某些已知蛋白，如血清白蛋白或大豆胰酶抑制剂上，以增强抗原在宿主内的免疫原性。佐剂可以是弗氏佐剂或MPL-TDM等。动物在接受免疫后，体内将产生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。另外，淋巴细胞也可以利用体外免疫获得。收集目的淋巴细胞，并用合适的融合剂，如PEG，使其与骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,AcademicPress,1996)。上述制备的杂交瘤细胞可以接种到合适的培养液中生长，培养液中优选含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶（HGPRT或HPRT）的母体骨髓瘤细胞，在培养液中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶（HAT培养基）等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养液敏感等特征。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如MOP-21或MC-11小鼠肿瘤衍生株（THE Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.USA），和SP-2/0或X63-Ag8-653细胞株（American Type CultureCollection,Rockville,Md.USA）。另外也有研究报道，利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur et al.,MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications,pp.51-63,Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)。生长杂交瘤细胞的培养液用于检测针对特异抗原的单抗的产生。测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性的方法包括例如，免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验（RIA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）。例如，可利用Munson等在Anal.Biochem.107:220(1980)描述的Scatchard分析法来测定单抗的亲和力。当确定了杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后，目的细胞株可以通过(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1996)所描述的标准的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养液可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。
还可以通过基因工程重组技术获得单克隆抗体。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增，可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。将所得的DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞（如E.coli细胞、COS细胞、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞），并在合适的条件下进行培养，可以获得重组表达的目标抗体。
如本文中所使用的，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体（其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类），且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体（其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类），但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P4,816,567to Cabilly etal.;Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:68516855(1984))。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白（受体抗体）的全部或部分CDR区被一非人源抗体（供体抗体）的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源（例如，小鼠、大鼠或兔）抗体。此外，受体抗体的构架区（FR）的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.,Nature,321:522525(1986);Reichmann etal.,Nature,332:323329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593596(1992);和Clark,Immunol.Today21:397402(2000)。
如本文中所使用的，“中和抗体”是指，能清除或显著降低目标病毒的毒力（例如，感染细胞的能力）的抗体或抗体片段。
如本文中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子（例如抗体）之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
