CN115466326A - 一种呼吸道合胞病毒的人源单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本文提供了结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段。本文还提供了该抗体或其抗原结合片段在预防或治疗RSV感染方面的用途。

Description

一种呼吸道合胞病毒的人源单克隆抗体及其应用
技术领域
本文涉及结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段。本文还涉及该抗体或其抗原结合片段在预防或治疗RSV感染方面的用途。
背景技术
呼吸道合胞病毒(RSV)会引起急性下呼吸道感染，是导致全球儿童患病死亡的主要病原。RSV相关疾病的住院概率是流感或副流感病毒相关疾病的三倍，高住院率在5 岁以下的婴幼儿中常见，3岁婴幼儿患病率最高，全球1月龄到1岁死亡的婴幼儿中，由RSV导致的占6.7％，是学龄前儿童特别是婴幼儿最为主要的呼吸道感染病原，免疫力低下的成年人和老年人也易感。尽管RSV严重威胁着全球人的健康，但却很少有预防和治疗RSV感染的措施，疫苗的研发也因福尔马林灭活的疫苗引起病情恶化而被阻碍。母体内的抗体在妊娠期最后几周会通过胎盘传给婴儿，可以提供保护性免疫，但这种保护每个月大约会衰退两倍，持久性差。目前没有疫苗和特效的治疗手段，唯一的预防措施是1998年获批的帕利珠单抗(Palivizumab)，虽然一定程度上能够减少婴幼儿的住院率和死亡率，但它免疫活性差，使用频率高，整个流行季节需要给先天性呼吸道循环系统障碍的早产儿免疫五次，这样的高成本和不便利使其不适用于所有的婴儿，也限制了对高风险婴儿的预防。此外，阿斯利康生产的对单克隆抗体D25进行了改进的一版单抗MEDI8897中和活性较强，只需要免疫1-2次即可，现在已进入三期临床。因此，亟需高效的新一代单克隆抗体药物用于预防/治疗RSV感染。
迄今为止，中和抗体已被证明是治疗病毒性疾病的有效方法。目前已经上市的治疗和预防病毒感染的药物有预防小儿呼吸道合胞病毒(RSV)感染的palivizumab(Synagis)，治疗HIV感染的艾巴利珠单抗(Trogarzo)，以及用于狂犬病毒暴露后预防的Rabishield。此外，还有多种针对不同病毒的单抗处于临床研究的不同阶段 (https://clinicaltrials.gov/)。抗体主要通过两方面起作用。一方面，具有中和活性的抗体可通过结合病毒囊膜蛋白，阻断病毒与细胞受体的结合，从而阻断病毒感染。另一方面，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒性作用(CDC)可募集巨噬细胞或是补体等免疫细胞和免疫分子，从而清除游离的病毒以及被感染的细胞。
呼吸道合胞病毒属于副黏液病毒科，是一种单股负链RNA病毒，有A、B两种抗原型，这两种抗原型都有流行。RSV表面的吸附蛋白(G)和融合蛋白(F)是能够诱导中和抗体应答的主要抗原。G蛋白是负责病毒粘附到细胞膜表面的蛋白，但它具有抗原多变性，很难产生一种广谱的保护性药物。F蛋白是负责病毒与细胞融合的蛋白，呈现出更多的中和抗体靶向表位，是现在研发中大多数疫苗和免疫治疗药物的主要靶点，也是目前临床上通过palivizumab预防RSV疾病的靶点。F蛋白具有融合前(pre-fusion)和融合后(post-fusion)两种构象。融合前F蛋白不稳定，会发生构象翻转，变成融合后F 蛋白。目前已发现大多数强中和表位都集中在融合前构象的F蛋白，比如单抗D25以及其改进版单抗MEDI8897都结合在融合前F的
Figure BDA0003112737050000021
表位。2013年，Peter Kwong团队通过引入一组突变(S190F,V207,S155C和S290C)获得了一种稳定融合前的RSV F蛋白 DS-Cav1。DS-Cav1免疫小鼠后能激活更高的中和抗体产生。
发明内容
一方面，本文提供了结合呼吸道合胞病毒F蛋白的抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区，所述重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3选自如下组合之一：
(1)HCDR1的氨基酸序列为:GFTFSSYA(SEQ ID NO：18)；
HCDR2的氨基酸序列为:ISYDGSNT(SEQ ID NO：19)；
HCDR3的氨基酸序列为:ARDYCSRGTCYHDY(SEQ ID NO：20)；
(2)HCDR1的氨基酸序列为:GYTFTTYD(SEQ ID NO：24)；
HCDR2的氨基酸序列为:LNPDNGNT(SEQ ID NO：25)；
HCDR3的氨基酸序列为:TRAPWWWYFDY(SEQ ID NO：26)；以及
(3)HCDR1的氨基酸序列为:GFSFTNYG(SEQ ID NO：30)；
HCDR2的氨基酸序列为:ISYDDGSDK(SEQ ID NO：31)；
HCDR3的氨基酸序列为:VRDPTGDY(SEQ ID NO：32)。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包括轻链可变区，所述重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3和所述轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3 选自如下组合之一：
(1)LCDR1的氨基酸序列为:QDIRND(SEQ ID NO：15)；
LCDR2的氨基酸序列为:AAS(SEQ ID NO：16)；
LCDR3的氨基酸序列为:LQDYNYPQTFG(SEQ ID NO：17)；
HCDR1的氨基酸序列为:GFTFSSYA(SEQ ID NO：18)；
HCDR2的氨基酸序列为:ISYDGSNT(SEQ ID NO：19)；
HCDR3的氨基酸序列为:ARDYCSRGTCYHDY(SEQ ID NO：20)；
