RSV融合蛋白的表位以及识别其的抗体
技术领域
本发明涉及分子病毒学领域,特别是呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytialvirus,RSV)的疫苗预防领域。具体而言,本发明涉及可用于预防呼吸道合胞病毒感染的表位肽(或其变体),包含此类表位肽(或其变体)以及载体蛋白的重组蛋白,以及此类表位肽(或其变体)和重组蛋白的用途。本发明还涉及针对此类表位肽的抗体,编码所述抗体的核酸分子,产生所述抗体的细胞株,以及它们的用途。本发明还涉及可用于预防呼吸道合胞病毒感染相关的一种或多种症状的疫苗或药物组合物,它们分别包含本发明的重组蛋白或抗体。
背景技术
自从20世纪50年代被发现以来,人类呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytialvirus,RSV)一直是婴幼儿下呼吸道感染最主要的病原。在美国,RSV是引起1岁以下婴儿住院的首要原因(D.K.Shay,R.C.Holman.et al.,JAMA,282(1999)1440-1446),5岁以下儿童临床约诊的主要原因之一(C.B.Hall,G.A.Weinberg,et al.,N Engl J Med,360(2009)588-598)。全球范围内每年有超过3000万例下呼吸道感染由RSV引起,其中超过300万的人需住院治疗。RSV是小于5岁的儿童最常见的住院原因(H.Nair,W.A.Brooks,et al.,Lancet,378(2011)1917-1930)。早产儿、支气管及肺发育不良者、先天性心脏病及免疫缺陷的婴幼儿RSV感染率高达50-70%(A.C.Cooper,N.C.Banasiak,P.J.Allen,Pediatr Nurs,29(2003)452-456)。每年有16-60万儿童死亡病例与RSV有关(T.S.Howard,L.H.Hoffman,etal.J Pediatr,137(2000)227-232;S.Leader,K.Kohlhase.J Pediatr,143(2003)S127-132)。婴幼儿感染RSV所导致的住院治疗时间可达2.5个月,由此引发的相关医疗费用在美国每年可高达3.6-5.7亿美元(E.A.Simoes.Lancet,354(1999)847-852)。老年人也是RSV易感人群,每年由RSV感染导致死亡的老年人数大于12000位,约为同一人群中流感死亡率的1/3(A.R.Falsey,P.A.Hennessey,et al.N Engl J Med,352(2005)1749-1759;W.W.Thompson,D.K.Shay,E.Weintraub,et al.JAMA,289(2003)179-186)。在我国由于缺乏本国研发的RSV诊断试剂,RSV检测由于过高的成本而得不到推广,这导致了RSV在我国的流行情况及危害性至今不完全清楚,但针对部分地区的研究表明RSV感染也是中国儿童下呼吸道感染的重要诱因(徐关仁,孙颂文,徐旭卿等.疾病控制杂志,4(2000)37-39;谢健屏,谢健屏,何翠娟,等.中华儿科杂志,35(1997)402-403;朱汝南,邓洁,王芳,等.21(2003)25-28)。
至今RSV依然没有安全有效的疫苗,只有一株识别RSV表位融合糖蛋白F的中和抗体(Palivizumab,商品名:Synagis)能在新生儿身上产生被动免疫效果,降低新生儿发病率。该抗体药物被批准在早产儿、患有慢性肺部疾病的、支气管及肺发育异常的、先天性心脏病的高危婴幼儿患者中应用(H.W.Kim,J.G.Canchola,C.D.Brandt,et al.Am JEpidemiol,89(1969)422-434),以预防由RSV引起的严重下呼吸道感染。该抗体药物自身中和效价不足同时生产成本过高导致上市后价格高昂,其使用被限制在“高感染风险婴幼儿”这一狭窄范围,而不能得到广泛应用。
Syangis的应用表明结合RSV-F蛋白的中和性单抗可以用于临床保护,F蛋白上存在有效的中和活性位点。而且F蛋白位于病毒表面对病毒入胞和合胞体形成在是必须的,因此,F蛋白是筛选预防和保护性抗体的重要靶标蛋白。
RSV是副粘病毒科肺炎病毒属的单股负链非节段性RNA病毒,有15222个核苷酸,编码10种主要蛋白。其中,F蛋白全长为574个氨基酸是N-糖基化的I型跨膜糖蛋白,作为主要跨膜蛋白是RSV感染过程中的重要表面分子。F蛋白膜融合的机制及触发过程仍完全不清楚,猜测是从处于高能量、亚稳定状态的融合前F构象(pre-fusion F,pre-F)与靶细胞结合后发生构象变化,形成高度稳定的融合后F蛋白(post-fusion F,pre-F),导致病毒膜与细胞膜的融合。亚稳定的pre-F构象和稳定的post-F构象的自由能差异很大导致膜融合的过程是不可逆的。McLellan等(J.S.McLellan,M.Chen,J.S.Chang,et al.J Virol,84(2010)12236-12244.)利用哺乳动物表达系统获得了稳定的post-F蛋白结构。
由于pre-F蛋白的结构不稳定,存在多种中间体,通过制备晶体研究pre-F蛋白的结构相当困难。因此,McLellan等(J.S.McLellan,M.Chen,J.S.Chang,et al.J Virol,84(2010)12236-12244.)利用已知结构的HPIV3pre-F蛋白对RSV pre-F蛋白的结构进行模拟和预测,提出RSV F蛋白可能存在pre-F构象,并提出了上述融合机制假说。对于pre-F构象的准确结构,及其融合过程中的变构过程都有待获得稳定的pre-F构象蛋白并进一步确认。
现阶段用于研究F蛋白抗原表位的抗体大部分是分离至BalB/c老鼠,通过多肽定位,抗体竞争与逃逸突变等方法对中和表位进行鉴定。作为病毒最主要的表面结构蛋白之一,F蛋白表面存在大量的中和抗体识别表位。目前已知的RSV F蛋白的中和抗体主要针对以下抗原表位(J.S.McLellan,Y.Yang,et al.J Virol,85(2011)7788-7796;M.Magro,D.Andreu,et al.J Virol,84(2010)7970-7982.)。
Ⅰ表位:针对Ⅰ表位的抗体有已上市的预防性单抗Synagis以及它的等效衍生物motavizumab,主要识别F1亚基a.a.255-a.a.275。McLellan等(J.S.McLellan,M.Chen,J.S.Chang,et al.J Virol,84(2010)12236-12244.)通过解析motavizumab单抗与F蛋白a.a.253-a.a.277残基肽的晶体结构证实这个区域形成“螺旋-转角-螺旋”二级结构为的结构。晶体结构显示motavizumab单抗结合在“螺旋-转角-螺旋”结构的一头,并且使得氢键和离子键作用于268位Asn与272位Lys,在这两个点的突变可引起抗体逃逸。motavizumab结合的抗原表位A的结构在post-fusion的结构中保留的非常完整,抗体结合位点暴露充分。motavizumab与post-F蛋白的结构揭示了Synagis和motavizumab单抗具有中和活性的机制。而RSV pre-F蛋白的模拟结构显示,该表位在pre-F蛋白处于构象的内部,在天然的RSVF蛋白上并不能暴露出来。Graham等证实,Synagis和motavizumab单抗只能够抑制RSV与细胞的融合,却不能抑制RSV的吸附(J.S.McLellan,Y.Yang,et al.J Virol,85(2011)7788-7796;J.S.McLellan,M.Chen,A.Kim,et al.Nat Struct Mol Biol,17(2010)248-250)。当然,只有通过pre-F蛋白的晶体结构才能对此进行确认。
Ⅱ表位:识别Ⅱ表位的抗体有131-2a,其识别F1的半胱氨酸富集区。这类抗体最多阻断50%RSV病毒感染,表明该表位具有翻译后的多相性,或者这些抗体通过间接效应如病毒的聚沉起中和效果。不像识别表位A和表位C的抗体,这些抗体部分地阻断病毒吸附靶细胞。很可能这个表位在pre-F蛋白的构象中靠近病毒的细胞膜,但是在post-F蛋白的构象中位于顶点。
Ⅳ表位:识别区域为a.a.422-a.a.438,是19和101F等单抗抗体的靶点。该表位位于F1中的构象相对保守的区域。McLellan等(J.S.McLellan,Y.Yang,et al.J Virol,85(2011)7788-7796)已经解出了101F与F蛋白(a.a.422-a.a.438)肽段复合物的晶体结构。该区域的核心表位为a.a.427-a.a.437,已知的逃逸突变Arg429和Lys433的氢键和离子键与101F相互作用。101F与游离肽的亲和力比与post-F的亲和力低几千倍,101F在post-F的结构上显示101F表位比线性肽更复杂。
针对上述三个表位的中和抗体与已上市的Synagis相比均没有太大的中和效价提升,且均与pre-F以及post-F有反应性。因此,以RSV F蛋白为靶标筛选针对pre-F且具有更高中和活性的单抗,将为RSV的预防与治疗奠定基础。
发明内容
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的,术语“RSV融合蛋白”或“F蛋白”是指,呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白(Fusion protein,F protein),其是本领域技术人员公知的(参见,例如NCBIGENBANK数据库登录号:P03420)。
如本文中所使用的,当提及F蛋白的氨基酸序列时,其使用SEQ ID NO:15所示的序列来进行描述。例如,表述“F蛋白的第196-209位氨基酸残基”是指,SEQ ID NO:15所示的多肽的第196-209位氨基酸残基。然而,本领域技术人员理解,在F蛋白的氨基酸序列中,可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于,置换,缺失和/或添加,例如不同基因型或基因亚型的F蛋白),而不影响其生物学功能。因此,在本发明中,术语“F蛋白”应包括所有此类序列,包括例如SEQ ID NO:15所示的序列以及其天然或人工的变体。并且,当描述F蛋白的序列片段时,其不仅包括SEQ ID NO:15的序列片段,还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如,表述“F蛋白的第196-209位氨基酸残基”包括,SEQ ID NO:15的第196-209位氨基酸残基,以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明,表述“相应序列片段”或“相应片段”是指,当对序列进行最优比对时,即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时,进行比较的序列中位于等同位置的片段。
之前的研究显示,F蛋白存在1种确定的构象,post-F。McLellan等结合副流感病毒(parainfluenza virus,PIV)的F蛋白研究结果推测,RSV的F蛋白可能还存在pre-F构象(McLellan等(2010),J Vriol,84:12236-12244)。在通常情况下,pre-F构象是不稳定的,其将自发转变为稳定的post-F构象。因此,从细胞中表达和纯化的F蛋白主要以post-F构象存在(McLellan等(2010),J Vriol,84:12236-12244)。
如本文中所使用的,术语“pre-F蛋白”是指,以pre-F构象存在的F蛋白。如本文中所使用的,术语“post-F蛋白”是指,以post-F构象存在的F蛋白。
如本文中所使用的,术语“抗体”是指,通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接,重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR)),其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991)),或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如,其包括,特别地,重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体,例如,IgG(例如,IgG1,IgG2,IgG3或IgG4亚型),IgA1,IgA2,IgD,IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的,术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽,其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力,和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合,其也被称为“抗原结合部分”。通常参见,Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版,Raven Press,N.Y.(1989),其以其全文通过引用合并入本文,用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下,抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如,scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽,其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