如本文中所使用的，术语“表位肽”是指，抗原上能够用作表位的肽段。在一些情况下，单独的表位肽即能够被针对所述表位的抗体特异性识别/结合。在另一些情况下，可能需要将表位肽与载体蛋白融合，以便表位肽能够被特异性抗体识别。如本文中所使用的，术语“载体蛋白”是指这样的蛋白，其可以充当表位肽的载体，即，其可以在特定位置处（例如蛋白内部，N端或C端）插入表位肽，以便该表位肽能够呈现出来，从而该表位肽能够被抗体或免疫系统识别。此类载体蛋白是本领域技术人员熟知的，包括例如，HPV L1蛋白（可以将表位肽插入在所述蛋白的第130-131位氨基酸之间或在第426-427位氨基酸之间，参见Slupetzky,K.等Chimeric papillomavirus-like particles expressing a foreignepitope on capsid surface loops[J].J Gen Virol,2001,82:2799-2804；Varsani,A.等Chimeric human papillomavirus type16(HPV-16)L1particles presenting the commonneutralizing epitope for the L2minor capsid protein of HPV-6and HPV-16[J].JVirol,2003,77:8386-8393），HBV核心抗原（可以用表位肽替换所述蛋白的第79-81位氨基酸，参见Koletzki,D.,et al.HBV core particles allow the insertion and surfaceexposure of the entire potentially protective region of Puumala hantavirusnucleocapsid protein[J].Biol Chem,1999,380:325-333），土拨鼠肝炎病毒核心蛋白（可以用表位肽替换所述蛋白的第79-81位氨基酸，参见SabineGertrud Beteramsand Michael Nassal，J.Virol.1998,72(6):4997），CRM197蛋白（可以将表位肽连接至该蛋白或其片段的N末端或C末端）。任选地，可以在表位肽与载体蛋白之间使用连接体（例如柔性或刚性连接体），以促进二者各自的折叠。
可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原（例如，流感病毒血凝素蛋白）的结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请WO03/48731中。因此，可使用本领域技术人员已知的常规技术，获得与本发明的单克隆抗体(例如，单克隆抗体12H5或G10D10或8F11)竞争结合流感病毒血凝素蛋白上的相同表位的抗体及其抗原结合片段（即，抗原结合部分）。
如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本文中所使用的，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌（菌株）来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：GI698,ER2566,BL21(DE3),B834(DE3),BLR(DE3)。
如本文中所使用的，术语“载体（vector）”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）或P1来源的人工染色体（PAC）；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒（如单纯疱疹病毒）、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒（如SV40）。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时（例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据），那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序（DNAstar,Inc.）方便地进行的Needleman等人（1970）J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表（weight residue table）、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重（gap weight）和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似（例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等）的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链（例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸）、酸性侧链（例如天冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的极性侧链（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸）、非极性侧链（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、β分支侧链（例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香族侧链（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的（参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
如本文中使用的，术语“免疫原性（immunogenicity）”是指，能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的特性，也指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答。免疫原性是抗原最重要的性质，一种抗原能否成功地诱导宿主产生免疫应答取决于三方面的因素：抗原的性质、宿主的反应性和免疫方式。
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体（或对某抗原具有特异性的抗体）是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力（KD）结合该抗原。
