CN104628850B

CN104628850B - Rsv-特异性结合分子

Info

Publication number: CN104628850B
Application number: CN201410747617.XA
Authority: CN
Inventors: 蒂姆·博蒙特; 阿德里亚努斯·奎里纳斯·巴克; 安田悦子
Original assignee: MedImmune Ltd
Current assignee: MedImmune Ltd
Priority date: 2009-10-06
Filing date: 2009-10-06
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2029-10-06
Also published as: CN104628850A

Abstract

本发明提供能够特异性结合RSV的抗体和其功能等同物。还提供编码所述抗体的核酸序列，以及产生所述抗体的抗体产生细胞和方法。

Description

RSV-特异性结合分子

本申请是2009.10.06提交的CN 200980162731.3，题为“RSV-特异性结合分子”的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物学和医学领域。

发明背景

呼吸道合胞病毒(RSV)为属于副粘病毒家族的感冒病毒。RSV为毒性的、容易传染的并且是2岁以下儿童下呼吸道疾病最常见的病因。在一个RSV感染季上至98％的日托儿童将会被感染。0.5％和3.2％之间的RSV感染儿童需要住院治疗。报道美国医院每年接收大约90,000例，4500例死亡。由于RSV而住院治疗的主要风险因素为早产、慢性肺疾病、先天性心脏病、受损的免疫力，在其他情况下健康的为小于6周的年龄的儿童中。除了充足营养形式的维持疗法和氧疗法外，对RSV阳性毛细支气管炎没有可用的有效治疗。抗病毒疗法诸如利巴韦林未被证明在RSV感染中有效。一种单克隆抗体，帕利珠单抗(也称为Synagis)，注册用于对RSV感染的预防。帕利珠单抗为针对RSV融合蛋白(F蛋白)遗传设计(人源化)的单克隆抗体。RSV的F蛋白为病毒膜蛋白并且负责附着后病毒粒子与宿主细胞的融合。另外，F蛋白促进相邻细胞通过形成合胞体的感染并且认为其功能取决于所述蛋白质最初的寡聚结构。然而，帕利珠单抗并不总是有效的。因此，本领域有针对RSV的替代和/或补充抗体以及疗法的需求。

发明内容

本发明的一个目的为提供针对RSV的改进的抗体或所述抗体的功能等同物。另外的一个目的为提供针对RSV的补充的抗体，其结合已有的RSV-特异性抗体，提供协同效应。另一个目的为提供针对RSV F蛋白的人或人源化抗体或功能等同物，其针对不同于已知RSV-特异性抗体所针对的表位。

因此，本发明提供分离的、合成的或重组的抗体或能够特异性结合呼吸道合胞病毒的功能部分、衍生物和/或类似物，并且其包括：

-重链CDR1序列，其包括与序列KLSIH至少70％相同的序列，和/或

-重链CDR2序列，其包括与序列GYEGEVDEIFYAQKFQH至少70％相同的序列，和/或

-重链CDR3序列，其包括与序列LGVTVTEAGLGIDDY至少70％相同的序列，和/或

-轻链CDR1序列，其包括与序列RASQIVSRNHLA至少70％相同的序列，和/或

-轻链CDR2序列，其包括与序列GASSRAT至少70％相同的序列，和/或

-轻链CDR3序列，其包括与序列LSSDSSI至少70％相同的序列。

本发明提供命名为“AM22”的抗体，其具有如图2所述的重链和轻链序列。尤其关乎AM22抗原-结合特性的AM22的CDR序列也在图2中描述。抗体AM22完全为人的，能够特异性结合RSV(图3)并且因此优选用于人个体的预防和/或治疗用途。

如上所述唯一已有的临床使用抗-RSV抗体为帕利珠单抗。其为针对RSVF蛋白抗原位点中表位的人源化单克隆抗体。人源化抗体还包含鼠抗体的一部分并且虽然相比完全鼠抗体其免疫原性特性减弱，但在应用于人时还可能出现人源化抗体的副作用。然而本发明人成功地获得和培养产RSV-特异性抗体的人B细胞，以提供人RSV-特异性抗体，其具有作为完全人序列结果的强烈降低的“即使有的”免疫原性活性。如实施例所示，根据本发明的抗体具有相比帕利珠单抗更优的特性(图1和表1)。本发明人已表明通过肌内注射给予本发明抗体随后用RSV-X鼻内激发(challenge)的棉鼠(Sigmodon hispidus)具有比给予帕利珠单抗随后用RSV-X激发的棉鼠更低的病理学指数(图4C和表2)。本文所用的病理学指数为用以区分肺损伤的三个独立标志的得分总数。这三个标志为支气管和细支气管上皮肥大、支气管和细支气管周围的炎症(支气管和细支气管周炎)和肺泡中的炎症(肺泡炎)。另外，通过TCID50(50％组织培养感染剂量)测定法测定的，用本发明抗体肌内注射且随后RSV-X激发的棉鼠具有比给予帕利珠单抗随后用RSV-X激发的棉鼠更低的肺病毒效价。因此，AM22优于帕利珠单抗。

除了帕利珠单抗外，还已知一些其他的RSV-特异性抗体。WO 2008/147196公开了RSV结合分子，即抗体D25、AM14、AM16和AM23的序列。如本申请实施例1所详述的，RSV特异性抗体AM22获自与抗体D25、AM14、AM16和AM23相同的供体。然而很明显的是，AM22比获自相同供体的所有其他抗体更有效地识别RSV。AM22的IC₅₀值，1.15ng ml-1，比帕利珠单抗、D25、AM14、AM16或AM23更低。因此，使用AM22用于RSV-相关病症的治疗和/或预防比使用其他的RSV特异性抗体更有优势。相比其他抗体，获得类似的效果只需要更少的AM22抗体。因此，给予个体更少的AM22用于RSV-相关病症的治疗和/或预防。或者，相比其他抗体，用类似量的AM22可以获得更有效的RSV-相关病症的治疗和/或预防。

此外，本发明的RSV-特异性抗体识别不同于如前公开的RSV结合分子的表位。AM22与之前鉴定的抗体(WO2008/147196)类似，能够结合RSV F蛋白(图3A)。然而，AM22不结合单体RSV F蛋白(图3B的左和右组)。与AM22相反，已知抗体帕利珠单抗和AM16(WO2008/147196和图3B中公开)能够结合F蛋白的单体形式。重要的是表达抗原特异性B细胞受体(BCR)的AM22B细胞系不识别F蛋白的重组形式(图3C)。因此AM22结合与帕利珠单抗、D25、AM23和AM16不同的F蛋白表位。当重组F蛋白在包含具有8个HIS-标签(ILZ-8xHIS)的异亮氨酸拉链三聚基序的载体中表达时，AM22识别该三聚体，其为构象依赖型结构(图3D)。相反AM14不识别F蛋白的单体形式或所述ILZ-8xHIS F蛋白。因此AM22结合同样与AM14不同的F蛋白表位。此外人们发现AM22不妨碍D25或帕利珠单抗结合RSV感染的Hep2细胞。因此相比D25、AM14、AM16、AM23和帕利珠单抗，AM22结合不同的F蛋白表位。因此，本发明的RSV-特异性抗体或其功能等同物优选与已知的RSV-特异性抗体，诸如帕利珠单抗、D25、AM14、AM16和AM23联用。通过将本发明的抗体与已知的RSV-特异性抗体联用，在同样的疗法期间可以识别两个或更多不同的RSV表位。因此获得对RSV更强的免疫原性应答。此外，可通过已知的RSV-特异性抗体与本发明的AM22抗体联用而实现对RSV更高的抗体特异性。随着对RSV更强的免疫原性应答和更高的特异性，所述联用将产生更有效的RSV-相关病症的治疗和/或预防。最后，如通过其约1.15ng/ml的低IC₅₀值所示，由于相比帕利珠单抗、D25、AM14、AM16和AM23，AM22具有对F蛋白更强的结合力，因此需要较低的总抗体剂量。