如本文中所使用的,术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段;术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段;术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544-546(1989));术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段;术语“F(ab')2片段”意指包含通过铰链区上的二硫键连接的两个Fab片段的抗体片段。
在一些情况下,抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scFv),其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见,例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构:NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如,可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头,但也可使用其变体(Holliger等人(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995),Protein Eng.8:725-731,Choi等人(2001),Eur.J.Immunol.31:94-106,Hu等人(1996),Cancer Res.56:3055-3061,Kipriyanov等人(1999),J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001),Cancer Immunol.描述。
在一些情况下,抗体的抗原结合片段是双抗体,即,双价抗体,其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达,但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对,从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见,例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993),和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如,重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的单克隆抗体5C4)获得抗体的抗原结合片段(例如,上述抗体片段),并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中,除非上下文明确指出,否则当提及术语“抗体”时,其不仅包括完整抗体,而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的,术语“单抗”和“单克隆抗体”是指,来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段,也即除可能自发出现的自然突变外,一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的,其通常包含至少2种或更多种的不同抗体,这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975),但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P 4,816,567)。
例如,可以如下来制备单克隆抗体。首先用免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。可将免疫原预先偶联到某些已知蛋白,如血清白蛋白或大豆胰酶抑制剂上,以增强抗原在宿主内的免疫原性。佐剂可以是弗氏佐剂或MPL-TDM等。动物在接受免疫后,体内将产生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。另外,淋巴细胞也可以利用体外免疫获得。收集目的淋巴细胞,并用合适的融合剂,如PEG,使其与骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,AcademicPress,1996)。上述制备的杂交瘤细胞可以接种到合适的培养液中生长,培养液中优选含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如,对于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT或HPRT)的母体骨髓瘤细胞,在培养液中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高,抗体分泌能力稳定,对HAT培养液敏感等特征。其中,骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤,如MOP-21或MC-11小鼠肿瘤衍生株(THE Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.USA),和SP-2/0或X63-Ag8-653细胞株(American Type CultureCollection,Rockville,Md.USA)。另外也有研究报道,利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur et al.,MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications,pp.51-63,Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)。生长杂交瘤细胞的培养液用于检测针对特异抗原的单抗的产生。测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性的方法包括例如,免疫沉淀或体外结合试验,如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。例如,可利用Munson等在Anal.Biochem.107:220(1980)描述的Scatchard分析法来测定单抗的亲和力。当确定了杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后,目的细胞株可以通过(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1996)所描述的标准的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养液可以是DMEM或RPMI-1640等。另外,杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。利用传统的免疫球蛋白纯化方法,如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等,可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。
还可以通过基因工程重组技术获得单克隆抗体。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增,可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。将所得的DNA分子插入表达载体内,然后转染宿主细胞(如E.coli细胞、COS细胞、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞),并在合适的条件下进行培养,可以获得重组表达的目标抗体。
如本文中所使用的,术语“嵌合抗体”是指这样的抗体,其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类),且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类),但无论如何,其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P 4,816,567to Cabilly etal.;Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:68516855(1984))。
如本文中所使用的,术语“人源化抗体”是指,人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段,其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如,小鼠、大鼠或兔)抗体。此外,受体抗体的构架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换,或被其他抗体的氨基酸残基替换,以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容,可参见例如,Jones et al.,Nature,321:522 525(1986);Reichmann etal.,Nature,332:323 329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593 596(1992);和Clark,Immunol.Today 21:397 402(2000)。
如本文中所使用的,“中和抗体”是指,能清除或显著降低目标病毒的毒力(例如,感染细胞的能力)的抗体或抗体片段。
如本文中所使用的,术语“表位”是指,抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如,表位通常以独特的空间构象包括至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15个连续或非连续的氨基酸,其可以是“线性的”或“构象的”。参见,例如,EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷,G.E.Morris,Ed.(1996)。在线性表位中,蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中,相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
如本文中所使用的,术语“表位肽”是指,抗原上能够用作表位的肽段。在一些情况下,单独的表位肽即能够被针对所述表位的抗体特异性识别/结合。在另一些情况下,可能需要将表位肽与载体蛋白融合,以便表位肽能够被特异性抗体识别。如本文中所使用的,术语“载体蛋白”是指这样的蛋白,其可以充当表位肽的载体,即,其可以在特定位置处(例如蛋白内部,N端或C端)插入表位肽,以便该表位肽能够呈现出来,从而该表位肽能够被抗体或免疫系统识别。此类载体蛋白是本领域技术人员熟知的,包括例如,HPV L1蛋白(可以将表位肽插入在所述蛋白的第130-131位氨基酸之间或在第426-427位氨基酸之间,参见Slupetzky,K.等Chimeric papillomavirus-like particles expressing a foreignepitope on capsid surface loops[J].J Gen Virol,2001,82:2799-2804;Varsani,A.等Chimeric human papillomavirus type 16(HPV-16)L1particles presenting thecommon neutralizing epitope for the L2minor capsid protein of HPV-6and HPV-16[J].J Virol,2003,77:8386-8393),HBV核心抗原(可以用表位肽替换所述蛋白的第79-81位氨基酸,参见Koletzki,D.,et al.HBV core particles allow the insertion andsurface exposure of the entire potentially protective region of Puumalahantavirus nucleocapsid protein[J].Biol Chem,1999,380:325-333),土拨鼠肝炎病毒核心蛋白(可以用表位肽替换所述蛋白的第79-81位氨基酸,参见SabineGertrudBeterams and Michael Nassal,J.Virol.1998,72(6):4997),CRM197蛋白(可以将表位肽连接至该蛋白或其片段的N末端或C末端)。任选地,可以在表位肽与载体蛋白之间使用连接体(例如柔性或刚性连接体),以促进二者各自的折叠。