(2)LCDR1的氨基酸序列为:SGSIASNY(SEQ ID NO：21)；
LCDR2的氨基酸序列为:EDN(SEQ ID NO：22)；
LCDR3的氨基酸序列为:QSYDTSNAVFG(SEQ ID NO：23)；
HCDR1的氨基酸序列为:GYTFTTYD(SEQ ID NO：24)；
HCDR2的氨基酸序列为:LNPDNGNT(SEQ ID NO：25)；
HCDR3的氨基酸序列为:TRAPWWWYFDY(SEQ ID NO：26)；以及
(3)LCDR1的氨基酸序列为:SLNIGSNY(SEQ ID NO：27)；
LCDR2的氨基酸序列为:KNN(SEQ ID NO：28)；
LCDR3的氨基酸序列为:AAWDDSLSGVVFG(SEQ ID NO：29)；
HCDR1的氨基酸序列为:GFSFTNYG(SEQ ID NO：30)；
HCDR2的氨基酸序列为:ISYDDGSDK(SEQ ID NO：31)；
HCDR3的氨基酸序列为:VRDPTGDY(SEQ ID NO：32)。
在一些实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO：4、6或8所示的序列者包括与SEQ ID NO：4、6或8所示序列有至少90％序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO：4所示的序列或者包括与SEQ ID NO：4有至少90％序列一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：5所示的序列或者包括与SEQ ID NO：5有至少90％序列一致性的氨基酸序列；所述重链可变区包括SEQ ID NO：6所示的序列或者包括与SEQ ID NO：6有至少90％序列一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：7所示的序列或者包括与SEQ ID NO：7有至少90％序列一致性的氨基酸序列；或者所述重链可变区包括 SEQ ID NO：8所示的序列或者包括与SEQ IDNO：8有至少90％序列一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：9所示的序列或者包括与SEQ ID NO：9有至少90％序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链恒定区包括SEQ ID NO：10所示的序列或者包括与SEQ ID NO：10有至少90％序列一致性的氨基酸序列；所述抗体的轻链恒定区包括SEQ IDNO：11或12所示的序列或者包括与SEQ ID NO：11或12有至少90％序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体为人源抗体。
在一些实施方案中，所述F蛋白为融合前构象。
在一些实施方案中，所述呼吸道合胞病毒为A或B型呼吸道合胞病毒。
另一方面，本文提供了核酸分子，其编码上述抗体的轻链、重链、轻链可变区或重链可变区。
另一方面，本文提供了包括上述核酸分子的表达载体。
另一方面，本文提供了宿主细胞，其表达上述抗体或其抗原结合片段，或者包括上述核酸分子或者表达载体。
另一方面，本文提供了药物组合物，其包括上述抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
另一方面，本文提供了上述抗体或其抗原结合片段在制备治疗或预防呼吸道合胞病毒相关疾病的药物中的用途。
另一方面，本文提供了在受试者中治疗或预防呼吸道合胞病毒相关疾病的方法，其包括以有效量的上述抗体或其抗原结合片段或上述药物组合物向所述受试者给药。
另一方面，本文提供了检测样品中是否存在呼吸道合胞病毒或其含量的方法，包括让所述样品与上述抗体或其抗原结合片段接触，并检测是否形成了抗原抗体复合物或形成的抗原抗体复合物的量。
另一方面本文提供了呼吸道合胞病毒检测试剂盒，其包括上述抗体或其抗原结合片段。
附图说明
图1显示了表达和纯化的RSV-F(DS-Cav1)蛋白的层析和SDS-PAGE检测结果。
具体实施方式
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
“抗体”指由浆细胞(效应B细胞)分泌、被机体免疫系统用来中和外来物质(多肽、病毒、细菌等)的免疫球蛋白。该外来物质相应地称作抗原。经典或普通抗体分子的基本结构是由2个相同重链和2个相同轻链组成的4聚体。根据氨基酸序列的保守性差异，将重链和轻链分为位于氨基端的可变区(V)和位于羧基端的恒定区(C)。一条重链和一条轻链的可变区相互作用形成了抗原结合部位(Fv)。在可变区中，某些区域氨基酸残基的组成和排列次序比可变区内的其它区域(骨架区，FR)更易变化，称为高变区(HVR)，高变区实际上是抗体与抗原结合的关键部位。由于这些高变区序列与抗原决定簇互补，故又称为互补决定区(complementarity-determining region,CDR)。重链和轻链均具有三个互补决定区，分别称为HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
在已知抗体互补决定区序列的情况下，本领域技术人员可容易地例如通过DNA重组技术将抗体分子的部分序列(例如恒定区或骨架区)替换为来自其他物种的序列，形成嵌合抗体，而该嵌合抗体可基本上保留其来源抗体的结合特异性。例如，在来源抗体为鼠抗体时，可将其恒定区替换为人抗体恒定区，或者相反，在来源抗体为人抗体时，可将其恒定区替换为鼠抗体恒定区，以减弱抗体在不同物种中使用时的免疫免疫原性或者为了利用恒定区的特定功能，例如ADCC相关活性。出于进一步降低抗体免疫原性或其他目的，可将抗体分子中除CDR序列之外的其他序列都用另一抗体分子(来自相同或不同物种)的对应序列(视情况可包括一个或数个氨基酸突变)替换，同时基本上保留其来源抗体的结合特异性。在一个具体实例中，本领域技术人员经常采用CDR移植来将鼠源抗体人源化。