因此一个实施方案提供在体外中和测定法中具有小于1.25ng/ml的IC₅₀值的本发明抗体或功能等同物，该测定法中HEp-2细胞被RSV-A2病毒感染。所述抗体或功能等同物优选具有小于1.2ng/ml的IC₅₀值，优选在0.5ng/ml和1.2ng/ml之间。另外，本发明的抗体或功能等同物在其中HEp-2细胞被RSV-A2病毒感染的体外中和测定法中优选具有比帕利珠单抗IC₅₀值低至少120倍，更优选至少130倍的IC₅₀值。所述抗体或功能等同物优选具有约1.15ng/ml的IC₅₀值。因此本发明的RSV-特异性抗体或其功能等同物与至少一种已有的RSV-特异性抗体联用可以实现更有效的RSV-相关病症的治疗和/或预防。

抗体的功能等同物在此定义为抗体的功能部分、衍生物或类似物。抗体的功能等同物优选为人工结合化合物，包括抗体的至少一个CDR序列。

抗体的功能部分定义为具有与所述抗体在类型上而不必要在数量上相同的至少一种特性的部分。所述功能部分能够(虽然不一定以相同的程度)结合与所述抗体相同的抗原。抗体的功能部分优选包括单一结构域抗体、单链抗体、单链可变片断(scFv)、Fab片段或F(ab')2片断。

抗体的功能衍生物定义为已经过改变而使得产生的化合物的至少一种特性(优选抗原结合特性)在类型上而不必要在数量上基本相同的抗体。通过许多途径提供衍生物，例如通过保守的氨基酸取代，氨基酸残基由通常具有相似特性(大小、疏水性等等)的另一个残基取代而使得整体功能很可能并不严重受影响。

本领域技术人员能够很好地生成类似的抗体化合物。其例如利用肽库或噬菌体展示库完成。所述类似物基本上具有所述抗体的至少一种在类型上而不必要在数量上相同的特性。

本发明的抗体优选为人抗体。使用人抗体用于人的预防和治疗减少了由于人个体中对非-人序列的免疫反应而产生的副作用的可能性。在另一实施方案中本发明的抗体、功能部分、衍生物或类似物为人源化抗体。通过将非-人高变结构域引入人抗体而产生人源化抗体并且因此相比完全非-人抗体，减弱了免疫原性特性。在另一优选实施方案中，本发明的抗体、功能部分、衍生物或类似物为嵌合抗体。这种情况下，目的序列，例如目的结合位点可包含在本发明的抗体或功能等同物中。

如技术人员熟知的，抗体的重链为装配免疫球蛋白分子的两类链中较大的链。重链包括恒定区和可变区，可变区参与抗原结合。抗体的轻链为装配免疫球蛋白分子的两类链中较小的链。轻链包括恒定区和可变区。其可变区与重链可变区一起参与抗原结合。

互补-决定区(CDR)为重链可变区和轻链可变区中的高变区。重链和连接的抗体轻链的CDR共同形成抗原结合部位。

因为本发明提供了以下理解，即图2中所述的CDR序列提供所需的结合特性，技术人员完全能够生成包含至少一种改变的CDR序列的变体。例如，应用保守的氨基酸取代。而改变图2中所述的至少一种CDR序列以生成相比AM22具有至少一种改变的特性的变体抗体或其功能等同物也是可能的。优选，提供包含CDR序列的抗体或功能等同物，该CDR序列与图2中所述CDR序列至少70％相同而使得AM22的良好结合特性至少部分维持或甚至得到改进。优选改变图2中所述的CDR序列使得得到的抗体或功能等同物相比AM22包含至少一种改进的特性，例如改善的稳定性和/或结合亲和力。优选维持结合特异性(同样，而不必全部)。包含与图2中所述CDR序列至少70％相同的氨基酸序列的变体抗体或其功能等同物也因此在本发明的范围内。用于改变氨基酸序列的各种方法是本领域中可得到的。例如，人工合成具有所需CDR序列的重链或轻链序列。优选，例如利用随机或定点-诱变突变编码CDR序列的核酸序列。

抗原和抗体之间结合的亲和常数和特异性的测定优选用以测定预防、治疗、诊断的功效以及利用本发明抗-RSV抗体的研究方法。“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点和其结合配体(例如抗原)之间总的非共价相互作用的力。除非另外指出，如此处所用的，“结合亲和力”指反映结合对(例如抗体和抗原)成员间1：1相互作用的固有结合亲和力。亲和力通常可由计算为k_off/k_on比值的平衡离解常数(K_d)表示。参见例如Chen，Y.，等.，(1999)J.Mol Biol 293：865-881。可通过本领域已知的常见方法测定亲和力，例如表面胞质共振(SPR)测定法，诸如IBIS Technologies BV(Hengelo，the Netherlands)的BiaCore或IBIS-iSPR仪器，或液相测定法，诸如Kinexa。

根据优选的实施方案，本发明的抗-RSV抗体对RSV F蛋白的表位具有结合亲和力，其包括小于1×10^-2M、1×10^-3M、1×10^-4M、1×10^-5M、1×10^-6M、1×10^-7M、1×10^-8M、1×10^-9M、1×10^-10M、1×10^-11M、1×10^-12M、1×10^-13M、1×10^-14M或小于1×10^-15M的离解常数(K_d)。在一实施方案中，抗-RSV抗体具有小于10^-7M、小于5×10^-8M、小于10^-8M、小于5×l0^-9M、小于l0^- ⁹M、小于5×10^-10M、小于10^-10M、小于5×10^-11M、小于10^-11M、小于5×10^-12M、小于10^-12M、小于5×10^-13M、小于10^-13M、小于5×10^-14M、小于10^-14M、小于5×10^-15M或小于10^-15M的K_d。

本发明进一步提供分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其包括：

-重链CDR1序列，其包括具有与序列KLSIH至少70％序列同一性的序列，和/或

-重链CDR2序列，其包括具有与序列GYEGEVDEIFYAQKFQH至少70％序列同一性的序列，和/或

-重链CDR3序列，其包括具有与序列LGVTVTEAGLGIDDY至少70％序列同一性的序列，和/或

-轻链CDR3序列，其包括与序列LSSDSSI至少70％相同的序列。

优选，本发明的抗体或功能等同物包括与图2所述的至少一条CDR序列至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％相同的CDR序列。最优选，本发明的抗体或功能等同物包括与图2所述的至少一条CDR序列至少95％相同的CDR序列。如上所述，尤其优选的抗体AM22包括由图2所述的CDR序列组成的CDR序列。本发明特别优选的实施方案由此提供分离的、合成的或重组的抗体或其功能等同物，其能够特异性结合RSV并且其包括：

-重链CDR1序列，其包括序列KLSIH，和/或

-重链CDR2序列，其包括序列GYEGEVDEIFYAQKFQH，和/或

-重链CDR3序列，其包括序列LGVTVTEAGLGIDDY，和/或

-轻链CDR1序列，其包括序列RASQIVSRNHLA，和/或

-轻链CDR2序列，其包括序列GASSRAT，和/或

-轻链CDR3序列，其包括序列LSSDSSI。

在一实施方案中提供抗体或功能等同物，其包括如图2所述的重链CDR1和CDR2序列以及轻链CDR1和CDR2序列，或与其至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％相同的序列。因此进一步提供分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其包括包含与序列KLSIH至少70％相同的序列的重链CDR1序列和包含与序列GYEGEVDEIFYAQKFQH至少70％相同的序列的重链CDR2序列，以及包含与序列RASQIVSRNHLA至少70％相同的序列的轻链CDR1序列和包含与序列GASSRAT至少70％相同的序列的轻链CDR2序列。所述抗体或功能等同物优选包括与上述重链CDR序列和轻链CDR序列至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％相同的CDR序列。优选，所述抗体或功能等同物还包括包含与序列LGVTVTEAGLGIDDY至少70％相同的序列的重链CDR3序列，和/或包含与序列LSSDSSI至少70％相同的序列的轻链CDR3序列。还提供包含上述重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及上述轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体或功能等同物。