如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体（例如，本发明的单克隆抗体12H5、G10D10或8F11）以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数（KD）结合抗原（例如，流感病毒血凝素蛋白），例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”可互换使用，并且当提及术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。例如，当提及杂交瘤细胞株12H5或G10D10或8F11时，其还指杂交瘤细胞株12H5或G10D10或8F11的亚克隆和后代细胞。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的（参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995），并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂（例如氢氧化铝）、弗氏佐剂（例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂）、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
如本文中所使用的，术语“蛋白疫苗”是指，基于多肽的疫苗，其任选地还包含佐剂。疫苗中的多肽可以是通过基因工程技术获得的，也可以是通过化学合成方法获得的。如本文中所使用的，术语“核酸疫苗”是指，基于DNA或RNA（例如质粒，如表达质粒）的疫苗，其任选地还包含佐剂。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病（例如流感病毒感染或与流感病毒感染相关的疾病）有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病（例如流感病毒感染或与流感病毒感染相关的疾病）的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
本发明人经过大量的实验研究出人意料地发现：流感病毒H1N1的表面抗原血凝素蛋白HA1结构域中存在着高度保守的表位，并且识别这些表位的抗体能够跨HA亚型特异性结合H1亚型和H5亚型流感病毒血凝素蛋白，且具有广谱的病毒反应性和中和病毒的能力。因此，本发明的抗体特别适合用于预防或治疗流感病毒感染或与流感病毒感染相关的疾病（例如流感）。
因此，在一个方面，本发明提供了一种单克隆抗体及其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体能够跨HA亚型特异性结合H1亚型（包括季节性H1N1和新甲型H1N1）和H5亚型流感病毒血凝素蛋白的HA1结构域（更具体而言，所述HA1结构域中的表位）。
在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体具有选自下列的重链和轻链CDR：
1）如SEQ ID NO:1-3所示的重链CDR1-3，以及如SEQ ID NO:4-6所示的轻链CDR1-3；
2）如SEQ ID NO:7-9所示的重链CDR1-3，以及如SEQ ID NO:10-12所示的轻链CDR1-3；和
3）如SEQ ID NO:13-15所示的重链CDR1-3，以及如SEQ ID NO:16-18所示的轻链CDR1-3。
在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体衍生自下述单克隆抗体，或是下述单克隆抗体：杂交瘤细胞株12H5或G10D10或8F11所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株12H5、G10D10和8F11分别保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且分别具有保藏号CCTCC NO:C201230、CCTCC NO:C201229和CCTCC NO：C2013119。
在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体（例如，scFv)、小鼠抗体、兔抗体、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体（例如，人鼠嵌合抗体）或双特异或多特异抗体。
在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。
在一个方面，本发明提供了一种能够跨HA亚型特异性结合H1亚型（包括季节性H1N1和新甲型H1N1）和H5亚型流感病毒血凝素蛋白HA1结构域或其中的表位的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体能够封闭所述的血凝素蛋白HA1结构域或其中的表位与选自下列的单克隆抗体的结合的至少50%，优选至少70%，更优选至少90%，例如至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％：
(i)杂交瘤细胞株12H5所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株12H5的保藏号是CCTCC NO:C201230；
(ii)杂交瘤细胞株G10D10所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株G10D10的保藏号是CCTCC NO:C201229；和
（iii）杂交瘤细胞株8F11所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株8F11的保藏号是CCTCC NO:C2013119。
此类单抗所识别的表位与单抗12H5或G10D10或8F11识别的表位相同，或者在空间上存在重叠，从而此类单抗能够降低单抗12H5或单抗G10D10或单抗8F11与其对应的表位的结合至少50%，优选至少60%，优选至少70%，优选至少80%，优选至少90%，优选至少95%或优选至少99%。
本发明还提供了分离的核酸分子，其编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。此类核酸分子可以从杂交瘤细胞中分离得到，也可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。