本领域技术人员还可以理解的是，在本文提供的具体抗体序列基础上，可以通过对少数氨基酸进行替换、删除、添加并验证或筛选所得产物与相应抗原(F蛋白)的结合能力或生物学活性，从而获得本发明提供的抗F蛋白抗体分子的相应变体，这些变体也应包括在本发明的范围内。
因此，在一些实施方案中，本文提供的抗体分子的重链可变区包括SEQ ID NO：4所示的序列或者包括与SEQ ID NO：4有至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：5所示的序列或者包括与SEQ ID NO：5有至少 85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％)序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的抗体分子的重链可变区包括SEQ ID NO：6所示的序列或者包括与SEQ ID NO：6有至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：7所示的序列或者包括与SEQ ID NO：7有至少85％ (例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％)序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的抗体分子的重链可变区包括SEQ ID NO：8所示的序列或者包括与SEQ ID NO：8有至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：9所示的序列或者包括与SEQ ID NO：9有至少85％ (例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％)序列一致性的氨基酸序列。
抗体的“抗原结合片段”指包括了来源抗体的部分序列(尤其是CDR序列)并且同时具有来源抗体结合特异性的多肽。该抗原结合片段通常包括来源抗体的轻链可变区和重链可变区，从而具备抗原结合能力。抗原结合片段的形式有多种，例如Fab、 F(ab’)2、单链抗体(scFv)、单域抗体(sdAb)等。scFv是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接成一条肽链而构成。通过正确折叠，来自重链和轻链的可变区通过非共价键相互作用形成Fv段，因而scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性。sdAb最早在驼类动物中发现，其天然缺乏轻链，但依然具有抗原结合能力。sdAb相对于普通的抗体分子具有一些优点，例如具有更佳的稳定性(耐pH、热、蛋白酶)，可以靶向并结合抗原分子上普通抗体分子难以接触到的抗原表位等。
抗体“特异结合抗原”或抗体的“抗原结合特异性”指该抗体相对于其他抗原，能够以更高或较高结合亲和力结合靶抗原。抗体与靶抗原的结合能力可通过各种方法进行定性或定量鉴定，例如通过测定抗体与靶抗原结合的KD值，测定抗体与其他抗体竞争结合靶抗原的能力等。这里Kd为平衡解离常数，可用于衡量抗体和其抗原之间的结合亲和力强弱。KD值越小，表明亲和力越强。抗体特异结合靶抗原并不意味着其不可以结合其他抗原，例如免疫交叉反应在本领域内也是已知的。
用在本文时，“抗体”可包括完整抗体或其抗原结合片段，并且可以是人抗体、鼠抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。抗体可以为任何类型的，例如IgG、IgE、IgM、 IgD、IgA或IgY)，或者任何亚类，例如IgG 1、lgG2、IgG 3、lgG4、IgA1或lgA2等。
制备抗体的方法在本领域内是已知的，包括但不限于利于抗原免疫动物后分离表达特定抗体的细胞(例如通过杂交瘤技术来制备抗体)、利用噬菌体抗体库的筛选抗体技术、通过基因工程技术转化细胞并使其表达抗体分子等。在一个具体实例中，本文实施例提供了通过向293T细胞中引入编码抗体重链和轻链的重组表达载体来制备抗体分子的方法。
本领域已知还可以对抗体分子进行多种修饰，例如PEG化、糖基化、形成抗体分子偶联物(例如ADC)、加纯化标签、或者与其他蛋白融合，例如形成双特异性抗体。在本文提供的抗体分子基础上进行修饰获得的这些抗体衍生物也应涵盖在本发明的范围内。
提及氨基酸序列时，术语“序列一致性(Sequence identity)”(也称为“序列同一性”)指两氨基酸序列(例如查询序列和参照序列)之间一致性程度的量，一般以百分比表示。通常，在计算两氨基酸序列之间的一致性百分比之前，先进行序列比对 (alignment)并引入缺口(gap)(如果有的话)。如果在某个比对位置，两序列中的氨基酸残基相同，则认为两序列在该位置一致或匹配；两序列中的氨基酸残基不同，则认为在该位置不一致或错配。在一些算法中，用匹配位置数除以比对窗口中的位置总数以获得序列一致性。在另一些算法中，还将缺口数量和/或缺口长度考虑在内。出于本发明的目的，可以采用公开的比对软件BLAST(可在网页ncbi.nlm.nih.gov找到)，通过使用缺省设置来获得最佳序列比对并计算出两氨基酸序列之间的序列一致性。
“表达载体”，也可称为“重组表达载体”，指包含各种表达元件以用于在宿主细胞中表达目的蛋白(例如抗体分子的轻链和/或重链)的核酸分子。对于用于在真核细胞(哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)中表达目的蛋白的表达载体，这些表达元件通常包括启动子、增强子、多腺苷酸化信号序列等。为了方便在大肠杆菌中扩增，表达载体通常还可包括大肠杆菌复制子序列。表达载体还可包括用于筛选的抗生素抗性基因或选择标记基因(例如氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、胸苷激酶基因(TK)等)和用于目的蛋白编码序列插入的多克隆位点(MCS)。表达载体可以为质粒载体或病毒载体。