可使用本领域技术人员已知的常规技术,就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如,可进行竞争和交叉竞争研究,以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原(例如,RSV融合蛋白)的结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请WO 03/48731中。因此,可使用本领域技术人员已知的常规技术,获得与本发明的单克隆抗体(例如,单克隆抗体5C4)竞争结合RSV融合蛋白上的相同表位的抗体及其抗原结合片段(即,抗原结合部分)。
如本文中所使用的,术语“分离的”或“被分离的”指的是,从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分,那么可能是其所处的天然环境发生了改变,或从天然环境下分离出该物质,或二者情况均有发生。例如,某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽,而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质,也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本文中所使用的,术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统,其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株,例如但不限于:GI698,ER2566,BL21(DE3),B834(DE3),BLR(DE3)。
如本文中所使用的,术语“载体(vector)”是指,可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时,载体称为表达载体。载体可以通过转化,转导或者转染导入宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的,包括但不限于:质粒;噬菌粒;柯斯质粒;人工染色体,例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于,逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件,包括但不限于,启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外,载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的,术语“宿主细胞”是指,可用于导入载体的细胞,其包括但不限于,如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞,如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞,如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞,或者如纤维原细胞,CHO细胞,COS细胞,NSO细胞,HeLa细胞,BHK细胞,HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的,术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如,两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据,或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据),那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如,如果两个序列的10个位置中有6个匹配,那么这两个序列具有60%的同一性。例如,DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常,在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用,例如,可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.,4:11-17(1988))的算法,使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外,可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法,使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的,术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如,可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换,例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质,包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如,赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此,优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见,例如,Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997),其通过引用并入本文)。
如本文中使用的,术语“免疫原性(immunogenicity)”是指,能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。其既指,抗原能刺激特定的免疫细胞,使免疫细胞活化、增殖、分化,最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的特性,也指抗原刺激机体后,机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答。免疫原性是抗原最重要的性质,一种抗原能否成功地诱导宿主产生免疫应答取决于三方面的因素:抗原的性质、宿主的反应性和免疫方式。
如本文中使用的,术语“特异性结合”是指,两分子间的非随机的结合反应,如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中,特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指,抗体以小于大约10-5M,例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本文中所使用的,术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数,其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小,抗体-抗原结合越紧密,抗体与抗原之间的亲和力越高。通常,抗体(例如,本发明的单克隆抗体5C4)以小于大约10-5M,例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如,RSV融合蛋白),例如,如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。
如本文中所使用的,术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用;术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用;术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中,氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如,丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的,术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”可互换使用,并且当提及术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”时,其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。例如,当提及杂交瘤细胞株RSV-Y-5C4-2(其在本文中也简称为,杂交瘤细胞株5C4)时,其还指杂交瘤细胞株RSV-Y-5C4-2的亚克隆和后代细胞。
如本文中所使用的,术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂,其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995),并且包括但不限于:pH调节剂,表面活性剂,佐剂,离子强度增强剂。例如,pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液;表面活性剂包括但不限于阳离子,阴离子或者非离子型表面活性剂,例如Tween-80;离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文中所使用的,术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂,当其与抗原一起或预先递送入机体时,其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种,包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
如本文中所使用的,术语“蛋白疫苗”是指,基于多肽的疫苗,其任选地还包含佐剂。疫苗中的多肽可以是通过基因工程技术获得的,也可以是通过化学合成方法获得的。如本文中所使用的,术语“核酸疫苗”是指,基于DNA或RNA(例如质粒,如表达质粒)的疫苗,其任选地还包含佐剂。
如本文中所使用的,术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如,预防疾病(例如RSV感染或与RSV感染相关的疾病)有效量是指,足以预防,阻止,或延迟疾病(例如RSV感染或与RSV感染相关的疾病)的发生的量;治疗疾病有效量是指,足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如,对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄,体重和性别,药物的施用方式,以及同时施用的其他治疗等等。
如本文中所使用的,本发明的表位肽的生物学功能包括但不限于选自下列的一种或多种:
1)与抗体5C4的特异性结合;
2)在受试者体内降低RSV融合蛋白的血清水平的能力(任选地,在将所述表位肽与载体蛋白融合后);
3)诱发有效清除体内的RSV和被RSV感染的细胞的抗体应答的能力(任选地,在将所述表位肽与载体蛋白融合后);和
4)治疗受试者的RSV感染或与RSV感染相关的疾病(例如肺炎)的能力(任选地,在将所述表位肽与载体蛋白融合后)。
本发明人经过大量的实验研究,出人意料地发现:RSV融合蛋白中的某些表位(例如,RSV融合蛋白的第148-216位氨基酸中包含的表位,或者包含RSV融合蛋白的第62-69位和第196-209位氨基酸残基的表位)以及识别这些表位的抗体促进了F蛋白的pre-F构象的稳定和维持,并且这些表位以及pre-F构象的稳定和维持对于机体免疫应答的诱导具有重要意义,并且所述的抗体具有特别优良的生物学活性(例如,特别高的中和活性),从而特别适合用于预防或治疗RSV感染或与RSV感染相关的疾病(例如肺炎,如小儿肺炎)。