可选择的，至少一条人CDR序列经优化，优选以提高结合效力或稳定性。例如通过诱变实验完成优化，其在优选检测产生的化合物的稳定性和/或结合效力以及选择改进的抗体或功能等同物后进行。

除了优化CDR序列，常常有利的是优化至少一个骨架区中的至少一条序列。优选进行上述优化以提高结合效力或稳定性。骨架序列例如通过将编码骨架序列的核酸分子突变，随后优选检测产生的抗体–或功能部分–的特性而优化。因此，有可能获得改进的或功能部分。因此还提供分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分、和/或类似物，其包含具有与图2所述重链序列至少70％序列同一性的重链氨基酸序列。如通过抗体AM22证实的，所述重链序列提供所需的结合特性。而且，如通过抗体AM22证实的，具有与图2所述轻链序列至少70％序列同一性的轻链氨基酸序列也提供所需的结合特性。因此本发明进一步提供分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其具有包含与序列QVQLVQSGAEVKKPGATVKVSCKISGHTLIKLSIHWVRQAPGKGLEWMGGYEGEVDEIFYAQKFQHRLTVIADTATDTVYMELGRLTSDDTAVYFCGTLGVTVTEAGLGIDDYWGQGTLVTVSS至少70％序列同一性的序列的重链序列和/或具有与序列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQIVSRNHLAWYQQKPGQAPRLLIFGASSRATGIPVRFSGSGSGTDFTLTINGLAPEDFAVYYCLSSDSSIFTFGPGTKVDFK至少70％序列同一性的轻链序列。

本发明分离的、或重组的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物优选包括重链序列和/或轻链序列，其与图2所述的重链序列和/或轻链序列至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％相同。同源性越高，所述抗体或功能等同物更接近地类似抗体AM22。本发明分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物优选包括类似AM22重链和轻链的重链以及轻链。因此进一步提供分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其包括重链序列和轻链序列，其分别与图2所述的重链序列和轻链序列至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％相同。在一实施方案中提供具有如图2所述重链序列和如图2所述轻链序列的抗体或功能等同物。

一个实施方案提供分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其包括由图2所述重链序列组成的重链序列，和/或包括由图2所述序列组成的轻链序列。或者，如技术人员所熟知的，有可能生成维持目的结合结合特性的缩短的重链或轻链序列。优选，生成相比原始的重或轻链具有更短恒定区的所述缩短的重链或轻链。优选保持可变区。例如，生产基于图2所述重链序列或轻链序列的Fab片段或F(ab')2片断或单个结构域抗体或单链抗体或纳米抗体或单片抗体。也因此提供包含图2所述序列的至少功能部分抗体功能部分。所述功能部分具有至少20个氨基酸的长度并且包括选自与图2所述重链CDR1序列至少70％相同的序列、具有与图2所述重链CDR2序列至少70％序列同一性的序列、具有与图2所述重链CDR3序列至少70％序列同一性的序列和具有与图2所述轻链CDR1序列至少70％序列同一性的序列、具有与图2所述轻链CDR2序列至少70％序列同一性的序列、具有与图2所述轻链CDR3序列至少70％序列同一性的序列的至少一条序列。

如之前所述，本发明的抗体和功能等同物识别RSV F蛋白三聚体的独特表位。因此，提供特异性识别该表位的抗体和功能等同物。特异性识别所述独特表位的抗体或其功能等同物优选与已知的RSV-特异性抗体，诸如帕利珠单抗、D25、AM14、AM16和AM23联用。通过将特异性识别所述独特表位的本发明的抗体或功能等同物与已知的RSV-特异性抗体联用，在同样的疗法期间可以识别两个或更多不同的RSV表位。因此，随着对RSV更强的免疫原性应答和对RSV更高的抗体特异性，所述联用将产生更有效的RSV-相关病症的治疗和/或预防。

因此，本发明提供分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其能够特异性结合由抗体识别的表位，其包括：

-重链CDR1序列，其包括序列KLSIH，和/或

-重链CDR2序列，其包括序列GYEGEVDEIFYAQKFQH，和/或

-重链CDR3序列，其包括序列LGVTVTEAGLGIDDY，和/或

-轻链CDR1序列，其包括序列RASQIVSRNHLA，和/或

-轻链CDR2序列，其包括序列GASSRAT，和/或

-轻链CDR3序列，其包括序列LSSDSSI。

在尤其优选的实施方案中本发明提供分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其能够特异性结合由AM22抗体识别的表位，其包括：

-重链CDR1序列，其包括序列KLSIH，和

-重链CDR2序列，其包括序列GYEGEVDEIFYAQKFQH，和

-重链CDR3序列，其包括序列LGVTVTEAGLGIDDY，和

-轻链CDR1序列，其包括序列RASQIVSRNHLA，和

-轻链CDR2序列，其包括序列GASSRAT，和

-轻链CDR3序列，其包括序列LSSDSSI。

本发明另外的实施方案涉及以改变效应物功能的某些抗体恒定区(Fc)修饰。例如，包含Fc区的蛋白质的血清半衰期通过增强Fc区对FcRn的结合亲和力而提高。如此处所用的所述术语“抗体半衰期”指抗体的药物动力学特性，其为给药后抗体分子平均生存时间的度量。抗体半衰期可表示为从患者身体(或其他哺乳动物)或其特定身体部分，例如如血清中测定的，即循环半衰期，或其他组织中清除50％已知免疫球蛋白量所需的时间。一种免疫球蛋白或一类免疫球蛋白与另外的免疫球蛋白半衰期可以不同。通常，抗体半衰期的提高导致给予抗体的循环中平均滞留时间(MRT)的提高。

半衰期的提高允许降低给予病人的药物量以及降低投药频率。为了提高本发明抗体的血清半衰期，例如如美国专利No.5,739,277所述，可以将补救受体(salvagereceptor)结合表位引入所述抗体中(特别是抗体片断中)。如此处所用的，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位，其负责提高IgG分子的体内血清半衰期。或者，具有提高的半衰期本发明的抗体可以通过修饰确定为参与Fc和FcRn受体之间相互作用的氨基酸残基而产生(参见，例如美国专利No.6,821,505和7,083,784)。另外，本发明的抗体半衰期可以通过本领域广泛利用的技术将PEG或清蛋白偶联抗体而提高。一些实施方案中包含本发明Fc变体区抗体相比包含天然Fc区的抗体具有约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约65％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％或更高的提高的半衰期。一些实施方案中包含Fc变体区的抗体具有相比包含天然Fc区的抗体约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍或更高的提高的半衰期，或在2倍和10倍之间，或5倍和25倍之间，或15倍和50倍之间的半衰期。因此本发明提供抗体、功能部分、衍生物或类似物，其包含补救受体结合表位，和/或确定为参与Fc和FcRN受体之间相互作用的经修饰的氨基酸残基，和/或非天然存在的氨基酸残基。另外优选的实施方案提供与PEG或白蛋白偶联的本发明的抗体或功能等同物。

在一实施方案中，本发明提供Fc变体，其中Fc区包含一个或多个位点的修饰(例如氨基酸取代，氨基酸插入，氨基酸缺失)，所述位点选自如Kabat等.，(J Immunol.1991；147(5)：1709-19)阐述的EU索引编号的234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、263、264、265、266、267、268、269、279、280、284、292、296、297、298、299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、373、378、392、416、419、421、440和443。可选择的，Fc区包括本领域技术人员已知的，在另外和/或替代位点的非天然存在的氨基酸残基(参见例如，美国专利5，624，821；6，277，375；6，737，056；7，083，784；7，317，091；7，217，797；7，276，585；7，355，008；2002/0147311；2004/0002587；2005/0215768；2007/0135620；2007/0224188；2008/0089892；WO94/29351和WO99/58572)。