本文提供的表达载体适合于在多种宿主细胞中表达本文提供的抗体分子或其片段，尤其适合于在哺乳动物细胞(例如小鼠、大鼠、猪、羊、猴、猩猩、或人细胞)中表达。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞可选自CHO细胞、HEK293细胞或BHK 细胞。
本发明人使用RSV融合前构象的F蛋白DS-Cav1为诱饵，利用单细胞测序技术从RSV感染康复的儿童外周血淋巴细胞(PBMCs)中分离到了4株人源单克隆抗体，分别命名为RV7、RV8、RV10和RV11。其中3株能够结合RSV F蛋白：RV8和RV10既结合融合前F蛋白又结合融合后F蛋白；RV11只结合融合前F蛋白。这3株单克隆抗体可用于RSV的诊断和抗原定量。其中2株RV8和RV11对RSV A型和B型都有中和活性，可用于RSV的预防和治疗。
本文中提供的抗体或其抗原结合片段可特异结合呼吸道合胞病毒F蛋白(融合前构象和/或融合后构象)，即呼吸道合胞病毒F蛋白作为该抗体的靶抗原。在该抗体与呼吸道合胞病毒F蛋白结合后，通过中和活性抑制RSV的细胞感染能力。因此，本文提供的抗体或其抗原结合片段可用于预防或治疗RSV感染。另一方面，由于本文提供的抗体的抗原结合特异性，可将该抗体用于检测来自受试者的样品(如血液)中是否存在 RSV病毒。相应地，本文提供可包括本文提供的抗体或其抗原结合片段的RSV检测试剂盒。
提及药物组合物，所使用的“药学上可接受的载体”指可以安全地进行施用的固体或液体稀释剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂等物质，这些物质适合于人和/或动物给药而无过度的不良副反应，同时适合于维持位于其中的药物或活性剂的活力。
提及治疗或预防RSV感染时，“有效量”指足以在受试者体内引起临床医师所期望的生物学或医学反应的活性化合物(如抗体)的量。本文提供的抗体给药时的“有效量”可由本领域技术人员根据给药途径、受试者的体重、年龄、病情等因素而确定。例如，典型的日剂量范围可以为每kg体重0.01mg至100mg活性成分。
以下通过具体实施例来进一步阐述本发明。
实施例1：RSV病毒融合前F蛋白(DS-Cav1)的表达与纯化
将编码RSV A2毒株的融合前F蛋白DS-Cav1蛋白的C端加上Thrombin酶切位点， 6个组氨酸序列，1个GS[甘氨酸-丝氨酸]连接序列，1个编码Strep II标签的序列以及 1个终止密码子(氨基酸序列如SEQ ID NO:1)，插入到哺乳表达载体pCAGGS的EcoR I和XhoI酶切位点中。将连接产物转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中。然后，挑取单克隆，接种到4mL LB培养基中，培养6-8小时；然后再转接种到300mL的LB培养基中，培养12-16小时，收集菌体，用无内毒素大提质粒试剂盒(TIANGEN)提取质粒，得到pCAGGS-RSV-F(DS-Cav1)。
将提取的质粒pCAGGS-RSV-F(DS-Cav1)转染293T细胞表达F蛋白。转染后4-5 天，将含有目的蛋白的293T细胞培养上清通过离心和过滤(0.22μM)去除细胞碎片后，与HisTrap HP(GE healthcare)镍螯合柱结合，再以不同浓度的咪唑洗脱层析柱，分别收集洗脱蛋白，通过SDS-PAGE结果判断含有目的蛋白的样品。
收集含有目的蛋白的洗脱峰，浓缩后，进行分子筛层析，根据蛋白的出峰位置和SDS-PAGE的结果确定目的蛋白的大小和纯度(分子筛及SDS-PAGE结果见图1)。分子筛结果显示，蛋白出峰位置在60-70mL，与F蛋白三聚体理论分子量150kDa吻合。 SDS-PAGE结果显示，在还原(+DTT)与非还原(-DTT)条件下，F蛋白都在～50 Kda左右，提示F蛋白亚基通过非共价形成三聚体。SDS-PAGE的T编号样品对于分子筛的T编号收集管。
实施例2：RSV F(DS-Cav1)蛋白特异性记忆B细胞的分离
在感染RSV病毒且痊愈出院的人员知情同意下，采集3-10mL的血液，分离 PBMCs。将分离到的PBMCs(107/mL)与400nM DS-Cav1蛋白(实施例1中制备)在冰上孵育结合半小时；然后用PBS洗2次，再与下列抗体(均购自BD)混合：anti-human CD3/PE-Cy5，anti-humanCD16/PE-Cy5，anti-human CD235a/PE-Cy5，anti-human CD19/APC-Cy7，anti-human CD27/Pacific Blue，anti-human CD38/APC，anti-human IgG/FITC，以及anti-His/PE。在冰上孵育半小时后，用PBS洗2次。随后，用 FACSAria III分选PBMCs，收集PE-Cy5-APC-APC-Cy7+Pacific Blue+FITC+PE+的细胞(即记忆B细胞)，直接将其收集到96孔板内，1细胞/孔。
实施例3：单一B细胞PCR及人源单克隆抗体IgG1的克隆
将实施例2获得的细胞通过Superscript III reverse transcriptase(Invitrogen)逆转录，反应条件为55℃，60min。将此逆转录产物作为模板，用HotStar TapPlus酶(QIAgen) 进行PCR，扩增抗体可变区序列(PCRa)，反应条件如下：95℃，5min；95℃，30s，55℃ (重链/κ链)/50℃(λ链)，30s，72℃，90s，35个循环，72℃，7min。将此作为模板再进行1轮PCR(PCRb)，条件如下：95℃，5min；95℃，30s，58℃(重链)/60℃(κ链)/64℃ (λ链)，30s，72℃，90s，35个循环，72℃，7min。1.2％的琼脂糖凝胶电泳，分离PCR 产物，将400-500bp的条带切胶回收后送测序公司测序。测序结果在IGBLAST网站上进行序列分析。分析结果如下:
总共得到了4个配对抗体：RV7、RV8、RV10以及RV11。根据测序结果，RV7 的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:3； RV8的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:5；RV10的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6；轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7；RV11的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8；轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9。分别将4个抗体的轻链测序结果与胚系基因进行比对，确定 RV7使用CLκ；RV8使用CLκ；RV10使用CLλ；RV11使用CLλ。
为了获得人源抗体进行后续评价，我们设计了全抗IgG1构建。策略如下：
重链：CMV promoter-HindⅢ-信号肽(SP)-重链可变区(VH)-重链恒定区(CH)-NotⅠ；
轻链κ：CMV promoter-HindⅢ-信号肽(SP)-轻链可变区(VK)-轻链恒定区(CLκ)-NotⅠ；
轻链λ：CMV promoter-HindⅢ-信号肽(SP)-轻链可变区(VL)-轻链恒定区(CLλ)-NotⅠ；
分析正确的可变区序列与相应的重链CH和轻链CLκ(或轻链CLλ)的恒定区通过搭桥PCR连接，克隆至表达载体KT351861中，得到含有特定抗体轻、重链编码基因的重组质粒；其中，使用酶切位点HindⅢ和NotⅠ将轻重链可变区连入含有恒定区的载体中。其中重链恒定区CH的氨基酸序列如SEQ ID NO:10；轻链恒定区CLκ的氨基酸序列如SEQ ID NO:11；轻链恒定区CLλ的氨基酸序列如SEQ ID NO:12；信号肽 (SP)的氨基酸序列如SEQ ID NO:13。
实施例4：单克隆抗体的表达与纯化
在含10％FBS的DMEM中培养293T细胞。用实施例3得到的分别编码抗体重链和轻链的重组表达载体共转染293T细胞。转染4-6小时后，将细胞培养液更换成无血清的DMEM，并且继续培养3天。收集上清，然后补加DMEM，继续培养4天，然后再次收集上清。
将收集的上清以8000rpm离心90min，然后与含有20mM磷酸钠(pH 7.0)的缓冲液等体积混合，随后用0.22μm滤膜进行过滤，然后装载至与protein A或G预装柱(5mL， GEHealthcare)。以100mM甘氨酸(pH 3.0)洗脱结合至预装柱的蛋白。将洗脱级分浓缩，然后通过分子筛层析法进行纯化。随后，通过SDS-PAGE(还原性和非还原性)检测所纯化的目的蛋白，在非还原条件SDS-PAGE中抗体呈现单一条带，在还原条件下SDS- PAGE中抗体的Fc区二硫键被打开，从而显示为两个条带，且抗体纯度超过95％。
实施例5：抗体的结合性能检测
(1)RSV融合后F蛋白(FΔFP)的构建表达
将编码RSV A2毒株的融合后F蛋白(FΔFP)的C端加上Thrombin酶切位点，6个组氨酸序列，1个GS[甘氨酸-丝氨酸]连接序列，1个编码Strep II标签的序列以及1个终止密码子(氨基酸序列如SEQ ID NO:14)，插入到哺乳表达载体pCAGGS的NdeI和 XhoI酶切位点中。将连接产物转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中。然后，挑取单克隆，接种到4mL LB培养基中，培养6-8小时；然后再转接种到300mL的LB培养基中，培养12-16小时，收集菌体，用无内毒素大提质粒试剂盒(TIANGEN)提取质粒，得到pCAGGS-RSV-FΔFP。
将提取的质粒pCAGGS-RSV-FΔFP转染293T细胞表达F蛋白。转染后4-5天，将含有目的蛋白的293T细胞培养上清通过离心和过滤(0.22μM)去除细胞碎片后，与 HisTrap HP(GE healthcare)镍螯合柱结合，再以不同浓度的咪唑洗脱层析柱，分别收集洗脱蛋白，通过SDS-PAGE结果判断含有目的蛋白的样品。
收集含有目的蛋白的洗脱峰，浓缩后，进行分子筛层析，根据蛋白的出峰位置和SDS-PAGE的结果判断的蛋白的大小和纯度。
(2)单克隆抗体Fab全段的制备和纯化
A、准备样品：
将全抗蛋白浓缩到10mg/ml以上，浓缩换液(200倍)为sample buffer(20mMNa3PO4,10mM EDTA,pH7.0)；将换液后的抗体浓缩到20mg/ml以上，加入一定量的digestion buffer(向sample buffer中加入cysteine·HCl至20mM,pH7.0)稀释，终浓度≥10mg/ml。
B、准备酶：
用剪去尖的枪头吸取0.5mL充分混匀的偶联酶beans(Thermo，Prod#20341)到反应容器中，1000g/min离心2min除去保存液；用3mL digestion buffer清洗beans 3 次，弃去洗脱。然后加入0.5mL digestion buffer，温和颠倒混匀。
C、酶切：
给反应管加上堵头，加入浓缩好的抗体(约10mg)，拧紧盖子，用封口膜封住空隙；将反应管固定到旋转混合仪，37℃孵育过夜；
D、Fab回收：
酶切过夜后，1000g/min离心5min，保留下液；用1mL Protein G binding buffer(20mM Na3PO4,pH7.0)清洗beans两次，回收下液；将以上2个步骤的下液混合后测浓度；浓缩下液过Protein G；将目的蛋白洗脱液浓缩换液至1×PBS缓冲液，通过分子筛进一步纯化。
(3)单克隆抗体与F蛋白的结合能力评估
在本实施例中，利用Biacore 3K(Biacore Inc.)进行表面等离子共振分析。具体步骤如下：
首先，将融合前F蛋白DS-Cav1和融合后F蛋白FΔFP以氨基偶联的方式分别固定在CM5芯片的Fc2和Fc4通道上(flow cell,Fc)。然后，以抗体捕获的方式，结合纯化的RV7、RV8、RV10和RV11抗体的Fab蛋白。Palivizumab作为阳性对照。另外，以20mM HEPES，150mMNaCl，pH 7.4溶液连续倍比稀释RV7、RV8、RV10、 RV11和Palivizumab抗体的Fab。然后，将连续稀释的Fab依次通过各通道(从低浓度开始依次上样)。记录RV7、RV8、RV10、RV11和Palivizumab抗体Fab结合DS-Cav1 或者FΔFP的动力学曲线，并利用BIAevaluationsoftware 3K(Biacore，Inc.)软件计算动力学常数KD。亲和力结果如表1所示。