因此,在一个方面,本发明提供了一种分离的表位肽或其变体,其中,所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第148-216位氨基酸残基或其片段组成,且至少包含呼吸道合胞病毒融合蛋白的第196-209位氨基酸残基,并且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于1个或几个(例如,1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个或9个)氨基酸残基的保守置换,且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。
在本发明的各种实施方案中,优选地,本发明的表位肽以其在pre-F蛋白中的空间构象存在,并且所述变体保留了其所源自的表位肽的空间构象。
在一个优选的实施方案中,所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第196-209位氨基酸残基组成,并且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于1个或几个(例如,1个,2个,3个或4个)氨基酸残基的保守置换,且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。
在另一个优选的实施方案中,所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第196-216位氨基酸残基组成,且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于1个或几个(例如,1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个或9个)氨基酸残基的保守置换,且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。
在另一个优选的实施方案中,所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第185-216位氨基酸残基组成,且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于1个或几个(例如,1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个或9个)氨基酸残基的保守置换,且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。
在另一个优选的实施方案中,所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第185-216位氨基酸残基组成,其中第185-194位氨基酸在蛋白质2级结构上形成β折叠,且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于1个或几个(例如,1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个或9个)氨基酸残基的保守置换,且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。
在另一个优选的实施方案中,所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第176-216位氨基酸残基组成,且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于1个或几个(例如,1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个)氨基酸残基的保守置换,且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。
在另一个优选的实施方案中,所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第176-216位氨基酸残基组成,其中第176-181位氨基酸与第185-194位氨基酸在蛋白质2级结构上形成β折叠,且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于1个或几个(例如,1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个)氨基酸残基的保守置换,且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。
在另一个优选的实施方案中,所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第148-216位氨基酸残基组成,且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于1个或几个(例如,1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个)氨基酸残基的保守置换,且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。
在另一个优选的实施方案中,所述表位肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第148-216位氨基酸残基组成,其中第176-181位氨基酸与第185-194位氨基酸在蛋白质2级结构上形成β折叠,且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于1个或几个(例如,1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个)氨基酸残基的保守置换,且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。
在另一个方面,本发明提供了一种分离的表位肽或其变体,其由第一肽和第二肽构成,其中第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第148-216位氨基酸残基或其片段组成且至少包含呼吸道合胞病毒融合蛋白的第196-209位氨基酸残基,并且第二肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第62-69位或第62-76位氨基酸组成,其中所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于1个或几个(例如,1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个)氨基酸残基的保守置换,且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。
在本发明的各种实施方案中,优选地,所述第一肽和第二肽以其在pre-F蛋白中的空间构象存在,并且所述变体保留了其所源自的表位肽的空间构象。
在一个优选的实施方案中,所述第一肽与第二肽共同构成了存在于RSV融合蛋白的pre-F构象中的空间结构。
在一个进一步优选的实施方案中,所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第196-209位氨基酸残基组成。在另一个优选的实施方案中,所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第196-216位氨基酸残基组成。在另一个优选的实施方案中,所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第185-216位氨基酸残基组成。在另一个优选的实施方案中,所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第185-216位氨基酸残基组成,其中第185-194位氨基酸在蛋白质2级结构上形成β折叠。在另一个优选的实施方案中,所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第176-216位氨基酸残基组成。在另一个优选的实施方案中,所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第176-216位氨基酸残基组成,其中第176-181位氨基酸与第185-194位氨基酸在蛋白质2级结构上形成β折叠。在另一个优选的实施方案中,所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第148-216位氨基酸残基组成。在另一个优选的实施方案中,所述第一肽由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第148-216位氨基酸残基组成,其中第176-181位氨基酸与第185-194位氨基酸在蛋白质2级结构上形成β折叠。
本领域技术人员知晓,可以将表位肽或其变体与载体蛋白融合,以增强表位肽或其变体的免疫原性,使得表位肽或其变体能够被机体的免疫系统识别,并诱发有效预防病毒感染。
因此,在一个方面,本发明还提供了一种重组蛋白,其包含本发明的分离的表位肽或其变体以及载体蛋白,并且所述重组蛋白不是天然存在的蛋白或其片段。在所述重组蛋白中,所述表位肽或其变体可以连接至载体蛋白的N末端或C末端,插入载体蛋白的内部,或替换载体蛋白的部分氨基酸序列,视所使用的具体载体蛋白而定。此外,任选地,所述表位肽或其变体通过连接体(刚性或柔性连接体,例如(GGGGS)3)与载体蛋白相连接。本发明的重组蛋白不受其产生方式的限定,例如,其可以通过基因工程方法(重组技术)产生,也可以通过化学合成方法产生。
在另一个方面,本发明还提供了一种分离的核酸分子,其包含编码本发明的表位肽或其变体或本发明的重组蛋白的核苷酸序列。在另一个方面,本发明还提供了一种载体,其包含如上所述的分离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体,也可以是表达载体。在一个优选实施方案中,本发明的载体是例如质粒,粘粒,噬菌体,柯斯质粒等等。在一个优选实施方案中,所述载体能够在受试者(例如哺乳动物,例如人)体内表达本发明的表位肽或其变体或本发明的重组蛋白。
在另一个方面,还提供了包含本发明的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于,原核细胞例如大肠杆菌细胞,以及真核细胞例如酵母细胞,昆虫细胞,植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞,例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系,例如293T细胞。
在另一个方面,还提供了制备本发明的重组蛋白的方法,其包括,在合适的条件下培养本发明的宿主细胞,和从细胞培养物中回收本发明的重组蛋白。
在另一个方面,本发明提供了一种蛋白疫苗,其包含本发明的表位肽(或其变体)或重组蛋白,以及药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)。在一个优选实施方案中,所述蛋白疫苗包含一个或多个本发明的表位肽,且这些表位肽可以是单独的或串联的、修饰的或未经修饰的、偶联至其他蛋白的或不偶联至其他蛋白的。
在另一个方面,本发明提供了用于预防、治疗或抑制受试者的RSV感染或与RSV感染相关的疾病(例如肺炎,如小儿肺炎)的方法,其包括,给有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的表位肽(或其变体)或重组蛋白或蛋白疫苗。
在另一个方面,提供了本发明的表位肽(或其变体)或重组蛋白在制备蛋白疫苗中的用途,所述蛋白疫苗用于预防、治疗或抑制受试者的RSV感染或与RSV感染相关的疾病(例如肺炎,如小儿肺炎)。
在另一个方面,提供了本发明的表位肽(或其变体)或重组蛋白,其用于预防、治疗或抑制受试者的RSV感染或与RSV感染相关的疾病(例如肺炎,如小儿肺炎)。
在另一个方面,本发明提供了一种基因疫苗,其包含本发明的分离的核酸分子或载体,以及药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)。在一个优选实施方案中,所述基因疫苗包含DNA或RNA。在此类实施方案中,所述DNA或RNA可以是裸露的或可以包裹于具有传递或/和保护功能的外壳内。在一个进一步优选的实施方案中,所述外壳可以是腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒等的外壳,也可以是采用化学方法合成的能行使相似功能的其他材料。