在一具体的实施方案中，本发明提供Fc变体抗体，其中所述Fc区包括在选自252、254和256的一个或多个位点的至少一个非-天然存在的氨基酸。在一实施方案中，所述非-天然存在的氨基酸选自252Y、254T和256E。

本发明提供相比现有技术中的抗体具有改进特性的RSV-特异性抗体和其功能等同物。发明人已成功产生具有目前已知最低IC₅₀值的RSV-特异性抗体。所述抗体具有对RSV的特别高或强的亲和力，并且因此尤其适于中和和/或至少部分预防RSV-感染和/或RSV感染的有害作用。因此一个实施方案提供具有如实施例(参见图1)所述体外中和测定法中测定的，小于1.25ng/ml，优选小于1.2ng/ml，更优选小于1.19ng/ml，更优选小于1.18ng/ml并且最优选在1.1ng/ml和1.17ng/ml之间的IC₅₀值的抗体。

本发明进一步提供分离的、合成的或重组的核酸序列或其功能等同物，其具有至少15个核苷酸，优选至少30个核苷酸，更优选至少50个核苷酸，更优选至少75个核苷酸的长度，编码本发明抗体或功能等同物的至少一个抗原-结合部分。例如从B细胞分离的所述核酸能够产生本发明的抗体。优选的实施方案提供包含具有与图2所述核酸序列的至少15个核苷酸至少70％序列同一性的序列。本发明的核酸序列优选包含具有与图2所述核酸序列的至少15个核苷酸至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％序列同一性的序列。优选，图2所述的核酸序列包含至少一个CDR编码序列。

一个优选实施方案提供具有至少15个核苷酸长度的分离的、合成的或重组的核酸序列，或其功能等同物，其编码本发明抗体或功能等同物的至少一个CDR序列。所述核酸序列优选编码具有与抗体AM22CDR区至少70％序列同一性的至少一个CDR序列。编码AM22CDR区的核酸序列在图2中描述。因此进一步提供分离的、合成的或重组的核酸序列，或其功能等同物，其包含与选自aaattatccattcac、ggttatgagggtgaggtcgatgagattttctacgcacagaagttccagcac、ctaggtgtgacagtgactgaggctggactggggatcgatgactac、agggccagtcagattgttagcaggaaccacttagcc、ggtgcgtccagtcgggccact和ctgtcctctgattcctccata的序列至少70％序列同一性的序列。

所述核酸序列或功能等同物优选包括与任何上述核酸序列至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％序列同一性的序列。进一步提供核酸序列或其功能等同物，其包含具有与图2所述核苷酸序列的至少一部分至少70％序列同一性的序列，所述部分具有至少15个核苷酸并且编码图2所述的至少一个CDR区。

本发明的核酸序列或其功能等同物优选编码具有与AM22CDR区、AM22重链和/或AM22轻链至少70％序列同一性的区域。因此一个实施方案提供分离的、合成的或重组的核酸序列，或其功能等同物，其包含编码具有与序列KLSIH至少70％序列同一性，和/或与序列GYEGEVDEIFYAQKFQH至少70％序列同一性，和/或与序列LGVTVTEAGLGIDDY至少70％序列同一性，和/或与序列RASQIVSRNHLA至少70％序列同一性，和/或与序列GASSRAT至少70％序列同一性，和/或与序列LSSDSSI至少70％序列同一性，和/或与序列QVQLVQSGAEVKKPGATVKVSCKISGHTLIKLSIHWVRQAPGKGLEWMGGYEGEVDEIFYAQKFQHRLTVIADTATDTVYMELGRLTSDDTAVYFCGTLGVTVTEAGLGIDDYWGQGTLVTVSS至少70％序列同一性，和/或与EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQIVSRNHLAWYQQKPGQAPRLLIFGASSRATGIPVRFSGSGSGTDFTLTINGLAPEDFAVYYCLSSDSSIFTFGPGTKVDFK至少70％序列同一性的氨基酸序列的序列。

如之前所述，本发明的抗体或功能等同物能够识别三聚体RSV F蛋白上呈现的独特表位。因此本发明的核酸序列优选编码能够特异性结合该独特表位的CDR序列。本发明因此还提供分离的、合成的或重组的核酸序列或其功能等同物，其编码至少一个能够特异性结合由抗体识别的表位的CDR序列，其包括：

-重链CDR1序列，其包括序列KLSIH，和/或

-重链CDR2序列，其包括序列GYEGEVDEIFYAQKFQH，和/或

-重链CDR3序列，其包括序列LGVTVTEAGLGIDDY，和/或

-轻链CDR1序列，其包括序列RASQIVSRNHLA，和/或

-轻链CDR2序列，其包括序列GASSRAT，和/或

-轻链CDR3序列，其包括序列LSSDSSI。

优选，所述核酸序列编码本发明完整的抗体或功能等同物(例如包括重链或轻链的)。因此进一步提供分离的、合成的或重组的核酸序列或其功能等同物，其编码至少一个能够特异性结合由抗体识别的表位的抗体或功能等同物，其包括：

-重链CDR1序列，其包括序列KLSIH，和/或

-重链CDR2序列，其包括序列GYEGEVDEIFYAQKFQH，和/或

-重链CDR3序列，其包括序列LGVTVTEAGLGIDDY，和/或

-轻链CDR1序列，其包括序列RASQIVSRNHLA，和/或

-轻链CDR2序列，其包括序列GASSRAT，和/或

-轻链CDR3序列，其包括序列LSSDSSI。

本发明的一个实施方案中核酸序列或功能等同物编码抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其能够特异性结合由AM22抗体识别的表位，其包括包含序列KLSIH的重链CDR1序列，和包含序列GYEGEVDEIFYAQKFQH的重链CDR2序列，和包含序列LGVTVTEAGLGIDDY的重链CDR3序列，和包含序列RASQIVSRNHLA的轻链CDR1序列，和包含序列GASSRAT的轻链CDR2序列，和包含序列LSSDSSI的轻链CDR3序列。

本发明的核酸序列或功能等同物优选编码抗体或其功能等同物，其具有小于1×10^-2M、1×10^-3M、1×10^-4M、1×10^-5M、1×10^-6M、1×10^-7M、1×10^-8M、1×10^-9M、1×10^-10M、1×10^-11M、1×10^-12M、1×10^-13M、1×10^-14M或小于1×10^-15M的离解常数(Kd)。

进一步提供包含本发明核酸序列的载体。所述载体适于多种应用。例如，包含治疗有益的核酸序列的本发明的载体适于预防或治疗应用。所述载体给予需要其的个体导致所述预防或治疗核酸序列的体内表达。所述载体还可以用于涉及目的核酸序列活体外表达的应用，例如用于(商业的)本发明抗体或功能等同物的生产。用于构建具有本发明核酸序列的载体的方法为本领域所熟知。适于产生本发明载体的非-限制性载体实例为逆转录病毒和慢病毒载体。

术语“％序列同一性”在此定义为在对齐两条序列并且必要时为了实现最大的百分比同一性而引入缺口后候选氨基酸序列或候选核酸序列中与对照序列中的残基相同的残基百分比。用于序列排列对比的方法和计算机程序是本领域所熟知的。

如此处所用的，本发明的核酸分子或核酸序列优选包含核苷酸链，更优选DNA和/或RNA。其他实施方案中本发明的核酸分子或核酸序列包含其他种类的核酸结构例如DNA/RNA螺旋、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和/或核酶。所述其他的核酸结构称为核酸序列的功能等同物。术语“核酸序列的功能等同物”还包括包含非天然核苷酸、修饰的核苷酸和/或非-核苷酸组块的链，其表现出与天然核苷酸相同的功能。