在一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含能够编码本发明的单克隆抗体的重链可变区的核酸序列。
在另一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含能够编码本发明的单克隆抗体的轻链可变区的核酸序列。
在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明的分离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。
在一个优选实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。
在另一个方面，还提供了包含本发明的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞（如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等）。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。
在另一个方面，还提供了制备本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，和从细胞培养物中回收本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株12H5，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC NO:C201230。在另一个方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株G10D10，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC NO:C201229。在另一个方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株8F11，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC NO:C2013119。
可通过常规方法，从单克隆抗体12H5、G10D10和8F11中获得抗体所包含的重链可变区、轻链可变区、重链可变区CDR和轻链可变区CDR的氨基酸序列和/或核苷酸序列。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶（例如辣根过氧化物酶）等。
在另一个方面，本发明提供了检测H1亚型和/或H5亚型流感病毒血凝素蛋白在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的（例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品）。
在另一个方面，本发明提供了诊断受试者是否感染了H1亚型和/或H5亚型流感病毒的方法，其包括：使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段检测H1亚型和/或H5亚型流感病毒在来自所述受试者的样品中的存在。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测H1亚型和/或H5亚型流感病毒血凝素蛋白在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了H1亚型和/或H5亚型流感病毒。
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在另一个方面，本发明提供了用于预防和/或治疗H1亚型和H5亚型流感病毒的感染和/或由所述感染引起的疾病（例如流感）的方法，其包括，给有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者本发明的药物组合物。
在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗H1亚型和H5亚型流感病毒的感染和/或由所述感染引起的疾病（例如流感）。
在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，用于预防和/或治疗H1亚型和H5亚型流感病毒的感染和/或由所述感染引起的疾病（例如流感）。
本发明所提供的药物和药物组合物可以单独使用或联合使用，也可以与其他药学活性剂（例如干扰素类药物，如干扰素或聚乙二醇干扰素）联合使用。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1A显示了琼脂糖凝胶电泳检测结果，其显示了不同样品对单抗12H5捕获NC20病毒的阻断效果，泳道1，PBS；泳道2，12H5；泳道3，G10D10；泳道4，抗FluB单抗13A12；泳道5，无病毒基因空白对照；泳道6，DNA2000MarKer。
图1B显示琼脂糖凝胶电泳检测结果，其显示了不同样品对单抗G10D10捕获NC20病毒的阻断效果，泳道1，DNA2000MarKer；泳道2，PBS；泳道3，12H5；泳道4，G10D10；泳道5，抗FluB单抗13A12；泳道6，无病毒基因空白对照。
图2显示单抗12H5用于检测细胞中的流感病毒抗原的效果。
图3显示单抗G10D10用于检测细胞中的流感病毒抗原的效果。
图4显示单抗12H5用于治疗流感病毒感染的小鼠的保护效果。
图5显示单抗G10D10用于治疗流感病毒感染的小鼠的保护效果。
生物材料保藏的说明
本发明的杂交瘤细胞株12H5和G10D10于2012年2月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国湖北省武汉市武汉大学)，且分别具有保藏号CCTCC NO:C201230和CCTCC NO:C201229。
本发明的杂交瘤细胞株SH1-8F11（在本文中也简称为杂交瘤细胞株8F11）于2013年9月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国湖北省武汉市武汉大学)，且具有保藏号CCTCC NO:C2013119。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明（而非限定本发明）的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1：抗H1亚型流感病毒HA单克隆抗体（单抗）的制备