在另一个方面,本发明提供了用于预防、治疗或抑制受试者的RSV感染或与RSV感染相关的疾病(例如肺炎,如小儿肺炎)的方法,其包括,给有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的基因疫苗或分离的核酸分子或载体。
在另一个方面,提供了本发明的分离的核酸分子或载体在制备基因疫苗中的用途,所述基因疫苗用于预防、治疗或抑制受试者的RSV感染或与RSV感染相关的疾病(例如肺炎,如小儿肺炎)。
在另一个方面,提供了本发明的分离的核酸分子或载体,其用于预防、治疗或抑制受试者的RSV感染或与RSV感染相关的疾病(例如肺炎,如小儿肺炎)。
在另一个方面,本发明提供了一种组合物,其包含本发明的表位肽(或其变体)或重组蛋白或分离的核酸分子或载体,以及药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)。在一个优选实施方案中,所述药物组合物包含一个或多个本发明的表位肽,且这些表位肽可以是单独的或串联的、修饰的或未经修饰的、偶联至其他蛋白的或不偶联至其他蛋白的。
在另一个方面,本发明提供了制备能够特异性结合并中和呼吸道合胞病毒并且稳定和维持F蛋白的pre-F构象的抗体的方法,其包括:
1)用本发明的表位肽(或其变体)或重组蛋白免疫非人动物(例如小鼠),以使所述动物产生抗体;和
2)筛选对呼吸道合胞病毒具有中和活性且与post-F蛋白不具有反应性(即,不结合或基本上不结合post-F蛋白)的抗体。
在另一个方面,本发明提供了能够特异性结合并中和呼吸道合胞病毒并且稳定和维持F蛋白的pre-F构象的抗体或其抗原结合片段,其通过如上所述的方法制备获得。
在一个方面,本发明提供了一种单克隆抗体及其抗原结合片段,其中,所述单克隆抗体能够特异性结合本发明的表位肽。优选地,所述单克隆抗体能够特异性结合呼吸道合胞病毒融合蛋白的第148-216位氨基酸残基或其片段(例如呼吸道合胞病毒融合蛋白的第196-209位氨基酸残基),和/或,呼吸道合胞病毒融合蛋白的第62-69位或第62-76位氨基酸残基。
在一个优选的实施方案中,所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如,scFv)、小鼠抗体、兔抗体、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体(例如,人鼠嵌合抗体)或双特异或多特异抗体。
在一个优选的实施方案中,所述的单克隆抗体包括非-CDR区,且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种,例如来自人抗体。
在一个优选的实施方案中,所述的单克隆抗体特异性结合呼吸道合胞病毒,且对所述病毒具有中和活性。在一个优选的实施方案中,所述的单克隆抗体不结合或基本上不结合post-F蛋白,而是结合并稳定pre-F蛋白。
在一个优选的实施方案中,所述的单克隆抗体包含下列CDR:
1)如SEQ ID NO:20所示的重链CDR1;
2)如SEQ ID NO:21所示的重链CDR2;
3)如SEQ ID NO:22所示的重链CDR3;
4)如SEQ ID NO:23所示的轻链CDR1;
5)如SEQ ID NO:24所示的轻链CDR2;和
6)如SEQ ID NO:25所示的轻链CDR3。
在一个优选的实施方案中,所述的单克隆抗体包含:
a)如SEQ ID NO:17所示的重链可变区;和
b)如SEQ ID NO:19所示的轻链可变区。
在一个优选的实施方案中,所述的单克隆抗体衍生自选自下列的单克隆抗体,或是选自下列的抗体:
杂交瘤细胞株5C4所产生的单克隆抗体,其中,杂交瘤细胞株5C4保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),且具有保藏号CCTCC NO:C2012147。
在另一个方面,本发明提供了一种单克隆抗体及其抗原结合片段,其能够阻断本发明的表位肽或pre-F蛋白与由杂交瘤细胞株5C4所产生的抗体的结合至少50%,优选至少60%,优选至少70%,优选至少80%,优选至少90%,优选至少95%或优选至少99%,其中,所述杂交瘤细胞株5C4保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),且具有保藏号CCTCC NO:C2012147。
此类单抗所识别的表位与单抗5C4识别的表位相同,或者在空间上存在重叠,从而此类单抗能够降低单抗5C4与本发明的表位肽或pre-F蛋白的结合至少50%,优选至少60%,优选至少70%,优选至少80%,优选至少90%,优选至少95%或优选至少99%。
本发明还提供了分离的核酸分子,其编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。此类核酸分子可以从杂交瘤细胞中分离得到,也可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。
在一个方面,本发明提供了分离的核酸分子,其包含能够编码本发明的单克隆抗体的重链可变区的核酸序列。
在一个优选的实施方案中,所述重链可变区如SEQ ID NO:17所示。在另一个优选的实施方案中,所述核酸分子具有SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。
在另一个方面,本发明提供了分离的核酸分子,其包含能够编码本发明的单克隆抗体的轻链可变区的核酸序列。
在一个优选的实施方案中,所述轻链可变区如SEQ ID NO:19所示。在另一个优选的实施方案中,所述核酸分子具有SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。
在另一个方面,本发明提供了一种载体,其包含本发明的分离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体,也可以是表达载体。
在一个优选实施方案中,本发明的载体是例如质粒,粘粒,噬菌体,柯斯质粒等等。
在另一个方面,还提供了包含本发明的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于,原核细胞例如大肠杆菌细胞,以及真核细胞例如酵母细胞,昆虫细胞,植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞,例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系,例如293T细胞。
在另一个方面,还提供了制备本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法,其包括,在合适的条件下培养本发明的宿主细胞,和从细胞培养物中回收本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面,本发明提供了一种杂交瘤细胞株5C4,其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),且具有保藏号CCTCC NO:C2012147。
可通过常规方法,从单克隆抗体5C4中获得抗体所包含的重链可变区、轻链可变区、重链可变区CDR和轻链可变区CDR的氨基酸序列和/或核苷酸序列。
单克隆抗体5C4的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:17和19所示;编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO:16和18所示。
单克隆抗体5C4的重链可变区CDR和轻链可变区CDR的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:20-25所示。
在另一个方面,本发明提供了一种试剂盒,其包括本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中,本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中,所述试剂盒还包括第二抗体,其特异性识别本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。优选地,所述第二抗体还包括可检测的标记。此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的,包括但不限于,放射性同位素,荧光物质,发光物质,有色物质和酶(例如辣根过氧化物酶)等。
在另一个方面,本发明提供了稳定pre-F蛋白的方法,其包括使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段,或者D25或AM22单克隆抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面,本发明提供了检测pre-F蛋白在样品中的存在或或其水平的方法,其包括使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中,本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中,所述方法还包括,使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。所述方法可以用于诊断目的,或者非诊断目的(例如,所述样品是细胞样品,而非来自患者的样品)。
在另一个方面,本发明提供了诊断受试者是否感染了RSV的方法,其包括:使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段检测RSV在来自所述受试者的样品中的存在。在一个优选的实施方案中,本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中,所述方法还包括,使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面,提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或者D25或AM22单克隆抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于稳定pre-F蛋白,或检测pre-F蛋白在样品中的存在或其水平,或用于诊断受试者是否感染了RSV。
在另一个方面,本发明提供了一种药物组合物,其包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段,以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在另一个方面,本发明提供了用于预防或治疗受试者的RSV感染或与RSV感染相关的疾病(例如肺炎,如小儿肺炎)的方法,其包括,给有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段,或者本发明的药物组合物。
在另一个方面,提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备药物组合物中的用途,所述药物组合物用于预防或治疗受试者的RSV感染或与RSV感染相关的疾病(例如肺炎,如小儿肺炎)。
在另一个方面,提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段,用于预防或治疗受试者的RSV感染或与RSV感染相关的疾病(例如肺炎,如小儿肺炎)。
本发明所提供的疫苗(蛋白疫苗和基因疫苗)、药物和药物组合物可以单独使用或联合使用,也可以与其他药学活性剂(例如干扰素类药物,如干扰素或聚乙二醇干扰素)联合使用。
在另一个方面,本发明提供了表达pre-F蛋白或抗原-抗体复合物的方法,其包括,在细胞中共表达编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或者D25或AM22单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸,以及编码F蛋白的核酸。
在另一个方面,本发明提供了试剂盒,其包含编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或者D25或AM22单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸,以及编码F蛋白的核酸。
发明的有益效果
本发明人首次发现了呼吸道合胞病毒融合蛋白(F蛋白)的新表位,并且出人意料地发现,该新表位以及特异性识别该新表位的抗体对于F蛋白的pre-F构象的稳定和维持具有重要作用。
此外,本发明人还发现,与现有技术已知的针对呼吸道合胞病毒融合蛋白的抗体相比,本发明的特异性识别该新表位的抗体具有更高的中和活性,这表明F蛋白的pre-F构象以及本发明所发现的新表位对于抗呼吸道合胞病毒的免疫应答的诱导具有重要作用。