本发明的核酸序列或载体尤其可用于产生对RSV特异性的抗体或功能等同物。其通过将核酸序列或载体导入细胞以使细胞的核酸翻译结构产生编码的抗体或功能等同物而完成。在一实施方案中，编码本发明重和/或轻链的核酸序列或载体在所谓的生产者细胞中表达，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO(小鼠骨髓瘤)或293(T)细胞系，其中的一些适合于商品化的抗体生产。所述生产者细胞的增殖产生能够生产本发明抗体或其功能等同物的生产者细胞系。优选，所述生产者细胞系适于生产用于人的抗体。因此，所述生产者细胞系优选无病原体诸如致病微生物。最优选，由人序列组成的抗体或功能等同物利用至少一种本发明的核酸序列或载体生产。

因此还提供能够产生本发明的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物的分离的或重组的抗体产生细胞，以及用于生产本发明分离的、合成的或重组的抗体或功能部分、衍生物和/或类似物的方法，其包括提供具有本发明核酸序列或功能等同物的细胞并且允许所述细胞翻译所述核酸序列或功能等同物或载体，由此产生所述抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物。

抗体产生细胞在此定义为能够产生和/或分泌抗体或其功能等同物的细胞，和/或能够发展成为能产生和/或分泌抗体或其功能等同物的细胞的细胞。本发明的抗体产生细胞优选为适合于商品化抗体生产的生产者细胞。优选，所述生产者细胞系适于生产用于人的抗体。

本发明的方法优选进一步包括收集、纯化和/或分离所述本发明的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物的步骤。可选择地经另外的纯化、分离或处理步骤后，获得的本发明抗体或功能等同物优选用于人的治疗。

既然已提供了本发明改进的呼吸道合胞病毒-特异性抗体或功能等同物和编码其的核酸序列以及载体，包括人抗体或功能等同物，因此改进的预防和/或治疗应用已成为可能。通过本发明的抗体或功能等同物中和RSV。因此本发明的抗体或功能等同物尤其适于用作药物或预防药剂，可选择性地与本领域已知的至少一种其他的RSV-特异性抗体联用。优选，抗体或功能等同物以由人序列，或至多5％非-人序列组成而使用以在治疗人个体时降低不良副作用的可能性。因此还提供了用作医药和/或预防药剂的本发明分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物或核酸序列或其功能等同物或载体或细胞。当给予本发明的核酸或功能等同物或载体时，其将在原位翻译为本发明的抗体或功能等同物。在尤其优选的实施方案中所述抗体包括抗体AM22或其功能等同物。所述医药或预防药剂优选用于中和或至少部分预防RSV的感染。因此进一步提供用作医药和/或预防药剂而至少部分治疗和/或预防RSV相关病症的本发明分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物或核酸序列或其功能等同物或载体或细胞。包括与本领域已知的至少一种其他RSV-特异性药剂，优选抗体联用的药物由于获得对RSV更强的免疫原性应答和/或实现对RSV更高的抗体特异性的联用而特别有益。因此进一步提供用作药物和/或预防药剂的本发明分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物或核酸序列或其功能等同物或载体或细胞与另外不同的RSV-特异性药剂，优选抗体或其功能等同物的组合物。本发明的组合物优选包括AM22和选自帕利珠单抗、D25、AM14、AM16和AM23的抗体。如之前所述，所述组合物特别适于至少部分治疗或预防RSV-相关的病症。因此进一步提供本发明的组合物用于制备用于至少部分治疗和/或预防RSV相关病症的药物和/或预防药剂的用途。因此还提供了本发明分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物或核酸序列或其功能等同物或载体或细胞用于制备用于至少部分治疗和/或预防RSV-相关病症的药物和/或预防药剂的用途，以及用于至少部分治疗或预防RSV-相关病症的方法，所述方法包括给予需要其的个体治疗有效量的本发明的分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物。在一个优选的实施方案中，使用具有至少一种其他RSV-特异性药剂，优选另外的RSV特异性抗体的组合物。所述个体已在治疗之前优选诊断为受RSV感染。

所述抗体优选包括抗体AM22或其功能部分。所述至少一种其他的RSV-特异性抗体优选为帕利珠单抗、D25、AM14、AM16或AM23。最优选使用AM22和D25的组合物。

为了至少部分治疗或预防呼吸道合胞病毒相关的病症，优选将本发明的抗体或功能等同物在感染发生之前给予个体。或者，本发明的抗体或功能等同物在个体已经感染时给予。所述抗体或功能等同物优选给予具有增加的并发症风险的个体，例如住院个体和/或具有受损免疫力的个体。此外年长的人具有增加的RSV感染风险。本发明的抗体或功能等同物优选经一次或多次注射给予。用于如之前所述预防或治疗应用的本发明抗体或功能等同物的剂量范围以存在严格方案要求的临床试验中临床上升剂量研究为基础而设计。一般的剂量在每公斤体重0.1和10mg之间。用于预防或治疗应用，本发明的抗体或功能等同物通常与药学可接受载体、稀释剂和/或赋形剂联用。合适载体的实例例如包括钥孔血蓝素(KLH)、血清白蛋白(例如BSA或RSA)和卵清蛋白。在一个优选的实施方案中所述合适的载体包括溶液如例如盐水。

又一个实施方案中使用编码本发明抗体或功能等同物的核酸或载体。如已经描述的，在给予所述核酸或载体时，通过宿主结构产生抗体或功能等同物。产生的抗体或功能等同物能够至少部分预防和/或中和呼吸道合胞病毒感染和/或所述感染的有害作用。因此还提供了用作医药和/或预防药剂的本发明的核酸序列或功能等同物或载体。进一步提供本发明的核酸序列或功能等同物或载体用于制备用于至少部分治疗和/或预防RSV相关病症的药物和/或预防药剂的用途。

进一步提供包括本发明分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物或核酸序列或其功能等同物或载体或细胞以及药学可接受载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。所述药物组合物优选适于人使用。在一个优选的实施方案中所述抗体为AM22。在另外优选的实施方案中所述核酸编码AM22或其功能等同物。在一实施方案中所述药物组合物进一步包括至少一种其他的RSV-特异性抗体，优选帕利珠单抗、D25、AM14、AM16和/或AM23。

本发明进一步用下列实施例解释。这些实施例并不限制本发明的范围，而仅仅用于阐明本发明。

参考文献

Chen Y，Wiesmann C，Fuh G，Li B，Christinger HW，McKay P，de Vos AM，LowmanHB.Selection and analysis of an optimized anti-VEGF antibody：crystalstructure of an affinity-matured Fab in complex with antigen.J Mol Biol.1999；293(4)：865-81.

Diehl SA，Schmidlin H，Nagasawa M，van Haren SD，Kwakkenbos MJ，Yasuda E，Beaumont T，Scheeren FA，Spits H.STAT3-mediated up-regulation of BLIMP1Iscoordinated with BCL6down-regulation to control human plasma celldifferentiation.J Immunol.2008；180(7)：4805-15.

Jaleco AC，Stegmann AP，Heemskerk MH，Couwenberg F，Bakker AQ，Weijer K，Spits H.Genetic modification of human B-cell development：B-cell developmentis inhibited by the dominant negative helix loop helix factor Id3.Blood.1999；94(8)：2637-46.

Kabat EA，Wu TT.Identical V region amino acid sequences and segmentsof sequences in antibodies of different specificities.Relative contributionsof VH and VL genes，minigenes，and complementarity-determining regions tobinding of antibody-combining sites.J Immunol.1991；147(5)：1709-19.