（1）病毒的制备：
分别以三个季节性H1N1流感病毒株A/New Calidonia/20/1999（H1N1）、A/Xiamen/3118/2006（H1N1）、A/Xiamen/N585/2009（H1N1），一个新甲型H1N1流感病毒株A/California/04/2009（H1N1）接种MDCK细胞，37℃孵育2天后，收集上清，得到扩增后的病毒。收集活病毒，在4℃下以0.03%福马林福尔马林灭活，灭活病毒经HA检测，确定灭活病毒液的滴度（注：HA滴度测定和HI检测的具体方法参见WHO操作指南，A/California/04/2009由香港大学微生物系馈赠，A/New Calidonia/20/1999、A/Xiamen/3118/2006、A/Xiamen/N585/2009均为本实验室保存毒株）。
（2）实验小鼠：
6周龄雌性Balb/C小鼠为厦门大学生命科学院实验动物中心提供。
（3）杂交瘤的制备：
我们使用标准的体内免疫方式和PEG融合方法获得单抗，详细方法参见Ed Harlowet al.,“Antibodies A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory1988.简要过程如下：
（4）小鼠免疫：
我们将上述灭活病毒滴度调制到8HA的较低剂量进行免疫。首先将病毒A/NewCalidonia/20/1999(H1N1)与弗氏完全佐剂（CFA）等体积混合乳化，经四肢肌肉多点注射，每只小鼠共注射400ul。首次免疫后将病毒A/Xiamen/3118/2006（H1N1）、A/Xiamen/N585/2009（H1N1）分别于第14d、28d加弗氏不完全佐剂（IFA）进行加强免疫。最后于第42d对小鼠进行脾脏免疫加强，免疫原为上述病毒等体积混合液，每只小鼠注射100ul。3d后取小鼠脾脏进行融合实验。
（5）细胞融合：
首先取小鼠脾脏研磨得到脾细胞悬液，然后与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合，经PEG1500作用下进行细胞融合，融合细胞重悬于400ml融合培养基，分装到20块96孔细胞培养板中培养。融合培养基为含HAT和20％FBS的RPMI1640完全筛选培养基。抗原广谱性克隆通过ELISA及中和实验筛选，经3次克隆化后，得到稳定的单抗细胞株。
（6）杂交瘤的筛选：
融合后细胞在96孔细胞培养板上培养10天后，吸取细胞上清进行血凝抑制（HI）检测，检测病毒为A/New Calidonia/20/1999(H1N1),阳性孔进行克隆化，直至细胞株所分泌的抗体能够稳定抑制病毒与血红细胞发生凝集为止。
（7）杂交瘤单抗筛选结果：
获得12H5等25株抗H1血凝素单抗。
（8）杂交瘤的培养：
25株稳定的杂交瘤单抗细胞株先在二氧化碳培养箱中扩增培养，经96孔转移至24孔，再转移至50ml细胞培养瓶扩增培养。然后收集细胞瓶内的细胞注射到小鼠腹腔内，7－10天后从小鼠腹腔中吸取单抗腹水。
（9）单抗的纯化：
单抗腹水先用50％的硫铵沉淀处理，然后用PBS将沉淀溶解，之后经Protein A柱在AKTA系统下纯化，得到纯化后的单抗，经SDS-PAGE鉴定纯化后的单抗纯度。
实施例2：血凝抑制试验方法鉴定跨H1/H5亚型血凝素广谱单抗的广谱反应性
挑选分离自不同时间、不同地区、代表不同变异类型的季节性H1N1流感病毒代表株、新甲型H1N1流感病毒代表株、高致病性H5N1禽流感病毒代表株和季节性H3N2流感病毒代表株，利用血凝抑制试验方法（HI）鉴定上述25个单抗株的单抗腹水对不同H亚型流感病毒的交叉反应性。根据单抗与各流感病毒株的反应性，鉴定出三个能同时识别H1和H5亚型流感病毒的跨H亚型广谱单抗12H5、G10D10和8F11（表1）。单抗12H5能同时与季节性H1亚型流感病毒、新甲型H1N1流感病毒和H5亚型禽流感病毒发生反应，显示出很好的跨HA亚型广谱反应性；单抗G10D10和8F11能同时与季节性H1亚型流感病毒和H5亚型禽流感病毒发生反应，不能与新甲型H1N1流感病毒反应，但其对季节性H1亚型流感病毒的反应谱比12H5更广，对1930年代分离的H1病毒和2008年后新分离的H1病毒都能反应，其对H5亚型禽流感病毒的反应谱也比12H5更广，能与更多的H5N1变异类型病毒株发生反应。这些结果表明，单抗G10D10和8F11也是非常优良的跨HA亚型广谱单抗。
表1：跨H1/H5亚型血凝素广谱单抗的血凝抑制试验活性（HI滴度）
注：HI滴度表示单抗腹水能够完全抑制病毒HA活性的最大稀释倍数；其中，≤100，表示不反应。
实施例3.微孔细胞中和实验方法鉴定跨H1/H5亚型血凝素广谱单抗的广谱中和活性（Neutralization titer）
中和活性是评价单抗是否具有治疗潜能的重要指标。利用微孔细胞中和实验检测所述单抗12H5、G10D10和8F11对H1N1及H5N1亚型流感病毒代表株的中和活性（Hulse-Post等人,PNAS.2005,102:10682-7），结果（表2）显示，单抗中和实验结果与血凝抑制试验活性结果基本一致，三株单抗（12H5、G10D10和8F11）对H1N1及H5N1病毒均具有广谱交叉中和活性。
表2跨H1/H5亚型血凝素广谱单抗的中和试验活性
≤100，表示不反应。
实施例4.阻断捕获PCR方法鉴定跨H1/H5亚型血凝素广谱单抗
为鉴别广谱单抗的识别特异性和专一性，我们利用阻断捕获PCR方法来鉴别广谱单抗，具体实验如下：
1.材料与方法
（1）超离流感病毒：取一定量的季节性H1N1流感病毒株A/NewCalidonia/20/1999（H1N1）在4℃下用0.03%福尔马林液灭活。灭活病毒在超速离心机上进行蔗糖密度梯度离心，4℃下25200rpm离心3小时，病毒沉淀物用1×PBS在4℃下溶解过夜。超离病毒经HA检测，确定超离病毒液的滴度。
（2）单抗：广谱H1单抗（12H5和G10D10）、无关对照单抗（抗乙型流感病毒血凝素单抗anti-Flu B HA mAb13A12，与甲型H1亚型流感病毒A/NewCalidonia/20/1999不能结合）；单抗浓度均为0.5mg/ml。
（3）NP引物：
上游引物q-NP-F（SEQ ID NO:27）：5'-AGT TGG AAC AAT GGT GAT GG-3'
下游引物q-NP-R（SEQ ID NO:28）：5'-TTC CGG CTC TCT CTC ACT TGA TC-3'
（4）阻断捕获PCR实验：