因此,本发明的表位肽或含有该表位肽的重组蛋白能有效用作蛋白疫苗,用于预防受试者的呼吸道合胞病毒感染或与呼吸道合胞病毒感染相关的疾病(例如小儿肺炎)。
此外,本发明的单克隆抗体及其抗原结合片段具有更高的中和活性,从而能够以更低的剂量有效阻断呼吸道合胞病毒对细胞的感染,进而可有效用于预防或治疗受试者的呼吸道合胞病毒感染或与呼吸道合胞病毒感染相关的疾病(例如小儿肺炎)。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了检测5C4单抗与post-F之间的反应性的ELISA测定法。结果显示,相比于商业化抗体帕利珠单抗(palivizumab,Synagis)和莫维珠单抗(Motavizumab),5C4抗体对post-F无明显的反应性。
图2显示了5C4单抗的中和活性的测定。结果显示,5C4单抗对呼吸道合胞病毒具有强中和活性。特别地,相比于商业化抗体帕利珠单抗(palivizumab,Synagis)和莫维珠单抗(Motavizumab),以及之前已报道的抗体D25(参见,美国专利申请12/600,950)及)及AM22(参见,美国专利申请12/898,325),5C4单抗对呼吸道合胞病毒的中和活性更强。
图3显示了5C4单抗的结合抑制活性的测定。结果显示,几株检测单抗均不影响病毒对细胞的吸附。
图4显示了5C4单抗的融合抑制活性的测定。结果显示,相比于商业化抗体帕利珠单抗(palivizumab,Synagis)和莫维珠单抗(Motavizumab),以及之前已报道的抗体D25(参见,美国专利申请12/600,950)及)及AM22(参见,美国专利申请12/898,325),5C4抗体的融合抑制活性更强。
图5显示了5C4单抗的病毒捕获能力的检测。结果显示,5C4单抗与呼吸道合胞病毒的结合具有很强的特异性。特别地,相比于商业化抗体帕利珠单抗(palivizumab,Synagis),5C4抗体对呼吸道合胞病毒的捕获能力更强。
图6显示了5C4单抗的反应性的Western Blot检测。结果显示,5C4单抗为识别构象表位的单抗,其识别非变性的RSV-A2和RSV-GFP,而不识别变性的RSV-A2和RSV-GFP。此外,5C4单抗能特异性识别RSV-A2、RSV-GFP,但与post-F基本上无反应性。
图7显示了使用5C4单抗的免疫荧光的检测。结果显示,5C4单抗可用于检测RSV A2对细胞的感染。
图8显示了5C4单抗与其他单抗的竞争性结合的分析。结果显示,AM22单抗、D25单抗与5C4单抗之间存在竞争结合,5C4单抗对AM22单抗、D25单抗结合的阻断率最高可达99%。这表明5C4单抗与AM22单抗、D25单抗识别抗原(F蛋白)上的相同表位。
图9显示了AM22/F蛋白、5C4/F蛋白与D25/F蛋白抗原-抗体复合物的电子显微镜观察结果。结果显示,AM22/F蛋白、5C4/F蛋白与D25/F蛋白抗原-抗体复合物具有相同的结构。这表明,AM22单抗、5C4单抗与D25单抗结合F蛋白上的相同表位,并且结合相同构象的F蛋白(pre-F构象)。
图10显示了帕利珠单抗/F蛋白与5C4/F蛋白抗原-抗体复合物的电子显微镜结果的比较,其中左图为post-F与帕利珠单抗的复合物的电子显微镜结果;左下图显示,左上图的白框区域中的post-F在电镜下观察到的结构;右图为pre-F与5C4的复合物的电子显微镜结果,图中白框区域为pre-F在电镜下观察到的结构。结果显示,帕利珠单抗/F蛋白与5C4/F蛋白抗原-抗体复合物具有显著不同的结构,并且这2种抗原抗体复合物中的F蛋白的构象也显著不同,其中帕利珠单抗/F蛋白复合物中的F蛋白为post-F构象,而5C4/F蛋白复合物中的F蛋白为pre-F构象。
图11显示了D25/F蛋白复合物的晶体结构。
图12显示了D25单抗与F蛋白上的表位的结合的空间结构。
图13显示了D25结合的表位在pre-F蛋白与post-F蛋白中的三级结构的变化。
图14显示了pre-F蛋白的单体和三聚体以及post-F蛋白的单体和三聚体的晶体结构。结果显示,pre-F蛋白与post-F蛋白具有显著不同的空间结构(构象)。
图15显示了pre-F蛋白和post-F蛋白的空间结构,构成所述空间结构的对应氨基酸序列,以及D25所识别的表位序列。结果显示,pre-F蛋白和post-F蛋白的空间结构存在着显著的差异。特别地,pre-F蛋白的空间结构包括α1-α10螺旋和β1-β23折叠;而post-F蛋白的空间结构包括α1螺旋,α5-α8螺旋,α10螺旋,β1-β2折叠和β5-β21折叠。
此外,图15的结果还显示,D25单克隆抗体在pre-F蛋白中的核心识别表位为两个空间上相互接近的肽段,即,a.a.62-69与a.a.196-209。这两个肽段的相互作用界面表明,F蛋白中的两个区段(a.a.62-76与a.a.137-216(或更具体地,a.a.148-216))或其片段对于这类抗体(本发明的抗体(例如5C4),D25和AM22)识别并稳定pre-F蛋白具有重要的作用,其中a.a.176-181与a.a.185-194这两个区域在F蛋白的pre-F构象及post-F构象之间存在显著的转变:它们在pre-F蛋白中的构象为β折叠(β3-β4折叠),而在post-F蛋白中的构象为α螺旋(包含在α5螺旋中)。
本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。
表1:序列的说明
生物材料保藏的说明
本发明的杂交瘤细胞株RSV-Y-5C4-2于2012年10月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC,中国湖北省武汉市武汉大学),其具有保藏号CCTCC NO:C2012147。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明,本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法,基本上参照J.Sambrook等人,分子克隆:实验室手册,第2版,冷泉港实验室出版社,1989,以及F.M.Ausubel等人,精编分子生物学实验指南,第3版,John Wiley&Sons,Inc.,1995中所述的方法进行;限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓,实施例以举例方式描述本发明,且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.RSV病毒的制备
RSV A2病毒株的制备和扩增
RSV A2病毒株由NIH Dr.Barney S.Graham(Graham et al,1988)实验室制备并馈赠。
准备汇合率为80%的Hep2细胞,37℃培养6小时后,去除上清,加入1ml RSV A2病毒株,室温孵育1小时。随后加入10%MEM培养基至15ml,37℃培养4天。收集细胞以及细胞上清至预冷的50ml离心管,使用手握式超声破碎仪破碎(50%,破1秒停3秒)后,置于冷冻离心机1000rpm,4℃离心15分钟。将上清转移至预冷的50ml离心管中,随后分装为1ml/管,置于干冰-酒精混合液中速冻。最后置于-80℃保存。
RSV GFP病毒的制备和扩增
RSV GFP病毒由NIH Dr.Peter Collins制备(Hallak et al),且由NIH Dr.BarneyS.Graham实验室馈赠。
准备汇合率为80%的Hep2细胞,37℃培养6小时后,去除上清,加入1ml RSV GFP病毒,室温孵育1小时。随后加入10%MEM培养基至15ml,37℃培养4天。收集细胞以及细胞上清至预冷的50ml离心管,使用手握式超声破碎仪破碎(50%,破1秒停3秒)后,置于冷冻离心机1000rpm,4℃离心15分钟。将上清转移至预冷的50ml离心管中,随后分装为1ml/管,置于干冰-酒精混合液中速冻。最后置于-80℃保存。
实施例2.post-F蛋白的表达和DNA-F载体的构建
post-F蛋白的表达
post-F蛋白的序列来自RSV-A2病毒株。为了增强post-F蛋白的表达,将其氨基酸序列中的第102(P102)、379(I379)和447(M447)位氨基酸分别替换成丙氨酸(P102A)、缬氨酸(I379V)以及缬氨酸(M447V)。此外,还从post-F蛋白序列中去除了融合肽段137-146。将经密码子优化的post-F序列插入真核表达载体pLEXm中(由Regensburg公司合成),从而获得post-F表达质粒pLEXm-postF,并且其C末端还包含HRV 3C蛋白酶位点以及8xHis标签。
pLEXm-postF经瞬时转染系统(TrueFect-Max,购买于United BioSystems公司)转入HEK293F细胞(购买于Invitrogen公司)中,置于120rpm、9%CO2摇床上37℃悬浮培养4-5天。收集细胞后,先用Ni2+-NTA Resin(购买于Qiagen公司)纯化,洗脱缓冲液为20mM Tris-HCl pH 7.5,200mM NaCl和250mM咪唑,pH 8.0。再根据说明书,用StrepTactin resin(购买于Novagen公司)进一步纯化。用HRV 3C protease(Novagen)酶切蛋白,再重新过Ni2+-NTA,除去未切干净的蛋白和亲和标签。蛋白再经过Superdex 200凝胶过滤柱(购买于GEHealthcare公司)纯化,缓冲液为2mM Tris-HCl pH 7.5,150mM NaCl和0.02%NaN3,最后将蛋白浓缩至约6mg/mL。
DNA-F的构建
将目的片段(RSV的全长F蛋白)构建到穿梭质粒ptrack-CMV中,获得质粒pAdTrack-CMV-RSV F。PmeI单酶切线性化37℃7h以上,酶切体系为50uL。在上述管中加buffer和去磷酸化酶,37度反应7h以上。而后乙醇沉淀,离心后用无菌水重悬。转化BJAdEasy感受态细菌,使pAdTrack-CMV-RSV F与pAdEasy-1在E.coli BJ5183中重组,再涂布至卡那霉素抗性的LB平板上,37℃选择培养,挑取6~8个小菌落,提取质粒,鉴定质粒大小(腺病毒质粒pAdEasy-1为33414bp)。用PacⅠ酶切鉴定:可切出两个片段,一个是30kb左右,另一个是3.0kb或4.5kb的片段,将鉴定正确后的阳性重组子转入E.coli DH5α中,保菌,提取质粒,获高拷贝数的质粒备用。准备1-2瓶293β5细胞,每瓶2*106个细胞,培养24h。用PacI消化重组腺病毒质粒4ug。乙醇沉淀质粒,用20uL无菌水重悬。将4ug经PacI消化的质粒和20uL Lipofectamine(GIBCO BRL)混合到500uL OptiMem I培养基中(每瓶细胞),室温孵育15-30min。用4mL无血清培养基洗一遍细胞。每瓶加入2.5mL OptiMem I。置37℃孵育约10min。加入Lipofectamine-DNA混合液至细胞瓶,置37℃孵育。4h后吸掉含Lipofectamine-DNA混合液的上清,加入6mL新鲜的完全培养基,37℃培养过夜。转染后7-10天,用橡胶刮棒将细胞刮下(不是胰酶),转至50mL锥底管。离心后用2mLHBSS或无菌PBS重悬。用干冰/甲醇冰浴冷冻细胞,再用37℃水浴化冻。剧烈震荡。重复上述“冻/融/震”过程3次,置-20℃保存。使用上述病毒悬液感染293β5细胞,37℃培养48h至荧光很强时,将感染后的细胞用培养基直接吹起,3000转离心3min,沉淀重悬,在液氮中反复冻融6次至细胞裂解后,4000转离心30min,取上清。在超离管中小心加入5ml40%Cscl,4.5ml15%Cscl,再加入上清,使其分层,平衡后,上超离,4℃下32000转离心16h,出现两条条带。而后小心吸出位于下层的较粗的条带,在含5%蔗糖、MgCl2的20mM TB8.0中透析后,即可得到纯化好的重组腺病毒。
实施例3.单克隆抗体的制备
杂交瘤的制备:
使用尾静脉注射DNA免疫方式和PEG融合方法获得单克隆抗体,详细方法参见EdHarlow et al.,“Antibodies A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory1988。简要过程如下:
小鼠免疫:首次免疫使用RSV全长F基因的质粒,免疫前将PBS与弗氏完全佐剂(CFA)等体积混合乳化,经四肢肌肉多点注射,每只每次注射300ul。使用PBS将RSV全长F基因的质粒稀释至50ug/ml,每只小鼠经尾静脉高压注射2ml。首次免疫后10d和17d,分别用同样剂量PBS加弗氏不完全佐剂(IFA)进行加强免疫后每只小鼠经尾静脉注射2ml含106拷贝量RSV F蛋白全长基因的腺病毒。第二加强后采血检测HI的抑制效价,当效价达到1:640后,取小鼠脾脏做融合。融合前72hr再次加强免疫,经脾脏注射RSV-A2株病毒液1次,50ul/只。制备15块融合板。