Kwakkenbos MJ，Diehl SA，Yasuda E，Bakker AQ，Van Geelen CMM，Lukens MV，Van Bleek GM，Widjojoatmodjo MN，Bogers WMJM，Mei H，Radbruch A，Scheeren FA，SpitsH and Beaumont T.Generation of stable monoclonal antibody-producing BCR+humanmemory B cells by genetic programming.Nat Med.2009In press.

Shvarts A，Brummelkamp TR，Scheeren F，Koh E，Daley GQ，Spits H，BernardsR.A senescence rescue screen identifies BCL6as an inhibitor of anti-proliferative p19(ARF)-p53signaling.Genes Dev.2002；16(6)：681-6.

Scheeren FA，Naspetti M，Diehl S，Schotte R，Nagasawa M，Wijnands E，

Gimeno R，Vyth-Dreese FA，Blom B，Spits H.STAT5regulates the self-renewal capacity and differentiation of human memory B cells and controlsBcl-6expression.Nat Immunol.2005；6(3)：303-13.

Ternette N，Tippler B，Uberla K，Grunwald T.Immunogenicity and efficacyof codon optimized DNA vaccines encoding the F-protein of respiratorysyncytial virus.Vaccine.2007；25(41)：7271-9.

US 5,624,821

US 5,739,277

US 6,277,375

US 6,737,056

US 6,821,505

US 7,083,784

US 7,317,091

US 7,217,797

US 7,276,585

US 7,355,008

US 2002/0147311

US 2004/0002587

US 2005/0215768

US 2007/0135620

US 2007/0224188

US 2008/0089892

WO94/29351

WO99/58572

WO2008/147196

附图说明

图1.AM22，新的全人单克隆抗体，相比帕利珠单抗在Hep2细胞上非常有效地中和RSV A2病毒。

图2.AM22重链和轻链核苷酸序列和氨基酸序列。

图3.如通过ELISA和FACS染色测定的，人抗-RSV单克隆抗体识别RSV的融合(F)蛋白上的构象表位。(A)显示抗体结合至感染水泡性口膜炎病毒(VSV)的EL-4细胞，其用RSV F或RSV G蛋白假模标本化。(B)显示抗-RSV F抗体结合至ELISA板，其涂布RSV感染的HEp2(左板)的裂解物或具有用重组HIS标签F蛋白(右板)涂布的Ni-NTA HisSorp板(Qiagen)。用HRP-偶联的IgG检测抗体(1：2500稀释，Jackson)检测结合F蛋白的抗体。(C)显示包含聚HIS标签的重组RSV F长菌株结合至原始的B细胞克隆，用抗-pentaHIS抗体检测结合至BCR。(D)中显示人抗-RSV抗体胞内结合至用包含三聚结构域(ILZ结构域)的RSV F构建体感染的293T细胞。

图4.RSV激发用人免疫球蛋白预防治疗的棉鼠。(A)显示在棉鼠中肌肉给药指示剂量的抗体后第1天和第5天来自血清的人IgG1的恢复。(B)显示RSV-X感染之前24小时用指示抗体处理的棉鼠肺中的RSV负载量。用TCID50培养物感染5天后测定RSV负载量。实验用每个处理组四至六个动物进行两次。也参见表2，在相同的动物组(C)中研究肺病理学，显示AM22和帕利珠单抗的通常肺病理学。

实施例

实施例1.B细胞培养、永生化和选择。

方法

如之前所述(Scheeren FA，等.(2005)Nat Immunol 6：303-313；Diehl SA，等.(2008)J Immunol 180：4805-4815和Kwakkenbos MJ，等.(2009)Nat Med印刷中)永生化和培养B细胞。简言之，我们通过Ficoll分离，CD22MACS微珠(Miltenyi Biotech)从外周血分离B细胞，随后在FACSAria(Becton Dickinson)上分选CD19⁺CD3^–CD27⁺IgM^–IgA^–细胞(IgG记忆细胞)。这些组织的使用经协会医生伦理委员会批准并且根据知情同意而定。逆转录病毒转染的B细胞在补充重组鼠IL-21(25ng ml^-1，R&D系统)的IMDM中以2x10⁵细胞ml^-1维持，并且与稳定表达CD40L的γ-照射的(50Gy)鼠L细胞纤维原细胞(CD40L-L细胞，10⁵细胞ml^-1)共培养36个小时。BCL6和Bcl-xL逆转录病毒构建体如前所述(Shvarts A，等.(2002)Genes Dev16：681-686和Jaleco AC，等.(1999)Blood 94：2637-2646))并且如之前所述克隆入LZRS逆转录病毒载体和转染入Phoenix包装细胞，随后添加至刺激的B细胞(Shvarts A，等.(2002)Genes Dev 16：681-686和Scheeren FA，等.(2005)Nat Immunol 6：303-313)。在用于延长周期的重组IL-21和CD40L-L细胞存在下，在IMDM中维持转染的B细胞。考虑到相对高的BCL6+Bcl-xL-转染的B细胞分泌的抗体量，检查了是否可以在特异性抗体分泌的基础上选择抗原-特异性B细胞。BCL6+Bcl-xL转染的健康供体的记忆B细胞以100细胞/孔接种并且用CD40L-L细胞和IL-21扩大。培养2星期后，收集上清液并且在微量中和实验中筛选RSV-中和抗体的存在。384个培养物中(100细胞/孔)，31个阻止RSV A2感染HEp2细胞。除了D25、AM14、AM16和AM23通过极限稀释而亚克隆的四个微量培养外，接着获得了AM22。AM22具有对RSV-A2病毒1.15ng ml^-1的中位半最大抑制浓度(IC₅₀)(图1)。

为了获得AM22免疫球蛋白基因座的重链和轻链序列，用

迷你试剂盒(Qiagen)分离RNA，产生cDNA，进行PCR并且将重链和轻链可变区克隆入pCR2.1TA克隆载体(Invitrogen)。为了排除逆转录酶或DNA聚合酶的诱导突变，进行了一些独立的克隆实验。为了产生重组得AM22mAb，将AM22框架的重和轻可变区与人IgG1和κ恒定区克隆入pcDNA3.1(Invitrogen)载体并且瞬时转染293T细胞。从培养上清液用蛋白A纯化重组AM22。

结果

之前开发了四个有效的构象依赖型抗-RSV抗体，命名为AM14、AM16、AM23和D25。这些抗体已在WO2008/147196和Kwakkenbos MJ等.(2009)Nat Med(印刷中)中描述。我们还从相同的供体发现了AM22，其相比其他的抗体更有效地识别RSV病毒，如对RSV A2病毒1.15ngml^-1的IC₅₀所明确显示的(表1和图1)。AM22VH和VL链的氨基酸序列揭示该抗体不同于其他的抗体(图2)。

实施例2.体外结合实验。

为了进一步确定AM22抗体的抗原特异性，我们进行了体外结合实验以揭示所述蛋白是否识别RSV F或G蛋白并且识别什么类型的构象。

方法

(1)RSV G或F蛋白的FACS染色

在培养在包含5％FCS，青霉素/链霉素和50μM2-巯基-乙醇的DMEM中的BHK细胞上制备表达RSV-G蛋白(VSV-G)或RSV-F蛋白(VSV-F)的野生型和重组水泡性口膜炎病毒(VSV)的病毒原种(通过M.Lukens，WKZ，Utrecht进行实验，并且由J.S.Kahn和J.K Rose，YaleUniversity School of Medicine友情提供VSV病毒)。在培养在补充5％FCS，青霉素/链霉素和50μM 2-巯基-乙醇的Iscove’s改进的Dulbecco’s培养基(IMDM，Gibco，Invitrogen)中的EL-4细胞上进行VSV感染。感染VSV病毒变体的EL-4细胞用重组抗体孵育并且随后用鼠-抗-人PE染色(图3A)。