把被阻断的单抗（包被单抗）预包被于聚苯乙烯酶标板上；用阻断单抗（待测单抗）同超离病毒等体积混合后，37℃孵育1小时，加入事先包被好单抗的酶标板在37℃反应2小时，用ELISA常规洗涤液（PBST）把未结合病毒洗掉，然后利用自动核酸提取仪提取被捕获于酶标板上的流感病毒的总RNA,经反转录成cDNA后，利用流感病毒NP基因特异性引物进行PCR,共扩增28个循环后，取PCR扩增产物跑琼脂糖胶电泳，以鉴定待测单抗对包被单抗捕获病毒的阻断能力，如果待测单抗与包被单抗识别表位越接近，其阻断能力就越强，包被单抗捕获到的病毒量就越低，最终电泳检测到的PCR产物的信号就越弱，最后用Quantity One软件对PCR产物信号进行定量分析，比较待测单抗与无关对照单抗的荧光信号值，计算出待测单抗和包被单抗的相互阻断率。
2.结果与分析
利用阻断捕获PCR方法结合Quantity One软件分析测定PBS、12H5、G10D10和13A12分别阻断单抗12H5捕获H1流感病毒NC20的阻断率。结果（图1A）显示，H1单抗12H5和G10D10能很好地阻断单抗12H5对NC20病毒的捕获，而非相关单抗13A12和PBS对照均基本不能阻断单抗12H5同NC20的捕获。通过Quantity One软件做扫描定量分析，测得图1A的泳道1的PeaKint×mm值为1557.323，泳道2为122.286，泳道3为125.807，泳道4为1413.796，再计算出相应的阻断率为：12H5对12H5的阻断率为92.14%，G10D10对12H5的阻断率为91.92﹪，FluB无关单抗13A12对12H5的阻断率为9.22﹪。
同样的方法，测定PBS、12H5、G10D10和FluB无关单抗13A12阻断单抗G10D10捕获H1流感病毒NC20的阻断率。结果（图1B）显示，H1单抗12H5和G10D10能很好地阻断单抗G10D10对NC20病毒的捕获，而非相关单抗13A12和PBS对照均基本不能阻断单抗12H5同NC20的捕获。通过Quantity One软件做扫描定量分析，测得图1B的泳道1的PeaK int×mm值为1052.753，泳道2为65.227，泳道3为20.841，泳道4为923.302，再计算出相应的阻断率为：12H5对G10D10的阻断率为93.80%，G10D10对G10D10的阻断率为98.02﹪，FluB无关单抗13A12对G10D10的阻断率为12.30﹪。
上述结果表明，广谱单抗12H5及G10D10识别的表位十分类似，12H5和G10D10彼此可以在较大的程度上相互阻断。
实施例5.逃逸突变分析方法确定跨H1/H5亚型血凝素广谱单抗所识别的表位位于HA1结构域中
用单抗12H5、G10D10和8F11诱导筛选逃逸突变病毒株，获得阳性的逃逸培养病毒，进行纯化、扩大培养、基因调取、测序及逃逸突变位点定位，以确定单抗12H5、G10D10和8F11识别的表位所在的区域。
1.材料与方法：
逃逸母病毒：选择季节性H1N1病毒A/Brisbane/59/2007和新甲型H1N1病毒A/California/07/2009为逃逸突变筛选的母病毒。
单抗：12H5、G10D10和8F11
逃逸筛选：105TCID50的病毒与单抗混匀，单抗终浓度为1mg/ml，总体积为1ml，病毒单抗复合物室温孵育4小时后感染预先铺于96孔板的MDCK细胞，病毒与单抗混合物孵育细胞2小时后吸去混合物，进入含有50ug/ml单抗的病毒维持液，37℃培养48小时，培养上清进行血凝实验测定，阳性病毒孔进行克隆化，经3轮克隆化后获得的稳定的逃逸病毒株。
逃逸突变位点定位：将获得的逃逸突变病毒进行RT-PCR扩增病毒的结构基因，并测序获得的结构基因的序列，与逃逸母病毒的的结构基因序列进行比对，获得逃逸突变位点。
2.结果与分析
逃逸突变结果显示，逃逸突变位点均位于编码流感病毒血凝素蛋白HA1结构域的基因中。
特别地，单抗12H5的逃逸突变筛选结果（表3）显示，逃逸突变位点涉及HA1基因的第138、142及186位（H3numbering，下同）氨基酸残基。其中，基于A/Brisbane/59/2007（H1N1）的病毒逃逸筛选获得5株逃逸病毒株，均在HA的第142位发生突变（N142D）；基于A/California/07/2009（新甲型H1N1）的病毒逃逸筛选获得19株逃逸病毒株，其中有1株病毒在HA的第138位发生突变（A138S），8株病毒在HA的第142位发生突变（A142E），另外10株病毒在HA的第186位发生突变（S186P）。
表3.单抗12H5诱导的逃逸病毒株的血凝素HA中的氨基酸突变位点
单抗G10D10的逃逸突变筛选结果（表4）显示，逃逸突变位点涉及HA1基因的第142位氨基酸残基，其中，基于A/Brisbane/59/2007（H1N1）的病毒逃逸筛选获得4株逃逸病毒株，且4株病毒均在第142位发生突变（2株N142H，1株N142S及1株N142Y）。
表4.单抗G10D10诱导的逃逸病毒株的血凝素中的氨基酸突变位点
单抗8F11的逃逸突变筛选结果（表5）显示，逃逸突变位点涉及HA1基因的第142位氨基酸残基，其中，基于A/Brisbane/59/2007（H1N1）的病毒逃逸筛选获得5株逃逸病毒株，并且均在第142位发生突变（4株N142D，1株N142K）。
表5.单抗8F11诱导的逃逸病毒株的血凝素中的氨基酸突变位点
上述逃逸突变结果显示，单抗12H5、G10D10、8F11识别一个类似的表位，并且它们所识别的表位均位于流感病毒血凝素蛋白HA1结构域中，并且均识别HA上的第142位氨基酸。
实施例6.跨H1/H5亚型血凝素单抗轻链基因和重链基因的分离
半贴壁培养约107个杂交瘤细胞，吹起贴壁细胞使其悬浮，悬液转移到新的4ml离心管中，1500rpm离心3min，收集细胞沉淀，重悬于100ul无菌PBS（pH=7.45）中，转移到一新的1.5ml离心管中。加入800ul Trizol(Roche,Germany),轻轻颠倒混匀，静置10min。加入200ul氯仿，剧烈振荡15s，静置10min,4℃12000rpm离心15min，转移上层液体至一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，静置10min。4℃12000rpm离心10min，弃上清，加入600ul75％乙醇洗涤，4℃12000rpm离心5min，弃上清，沉淀于60℃真空抽干5min。透明的沉淀溶于70ul DEPC H2O中，分装成两管。每管加入1ul反转录引物,其中一管加入的反转录引物为MVJkR（5'-CCG TTT GKA TYT CCA GCT TGG TSC C-3'）（SEQ ID NO:19）,用于扩增轻链可变区基因，另一管加入的反转录引物为MVDJhR（5'-CGG TGA CCG WGG TBC CTT GRCCCC A-3'）（SEQ ID NO:20），用于扩增重链可变区基因。每管再加入1ul dNTP(上海生工)，置72℃水浴10min，立即放到冰浴中置5min,加入10ul5x反转录缓冲液，1ul AMV(10u/ul,Pormega)，1ul Rnasin(40u/ul,Promega),混匀后于42℃将RNA反转录成cDNA。