融合:取血清中抗体中和RSV GFP的反应滴度最高的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0相融合。先把脾脏研磨得到脾细胞悬液,然后与细胞数低十倍的处于对数生长期的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞混合,经PEG1500作用1min将两种细胞融合一起,然后把融合细胞液100ml分装到10块96孔板中培养。融合培养基为含HAT和20%FBS的RPMI1640完全筛选培养基。抗原特异性克隆通过间接ELISA法和中和试验筛选,筛选有中和活性且无post-F反应性的单克隆抗体细胞株。经3次克隆化后,得到稳定的单克隆抗体细胞株。
杂交瘤的筛选:融合后细胞在96孔细胞板上培养10天后,吸取细胞上清做RSV-post F酶联免疫法及RSV-A2中和检测,酶联免疫法或RSV-A2阳性孔继续克隆化,直至细胞株所分泌的抗体能够稳定阻断RSV-A2且不与post F反应为止。
筛选结果:获得一株杂交瘤细胞株RSV-Y-5C4-2,其所分泌的单克隆抗体5C4与post-F无反应性,且有较高的中和活性。
杂交瘤的培养:稳定的杂交瘤单克隆抗体细胞株先在二氧化碳培养箱中扩增培养,经96孔转移至24孔,再转移至50ml细胞瓶经扩增培养。然后收集细胞瓶内的细胞注射到小鼠腹腔内,7-10天后从小鼠腹腔中吸取腹水。
单克隆抗体的纯化:腹水先用50%的硫酸铵沉淀处理,然后对PB,pH7.4透析,之后用DEAE柱在HPLC下纯化,得到纯化后的单克隆抗体,经SDS-PAGE鉴定纯化后的单克隆抗体纯度。
实施例4.单克隆抗体5C4的表征
对post-F的反应性的ELISA检测
用1XCB将post-F稀释至20ng/100μL的浓度,包被于聚苯乙烯板的微孔中,100μL每孔,37℃包被2小时,PBST洗1次。加入含2%(质量/体积比)的BSA的PBS 180μL封闭,37℃孵育2小时。将待检抗体稀释至1μg/ml作为原始滴度加入100μL,并且10倍梯度稀释,用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠1:5000稀释加入100μL作为检测二抗,ELISA读值大于0.5为检测阳性。结果如图1所示。图1的结果显示,5C4单抗与post-F几乎无结合。相比于商业化抗体帕利珠单抗(palivizumab,Synagis)和莫维珠单抗(Motavizumab),5C4抗体对post-F无明显的反应性。
中和活性的测定
将待检抗体稀释至100μg/ml作为原始滴度,加入100μL于U底板中,并且4倍梯度稀释。加入1×106PFU的75μL呼吸道合胞病毒悬液,37℃孵育1小时。而后将孵育后混合液100ul加入铺有100ul Hep2细胞的96孔板上,37℃孵育24小时,Paradim检测其中和活性。结果如图2所示。图2的结果显示,5C4单抗对呼吸道合胞病毒具有强中和活性。特别地,相比于商业化抗体帕利珠单抗(palivizumab,Synagis)和莫维珠单抗(Motavizumab),以及之前已报道的抗体D25(参见,美国专利申请12/600,950)及)及AM22(参见,美国专利申请12/898,325),5C4抗体对呼吸道合胞病毒的中和活性更强。
结合抑制活性的检测
细胞准备:首先将5x 104个/100μL的Hep2细胞铺在96孔板的每个孔中,置于37℃孵育2小时。随后将其置于4℃冷却1小时。
样品准备:将1mg/ml的单抗样品10μL加入到90μL的MEM培养基中,随后使用MEM培养基4倍稀释11个梯度。将75μL病毒样品与75μL稀释单抗样品混合,25℃孵育1小时。随后冷却至4℃。将100μL单抗-病毒混合物加入Hep2细胞中,4℃共孵育1小时。
样品检测:去除上清,加入预冷的PBS 100μL洗细胞,4℃1700G离心5分钟。重复两次。随后加入100μL标记了FITC的羊抗RSV抗体(1:1000稀释,购买于BiodesignInternational公司),4℃孵育45分钟,去除上清,加入预冷的PBS100μL洗细胞,4℃1700G离心5分钟。去除上清后,每孔加入150μL 0.5%多聚甲醛固定细胞。最后使用流式细胞仪进行检测。结果示于图3中。
融合抑制活性的检测
细胞准备:首先将5x 104个/100μL的Hep2细胞铺在96孔板的每个孔中,置于37℃孵育2小时。随后将搬置于4℃冷却1小时。
样品准备:将1mg/ml的单抗样品10μL加入到90μL的MEM培养基中,随后使用MEM培养基4倍稀释11个梯度,置于4℃备用。随后使用MEM培养基将RSV-GFP稀释8倍,将50μL RSV-GFP加入到细胞中,4℃孵育1小时。去除上清,加入预冷的PBS 100μL洗细胞,4℃1700G离心5分钟。重复三次。然后将50μL预冷的MEM培养基加入细胞中,再将50μL稀释单抗样品加入细胞中,置于4℃孵育1hr。随后将细胞转移至37℃孵育18小时。
样品检测:去除上清,加入预冷的PBS 100μL洗细胞,4℃1700G离心5分钟。重复两次。每孔加入150μL 0.5%多聚甲醛固定细胞。最后使用流式细胞仪进行检测。结果示于图4中。结果显示,相比于商业化抗体帕利珠单抗(palivizumab,Synagis)和莫维珠单抗(Motavizumab),以及之前已报道的抗体D25(参见,美国专利申请12/600,950)及)及AM22(参见,美国专利申请12/898,325),5C4抗体的融合抑制活性更强。
病毒捕获能力的检测
用20mM PB,pH 7.4把单克隆抗体稀释至3μg/100μL的浓度,包被于聚苯乙烯板的微孔中,300μL每孔,4℃包被10小时,而后37℃包被1小时,PBST洗1次。加入含2%(w/v)BSA的PBS 350μL封闭,37℃孵育2小时。而后加入病毒量为1×106PFU的200μL呼吸道合胞病毒悬液,37℃孵育2小时。孵育完的板洗板5遍。洗完板后,每孔加入200μL Trizol裂解,4℃裂解10min后,提取样品中的呼吸道合胞病毒的RNA,进行Real-time PCR定量实验,结果如图5所示。图5的结果显示,5C4单抗与呼吸道合胞病毒的结合具有很强的特异性。相比于商业化抗体帕利珠单抗(palivizumab,Synagis),5C4抗体对呼吸道合胞病毒的捕获能力更强。
5C4单抗的反应性的Western Blot检测
将煮沸和未煮沸的post-F、RSV-A2、RSV-GFP分别10ul上样于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶,进行电泳,而后35mA电流进行转膜1h。转膜完毕后,加入5%脱脂奶4℃封闭过夜。TNT洗膜3次,每次10min。再将1:2000稀释至1XTN的待检抗体加入膜中,室温下摇床孵育1h。TNT洗膜3次,每次10min。加入1:5000稀释的用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体作为检测5C4的二抗,加入1:2000稀释的用辣根过氧化物酶标记的鼠抗人抗体作为检测莫维珠单抗的二抗,室温下摇床孵育1h。TNT洗膜3次,每次10min。显色,拍照。结果如图6所示。图6的结果显示,5C4单抗为识别构象表位的单抗,其识别非变性的RSV-A2和RSV-GFP,而不识别变性的RSV-A2和RSV-GFP。此外,5C4单抗能特异性识别RSV-A2、RSV-GFP,但与post-F基本上无反应性。
免疫荧光的检测
细胞准备:将1x 105个/ml的Hep2细胞加入铺有玻片的24孔板中,37℃孵育4小时,随后置于4℃冷却1小时。
样品准备:去除细胞培养上清,加入预冷的100μL RSV-A2(使用MEM培养基将RSV-A2稀释5倍),置于4℃孵育1小时后,去除上清,加入1ml MEM培养基。随后分别在5分钟、1小时、6小时、16小时以及24小时取样品进行检测。
样品检测:加入1ml预冷的PBS,置于摇床5分钟,去上清,重复2次。随后加入100μL0.4%多聚甲醛,室温避光孵育15分钟后,加入1ml PBS,置于摇床5分钟,去上清,重复3次。再加入100μL 0.3%TritonX-100,室温孵育10分钟后,加入1ml PBS,置于摇床5分钟,去上清,重复3次。随后加入100μL山羊血清,室温孵育30分钟后,加入1ml PBS,置于摇床5分钟,去上清,重复3次。再加入100μL单抗样品(使用PBS稀释10倍),室温孵育3小时后,加入1mlPBS,置于摇床5分钟,去上清,重复3次。然后加入100μL标记有FITC的羊抗鼠多抗(1:600,购买于Sigma公司),室温避光孵育30分钟后,加入1ml PBS,置于摇床5分钟,去上清,重复3次。再然后,加入100μL DAPI(1:2000,购买于Invitrogen公司),室温避光孵育5分钟后,加入1ml PBS,置于摇床5分钟,去上清,重复3次。最后将玻片取出,置于加有封片剂的载玻片上,指甲油封片,使用激光扫描共聚焦显微镜进行观察。结果如图7所示。图7的结果显示,5C4单抗可用于检测RSV A2对细胞的感染。
5C4单抗重链和轻链的可变区/CDR序列的确定
将分泌5C4单抗的杂交瘤细胞株RSV-Y-5C4-2扩增至108/ml,用吹管吹起半贴壁细胞使之悬浮。取1ml细胞悬浮液,以1000rpm离心5分钟,去上清。加入1ml PBS(PH7.44)重悬并洗涤细胞,然后以1000rpm离心5分钟,去上清,重复3次。向细胞沉淀中加入800μL Trizol(Roche Germany),剧烈震荡,然后静置10min,以裂解样品。然后加入200μL DEPC水,以补充水相。向样品中加入250μL CHCl3,剧烈震荡10sec,然后以12000rpm,4℃,离心5min。吸取上清水相500-600μL至新的1.5ml EP管中,加入600μL预冷异丙醇(异丙醇:上清体积比约为1:1),轻柔颠倒混匀,4℃静置10min,然后以4℃12000rpm,离心10min。吸去上清,留白色沉淀。向沉淀物中加入700μL 75%乙醇,并以4℃12000rpm,离心5min。吸去上清,使用抽干仪抽干或烘干,直至白色沉淀变为透明状。向沉淀物中加入20μL DEPC水以溶解mRNA,将其分装成两管。每管加入1ul反转录引物,其中一管加入的反转录引物为MVkR(5'-ACT ggA Tgg TgggAA gAT ggA-3'),用于扩增轻链可变区基因;另一管加入的反转录引物为MVhR(5'-CCAggg RCC ARK ggA TAR CAN gRT gg-3'),用于扩增重链可变区基因。然后,向每管中再加入1ul dNTP,置于72℃水浴10min,然后立即放到冰浴中置5min,然后加入10ul 5x反转录缓冲液,1ul AMV(10u/ul,Pormega),1ul Rnasin(40u/ul,Promega)。将混合物混匀后于42℃进行逆转录反应,以将RNA反转录成cDNA。
抗体基因可变区的分离采用聚合酶链式反应(PCR)法。合成重链可变区上游引物组合(表2),轻链可变区上游引物组合(表3)。另外,将MVkR用作轻链可变区基因扩增的下游引物,将MVhR用作重链可变区基因扩增的下游引物。PCR模板即为以上合成的两种cDNA。PCR条件为:94℃5min;(94℃40s,53℃1min,72℃50s)x35个循环;72℃15min。回收扩增产物,并克隆至pMD 18-T载体中,然后送至上海博亚公司进行测序。抗体的可变区序列和CDR序列如表4-5所示,其中互补决定区(complementary determinant region,CDR)序列通过Kabat方法来确定(Kabat EA,Wu TT,Perry HM,Gottesman KS,Coeller K.Sequences of proteinsof immunological interest,U.S Department of Health and Human Services,PHS,NIH,Bethesda,1991)。
表2:扩增单抗重链可变区基因的上游引物序列
上游引物名称 |
上游引物序列 |
MVhF-B1 |
5‘-ATgRAATgSASCTgggTYWTYCTCTT-3’ |
MVhF-B2 |
5‘-ATggACTCCAggCTCAATTTAgTTTTCCT-3’ |
MVhF-C1 |
5‘-ATggCTgTCYTRgBgCTgYTCYTCTg-3’ |
MVhF-C2 |
5‘-ATggVTTggSTgTggAMCTTgCYATTCCT-3’ |
MVhF-C3 |
5‘-ATgAAATgCAgCTggRTYATSTTCTT-3’ |
MVhF-D1 |
5‘-ATggRCAgRCTTACWTYYTCATTCCT-3’ |
MVhF-D2 |
5‘-ATgATggTgTTAAgTCTTCTgTACCT-3’ |
MVhF-D3 |
5‘-ATgggATggAgCTRTATCATSYTCTT-3’ |
MVhF-E1 |
5‘-ATgAAgWTgTggBTRAACTggRT-3’ |
MVhF-E2 |
5‘-ATggRATggASCKKRTCTTTMTCT-3’ |
MVhF-E3 |