表1抗体Fab片段与融合前F蛋白DS-Cav1和融合后F蛋白FΔFP的结合常数
Figure BDA0003112737050000111
aNull表示没有结合
结果分析：RV7既不结合RSV融合前F蛋白，也不结合RSV融合后F蛋白。RV8 既结合RSV融合前F蛋白(KD＝25.6nM)，也结合融合后F蛋白(KD＝17.5nM)。RV10 既结合融合前F蛋白(KD＝10.1nM)，也结合融合后F蛋白(KD＝7.11nM)；RV11抗体只能够结合RSV的融合前F蛋白(KD＝7.18nM)，不结合融合后F蛋白。
实施例6：抗体的中和活性检测
我们采用流式染色的方法检测抗体的中和活性，详细步骤如下。简单概括而言，我们将纯化到的抗体进行梯度浓度稀释，然后与病毒混合，孵育一段时间后感染前一天准备好的易感细胞。2天后将细胞固定、通透，用靶向F蛋白的一抗染色，用带有标记的二抗再次染色，最后进行流式检测，统计感染的细胞比例。最后通过计算得到抗体的中和活性。
操作步骤：
1.细胞准备
①提前12-16小时铺Hep2细胞于24孔板中放10％DMEM培养基中培养，待次日长至70％以上后做抗体中和实验。
②稀释抗体：RV7、RV8、RV10、RV11、Palivizumab共五种抗体，每种抗体纯化后过滤为无菌条件，将抗体加入48孔板中3倍梯度稀释，每孔至少350μL-400μL用2％ FBS DMEM培养基稀释。
③稀释病毒：将病毒从-80％冰箱取出解冻，按照适宜的病毒稀释倍数用2％FBSDMEM培养基稀释病毒，然后加入到抗体的48孔板中，300μL/孔。(RSV_A2或者 RSV-Long或者RSV-B：450μL稀释到40mL，最终滴度：1.2×104TCID50/100μL)。
④病毒与抗体孵育：
将稀释好的病毒与抗体摩尔比1:1混匀，放于37℃CO2培养箱中孵育1小时。
⑤洗细胞：
提前10分钟，将刚刚长满的Hep2细胞从培养箱拿出，用移液器吸掉培养基用PBS清洗细胞一次，每孔加入500μL PBS。
⑥加病毒抗体混合液：将细胞中的PBS吸出，将病毒与细胞上清混合物每孔300μL加入细胞中，37℃孵育1小时。(一个梯度两个孔，各11个梯度，每个板子两孔病毒孔对照)
⑦补液：孵育结束后，吸去上清，每孔加入含有青链霉素混合液双抗+2％FBS的DMEM培养基1mL。放入培养箱培养细胞48小时左右。
2.流式检测
①观察感染后的细胞，待其发生适宜的细胞病变后，收细胞。
②消化细胞：去除细胞培养基，用PBS清洗细胞一次，每孔加入120微升胰酶，放于37℃培养箱中消化2min，待细胞脱落后，用10％FBS+PBS 130μL终止反应。
③转移细胞至圆底96孔板中。500g，4℃离心10min，去上清。
④用1％FBS+PBS每孔150μL清洗1次，离心同上，去上清。
⑤加入100μL Fixation and Permeabilization Solution，固定通透细胞30min，4℃冰上避光进行。
⑥加入100μL 1×wash buffer混匀，500g，4℃离心10min。用100μL wash buffer重悬，将96孔板外喷酒精并密封好，从P3转至P2进行后续操作。安全起见，在4℃静置一夜再操作。或将细胞转移至新的圆底96孔板。
⑦加一抗：用1×wash buffer稀释已经纯化的Palivizumab，至浓度2μg/mL，将细胞离心，去上清，每孔加入50μL抗体，冰上孵育30min。随后，加入1×wash buffer 150 μL，混匀，离心去上清。
⑧加二抗：用1×wash buffer稀释Anti-Human-IgG(FITC)，1:150倍稀释抗体，每孔加入50μL抗体，冰上孵育30min。随后，加入1×wash buffer 150μL，混匀，离心去上清。重复洗涤一次。最后用150μLPBS重悬。
最终流式检测：用BD FACSAriaⅡ进行流式分析检测。用FlowJo7.6.1进行分析。
结果：
对于RSV A型A2毒株，抗体的半数抑制浓度(IC50)分别为RV8 539.5ng/mL和 RV1142.3ng/mL，二者均好于已上市的palivizumab的751ng/mL，尤其是RV11抗体，其中和活性比palivizumab强约18倍。对于检测浓度范围，RV7和RV10没有中和活性。数据见表2。
表2抗体对RSV A型A2毒株的中和活性
Figure BDA0003112737050000131
aNull表示没有中和活性
对于RSV A型Long毒株，抗体的半数抑制浓度(IC50)分别为RV8 842.9ng/mL和RV11 56.3ng/mL，二者均好于已上市的palivizumab(IC50＝897.4ng/mL)，尤其是RV11 抗体，其中和活性比palivizumab强约16倍。对于检测浓度范围，RV7没有中和活性。数据见表3。
表3抗体对RSV A型Long毒株的中和活性
Figure BDA0003112737050000132
aNull表示没有中和活性
对于RSV B型临床分离毒株，抗体的半数抑制浓度(IC50)分别为：RV8＝183.1 ng/mL,RV11＝31.4ng/mL，二者均好于已上市的palivizumab(IC50＝1413.0ng/mL)，尤其是RV11抗体，其中和活性比palivizumab强约45倍；RV8抗体的中和活性也较 Palivizumab提高了7.7倍。数据见表4。
表4抗体对RSV B型临床分离毒株的中和活性
Figure BDA0003112737050000141
本文中提到的一些氨基酸序列如下：
SEQ ID NO:1