(2)RSV ELISA

平板用RSV感染的HEp-2细胞裂解物在PBS中37℃4℃包被1小时并且在ELISA洗涤缓冲液中(PBS，0.5％Tween-20)洗涤。在抗-RSV抗体或多克隆的山羊抗-RSV(Biodesign)与酶-偶联抗-IgG抗体联用添加(HRP-偶联的抗-IgG(Jackson)1：2500稀释)之前，通过用4％牛奶的PBS孵育封闭平板。TMB底物/终止液(Biosource)用于ELISA显影(图3B左板)。除了RSV-A2感染的HEp-2细胞裂解物外，来自RSV长菌株(Frank Coenjaerts，UMCU，Utrecht友情提供，Ternette N，等.，(2007)Vaccine 25：7271-7279)的HIS-标签F蛋白用于包被Ni-NTAHisSorp平板(Qiagen)(图3B右板)。用HRP-偶联的IgG检测抗体(1：2500稀释，Jackson)检测RSV F抗体的结合。在另外的设置中原始的B细胞克隆用于FACS分析(图3C)。B细胞与重组HIS标签F蛋白孵育并且用标记的抗-5HIS抗体ALEXA fluor 647(Qiagen)检测BCR结合。

(3)RSV三聚体

除了重组的RSV长菌株来源的F蛋白，通过将F的开放读框插入融合后有8个HIS重复(ILZ-8xHIS)的异亮氨酸拉链结构域的构建体中构建RSV A2F三聚体。蛋白构建体在293T细胞中瞬时表达并且通过利用BD Fix Perm试剂盒的胞内染色方案检测(图3D)。

结果

在通过重组VSV表达时所有抗体识别RSV-F蛋白(图3A)。此外，除了AM16，由于其不识别RSV感染的HEp-2细胞的裂解物，识别取决于RSV-F蛋白中构象表位的存在(图3B左板)。当在直接ELISA中检测时纯化的HIS-标签重组RSV-F长菌株蛋白也没有被D25、AM14、AM22和AM23识别。然而当最初稳定的BCR表达B细胞系与未-纯化的HIS标签RSV-F蛋白培养上清液孵育时，观察到AM16、AM23结合B细胞克隆而D25结合较弱(图3C)。该未-纯化的培养上清液中的蛋白质可能包含RSV F三聚体的一小部分，其结合BCR但仅在HisSorp平板上作为单体被捕获。然而对AM14和AM22B细胞系的BCR，仍然没有观察到RSV-F蛋白的捕获(图3C)。因此AM14和AM22结合不同的表位。可能F蛋白生产细胞系的未处理培养上清液中存在低百分数的蛋白F均三聚体或二聚体。这些更天然的F构象可能表达由AM23和D25识别的表位，其在ELISA方法的变性条件中消失了。有趣的是在用包含ILZ-8xHIS序列的RSV三聚构建体转染的293T细胞上进行胞内染色时，发现AM22识别RSV F(图3D)，然而AM14仍然不识别该蛋白质结构。因此由于其识别变性条件中不存在而因此在该蛋白质单体形式中不存在的RSV-F蛋白构象，AM22为独特的。只有当RSV F蛋白强制在一起且形成三聚体时，随后才能通过AM22抗体检测呈现在病毒粒子上的构象的F结合，并且由此解释AM22的高中和效力。

实施例3.体内效力实验。

为了研究AM22单克隆抗体的体内效力，进行了棉鼠实验。

方法

无病原体的7–9周-大小棉鼠(Sigmodon hispidus，Harlan Laboratories，Nederland)用异氟烷麻醉并且通过肌内(i.m.)注射而给予0.1ml纯化的抗体，对于对照抗体、帕利珠单抗、AM22、AM23和D25，为2.0或0.4mg kg^-1的剂量，而AM14给予0.4和0.1mg kg^-1。二十四小时后，麻醉动物，采血用于血清hIgG测定并且通过鼻内滴注10⁶TCID₅₀RSV-X(100μl)激发。五天后处死动物采集肺。测定肺病毒效价并且最低极限的检测为2.1log₁₀TCID₅₀g-1。荷兰疫苗学会动物试验委员会批准了所有涉及棉鼠的程序。

结果

检测棉鼠中的抗-RSV抗体板，除了AM16。在RSV-X，最初的RSV A分离物鼻内给予之前，动物用2.0或0.4mg kg^-1单克隆抗体预防治疗。由于相对低的抗体产生，以0.4和0.1mgkg^-1给予AM14抗体。对于所有抗体，在第1天(病毒培养那天)和第5天(处死那天)从棉鼠血清回收的人IgG水平在相同的范围，并且随后的抗体减少也是可比较的(图4A)。

来自处死动物肺的RSV病毒的回收在用2.0mg/kg免疫球蛋白治疗的所有动物组中相比对照组强烈降低(图4B)。用0.4kg^-1帕利珠单抗和AM23治疗的动物显示显著的病毒复制，而AM14和D25组中6只中的1只显示可检测的病毒复制。从用AM22治疗的动物没有能回收病毒。这些结果表明特异性识别RSV F蛋白上构象表位的AM22拥有强的体内中和能力。

RSV激发的棉鼠肺病理学分析

在鼻内RSV感染5天后从每只棉鼠去除左肺并且用福尔马林固定。肺损伤因三个独立标志而分为0-5类：1)支气管和细支气管上皮肥大，2)支气管和细支气管周围的炎症(细支气管周炎)以及3)肺泡炎症(肺泡炎)。一组中所有动物的平均总得分生成生成病理学指数(满分15)(图4c，表2)。RSV感染后的肺病变在用高剂量免疫球蛋白(2mg kg^-1)治疗的动物组中显著降低(表3)。然而仅在AM14、AM22和AM23组中较低浓度(0.4mg kg^-1)时病变显著降低。虽然用AM22和AM23以2mg kg^-1治疗的5只动物中3只完成没有病变，分别在AM14和AM22组的6只动物中的2或1只中检测检测到0.4mg kg^-1的完全保护(表3)。

当结合实施例1、2和3的结果时可以推论AM22具有某些优势。AM22显示最低的IC₅₀值，表明与其他的抗体相比更低量的AM22获得类似的预防或或治疗效果。AM22识别与其他抗体不同的RSV F蛋白表位，并且因此可用于与一种其他的抗体联用以获得对RSV更强的免疫原性应答和对RSV更高的抗体特异性。最后，棉鼠用AM22治疗导致病毒复制的几乎完全抑制，而使得这些棉鼠中可能完全没有病变。

实施例4：AM22对RSV F蛋白的亲和力

测定RSV F蛋白和AM22之间的亲和常数和结合特异性利于确立抗体的预防、治疗和诊断价值。由于已对寡聚蛋白质结构测定了抗体亲和力，因此其为抗体的激发特性。通常对芯片上捕获的固定试剂测定亲和力常数。然而芯片上捕获的蛋白F不会被AM14、AM22、AM23和D25抗体识别。

方法

“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点和其结合配偶体(例如抗原)之间总的非共价相互作用的力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由计算为k_off/k_on比值的平衡离解常数(Kd)表示。可通过本领域已知的普通方法测定亲和力，诸如表面胞质团共振(SPR)测定法。亲和力(KD)，开-比率(ka)和关-比率(kd)将通过用IBIS TechnologiesBV的IBIS iSPR仪器(Hengelo，the Netherlands)的SPR分析而测定。简要地，固定抗-RSV抗体并且稀释纯化的RSV F蛋白(包含5-HIS)，通过注射注射至少三个系列的蛋白质稀释物测定比率和亲和力常数。

IBIS iSPR仪器中另外的设置为固定1)抗-5HIS抗体，其上偶联F-5HIS蛋白，或2)F-5HIS蛋白直接固定在芯片上且随后芯片芯片上的样品用AIMM抗体孵育以测定亲和力常数。