抗体基因可变区的分离采用聚合酶链式反应（PCR）法，使用根据Novagen公司的Ig-Prime kits合成的引物组以及另外设计合成的两条下游引物MVJkR、MVDJhR（上海博亚公司合成），MVJkR为轻链可变区基因扩增的下游引物，MVDJhR为重链可变区基因扩增的下游引物。模板即为以上合成的两种cDNA。PCR条件为：94℃5min,94℃40s，53℃1min，72℃50s35cycles,72℃15min。回收目的片段并克隆至pMD18-T载体，送至上海博亚公司测序，序列经blast比对后确定抗体可变区序列，并确定出相应的氨基酸序列。
依上述方法从12H5、G10D10、8F11广谱单抗杂交瘤细胞株中克隆出其抗体可变区基因，并确定出相应的氨基酸序列。表6所示为所用的上游引物序列，表7所示是根据抗体可变区氨基酸序列，通过Kabat方法(Kabat EA,Wu TT,Perry HM,Gottesman KS,CoellerK.Sequences of proteins of immunological interest,U.S Department of Healthand Human Services,PHS,NIH,Bethesda,1991)确定的互补决定区（complementarydeterminant region，CDR）。
表6.扩增12H5、G10D10、8F11广谱单抗可变区基因的上游引物序列
表7.Kabat方法确定的3株跨H1/H5亚型血凝素单抗的CDR氨基酸序列
实施例7.跨H1/H5亚型血凝素广谱单抗应用于检测流感病毒
为测试上述跨H1/H5亚型血凝素广谱单抗用于检测流感病毒的效果，我们以12H5和G10D10为代表单抗进行实验。选取季节性H1亚型流感病毒代表株A/New Calidonia/20/1999、A/Brisbane/59/2007、新甲型H1N1流感病毒代表株A/California/04/2009以及作为对照的季节性H3亚型流感病毒代表株A/Brisbane/59/2007(H3N2)感染MDCK细胞，在感染24h后固定细胞，应用免疫荧光方法分析单抗12H5和G10D10对流感病毒的检测效果，结果（图2）显示，单抗12H5对两类H1亚型流感病毒的HA抗原均有良好的反应活性，荧光主要集中在细胞膜上，同时也存在细胞质中，对H3亚型流感病毒和阴性细胞无非特异性反应。而单抗G10D10对季节性H1N1流感病毒的HA抗原有良好的反应活性，而对新甲型H1N1及H3亚型病毒无非特异性反应（图3），这一结果与它们在血凝抑制试验及中和试验中的效果一致，说明它们可用于检测细胞中的流感病毒。
实施例8.跨H1/H5亚型血凝素广谱单抗应用于治疗流感病毒感染
利用抗体被动免疫治疗传染病是一种潜在有效的抗病毒治疗途径。通过体外微孔中和试验已证实本发明涉及的单抗对不同分离地和分离时间的H1N1及H5N1病毒株均有很强的中和活性，单抗特点是对H1中和反应谱广、中和滴度高，同时对部分H5也好的中和效果。为进一步验证单抗的体内抗病毒效果，本发明基于H1N1和H5N1病毒感染动物模型Balb/C小鼠，在动物生物安全3级实验室内进行了单抗对N1N1及H5N1流感病毒的抗病毒治疗体内验证实验。具体如下：
（1）材料与方法
动物：Balb/C小鼠，SPF，6－8周龄，雌性，体重约20g。
单抗：12H5和G10D10。
H1N1病毒：
季节性H1N1流感病毒株A/PuertoRico/8/1934(H1N1)，简称PR8;
新甲流H1N1流感病毒株A/California/07/2009(H1N1)的小鼠适应株A/California/07/2009(H1N1)-MA，简称CA07-MA。
H5N1病毒:A/Bar-Head Gs/QH/15C/2005（H5N1），简称QH15C
麻醉剂:Isoflorane(异弗烷)
动物分组：提前一天将小鼠送入ABSL－3实验室，按5只一笼分成4组，标记成G1、G2、……等，并记录下每只小鼠的体重，详细方案（表8）。
病毒感染：H5病毒QH15C预先稀释成103TCID50/ul，H1病毒RP8及CA04-MA预先稀释成105TCID50/ul，小鼠病毒接种量为25ul/只。接种前先用异弗烷麻醉小鼠，然后病毒经鼻腔接种感染小鼠。
单抗的干预：病毒感染后24h（dpi.1）对抗体治疗组小鼠分别注射不同剂量的抗体，剂量分别为20mg/kg、10mg/kg、5mg/gk及2.5mg/kg，注射体积为100ul/mice。
观察记录：病毒感染后的1－14天，每天记录小鼠体重变化情况、存活情况和相应的行为表征情况。
表8.广谱单抗的抗病毒治疗试验方案
（2）结果与分析
分别用一周致死剂量的新甲型H1N1的CA7病毒及H5N1病毒株QH15C感染小鼠，在感染后1天干预抗体，通过测量体重和计算生存率来判断单抗的治疗效果（图4），可见阴性对照组在整个实验过程中未见明显的体重波动，两个病毒对照组均出现明显的体重下降，CA07病毒对照组在感染后6天小鼠全部死亡；QH15C病毒对照组在病毒感染后9天小鼠全部死亡。对两种病毒，不同剂量的12H5抗体干预，都会使小鼠体重得到恢复（图4A及4C）。而观察病毒感染后1－14天的小鼠存活情况，可知10mg/kg及5mg/kg剂量下的12H5单抗治疗均能使两种病毒感染下的小鼠正常存活14天，治疗效果达100％，而2.5mg/kg体重的剂量则不能完全保护小鼠存活，对两种病毒的治疗效果均为60％（图4B及4D）。上述结果说明12H5在低剂量（5mg/Kg）下也有很好的保护效果。
分别用一周致死剂量的H5N1病毒株QH15C及季节性流感病毒株PR8（近年来的季节性H1N1病毒对小鼠不致病，因此在本实验中选择对小鼠致病的早年H1N1病毒株PR8）感染小鼠，用于评估单抗G10D10的治疗效果。由于单抗G10D10对PR8的活性较弱（HI滴度仅为400），因此在动物实验过程中使用较高剂量（20mg/kg）进行治疗。结果（图5）显示，单抗G10D10对H5病毒的治疗效果好于单抗12H5，在3个剂量的抗体治疗均能有效使小鼠体重得以回升（图5A），并最终100%保护小鼠存活（图5B）。而对于PR8病毒，20mg/kg的G10D10单抗干预也能有效缓解小鼠体重下降（图5C），并最终使80%的小鼠得以存活（图5D）。说明单抗G10D10也具备广谱的抗病毒治疗效果。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (23)