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIE LSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMN YTLNNTKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLS TNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEI TREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSV SFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVIT SLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLGSGYIPEAPRDG QAYVRKDGEWVLLSTFLLVPRGSHHHHHHGSWSHPQFGK
SEQ ID NO:2
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYLSWIRQPPGKGLEWIGYIYHTGSTNY NPSLKSRVTISVHSSKNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARHMRIVTTIDYWGQGTLVTV SS
SEQ ID NO:3
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQGISSYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:4
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWMAVISYDG SNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMFYCARDYCSRGTCYHDY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:5
DIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNDLSWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYSCLQDYNYPQTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:6
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYDFHWVRQAPGQGLEWIGWLNPDN GNTKHSQKFQGRVTFTRDTSASTAFMELSSLRSEDTAVYYCTRAPWWWYFDYWGQ GTLVTVSS
SEQ ID NO:7
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWCQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGV PDRFSGSIDSSSNSASLTISGLRTEDEADYYCQSYDTSNAVFGGGTKLTVLGQPKA
SEQ ID NO:8
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFTNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDD GSDKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRDPTGDYGDFPEQ DGYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:9
QAVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSLNIGSNYVYWYQQLPGTAPKFLIYKNNQRPSG VPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGVVFGGGTKLTVLGQPKA
SEQ ID NO:10
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:11
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECS
SEQ ID NO:12
APSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSN NKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO:13
ETDTLLLWVLLLWVPGSTGD
SEQ ID NO:14
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIE LSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMN YTLNNAKKTNVTLSKKRKRRAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSN GVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGV TTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETC KVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSC YGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGE PIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLLVPRGSHHHHHHHHGSWS HPQFGK。

Claims (16)