表1.纯化的IgG的RSV中和活性。

用标准的TCID₅₀培养测定法对具有RSV A2病毒的HEp2细胞测定所选的抗-RSV IgG的IC₅₀(ng/ml)值。

表2.棉鼠中的累积病变得分。

RSV感染之前用指定抗体处理24小时的棉鼠肺的累积病变得分。感染后5天获得的肺样本由随机病理学者评估。肺病变因三个独立标志而分为0-5的得分：1)支气管和细支气管上皮的肥大，2)细支气管周炎和3)肺泡炎。用2-方Wilcoxon检验计算相关对照组的具有平均标准误(SEM)和统计差异的平均病变得分(满分)。实验用每个处理组四至六只动物进行两次。N.A.为不适用的。

表3.棉鼠中病变的预防。

在RSV-X感染期间第5天肺病变显著减少/或没有的动物数。实验用每个处理组四至六只动物进行两次。

Claims

1.能够特异性结合呼吸道合胞病毒的分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分，并且其包括:

重链序列，所述重链包括：

-重链CDR1序列，其序列为KLSIH，和

-重链CDR2序列，其序列为GYEGEVDEIFYAQKFQH，和

-重链CDR3序列，其序列为LGVTVTEAGLGIDDY，和

轻链序列，所述轻链包括：

-轻链CDR1序列，其序列为RASQIVSRNHLA，和

-轻链CDR2序列，其序列为GASSRAT，和

-轻链CDR3序列，其序列为LSSDSSI；和

所述重链序列与QVQLVQSGAEVKKPGATVKVSCKISGHTLIKLSIHWVRQAPGKGLEWMGGYEGEVDEIFYAQKFQHRLTVIADTATDTVYMELGRLTSDDTAVYFCGTLGVTVTEAGLGIDDYWGQGTLVTVSS至少70％相同和/或所述轻链序列与序列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQIVSRNHLAWYQQKPGQAPRLLIFGASSRATGIPVRFSGSGSGTDFTLTINGLAPEDFAVYYCLSSDSSIFTFGPGTKVDFK至少70％相同。

2.如权利要求1所述的抗体或其功能部分，其中所述重链序列是与QVQLVQSGAEVKKPGATVKVSCKISGHTLIKLSIHWVRQAPGKGLEWMGGYEGEVDEIFYAQKFQHRLTVIADTATDTVYMELGRLTSDDTAVYFCGTLGVTVTEAGLGIDDYWGQGTLVTVSS至少75％相同的序列。

3.如权利要求1所述的抗体或其功能部分，其中所述重链序列是与QVQLVQSGAEVKKPGATVKVSCKISGHTLIKLSIHWVRQAPGKGLEWMGGYEGEVDEIFYAQKFQHRLTVIADTATDTVYMELGRLTSDDTAVYFCGTLGVTVTEAGLGIDDYWGQGTLVTVSS至少80％相同的序列。

4.如权利要求1所述的抗体或其功能部分，其中所述重链序列是与QVQLVQSGAEVKKPGATVKVSCKISGHTLIKLSIHWVRQAPGKGLEWMGGYEGEVDEIFYAQKFQHRLTVIADTATDTVYMELGRLTSDDTAVYFCGTLGVTVTEAGLGIDDYWGQGTLVTVSS至少85％相同的序列。

5.如权利要求1所述的抗体或其功能部分，其中所述重链序列是与QVQLVQSGAEVKKPGATVKVSCKISGHTLIKLSIHWVRQAPGKGLEWMGGYEGEVDEIFYAQKFQHRLTVIADTATDTVYMELGRLTSDDTAVYFCGTLGVTVTEAGLGIDDYWGQGTLVTVSS至少90％相同的序列。

6.如权利要求1所述的抗体或其功能部分，其中所述重链序列是与QVQLVQSGAEVKKPGATVKVSCKISGHTLIKLSIHWVRQAPGKGLEWMGGYEGEVDEIFYAQKFQHRLTVIADTATDTVYMELGRLTSDDTAVYFCGTLGVTVTEAGLGIDDYWGQGTLVTVSS至少95％相同的序列。

7.如权利要求1所述的抗体或其功能部分，其中所述轻链序列是与序列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQIVSRNHLAWYQQKPGQAPRLLIFGASSRATGIPVRFSGSGSGTDFTLTINGLAPEDFAVYYCLSSDSSIFTFGPGTKVDFK至少75％相同的序列。

8.如权利要求1所述的抗体或其功能部分，其中所述轻链序列是与序列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQIVSRNHLAWYQQKPGQAPRLLIFGASSRATGIPVRFSGSGSGTDFTLTINGLAPEDFAVYYCLSSDSSIFTFGPGTKVDFK至少80％相同的序列。

9.如权利要求1所述的抗体或其功能部分，其中所述轻链序列是与序列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQIVSRNHLAWYQQKPGQAPRLLIFGASSRATGIPVRFSGSGSGTDFTLTINGLAPEDFAVYYCLSSDSSIFTFGPGTKVDFK至少85％相同的序列。

10.如权利要求1所述的抗体或其功能部分，其中所述轻链序列是与序列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQIVSRNHLAWYQQKPGQAPRLLIFGASSRATGIPVRFSGSGSGTDFTLTINGLAPEDFAVYYCLSSDSSIFTFGPGTKVDFK至少90％相同的序列。

11.如权利要求1所述的抗体或其功能部分，其中所述轻链序列是与序列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQIVSRNHLAWYQQKPGQAPRLLIFGASSRATGIPVRFSGSGSGTDFTLTINGLAPEDFAVYYCLSSDSSIFTFGPGTKVDFK至少95％相同的序列。

12.如权利要求1所述的抗体或其功能部分，其结合三聚RSV F蛋白，不结合变性或单体RSV F蛋白。

13.如权利要求1所述的抗体或其功能部分，其在体外中和测定法中具有小于1.25ng/ml的IC₅₀值，所述该测定法中HEp-2细胞被RSV-A2病毒感染。

14.权利要求1所述的抗体或其功能部分，其偶联至PEG或白蛋白。

15.权利要求1所述的抗体或其功能部分，包括Fc区，其包含选自如Kabat阐述的EU索引编码的234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、263、264、265、266、267、268、269、279 280、284、292、296、297、298、299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、373、378、392、416、419、421、440和443的一个或多个位点的修饰，所述修饰包括氨基酸取代和/或氨基酸插入和/或氨基酸缺失。

16.权利要求15所述的抗体或其功能部分，包括Fc区，其包含选自如Kabat阐述的EU索引编码的252、254和/或256氨基酸取代，其中252位的氨基酸取代是酪氨酸取代，254位的氨基酸取代是苏氨酸取代，和/或256位的氨基酸取代是谷氨酸取代。

17.权利要求1-16任何一项的抗体或其功能部分，其为人抗体。

18.编码权利要求1-17任一所述的抗体的分离的、合成的或重组的核酸序列。

19.一种载体，包含如权利要求18所述的核酸序列。

20.一种分离或重组的细胞，其特征在于，包含权利要求18所述的核酸序列或权利要求19的载体。

21.组合物，其包含：如权利要求1-20任一所述的抗体、或核酸序列、或载体、或细胞；

一种其他的RSV-特异性药剂。

22.如权利要求21所述的组合，其中所述其他RSV-特异性药剂是一种RSV-特异性抗体。

23.如权利要求22所述的组合，其中所述其他RSV-特异性抗体是帕利珠单抗、D25、AM14、AM16或AM23。

24.如权利要求1-23任一所述的抗体、或核酸序列、或载体、或细胞、或组合的用途，其特征在于，用于制备至少部分治疗或预防RSV-相关的病症的药物。

25.一种药物组合物，其特征在于，包含：

如权利要求1-23任一所述的抗体、或核酸序列、或载体、或细胞、或组合；

药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

26.权利要求25所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备至少部分治疗或预防RSV-相关的病症的药物。