5‘-ATgAACTTYgggYTSAgMTTgRTTT-3’ |
MVhF-F1 |
5‘-ATgTACTTgggACTgAgCTgTgTAT-3’ |
MVhF-F2 |
5‘-ATgAgAgTgCTgATTCTTTTgTg-3’ |
MVhF-F3 |
5‘-ATggATTTTgggCTgATTTTTTTTATTg-3’ |
表3:扩增单抗轻链可变区基因的上游引物序列
上游引物名称 |
上游引物序列 |
MVkF-A |
5‘-ATgRAgWCACAKWCYCAggTCTTT-3’ |
MVkF-B |
5‘-ATggAgACAgACACACTCCTgCTAT-3‘ |
MVkF-C |
5’-ATggAgWCAgACACACTSCTgYTATgggT-3’ |
MVkF-D1 |
5‘-ATgAggRCCCCTgCTCAgWTTYTTggWTCTT-3‘ |
MVkF-D2 |
5’-ATgggCWTCAAgATgRAgTCACAKWYYCWgg-3’ |
MVkF-D3 |
5‘-ATgAgTgTgCYCACTCAggTCCTggSgTT-3‘ |
MVkF-E1 |
5‘-ATgTggggAYCgKTTTYAMMCTTTTCAATTg-3’ |
MVkF-E2 |
5’-ATggAAgCCCCAgCTCAgCTTCTCTTCC-3‘ |
MVkF-E3 |
5‘-ATgAgMMKTCMTTCATTCYTggg-3’ |
MVkF-F1 |
5’-ATgAKgTHCYCgCTCAgYTYCTRg-3‘ |
MVkF-F2 |
5‘-ATggTRTCCWCASCTCAgTTCCTTg-3’ |
MVkF-F3 |
5’-ATgTATATATgTTTgTTgTCTATTTCT-3‘ |
MVkF-F4 |
5‘-ATgAAgTTgCCTgTTAggCTgTTggTgCT-3’ |
MVkF-G1 |
5’-ATggATTTWCARgTgCAgATTWTCAgCTT-3‘ |
MVkF-G2 |
5‘-ATggTYCTYATVTCCTTgCTgTTCTgg-3’ |
MVkF-G3 |
5’-ATggTYCTYATVTTRCTgCTgCTATgg-3’ |
表4:单克隆抗体的重链和轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列
序列名称 |
序列号 |
Vh核苷酸序列 |
SEQ ID NO:16 |
Vh氨基酸序列 |
SEQ ID NO:17 |
Vk核苷酸序列 |
SEQ ID NO:18 |
Vk氨基酸序列 |
SEQ ID NO:19 |
表5:通过Kabat方法确定的单克隆抗体CDR序列
Vκ是指kappa链可变区,其是轻链可变区(VL)的一种。
实施例5.5C4单抗与其他单抗的竞争性结合分析
在RSV感染的HEp-2细胞上进行抗体的竞争性结合,HEp-2细胞用3倍感染量的RSV感染18到20小时,感染后采用细胞离散方法(细胞剥离器、Mediatech Inc.,Herndon,VA)进行细胞分离,然后用PBS洗细胞。最后细胞在U型底部的96孔板中以每孔5×104的细胞量溶于PBS中进行孵育。单克隆抗体5C4、AM22、D25和101F(参见McLellan等(2010),J Vriol,84:12236-12244)均以起始的稀释浓度为100μg/ml的量加入HEp-2细胞中。半个小时后,加入100ul Alexa 488与浓度为1μg/ml D25的结合物,在4℃孵育1小时。孵育完的细胞第一遍用PBS洗,然后用0.5%的多聚甲醛进行填充,D25与Alexa 488在细胞上结合后产物通过流式细胞仪检测(LSR II instrument,Becton Dickinson,San Jose,CA),检测的数据采用FlowJo软件8.5版本(Tree Star,San Carlos,CA)进行分析。结果如图8所示。图8的结果显示,AM22、D25与5C4之间存在竞争结合,5C4对AM22、D25结合的阻断率最高可达99%。这表明5C4单抗与AM22、D25单抗识别抗原(F蛋白)上的相同表位。
实施例6.抗原-抗体复合物的分析
抗原-抗体复合物的制备
RSV F蛋白来源于RSV A2亚型的病毒株P03420,它包含了3个自然发生的氨基酸突变(P102A,I379V和M447V)。将经过哺乳动物密码子优化的RSV F蛋白1-513位氨基酸与T4噬菌体的次要纤维蛋白Fibritin的C末端融合,并构建到哺乳动物细胞表达载体pLEXm上,该质粒同时带上了凝血酶位点、His标签与链球菌素标签。将表达RSV F蛋白、D25抗体的轻链和重链(在铰链区含有或不含有种子密码子)的质粒同时转染悬浮的HEK293GnTI细胞,或者先只转染表达RSV F蛋白的质粒,在转染后3小时,将之前纯化好的D25抗体的Fab加入GnTI细胞。经过4-5天的表达,收集细胞上清、离心分离,过滤并浓缩。所获得的细胞上清首先通过Ni柱(Qiagen,Valencia,CA)纯化,洗脱液为20mM的Tris-HCl pH7.5,200mM NaCl,250mM咪唑,pH 8.0。之后,产物经过浓缩后,再按照制造商的说明书(Novagen,Darmstadt,Germany)用亲和素树脂柱进行纯化。经过凝血酶蛋白酶的过夜处理以去除His和链霉素标签后,加入过量的D25抗体Fab与复合物混合,然后经过Superose6凝胶过滤柱(GEHealthcare),穿透液为2mM Tris-HCl pH 7.5,350mM NaCl,and 0.02%NaN 3。洗脱下来的复合物用等体积的水稀释后浓缩至大约5mg/ml。同样的方法用来表达和纯化AM22/F蛋白或者5C4/F蛋白的抗原-抗体复合物。
复合物的电子显微镜检测
样品被新排出的碳涂层的网格辉光吸收,短暂地用水冲洗,然后用新配制的0.75%的铀酰甲酸盐染色。图像通过带有Eagle CCD相机的FEI T20显微镜采集。图像分析及二维平均采用Bsoft(J.Struct.Biol.157,3(2007))及EMAN(J.Struct.Biol.128,82(1999))来进行。结果示于图9中。结果显示,AM22/F蛋白、5C4/F蛋白与D25/F蛋白抗原-抗体复合物具有相同的结构。这表明,AM22单抗、5C4单抗与D25单抗结合F蛋白上的相同表位,并且结合相同构象的F蛋白(pre-F构象)。
进一步,比较了帕利珠单抗/F蛋白与5C4/F蛋白抗原-抗体复合物的电子显微镜结果。结果示于图10中,其中左图为post-F与帕利珠单抗的复合物的电子显微镜结果;左下图显示,左上图的白框区域中的post-F在电镜下观察到的结构;右图为pre-F与5C4的复合物的电子显微镜结果,图中白框区域为pre-F在电镜下观察到的结构。结果显示,帕利珠单抗/F蛋白与5C4/F蛋白抗原-抗体复合物具有显著不同的结构,并且这2种抗原抗体复合物中的F蛋白的构象也显著不同,其中帕利珠单抗/F蛋白复合物中的F蛋白为post-F构象,而5C4/F蛋白复合物中的F蛋白为pre-F构象。
图9和10的结果表明,F蛋白中的该表位以及识别该表位的抗体对于稳定和维持F蛋白的pre-F构象具有重要作用。
复合物的结晶
起始晶体通过气象扩散法培养,20℃下将复合物与0.1ul保存溶液(40%(w/v)PEG400,5%(w/v)PEG 3350,和0.1M醋酸钠,pH 5.5)混合(54)。晶体在悬滴中再生长,衍射的晶体生长于含有30%(w/v)PEG 400,3.75%(w/v)PEG 3350,0.1M HEPES pH 7.5,和1%(v/v)1,2-丁二醇的保存液中。在液氮中将晶体直接冻住,在SER-CAT光束线ID-22,波长下得到X射线衍射数据。
复合物晶体的衍射及解构
通过HKL200(Z.Otwinowski,W.Minor,in Methods Enzymol.(Academic Press,1997),vol.276,pp.307-326)整合、梳理X射线衍射数据,通过PHASER(A.J.McCoy et al.,Phaser crystallographic software.J.Appl.Crystallogr.40,658(2007))解决分子替换问题,使用伸展的D25Fab结构和来源于RSV F蛋白的post-F结构(PDB ID:3RRR,(J.Virol.,85,7788(2011)))的29-42,49-60,78-98,219-306,313-322,333-343和376-459片段作为探究模型。通过一个NaAuCl4衍生物的6个位点定位得到活性侧链(F残基Met97/His159,Met264/Met274,His317,和Met396;D25重链残基Met19/His81和His 58)。通过COOT(ActaCrystallogr D Biol Crystallogr,66,486(2010))建立了手工模型,建立过程中首先建立了二级结构元素。通过PHENIX(Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66,213(2010))进行了单个位点、TLS参数以及单个B因素的确定,在精确过程中应用伸展的D25Fab结构以及RSV F post-F结构作为参照模型。除了F2C端至Met97的残基外,建立了成熟蛋白中的所有RSV F残基。最后的数据整理和精确统计概括于表6中。复合物的晶体结构示于图11-13中。
表6.晶体结构相关数据
另外,还使用相同方法分析了pre-F蛋白的单体和三聚体以及post-F蛋白的单体和三聚体的晶体结构。结果示于图14中。结果显示,pre-F蛋白与post-F蛋白具有显著不同的空间结构(构象)。
复合物晶体的衍射及解构的结果显示,D25单抗识别的表位位于RSV F蛋白的远膜端的头部,其中,D25的重链结合一个单体,轻链结合与该单体相邻的另一个单体(如图11-12所示)。D25抗体自身6个CDR区中的5个与RSV F蛋白相结合,其中重链的CDR3与F蛋白第4号α螺旋(由F蛋白的第196-209位氨基酸残基构成)相结合,并且结合第2号β折叠(由F蛋白的第38-60位氨基酸残基构成)与第1号α螺旋(由F蛋白的第74-96位氨基酸残基构成)之间的环形结构(由F蛋白的第62-72位氨基酸残基构成)。虽然D25结合的表位在pre-F蛋白与post-F蛋白中的二级结构变化不大,但在三级结构上变化显著:第4号α螺旋反生180°转向并且远离第2号β折叠(如图13所示)。D25结合的表位的三级结构的变化揭示了,为什么D25抗体仅结合pre-F蛋白,而不结合post-F蛋白,并且解释了,D25抗体为什么能稳定pre-F蛋白的结构并由此中和RSV。
根据图11-13以及表2的结果可以确定,D25单抗所识别的F蛋白表位由呼吸道合胞病毒融合蛋白的第148-216位氨基酸残基或其片段组成,且至少包含呼吸道合胞病毒融合蛋白的第196-209位氨基酸残基。此外,还发现,呼吸道合胞病毒融合蛋白的第62-69位或第62-76位氨基酸残基对D25单抗/F蛋白的特异性结合具有促进作用。通过类似的方法可以确定,AM22单抗和5C4单抗同样识别F蛋白的上述表位。
上述结果还显示于图15中。图15显示了pre-F蛋白和post-F蛋白的空间结构,构成所述空间结构的对应氨基酸序列,以及D25所识别的表位序列。图15的结果显示,pre-F蛋白和post-F蛋白的空间结构存在着显著的差异。特别地,pre-F蛋白的空间结构包括α1-α10螺旋和β1-β23折叠;而post-F蛋白的空间结构包括α1螺旋,α5-α8螺旋,α10螺旋,β1-β2折叠和β5-β21折叠。
此外,图15的结果还显示,D25单克隆抗体在pre-F蛋白中的核心识别表位为两个空间上相互接近的肽段,即,a.a.62-69与a.a.196-209。这两个肽段的相互作用界面表明,F蛋白中的两个区段(a.a.62-76与a.a.137-216(或更具体地,a.a.148-216))或其片段对于这类抗体(例如,本发明的抗体(例如5C4),D25和AM22)识别并稳定pre-F蛋白具有重要的作用,其中a.a.176-181与a.a.185-194这两个区域在F蛋白的pre-F构象及post-F构象之间存在显著的转变:它们在pre-F蛋白中的构象为β折叠(β3-β4折叠),而在post-F蛋白中的构象为α螺旋(包含在α5螺旋中)。
这些结果表明,D25单抗、AM22单抗和5C4单抗识别F蛋白上的相同表位,并且通过与该表位的相互作用,稳定和维持了F蛋白的pre-F构象。本发明所发现的F蛋白的新表位,以及识别该表位的抗体可用于稳定F蛋白的pre-F构象。
此外,上文的结果显示,识别该表位的抗体均具有强中和活性。这表明,F蛋白的pre-F构象和该新表位对于诱导强机体免疫应答具有重要作用;并且,识别该新表位的抗体可用于有效预防和治疗RSV感染和与RSV感染相关的疾病。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,但本领域技术人员将理解:根据已经公开的所有教导,可以对细节进行各种修改和变动,并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。