1.结合呼吸道合胞病毒F蛋白的抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区，所述重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3选自如下组合之一：
(1)HCDR1的氨基酸序列为:GFTFSSYA；
HCDR2的氨基酸序列为:ISYDGSNT；
HCDR3的氨基酸序列为:ARDYCSRGTCYHDY；
(2)HCDR1的氨基酸序列为:GYTFTTYD；
HCDR2的氨基酸序列为:LNPDNGNT；
HCDR3的氨基酸序列为:TRAPWWWYFDY；以及
(3)HCDR1的氨基酸序列为:GFSFTNYG；
HCDR2的氨基酸序列为:ISYDDGSDK；
HCDR3的氨基酸序列为:VRDPTGDY。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，还包括轻链可变区，所述重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3和所述轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3选自如下组合之一：
(1)LCDR1的氨基酸序列为:QDIRND；
LCDR2的氨基酸序列为:AAS；
LCDR3的氨基酸序列为:LQDYNYPQTFG；
HCDR1的氨基酸序列为:GFTFSSYA；
HCDR2的氨基酸序列为:ISYDGSNT；
HCDR3的氨基酸序列为:ARDYCSRGTCYHDY；
(2)LCDR1的氨基酸序列为:SGSIASNY；
LCDR2的氨基酸序列为:EDN；
LCDR3的氨基酸序列为:QSYDTSNAVFG；
HCDR1的氨基酸序列为:GYTFTTYD；
HCDR2的氨基酸序列为:LNPDNGNT；
HCDR3的氨基酸序列为:TRAPWWWYFDY；以及
(3)LCDR1的氨基酸序列为:SLNIGSNY；
LCDR2的氨基酸序列为:KNN；
LCDR3的氨基酸序列为:AAWDDSLSGVVFG；
HCDR1的氨基酸序列为:GFSFTNYG；
HCDR2的氨基酸序列为:ISYDDGSDK；
HCDR3的氨基酸序列为:VRDPTGDY。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包括SEQ IDNO：4、6或8所示的序列者包括与SEQ ID NO：4、6或8所示序列有至少90％序列一致性的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中
所述重链可变区包括SEQ ID NO：4所示的序列或者包括与SEQ ID NO：4有至少90％序列一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：5所示的序列或者包括与SEQ IDNO：5有至少90％序列一致性的氨基酸序列；
所述重链可变区包括SEQ ID NO：6所示的序列或者包括与SEQ ID NO：6有至少90％序列一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：7所示的序列或者包括与SEQ IDNO：7有至少90％序列一致性的氨基酸序列；或者
所述重链可变区包括SEQ ID NO：8所示的序列或者包括与SEQ ID NO：8有至少90％序列一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：9所示的序列或者包括与SEQ IDNO：9有至少90％序列一致性的氨基酸序列。
5.如权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的重链恒定区包括SEQ ID NO：10所示的序列或者包括与SEQ ID NO：10有至少90％序列一致性的氨基酸序列；所述抗体的轻链恒定区包括SEQ ID NO：11或12所示的序列或者包括与SEQ ID NO：11或12有至少90％序列一致性的氨基酸序列。
6.如权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为人源抗体。
7.如权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述F蛋白为融合前构象。
8.如权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述呼吸道合胞病毒为A或B型呼吸道合胞病毒。
9.核酸分子，其编码权利要求1-7任一项所述的抗体的轻链、重链、轻链可变区或重链可变区。
10.包括权利要求9所述的核酸分子的表达载体。
11.宿主细胞，其表达权利要求1-8任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或者包括权利要求9所述的核酸分子或者权利要求10所述的表达载体。
12.药物组合物，包括权利要求1-8任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
13.权利要求1-8任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备治疗或预防呼吸道合胞病毒相关疾病的药物中的用途。
14.在受试者中治疗或预防呼吸道合胞病毒相关疾病的方法，包括以有效量的权利要求1-8任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求12所述的药物组合物向所述受试者给药。
15.检测样品中是否存在呼吸道合胞病毒或其含量的方法，包括让所述样品与权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触，并检测是否形成了抗原抗体复合物或形成的抗原抗体复合物的量。
16.呼吸道合胞病毒检测试剂盒，包括权利要求1-8任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
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