1.一种单克隆抗体及其抗原结合片段，其能够跨HA亚型特异性结合H1亚型和H5亚型流感病毒血凝素蛋白的HA1结构域，
其中，所述单克隆抗体具有选自下列的重链和轻链CDR：
1)如SEQ ID NO:1所示的重链CDR1，如SEQ ID NO:2所示的重链CDR2,如SEQ ID NO:3所示的重链CDR3；以及,如SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1,如SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2,如SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3；
2)如SEQ ID NO:7所示的重链CDR1，如SEQ ID NO:8所示的重链CDR2,如SEQ ID NO:9所示的重链CDR3；以及,如SEQ ID NO:10所示的轻链CDR1,如SEQ ID NO:11所示的轻链CDR2,如SEQ ID NO:12所示的轻链CDR3；或
3)如SEQ ID NO:13所示的重链CDR1，如SEQ ID NO:14所示的重链CDR2,如SEQ ID NO:15所示的重链CDR3；以及,如SEQ ID NO:16所示的轻链CDR1,如SEQ ID NO:17所示的轻链CDR2,如SEQ ID NO:18所示的轻链CDR3。
2.权利要求1所述的单克隆抗体及其抗原结合片段，其中所述H1亚型包括季节性H1N1和新甲型H1N1。
3.权利要求1所述的单克隆抗体及其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体衍生自下述单克隆抗体，或是下述单克隆抗体：杂交瘤细胞株12H5或G10D10或8F11所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株12H5、G10D10和8F11分别保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且分别具有保藏号CCTCC NO:C201230、CCTCC NO:C201229和CCTCC NO:C2013119。
4.权利要求1所述的单克隆抗体及其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、小鼠抗体、兔抗体、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体或双特异或多特异抗体。
5.权利要求4所述的单克隆抗体及其抗原结合片段，其中，所述单链抗体是scFv；和/或，所述嵌合抗体是人鼠嵌合抗体。
6.权利要求1所述的单克隆抗体及其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种。
7.权利要求6所述的单克隆抗体及其抗原结合片段，其中所述非-CDR区来自人抗体。
8.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-7任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
9.一种分离的核酸分子，其包含能够编码权利要求1-7任一项所述的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的核酸序列。
10.一种载体，其包含权利要求8-9任一项的分离的核酸分子。
11.一种宿主细胞，其包含权利要求8-9任一项的分离的核酸分子或权利要求10的载体。
12.一种杂交瘤细胞株，其选自：
1)杂交瘤细胞株12H5，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC NO:C201230；
2)杂交瘤细胞株G10D10，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC NO:C201229；和
3)杂交瘤细胞株8F11，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC NO:C2013119。
13.一种药物组合物，其包含权利要求1-7任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
14.权利要求13所述的药物组合物，其是疫苗。
15.权利要求13所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂是佐剂。
16.一种药物组合物，其包含权利要求8-9任一项的分离的核酸分子或权利要求10的载体，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
17.权利要求16所述的药物组合物，其是疫苗。
18.权利要求16所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂是佐剂。
19.一种制备权利要求1-7任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：
1)在宿主细胞中表达权利要求8-9任一项的分离的核酸分子或权利要求10的载体，以产生所述单克隆抗体或其抗原结合片段；和
2)分离所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
20.通过权利要求19的方法制备获得的单克隆抗体或其抗原结合片段。
21.权利要求1-7任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测H1亚型和/或H5亚型流感病毒血凝素蛋白在样品中的存在或其量，或用于诊断受试者是否感染了H1亚型和/或H5亚型流感病毒。
22.权利要求1-7任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗H1亚型和H5亚型流感病毒的感染和/或由所述感染引起的疾病。
23.权利要求22所述的用途，其中所述由所述感染引起的疾病是流感。
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